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Pgina Parmetros biolgicos del agua. 2 Determinacin de microorganismos aerobios mesfilos....... 4 Determinacin de Coliformes Totales y Fecales ....... 5 Determinacin de Estreptococos Fecales...12 Determinacin de Clostridios Sulfito Reductores...15 Conclusiones del anlisis...17
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La normativa recoge una serie de anlisis microbiolgicos segn se efecte sobre el agua un anlisis mnimo: Coliformes Totales y Fecales; uno normal: los anteriores ms: bacterias aerobias a 37 C, Estreptococos Fecales y Clostridios Sulfito-Reductores; o completo: los anteriores ms aerobias a 22 C, microoganismos parsitos y/o patgenos; el anlisis realizado ha sido el normal.
El agua problema procede de un manantial, vamos a realizar un anlisis microbiolgico normal y el objetivo va a ser determinar la contaminacin microbiolgica que puede existir, buscar las causas de esa contaminacin y proponer soluciones al problema.
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Procedimiento:
El mtodo consiste en filtrar a vaco una determinada cantidad de agua que va a ser de 100 mL sobre una membrana filtrante estril depositada con la cuadrcula hacia arriba. Una vez filtrada el agua, se retira la membrana y se deposita con pinzas estriles sobre una placa Petri con medio P.C.A., se incuba 37 C horas. Tras la incubacin se realiza un recuento de las colonias aparecidas, expresndose el resultado en u.f.c. en 100 mL. 24 -48
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Procedimiento:
Vamos a seguir el mismo mtodo para la determinacin de los dos tipos de Coliformes, lo nico que variar ser la temperatura de incubacin de cada determinacin, que para los Coliformes Totales ser de 37 C y para los fecales ha de ser de 44 C.
Prueba presuntiva:
Para determinar estos Coliformes se va a utilizar el medio de cultivo BGBB (dispuesto en tubo), que es un medio selectivo y de enriquecimiento ya que inhibe el crecimiento de microorganismos distintos de los del grupo de los Coliformes a la vez que permite que stos crezcan sin restriccin, se distribuye el medio en nueve tubos (tres series de tres tubos) con diez mililitros cada uno de medio de cultivo y echando 10 ml de el agua a la primera serie de tubos, 1 ml de agua a la segunda serie, y 0,1 ml a la tercera. Colocaremos en cada tubo
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coliformes y habr que hacer las pruebas confirmativas de IMViC. Se aplicar la tcnica del nmero ms probable (NMP).
Pruebas IMViC:
Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pueden identificarse a travs de una serie de pruebas bioqumicas, que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metablica. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacin, uno de los ms
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El triptfano, aminocido suministrado por una peptona adecuada, se descompone en indol por accin de algunos microorganismos. La prctica va a consistir en observar si el microorganismo es capaz de producir indol cuando est en presencia de agua de peptona. El indol producido es detectado por indol de kovacs que produce una coloracin al reaccionar con l. Se coge con un asa de siembra, colonias de la placas de EMB y se siembra en un tubo con agua de peptona. Se incuba horas a la temperatura correspondiente segn se trate de Coliformes Totales Fecales, 24-48 horas, pasado el tiempo de incubacin se sacan los tubos de la estufa y se les aade 1 mL de reactivo indol de Kovacs y se deja reposar. Si aparece una coloracin roja indica que la prueba es positiva, el microorganismo produce indol. Rojo de metilo:
Esta es una prueba cualitativa de la acidez producida por el crecimiento de una bacteria en agua de peptona glucosa con tampn fosfato. Debido a la acidez producida, el medio virar de amarillo a rojo considerando la prueba positiva al aadir un reactivo. El procedimiento es el mismo que el del indol, con la diferncia que, en vez de aadir indol de kovacs, aadimos Rojo de Metilo.
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Algunas bacterias producen acatilmetilcarbimol (producto intermedio en la degradacin de la glucosa de los hidratos de carbono), que en presencia de KOH y aire, se oxida para dar diacetilo, que reacciona con -naftol y un producto de descomposicin de la arginina de la peptona, para producir un color rojo. En un tubo con agua de peptona y glucosa se siembran colonias aparecidas en las placas EMB Levine. Se incuba a 37 44 C 24-48 horas, luego se aade 1 mL de reactivo de Voges Proskauer,que contiene -naftol y KOH, se aade seis gotas de reactivo omehara y dos de reactivo de Barry, se agita, se deja reposar 10-15 minutos y si aparece una coloracin roja la prueba es positiva. Citrato:
Esta prueba determina la capacidad que presenta el microorganismo problema para utilizar el citrato como nica fuente de carbono. En un tubo con agar inclinado con Citrato de Simmons, se siembra una colonia de las aparecidas en EMB en picadura y estra. Si aparece crecimiento en el slam y si el medio vira de verde a azul (debido a la produccin de amonaco que lo alcaliniza), el microorganismo es citrato positivo.
Tincin de Gram:
La coloracin de Gram tiene fundamental importancia en la
diferenciacin morfolgica y taxonmica de las bacterias. Las bacterias se clasifican en dos grandes grupos segn retengan o no el colorante de base usado en la tincin, que es el violeta de genciana o el cristal violeta:
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Resultado de la determinacin:
Se han obtenido idnticos resultados tanto en la determinacin de coliformes totales como fecales y stos han sido:
Prueba presuntiva:
En los tubos ha aparecido un viraje del color del medio de cultivo de violeta a amarillo debido a la produccin de cido y en la campana Durhan puede apreciarse con bastante gas en su interior. Los resultados son positivos en 2 de los 3 primeros tubos,2 de los 3 sundos y 1 de los 3 ltimos (viraje del medio y gas); con estos datos vamos a las tablas del nmero ms probable (NMP) y tenemos: Ms de 20 u.f.c. por cada mL de agua problema. Como sta prueba ha sido positiva, realizaremos las pruebas confirmativas, de haber resultado negativas las primeras, daramos por terminado el anlisis.
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Pruebas IMViC:
- Indol: Aparece un anillo rojo bordeando al tubo: Indol positivo:el microorganismo produce indol. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. - Rojo de Metilo: Tras la incubacin de cuatro das, se aade el reactivo y el tubo se colorea de rojo: Rojo de metilo positivo; el microorganismo produce acidez en su crecimiento. En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha. - Voges-Proskauer: El microorganismo no produce acetilcarbimol al aadirle el reactivo que se detecta con la aparicin del color rojo, en este caso el resultado es negativo, (tubo del medio). En la figura aparecen de izquierda a derecha: tubo sin inoculacin de bacterias, resultado negativo y resultado positivo a la derecha.
- Citrato: Tras la incubacin se observa que el microorganismo no ha crecido en el slam del tubo (tubo del centro) y el medio no ha virado de color, por lo que no es capaz de obtener su fuente de carbono del citrato.
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Escherichia Coli
I +
M +
VI -
C -
Tincin de Gram:
Con esta prueba, hemos observado bacterias bacilares Gram negativas con lo que podemos confirmar la presencia de Escherichia Coli que responde a estas caractersticas y es el mayor indicador de contaminacin fecal en el agua.
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Resultado de la determinacin:
En el tubo sembrado a partir de la dilucin 10-1 se observa 1 colonia negruzca. En el tubo sembrado a partir de la dilucin 10-2 no se observa ninguna colonia. El nmero total de formas vegetativas y esporuladas ser:
1 colonia * 10 (Inverso del factor de dilucin) = 10 formas vegetativas y esporuladas por cada mL de agua problema.
El color negro de estas colonias es debido a que los Clostridios han reducido el sulfito a sulfuro, que reacciona con el Fe+2 del medio formando FeS que es negro, por eso las colonias aparecidas son negras.
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BACTERIAS A. M. : 200 u.f.c. / mL COLIFORMES: 0 u.f.c. / 100 mL. E. COLI: 0 u.f.c. / 100 mL. ESTREPTOCOCOS FECALES : 0 u.f.c. / 100 mL. CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES: 0 u.f.c. / 100 mL.
Como resultado hemos obtenido una gran contaminacin microbiolgica del agua, donde no debera aparecer ningn tipo de contaminacin puesto que se trata de un agua que en tiempos pasados se ha utilizado para consumo humano, aunque actualmente se conoca la no potabilidad de la misma. Durante aos se ha hecho un seguimiento de la calidad del agua analizado y comparando resultados vemos que los parmetros biolgicos se alejan notablemente de los permitidos a partir de un determinado momento. La causa presumible es la ubicacin de unas grandes instalaciones ganaderas, a pocos metros de distancia, de donde se encuentra el manantial del agua analizado que originaran la contaminacin. Es normal que aparezca una contaminacin fecal en el agua y la presencia de Escherichia Coli, que es el mejor indicador de este tipo de contaminacin, as lo confirma.
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