EXPERIMENTO 4

METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE CARBOHIDRATOS (MONOSACARIDOS, DISACRIDOS Y POLISACARIDOS)

REQUISITOS Repasar las estructuras de los principales monosacridos, disacridos y polisacridos OBJETIVOS Identificar por mtodos colorimetritos cuantitativos los principales monosacridos, disacridos y polisacridos

1.

FUNDAMENTOS

Los carbohidratos estn distribuidos ampliamente en vegetales y animales en los cuales tiene participacin estructural, funcional y metablica. Los carbohidratos se clasifican dependiendo del numero de tomos de carbono que posee y la funcin aldehdica o cetonia, estas a su vez le confiere la base para la mayora de las reacciones usadas para su identificacin y cuantificacin. Cuando el carbohidrato esta formado por una sola molcula de carbohidrato, se denomina monosacrido, por dos, disacrido y por mas de dos, polisacrido. Los disacridos son azucares formados por la unin de dos monosacridos mediante el enlace glucosdico. Si este enlace se efecta entre dos carbonos anomricos, el disacrido no tendr el potencial aldehdo o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que involucren la participacin de estos grupos, recibiendo el nombre de azcar no reductor, la sacarosa y la trealosa son ejemplos de los disacridos no reductores (ver anexos). Todos los disacridos que posean un carbono anomrico libre, darn positivas estas reacciones, llamndose azucares reductores, debido a que promueven la reduccin del reactivo usado y ellos mismos se oxidan. Aunque la mayora de los disacridos carecen de importancia para el hombre, con algunas excepciones como la sacarosa, su estudio se debe a que disacridos como la maltosa y la celubiosa, se originan como producto de la 47

hidrlisis de polisacridos, la maltosa, por ejemplo, es el producto de la hidrlisis del glucgeno y el almidn. Los polisacridos, si son abundantes y representan para el hombre la principal fuente de energa metablica de fcil aprovechamiento, el almidn, constituido por solo molculas de glucosa es sin lugar a dudas la base alimenticia del globo terrestre, especialmente en la poblacin de bajos recursos. En el anexo, se muestran las estructuras de los principales mono, di y polisacridos. 1.1 1.1.1 Fundamentos qumicos de las pruebas. Prueba de Molish

Es una reaccin general para carbohidratos que contienen ms de 5 tomos de carbono, la reaccin se muestra en la siguiente figura: Figura 1 Reaccin de Molish

OH OH OH OH OH

CH CH CH CH CH CH2 Hexosa

H2SO4 3H2O

O HOH3C H Hidroximetil Furfura O C

OH

O HOH3C O C H +

2
HO H3 C

OH

CH
OH

1.1.2

Prueba de Barfoed:

Es una reaccin para identificar monosacridos, aunque algunos disacridos (los reductores) dan positiva la reaccin, pero con mas tiempo de calentamiento, ya que as se hidroliza el disacrido. El fundamento radica en la reduccin del acetato cprico a oxido cuproso. 1.1.3 Prueba de Bial o de Orcinol-HCl

Es una prueba especfica para pentosas la cual se muestra en la figura 2. La positividad se reconoce por la formacin de una coloracin verde botella brillante. 48

Figura 2 Reaccin de Bial

OH OH OH OH

CH CH CH CH CH2 Pentosa

HCl 3H2O

O O Furfural CH

OH

CH3

CH 3 OH

O O CH +

2
HO OH

H2O

O
CH 3

CH
OH

Orcinol

OH bis (3,5 - dioxi-metil-fenil furfuril-metano)

1.1.4

Prueba de Seliwanoff:

Es especifica para cetosas que contengan 5 o ms tomos de carbono, pero se usa casi exclusivamente para identificar fructosa. La reaccin se presenta en la figura 3 Figura 3 Reaccin de Seliwanoff

OH

OH HC l 3H 2 O O C

O H C H2O H Hidroximetil-furfural

C H 2 C C HC HC HC H 2 O H OH Fructuosa
1.1.5 Prueba de Lugol:

Es una prueba que se usa para identificar almidn. El color azul, se debe, posiblemente a la formacin de un complejo: Ioduro de almidn. 1.1.6 Prueba de Benedict: Es una prueba especfica para las sustancias reductoras con grupos carboxilos libres. 49

Figura 4 Reaccin de la prueba de Benedict cualitativo

CuSO4 + 2 NaOH O C H Cu(OH)2 + Cu 2 O + R Na2 SO4 COOH + H 2 O

Cu(OH)2 + R

(rojo ladrillo)

1.1.6

Prueba Fenilhidrazina

Es una prueba para distinguir asas (y oligosacridos). Los carbohidratos que solo se diferencian en sus tomos de carbono 1 y/o 2 darn la misma osazona, como es el caso de la glucosa y la fructosa, que son isomeros de funcin. La figura 5 muestra la reaccin. Figura 5 reaccin de la Prueba de Fenilhidrazina
H O OH OH + H2O N NH2 H N N OH OH Fenilhidrazcina OH CHCHCHCHCHCH2OH OH

CHCHCHCHCHCH2OH OH OH D-glucosa

Fenilhidrazcina de D-gluco

OH OH OH OH

H N NH2

H O

OH OH OH

NH2

CH N N CH CHCHCHCH2OH

N N C C CH CHCH2OH CH

+
NH3

Cetofenilhidrazona de D-glucosa Anilina

N H H O OH OH H N NH2 N OH OH N N C C CHCHCHCH2OH OH

C C CHCHCHCH2OH N OH N H

+
H2O

Glucosazon

2. 2.1

MATERIALES Y MTODOS Materiales Tubos de ensayo, mechero, pinzas de madera 50

2.2

Mtodos Prueba Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema R. de Molish: -naftol al 10% en etanol Mezclar H2SO4 concentrado Dejar caer lentamente de por las paredes del tubo. La aparicin de un anillo violeta-rojizo en el sitio de contacto de los dos lquidos, indica que la muestra contiene carbohidratos. Volumen 1 ml 2 gotas

2.2.1 P. de Molish

0,50 ml 2.2.2. P. de Barfoed Sustancia problema Reactivo de Barfoed Acetato de cobre cristalizado 13,3 g en 200 ml de H2O destilada. Filtrar si es necesario. Aadir 1.8 ml de cido actico glacial (CH3COOH). Mezclar y calentar en bao de agua hirviente, contando los minutos y sacar del bao cada tubo inmediatamente despus que haya aparecido el precipitado rojo ladrillo de Cu2O. Anotar el tiempo que corresponda a cada carbohidrato. La aparicin de un precipitado rojo, antes de los 6 min. indica la presencia de un monosacrido. La aparicin de un escaso precipitado rojo, entre 9 y 12 min indica la presencia de Lactosa o Maltosa. 2.2.3 P. de Bial Sustancia problema Reactivo de Bial 300 ml de HCl concentrado en 250 ml de H2O destilada, aadir 1,5 g de orcinol y 8 gotas de cloruro frrico al 1% (Cl3Fe.6H2O) Mezclar Llevar a bao de mara hirviente durante 3 min. La aparicin de un color verde botella, brillante y totalmente transparente, indica la presencia de una pentosa. Algunos azucares dan con el Bial una coloracin verde, pero est es opaca. 1 ml 1 ml

2,5 ml

1.5 ml 1 ml

51

Prueba 2.2.4. P. de Seliwanoff

Procedimiento En un tubo de ensayo colocar: Sustancia problema Reactivo de Seliwanoff: Resorcinol al 0.5 % en H2O, tomar 3 ml aadir 12 ml HCl concentrado, aadir H2O c.s.p. 35ml. Llevar a bao de Mara hirviente durante 10min. La formacin de un color rojo cereza, indica la presencia de fructosa. Sustancia problema Reactivo de Lugol: A 5 g de Iodo y 10 g de K aadir H2O c.s.p 100 ml Mezclar y observar. La aparicin de una coloracin azul indica la presencia del almidn y una coloracin roja, indica el glucgeno o eritrodextrina. Si el color no cambia, el carbohidrato es un monosacrido o un disacrido. Sustancia problema Reactivo de Benedict cualitativo Sulfato cprico + Citrato de sodio + Carbonato de sodio Mezclar Llevar a bao de Mara hirviente por 5 min. La aparicin de un precipitado verde, amarillo o rojo indica la presencia de un azcar reductor. Sustancia problema Reactivo de fenilhidrazina. Se mezclan fenilhidrazina, cido actico glacial y agua destilada en una proporcin de 1:1:4 Mezclar bien Coloque los tubos en agua de bao hirviendo durante 10 min. Al final del perodo de calentamiento, enfri los tubos en chorro de agua Dejar en reposo durante 5 min Examinar al microscopio la forma caracterstica de los cristales de osazona, colocando con mucho cuidado una gota en el portaobjeto. Cubrir con la laminilla cubreobjeto evitando daar los cristales con movimientos bruscos o exceso de muestra.

Volumen 1 ml 2 ml

2.2.5. P. de Lugol

2 ml 1 gota

2.2.6. P. de Benedict

0.5 ml 2 ml

2.2.7. P. de Fenilhidrazina

2 ml 0.5 ml

52

2.3

Marcha analtica para monosacridos, disacridos y polisacridos

SUSTANCIA DESCONOCIDA

Prueba Molish (-) incolora No es carbohidrato (+) Anillo rojo o violeta Carbohidrato Prueba Barfoed

(+) Precipitado rojo antes de los 6 min. Monosacrido P. Bial (-) Otro color Hexosa P. Seliwanoff (-) Incoloro o una leve coloracin Glucosa o galactosa (+) Rojo Fructosa (+) Verde Pentosa

(+) Precipitado rojo de 9 a 12 min. Disacrido o Polisacridos Prueba Lugol

(+) Azul Almidn

(-) Amarillo Disacrido

(+) Rojo o amarillo oscuro Glucgeno P. Benedict

P. Fenilhidrazina

(-) No cambia No es reductor Sacarosa

(+) Precipitado rojo Reductor

(+) Cristales en forma de palma (Glucosazona) Glucosa

(+) Cristales en forma de estrella (Galactosazona) Galactosa

P. Fenilhidrazina (+) Cristales en (+) Cristales en forma de Flor forma de nido (Maltosazona) (Lactosazona) Maltosa Lactosa

53

2.4

Preparacin del almidn de diversas especies de granos para observar los grnulos al microscopio.

Suspenda algunas partculas del almidn comercial (Papa, yuca y frjol) en dos gotas de agua sobre un portaobjeto. Cubra con la laminilla y examine al microscopio. Dibuje dos o tres grnulos en el cuadro que tiene en su informe, anote sus observaciones. 2.4.1 Tubo Hidrlisis cida de disacridos. Volumen de la solucin del disacrido (ml) 1 1 1 1 HCl 1 N (ml) 1 1 0 0 H2O (ml) 0 0 1 1 Tome cuatro tubos de ensayo y siga el siguiente procedimiento: Solucin del disacrido 1 Maltosa 2 Sacarosa 3 Maltosa 4 Sacarosa Seguidamente:

1. Hervir simultneamente todos los tubos en bao de Mara durante 1 min. 2. Neutralizar los tubos 1 y 2 aadiendo 7 gotas de NaOH 1 N y 7 gotas de agua a los tubos 3 y 4 3. A cada tubo aada 0.5 ml de Benedict y lleve a bao de Mara por 2 min. 4. Observe los resultados y anote en su informe. 3. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. AUTO-EVALUACIN. Explique por qu el monosacrido gliceraldehido da negativa la P. Molish. Cuales son las aplicaciones prcticas de las pruebas estudiadas. Escriba la glucosa en forma de silla. Defina los siguientes trminos: carbono anomrico, centro quiral, levorrotatorio. Dibuje los monosacridos glucosa, galactosa, ribosa y fructosa, clasifquelos segn el nmero de tomos de carbono y la funcin principal Efectu un enlace hemiacetlico y uno hemicetlico, escriba las diferencias entre ambos enlaces. Escriba las funciones: aldehdica, cetnica, alcohlica, cida, colquelas en orden de reactividad y explique el por qu de ese orden. Explique en que consiste la hidrlisis cida de disacridos. Escriba y compare las frmulas de la maltosa y la trealosa. Defina los siguientes trminos: azcar reductor y azcar no reductor, cite ejemplos. Cul es la importancia energtica del almidn. Efectu un enlace glucosdico.

54

4. 4.1

ANEXO REPRESENTACIN DE FISCHER DE MONOSACRIDOS

Representacin de Fischer de los monosacridos mas frecuentes en la naturaleza carbonos H H H H H H C OH C O 1 C O C O C O * * * * C O H C OH H C OH H C OH HO C H 2 * HO C H HO C H H C OH HO C H 3 HO C H H C OH HO C H H C OH H C OH H C OH 4 5 6 H H C OH C OH H H C OH C OH H H C OH C OH H D-Galactosa D-Ribosa H C OH H H H C OH C OH H D-Fructosa

H D-Glucosa

H D-Manosa

4.2

REPRESENTACIN DE HAWORTH Representacin en estructuras de Haworth

CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH

O *

O *

O *

O *

O *
CH2OH

-D-Manopiranosa -D-Glucopiranosa

-D-Ribofuranosa -D-Fructofuranosa

-D-Galactopiranosa

55

4.3 DISACRIDOS MAS IMPORTANTES Y ESTRUCTURAS DEL PIRANO Y FURANO

DISACARIDOS MAS IMPORTANTES
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH

o o

o o

MALTOSA D-glucopiranosil (1-4) D-glucopiranosa

CH2OH CH2

CELUBIOSA D-glucopiranosil (1-4) D-glucopiranosa

CH2OH CH2OH

o o

o o

ISOMALTOSA D-glucopiranosil (1-6) D-glucopiranosa

CH2OH

LACTOSA D-galactopiranosil (1-4)D-glucopiranosa

CH2OH

o
HO2HC

o o

CH2OH

o
CH2OH

TREALOSA D-glucopiranosil (1-2) D-glucopiranosido

SACAROSA D-glucopiranosil (1-2) D-fructofuranosido

PIRANO
o

BOTE

SILLA FURANO o

56

4.4

ANMEROS DE LA GLUCOSA Y REPRESENTACIN EN SILLA D-GLUCOSA

H O

H H

1C C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 H

OH OH H

1C C

HO H

1C * C 2 C 3 C 4 C 5 C 6 H

H OH

H2O O

OH H2O

HO H

H OH

HO H H2O H

3 4

C C C C

H OH H2O

HO H

H OH

H H

5 OH H 6

OH OH

H H

OH

H (Estructuras de Fisher) D- glucosa Beta-D- glucosa (anmero beta)

Alfa-D- glucosa (anmero alfa)

(e) CH2OH 6 a (a) H 5 O H (e) e 4 6 e 5 (e) OH H (a) H a (a) *1 e 3 a 2 e * 1 a e a

OH (e)

OH (a )

H (a)

OH (e) Alfa-D- glucopiranosa (Estructuras de Howard) Alfa-D- glucopiranosa (Estructura en silla)

clave: * = Carbono anomrico, a = eje axial, e = eje ecuatorial

57

5. INFORME 4 Apellidos Grupo de prcticas Fecha Calificaciones Entrada

(CARBOHIDRATOS) Nombres N del mesn N del estudiante Desarrollo Informe Definitiva

1. Complete el siguiente cuadro con la informacin deseada. En la casilla N0 Muestra, coloque el numero de cada tubo de las muestras problemas que se le entrego. Use los signos (+) o (-), para reportar la positividad o negatividad de la reaccin. Sobre la base de los resultados de sus pruebas, Ud. puede identificar la muestra problema. N0 Muestra P. Molish P. Barfoed P. Bial P. Seliwanoff P. Lugol P. Benedict P. Fenilhidrazina Nombre de la muestra problema 2. Dibuje y anote y sus observaciones sobre los cristales identificados en el microscopio Dibujo de los cristales de osazonas

Observaciones

58

3. Dibuje en el siguiente cuadro los grnulos de almidn, anote sus observaciones Almidn Dibujo Yuca Papa frjol

Observaciones

4. Anote sus resultados y la explicacin sobre la hidrlisis cida de disacridos Tubo 1 Resultado Explicacin

Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin anexar hojas. 59