04.11.

2008

Genel Bak
Proteinler, amino asitlerin belirli trde, belirli sayda ve belirli dizili srasnda karakteristik dz zincirde birbirlerine kovalent balanmasyla olumu polipeptitlerdir.

PROTENLERN TANIMLANMASI ve TAYN YNEMLER

Proteinler, btn hcrelerde ve hcrelerin btn ksmlarnda bulunurlar; bir bakteri hcresinde yaklak 4000 tr protein bulunmaktadr. Myoglobin in 3D yaps

1 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

Genel Bak
Yaamsal btn ilevler proteinlere baldr.
Proteinlerin yaplarnda, kovalent balar; peptit balar ve dislfid balardr; kovalent olmayan balar; hidrojen balar, iyon balar ve hidrofob balar (apolar balar)dr.

Enzim ..katalizr Membran proteini..madde iletimi Reseptr madde iletimi Antikor savunma Zehir ve antibiyotikler .........savunma Aktin, miyosin ve flagellin .hareket Byme faktrleri.......gelime Hormonlar .haberleme

3 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

Protein molekllerinin yaps ve konformasyonu Proteinlerde birinci (primer), ikinci (sekonder), nc (tersiyer), drdnc (kuarterner) yap diye drt yap tanmlanr:

5 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

04.11.2008

PROTENLERN ETL ZELLKLER

Proteinler, eitli etkilerle denatre olurlar. Proteinler, amfoter maddeler yani amfoter elektrolit veya amfolittirler; hem asit hem baz gibi davranma zellikleri vardr. Proteinler Yaplarna Gre; Fibriler proteinler: keratin, kollajen, elastin, ipek fibroini, fibrinojen, miyozin Globler proteinler: albminler, globlinler, globinler, glutelinler, prolaminler, protaminler, histonlar Membran proteinleri: Glikoproteinler, Proteoglikanlar, Lipoproteinler, Fosfoproteinler, Nkleoproteinler, Metalloproteinler
7 8

Proteinlerin Molekl Arlklar

Protein Insulin (bovine) Cytochrome c (equine) Ribonuclease A (bovine pancreas) Lysozyme (egg white) Myoglobin (horse) Chymotrypsin (bovine pancreas) Hemoglobin (human) Serum albumin (human) Hexokinase (yeast) -Globulin (horse) Glutamate dehydrogenase (liver) Myosin (rabbit) Mr 5,733 12,500 12,640 13,930 16,980 22,600 64,500 68,500 96,000 149,900 332,694 470,000

Ribulose bisphosphate carboxylase (spinach) Glutamine synthetase (E. coli)

560,000 600,000 9 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. 10

Protein Tayini
Protein analizleri, fen bilimleri aratrmalar ve farmostik endstrisinde nemli bir ara olarak karmza kar. Protein Analizinin Amalar: o Hastalklarn Kesin Tansnn Konmasnda - Kaltm tipinin belirlenmesi (Xe bal, dominant) - Gendeki mutasyonlarn aratrlmasnda nereden balanmas gerektiinin belirlenmesi o Baz durumlarda prognosis iin yardmc
Mutasyon tipinin belirlenmesi (r: ereve kaymas) Gen terapi iin hayvan modellerinin gelitirilmesi
11 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

Protein Tayini
o Mutasyonlar ieren ilevsel olarak nemli blgelerin yerleimlerinin belirlenmesi o Birbirleriyle etkileim iinde olan proteinlerin tanmlanmas o En ok karmza kan alma alanlar ELISA (Enzyme linked Immuno-Sorbent Assays) ve Ktle Spektrometrisi (MS)dir.

12 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

04.11.2008

ELISA: hedef bir molekl spesifik olarak tanyan ve balanan antikorlar, enzimler ile kombine kullanlarak balanma olay sonrasnda hedef molekln pikogram dzeyine kadar saptanmasnda kullanlr. Kullanm Alanlar: o Potansiyel ila adaylarnn optimizasyonu ve snflandrlmas o Klinik ncesinde hayvansal almalarda ve klinikte insan kaynakl rneklerin aratrlmas o Endstride rnlerin test edilmesi (kalite kontrol)

Protein kayna olarak;

Hayvansal dokular, kan, plasenta, bitkisel dokular, algler, kf, maya, mantar ve bakteriler kullanlmaktadr. Proteinin izolasyonu yapmak iin, ham bir tam hcre ekstraktndan, biyolojik aktivite kayb olmakszn hcre fraksiyonunun seilmesi gerekmektedir.

13 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

14

Spektrofotometre
PROTEN TAYN YNTEMLER Protein miktar tayini deneylerinde her zaman gz nnde bulundurulmas gereken temel baz hususlar vardr.
Fotometrik tayinler bir numuneye giren kla, kan n iddeti arasndaki orann llmesine dayanr. bir kaynaktan kan k paralel bir demet haline getirilir, bir monokromatrden (prizma) geirilir ve absorbsiyonun meydana geldii kvete girer. Kvetten kan k demeti, gelen k demetinin iddeti ile orantl bir elektrik sinyal oluturan fotoelektrik dedektre arpar. Her atom, molekl veya kimyasal ban kendine zel spesifik bir k dalga boyu absorbsiyonu vardr. Spektrofotometre zeltiye bilinen spesifik bir dalga boyu n gnderip, bu n ne kadarnn absorbe olduunu ve ne kadarnn yayldn len bir alettir. Bu lmlerde bir kimyasaln ne miktarda bulunduunu hesaplayabiliriz.

Kullandnz cam malzeme ve dier malzemelerin temiz olmasna zen gsteriniz. Kvetlerin (kuvars veya plastik) temiz olduundan emin olunuz. Protein miktar tayini denemelerinin rneinizdeki proteinlerin kompozisyonuna bal olduunu her zaman gz nnde bulundurunuz. Denemeye balamadan nce kullanacanz spektrofotometrenin limitlerini biliniz. Her zaman lm yapmadan nce spektrofotometrenin 1520 dakika snmasna izin veriniz.

15 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

16

Standart Eri
Protein miktar tayini denemelerinde ou zaman protein karmlarnn veya ektinksiyon katsays bilinmeyen proteinlerin miktarlar tayin edilmek istenir. Bu durumunda miktar bilinen saf bir protein standart olarak kullanlmak suretiyle bir standart eri oluturulur.

Standart Eri nasl hazrlanr ve dikkat edilecek hususlar ?

Hazrlayacanz standart erinin miktar bilinmeyen protein rneinizdeki protein miktarn ierisine alacak ekilde olmasna dikkat ediniz. Standart eriyi hazrlarken, rneinizin iinde bulunduu tampon zeltiyi kullannz ve tampon zeltinin ierebilecei safszlklar bertaraf etmek iin tampon zeltinin absorbansn rneklerinizin absorbansndan kartnz. Standart eriyi hazrlarken ayn stok zeltiden seyreltilerek hazrlanm farkl konsantrasyonlarda standartlar kullannz. Standart eri grafiini izerken protein konsantrasyonunu x-, absorbans y- eksenine yerletiriniz. Hatalara yer vermemek iin standart eride konsantrasyon yerine mikrogram miktarlar kullannz

17 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

18

04.11.2008

Standart Eri
y ekseni (abs) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 x ekseni(mg/ml)
0,6 0,5
BSA standart eri

ABS (595nm)

0.2 0.8 1.2 1.8 2.0

0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 BSA (mg/ml)

y = 2,645x R = 0,993

DENEYSEL YNTEMLER 1- Proteinlerin izoelektrik noktalar tayini Proteinlerin izoelektrik noktalar deiik yntemlerle tayin edilebilir. Deiik pH deerlerindeki Asetik asit/Asetat tamponlarndan alnan belirli hacime eit miktarda kazein katlr. En fazla protein kelen zeltinin pHs kazeinin izoelektrik pHsdr.
0,3

0,2

Bu standart eri iin uygun eri eitlii: y = 2,645x Burada xdeerleri g protein ve x deerleri A590 a karlk gelmektedir. [mg/ml Protein= 2,645*[A590] Dolays ile eri eitliinde okunan absorbansn direk olarak yerine konmas ile protein miktar hesaplanabilir.
19 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

Reaktifler: Kazein zeltisi: 20gr/lt (0,4 M sodyum asetatta hazrlanr) Asetik asit: 1 M Asetik asit:0,1 M

20 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

Metot Protein ktrmesi: Numaralandrlm 9 santrifj tpne aadaki tabloda belirtilen ekilde doldurulup iyice alkalanr.
Tp No: Asetik asit (ml) Asetik asit (ml) Destile su (ml) 1 0,1 4,4 2 0,3 4,2 0,5 3 0,5 4,0 0,5 4 1,0 3,5 0,5 5 2,0 2,5 0,5 6 4,0 0,5 0,5 7 0,8 3,7 0,5 8 1,6 2,9 0,5 9 3,2 1,3 0,5

Kazein zeltisi 0,5 (ml) kelme veya Bulanklk pH deeri

15 dk sonra tplerdeki bulanklk veya kelti dzeyi gz ile izlenir ve tabloya aadaki ekilde ilenir: (O) : kelti ve bulanklk yok (+) : Az bulanklk var + : Belirgi bulanklk var ++ : iddetli bulanklk var +++ : kelti var

21 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

22

pH=pKa + log (Cbaz/Casit) [pK2 (Asetik asit): 4,76) Cbaz: Tm tplerde sabit ve 0,04 Mdr. Casit:Deikendir. rnein 1. Tpteki zeltinin pHs u ekilde hesaplanr: 1. Tpteki sv hacmi (toplam) : 5 ml lave edilen 0,1 M asetik asit hacmi : 0,1 ml Seyrelme faktr : 5/0,1=50 Tpteki asetik asit konsantrasyonu : 0,1/50=0,002 Mdr. Yukardaki denklemde bu deer yerine konulduunda; pH=4,76 + log 0,04/0,002= 4,76/1,3=6,06 bulunur.

Protein miktar tayini (Bradford) 1ml serum, Bradford reaktifi, deney tpleri Metod
Standart 0,1 ml 0,1 ml 2 ml 2 ml 2 ml Kr 0,1 ml rnek Destile su Standart zeltisi rnek zeltisi Bradfrd reaktifi

Kazeinin en az znd ve protein miktarnn en yksek bulunduu tpten alnan st fazn pH deeri izoelektrik pH deeridir.

Tpler kartrlp 10 dk. oda scaklnda bekletilir. 595 nmde absorbanslar okunur.

23 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

24

04.11.2008

Standart stok zeltisi 10mg/ml olarak hazrlanr.

Standart zeltisi Konsantrasyon (BSA) (mg/ml) 1 0,02 2 0,05 3 0,10 4 0,15 5 0,20

Serum rneinin ierdii protein miktar, spetrofotometrik olarak 595 nm de llen absorbans deerinin, standart eriden elde edilen formlde yerine konulmas ile hesaplan.

25 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab. Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.

26

Tanyan Bilir. Tanmayan renir

27 Dr.Ozlem mamoglu, Mula niversitesi,Biyoloji Blm,Biyokimya Lab.