Extrait du sujets de BTS Biochimiste

Exercice 1
Structure primaire (10 points) Une casine a t spare et purifie. Il s'agit d'une protine de masse molaire molculaire 23600 g/mol. Elle prsente une seule chane de 199 acides amins. L'hydrolyse enzymatique par la chymosine conduit la coupure de plus de 25 liaisons peptidlques. Cette hydrolyse s'effectue prfrentiellement au niveau des liaisons contenant le groupe carboxyle d'une phnylalanlne ou d'une leucine. La squence de l'un des peptides obtenus aprs action de la chymosine - le peptide P - est recherche. La composition du peptide P en acides amins est la suivante Arg, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Ser. L'hydrolyse trypsique du peptide P libre un acide amin x, un tripeptlde T1 (Glu, Gly, Leu) et un pentapeptide T2 (Ile, His, Lys, Met, Ser). L'action du bromure de cyanogne sur le peptide P conduit la formation d'un ttrapeptide BC1 et d'un pentapeptide DC2, prsentant a son extrmit C terminale : une lactone d'homosrine. L'hydrolyse du peptide P par la thermolysine libre l'acide amin basique x, un acide amin y et un heptapeptide. Lors de l'action de la carboxypeptldase A sur le peptide P, le dtachement des acides amins en fonction du temps est le suivant : - apparition de leucine dans les 2 premires minutes, - apparition de leucine et de glycine dans les 5 premires minutes. Dterminer une squence possible pour le peptide P. Donne : Document 2 - spcificit des processus de clivage dans l'analyse des squences d'acides amins Document 2:

SPECIFICITE DES PROCESSUS DE CLIVAGE UTILISES DANS L'AHALYSE DES SEQUENCES D'ACIDES AMINES
PROCESSUS 1 - Clivages terminaux 1.1 Clivage d'Edman ct C de l'acide amin N terminal ct N de l'acide amin C terminal Rn = n'importe amino-acide Rn = Arg, Lys, Pro Rn -1 = Pro quel A l'exception des acides amins N terminaux bloqus SITE SPECIFICITE COMMENTAIRE

1.2 Carboxypeptidase A 1.3 Carboxypeptidase B 2 - Clivages Internes 2.1 Bromure cyanogne 2.2 Trypsine 2.3 Chymotrypsine

ct N do l'acide amin C Rn = Arg, Lys terminal Rn -1 = Pro Rn = Met Rn = Lys, Arg Rn - 1 = Pro Rn = Phe, Trp, Tyr, Leu Rn - 1 = Pro Hautement spcifique Hautement spcifique Occasionnellement Rn = Met ou autres acides amins

de ct C de Rn ct C de Rn ct C de Rn

2.4 Thermolysine

ct N de Rn

Rn = Leu, Ile, Phe, Trp, Occasionnellement Tyr, Val Rn = Ala ou autres Rn - 1 = Pro acides amins Non spcifique

2.5 Pepsine ct N de Rn Rn (rsidu de rang n) : Indique la localisation du clivage.

Exercice 2

Structure primaire d'un peptide.

La composition en acides amins d'un peptide P, dtermine aprs hydrolyse acide est: Lys 1; Arg 1; AsX 1; Ser 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Ala 1; Val 1; Met 2; Ile 1; Phe 1. La charge nette de P est +1 pH 6,4. Aprs traitement de P par le DNFB. on obtient DNP-Ser. L'action de la carboxypeptidase sur P dtache Ile. L'hydrolyse de P par la Trypsine donne 3 oligopeptides dont les compositions en acides amins dtermines aprs hydrolyse acide sont : T1 Lys 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Val 1; Met 1. T2 Arg 1; Ser 1; Ala 1; Met 1; Phe 1. T3 AsX 1; Ile 1. T1 absorbe fortement 280nm. La charge nette de T3 a pH 6,4 est -1. L'hydrolyse de P par la Chymotrypsine donne 3 oligopeptides dont les compositions en acides amins, dtermines aprs hydrolyse acide sont: CT1 Arg 1; Ala 1; Val 1; Met 1. CT2 Lys 1; AsX 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Met 1; lle 1. CT3 Ser 1; Phe 1. L'hydrolyse de P par le bromure de cyanogne donne notamment 2 oligopeptides dont les compositions en acides amins dtermines aprs hydrolyse acide sont: RC1 Arg 1; GlX 1; Ala 1; homosrine lactone 1. RC2 Lys 1; AsX 1; Pro 1; Gly 1; Ile 1. Trait par le ractif de Sanger: BC2 donne DNP Gly. Quelle est la squence de P?

Exercice 3:
Formule dveloppe, variation de la charge en fonction du pH et dtermination du pHi On donne les peptides suivants : Lys-Ala-His-Glu-Met et Trp-Leu-Asp-Cys. crire la formule dveloppe de ces peptides. tudier la variation de leur charge nette en fonction du pH et dterminer leur pH isolectrique. On utilisera les valeurs suivantes pour le pK a des diffrentes fonctions ionisables : -COOH ou -COOH -NH2 -NH2 Imidazole Thiol 3 4,5 8,5 10,5 6,5 10

Exercice 4:
tude d'un dipeptide. Courbe d'absorbance en fonction du pH 1. crire la formule du dipeptide alanyl-tyrosine. 2. Prciser les diffrentes formes ioniques possibles de ce dipeptide en fonction du pH du milieu. On donne les valeurs des pKa 25 T : Tyrosine: pKa1: (-COOH) = 2,20; pKa2 (-NH2) = 9,10; pKa3 (-OH) = 10,10 Alanine: pKa1: (-COOH) = 2,35; pKa2 (-NH2) = 9,70 3. Application: on mesure la densit optique 25C et 295nm d'une solution 0,4M d'alanyltyrosine diffrents pH: on obtient les rsultats suivants: pH 1,3 4,6 8 9,7 10,2 10,5 12 13 14 DO 295nm 0 0,01 0,08 0,3 0,55 0,68 0,87 0,91 0,91 Tracer la courbe traduisant la variation de la densit optique en fonction du pH. Interprter la courbe. (BTS biochimiste 1974)

Exercice 5:
Analyse d'un peptide par lectrochromatographie Un chantillon est soumis une lectrochromatographie sur papier (lectrophorse pH 6,4 suivie d'une chromatographie ascendante en solvant organique). Aprs rvlation la ninhydrine, les spots 1, 3, 4 et 5 apparaissent colors en mauve et le spot 2 en jaune (fig. 1). Les constituants 1 et 3 peuvent galement tre rvls par des ractifs de la fonction phnol et le constituant 4 par la raction de Sakaguchi.

Figure 1

Figure 2

1) Quelle peut tre la nature des constituants correspondant aux taches 1, 2, 4, 5? 2) Aprs hydrolyse trypsique de l'chantillon et lectrochromatographie dans les mmes conditions que prcdemment, on obtient la carte reprsente par la figure 2. Quelle(s) hypothse(s) peut-on

faire sur la nature de 3? 3) L'chantillon est dpos en haut d'une colonne de rsine changeuse de cations faible tamponne pH 6. L'lution est pratique en augmentant le pH. Dans quel ordre sortiront les diffrents constituants organiques ? Que penser de cette sparation ? (BTS biochimiste 1977)

Exercice 6:
Analyse d'un peptide 1) Comment peut-on mettre en vidence la nature peptidique du compos tudi? 2) L'hydrolyse acide totale et l'analyse chromatographique de l'hydrolysat rvlent que le peptide est constitu d'arginine (Arg), d'alanine (Ala), de valine (Val), de leucine (Leu), de phnylalanine (Phe) et de tyrosine (Tyr). Quel est le rvlateur utilis pour localiser ces acides amins sur le chromatogramme ? 3) Dtermination de la formule brute: on dtermine la masse molaire du peptide, on l'hydrolyse, on en fractionne les diffrents acides amins que l'on dose sparment. On a obtenu la formule brute suivante: (Arg) 1, (Ala) 1, (Val) 1, (Leu) 1, (Phe) 1, (Tyr) 1, c'est un hexapeptide. La mthode l'aminopeptidase montre que l'acide amin NH2 terminal est l'alanine (par convention le rsidu NH2 terminal est plac l'extrmit gauche du peptide). L'hydrolyse trypsique conduit 2 tripeptides dont l'un est constitu d'alanine, arginine et tyrosine. L'hydrolyse acide partielle conduit un mlange de peptides: peptide P1 constitu d'arginine et de phnylalanine; peptide P2 constitu de leucine et de valine; peptide P3 constitu de phnylalanine, de leucine et d'arginine. En dduire la structure du peptide, c'est--dire sa squence en acides amins. La trypsine est spcifique des liaisons peptidiques impliquant le groupement carboxyle d'une arginine ou d'une lysine. (BTS biochimiste 1972)

Exercice 7:
On considre les oligopeptides suivants: Gly-Arg; Gly-Glu et Gly-Glu-Arg. On procde une lectrophorse sur papier d'un mlange de ces 3 peptides pH 1 et pH 13. Aprs l'lectrophorse, on rvle les peptides avec la ninhydrine. On obtient 2 taches pour chaque lectrophorse. Ces taches sont localises comme le montrent les figures 1 et 2:

Laquelle des figures correspond l'lectrophorse pH 1, laquelle l'lectrophorse pH 13? Quel lectrophorgramme obtiendrait-on pH 7?

Exercice 8:
On soumet une squence polypeptidique une hydrolyse acide totale, l'action des carboxypeptidases A et B, la raction de Sanger (DNFB) et l'hydrolyse par la Trypsine. L'hydrolysat acide contient 1 Gly, 1 Glu, 1 Lys, 1 Leu, 1 Met, 1 Asp, 1 Arg, 1 Phe, 1 His et 1 Pro. Les carboxypeptidases A et B sont sans effet. La raction de Sanger suivie d'hydrolyse totale conduit DNP-Gly et DNP-Lys. Aprs action de la trypsine on obtient 4 fragments: - un ttrapeptide (1) qui donne avec le DNFB la DNP-Leu et la DNP-Lys; par ailleurs, (1) est trait avec BrCN; les produits de la raction sont spars; parmi eux figure un dipeptide non charg en milieu neutre; - un tripeptide (2): aprs raction avec le DNFB suivie d'hydrolyse, le mlange des aminoacides

est spar par chromatographie sur rsine changeuse de cations, pH 3; un des trois aminoacides n'est pas retenu par la rsine et se retrouve dans les premires fractions de l'luat; les aminoacides qui ont ragi avec le DNFB sont la Gycine et la Lysine; - un dipeptide (3): la raction de Sanger rvle la prsence de DNP-Asp; en outre, il donne une raction de Sakaguchi positive; - le 4e fragment (4) donne avec le DNFB la DNP-Gly; la chymotrypsine hydrolyse ce fragment en 2 dipeptides. Aprs action du BrCN sur le polypeptide on retrouve 2 peptides: l'un contenant Gly, Glu, Leu et Lys, l'autre tous les aminoacides restants. tablir la structure primaire de la squence polypeptidique.

Exercice 9:
On donne le peptide suivant : Trp-Gly-Asp-Lys. 1. crire la formule dveloppe de ce peptide. 2. tudier la variation de sa charge nette en fonction du pH et en dduire la valeur de son pH isolectrique. Donnes : pKa des diffrents groupements ionisables : pK1 Acide Aspartique Glycine Lysine Triptophane 2,09 2,34 3,18 2,38 pK2 9,82 9,6 8,95 9,39 10,53 pK3 3,86