JURNAL 1 Deteksi Chlamydia Trachomatis Dari Spesimen Urin Menggunakan PCR Pada Wanita yang Mengidap Cervicitis

ABSTRAK Chlamydia trachomatis adalah agen yang paling umum dari infeksi urogenital pada pria dan wanita. Diagnosis infeksi klamidia didasarkan pada isolasi bakteri dalam media kultur jaringan yang membutuhkan setidaknya 48 sampai 72 jam. Polymerase chain reaction (PCR) adalah metode yang sensitif dan spesifik untuk mendeteksi sejumlah kecil DNA bakteri dalam sampel klinis. Tujuan pertama penelitian ini adalah untuk melakukan tes PCR untuk mendeteksi adanya Chlamydia trachomatis dari sampel urin dan setelah itu untuk mengidentifikasi frekuensi Chlamydia trachomatis pada wanita yang mengidap cervicitis, untuk mengidentifikasi faktor-faktor risiko potensial untuk infeksi kelamin klamidia. Dari Agustus sampai dengan Oktober 2002, total 122 wanita berturut-turut dengan cervicitis yang datang ke klinik Obstetri & Ginekologi shoosh, Teheran-Iran terlibat dalam penelitian. Setelah ekstraksi DNA dari urin spesimen, tes PCR dilakukan. Genom Chlamydia trachomatis terdeteksi di 14 dari 94 (14/9%) spesimen urin. Frekuensi tertinggi infeksi Chlamydia trachomatis serviks ditemukan pada wanita dengan usia 28-38 tahun, pendidikan dasar tingkat kelompok, dan pada pengguna IUD untuk kontrasepsi. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa teknik PCR adalah metode yang berguna untuk mendeteksi Chlamydia trachomatis dalam urin.

PENDAHULUAN Chlamydia trachomatis adalah salah satu penyebab yang paling umum diobati untuk penyakit menular seksual pada pria dan wanita. Di seluruh dunia, ada kejadian tahunan diperkirakan 50 juta kasus infeksi klamidia. Spesies Chlamydia trachomatis dibagi menjadi 15 serovarian didefinisikan oleh antiserum polivalen dan monoklonal antibodi. Serovarian A, B, Ba dan C adalah agen etiologi dari trachoma, server D-K berhubungan dengan infeksi oculogenital, sementara serovarian L1, L2 dan L3 menyebabkan lymphogranuloma venereum. Infeksi urogenital dengan Chlamydia trachomatis di wanita memiliki perjalanan klinis bervariasi dari tanpa gejala infeksi terhadap infeksi menaik menyebabkan penyakit radang panggul yang terkait dengan kehamilan ektopik dan ketidaksuburan tubal. Chlamydia

trachomatis dapat menyebabkan banyak penyakit pada manusia, termasuk trachoma okular, uretritis, epididimitis, cervicitis, salpingitis dan lymphogranuloma. Cervicitis adalah infeksi kelamin utama pada wanita yang disebabkan oleh Chlamydia. Dalam penyelidikan sebelumnya, infeksi serviks Chlamydia trachomatis juga dikaitkan dengan prematur membran ketuban pecah dini, prematur tenaga kerja dan berat badan lahir yang kurang. Wanita terinfeksi asymptomatically mungkin pada resiko reproduksi yang serius, karena itu, skrining untuk infeksi klamidia genital adalah prioritas tinggi untuk kesehatan masyarakat. Peningkatan prevalensi penyakit klamidia telah dihasilkan banyak kepentingan dalam pengembangan sensitif, spesifik, dan teknik cepat untuk diagnosis infeksi klamidia. Diagnosis infeksi Chlamydia Trachomatis sering didasarkan pada isolasi bakteri di media kultur jaringan. Metode ini membutuhkan koleksi spesimen yang hati-hati dan transportasi dengan kondisi ketat dan membutuhkan setidaknya 48 sampai 72 jam untuk melakukannya. Baru-baru ini, metode PCR telah digunakan untuk mendeteksi infeksi Chlamydia trachomatis. PCR telah terbukti lebih sensitif dan lebih spesifik dari tes mikrobiologi konvensional. Teknik amplifikasi asam nukleat seperti PCR melibatkan amplifikasi eksponensial welldefined DNA target, sehingga meningkatkan sensitivitas deteksi dibandingkan dengan sensitivitas metode nonculture lain. PCR adalah teknik amplifikasi DNA in vitro baru yang memungkinkan amplifikasi eksponensial virtual molekul DNA yang didefinisikan dengan baik selama beberapa siklus, keuntungan dari amplifikasi DNA dengan PCR adalah bahwa ia tidak memerlukan organisme hidup. Selain itu, PCR tampaknya merupakan suatu alat yang optimal untuk peningkatan sensitivitas deteksi. Studi-studi sebelumnya menunjukkan bahwa PCR memiliki sensitivitas 97%-100% dan spesifisitas 98% untuk mendeteksi Chlamydia trachomatis, sementara pada umumnya metode lain meniliki masing-masing memiliki sensitivitas dan spesifisitas dari 85% dan 100%. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk melakukan uji PCR untuk mendeteksi Chlamydia trachomatis pada sampel urin menentukan frekuensi Chlamydia trachomatis pada wanita cervicitis mengidentifikasi beberapa faktor risiko potensial untuk infeksi kelamin klamidia.

BAHAN DAN METODE Pasien Dari bulan Agustus hingga Oktober 2002 sebanyak 122 wanita berturut-turut dengan cervicitis yang datang ke klinik Obstetri & Ginekologi Shoosh, Teheran-Iran, yang terlibat dalam penelitian. Setelah dilakukan pemeriksaan oleh dokter, informasi diperoleh dari semua pasien, dan kuesioner tentang, usia, tingkat pendidikan, pekerjaan, status perkawinan, riwayat infeksi alat kelamin, riwayat aborsi, riwayat kontrasepsi, metode operasi kelamin dan gejala
2

selesai. Tidak ada pasien menerima pengoatan antibiotik selama 4 minggu sebelum kunjungan dan memenuhi syarat jika mereka tidak buang air kecil selama 2 jam sebelumnya. Sepuluh sampai 15 ml urin dari setiap pasien dikumpulkan ke dalam gelas steril dan segera disimpan pada suhu 4C sampai diproses. Spesimen urin tersebut disentrifugasi pada (12.000g) selama 20 menit dan supernatan dibuang dan pelet dibekukan pada -20C, sampai proes PCR dilakukan. Ekstraksi DNA dari spesimen Pelet ditangguhkan dalam 500 l sodium dodesil sulfat (SDS) larutan penyangga [50 mM Tris-EDTA (PH 7,5), 1% SDS, 0,1 mg proteinase k/ml]. Suspensi diinkubasi pada suhu 55C selama 4 jam dan kemudian direbus selama 20 menit. Lisat diekstraksi dengan volume yang sama dari fenol dan kemudian dengan volume yang sama kloroform. DNA mengendap dalam volume isopropanol yang sama, dicuci tepat waktu dengan etanol 70%, dikeringkan, dan di suspensi kembali dalam 50 l air suling ganda. Polymerase Chain Reaction Chlamydia trachomatis adalah bakteri intraseluler obligat. Luar membran protein dari bakteri intraseluler obligat memainkan peran langsung dalam proses adaptasi dengan memfasilitasi interaksi antara sel bakteri dan sel inangnya. Dengan demikian, MOMP telah terlibat dalam mekanisme lampiran, infeksi dan patogenesis. Primer; CT1: CCT / GTG / GGG / AAT / CCT / GCT / GCT / GAA CT4: GTC / GAA / AAC / AAA / GTCATCCAGTA / GT Sebuah derivat berasal dari jenis yang sangat menarik dari urutan DNA diterbitkan untuk MOMP dari serovarian Chlamydia trachomatis (Aksesi nomor: gi / 532121 / gb / L35606.1 / CHTOMP1A). Semua serovarian diproduksi pada intensitas yang sama yaitu pada fragmen 144-bp. Singkatnya, 2 l ekstrak DNA diproses pada 30 l volume reaksi mengandung PCR buffer (10 mM Tris [pH 9,0], 50 mM KCl, 0,01% gelatin), 200 M deoxynucleoside trifosfat, 2,5 mM MgCl2, 0,5 M masing-masing primer, dan 1 U Taq polimerase. Amplifikasi dilakukan dalam mastercycler (Eppendrof, Jerman). Siklus pertama, terdiri dari 5-min denaturasi pada suhu 94C, diikuti dengan 35 siklus masing-masing 30 detik pada suhu 94C, 45 detik pada suhu 56C, dan 1 menit pada suhu 72C, dengan ekstensi akhir untuk 10 menit pada suhu 72C. Produk PCR divisualisasikan dalam gel agarosa 2% yang mengandung 0,5 g etidium bromida/ml. Kemudian dikonfirmasi semua pasien yang spesimennya positif

klamidia dengan menggunakan plasmid primer dari Chlamydia trachomatis yang dirancang dengan menggunakan software DNASIS. Primer BP1: AAC / CGT / TTT / TAA / TAG / TGGCA Primer BP2: TTC / TGG / CCA / AGA / ATT / ATCC yang memperkuat sebuah fragmen 377-bp dari plasmid samar klamidia (7,5 kb). Plasmid samar Chlamydia trachomatis digunakan sebagai DNA target untuk amplifikasi karena ada 10 salinan per dasar tubuh; sensitivitas meningkat kuat. Dengan kemajuan dalam teknologi DNA, metode laboratorium untuk amplifikasi dan deteksi plasmid multicopy DNA hadir di semua serovarian Chlamydia trachomatis telah diperkenalkan untuk diagnosis infeksi Chlamydia trachomatis. HASIL DNA diekstraksi hanya dalam 94 spesimen dari semua 122 spesimen urin yang dikumpulkan, dan 28 spesimen hilang. 14 dari 94 spesimen (15%) positif dengan PCR menggunakan primer spesifik untuk MOMP (CT1 & CT2) (Gambar. 1) dan plasmid samar (BP1 & BP2) (Gambar. 2). Hasil PCR oleh MOMP primer (CT1 & CT2) dan plasmid primer samar (BP1 & BP2) adalah sama.

Gambar 1 : Deteksi Chlamydia trachomatis dari spesimen serviks menggunakan PCR. 1 = ukuran DNA marker ; 2 = kontrol positif ; 3 = kontrol negatif ; 4 & 7 = pasien yang positif Chlamydia trachomatis ; 5 & 6 = pasien yang negatif Chlamydia trachomatis

Gambar 2 : Deteksi Chlamydia trachomatis dari spesimen serviks menggunakan PCR (plasmid primer). M = ukuran DNA marker ; 1 = kontrol positif ; 2 = kontrol negatif ; 3,7,8,dan 10 = pasien yang positif Chlamydia trachomatis

Dalam penelitian ini usia pasien berkisar antara 17-62 tahun dan semua pasien positif klamidia adalah pembantu rumah tangga. Distribusi usia pasien dapat dilihat pada Tabel 1 dan tingkat pendidikan pada Tabel 2. Semua kasus positif menikah dan mereka tidak pernah menggunakan kondom. Lima (36%) diantaranya menggunakan IUD, 3 (21%) menggunakan kontrasepsi oral, untuk 2 pasien menggunakan tubektomi dan 4 (29%) tidak menggunakan kontrasepsi.

Tabel 1 : frekuensi Chlamydia trachomatis pada wanita cervicitis berdasarkan usia

Tabel 2 : frekuensi Chlamydia trachomatis pada wanita cervicitis berdasarkan tingkat pendidikan

Sebelas dari 14 (79%) pasien positif Chlamydia trachomatis memiliki riwayat infeksi kelamin, 5 pasien (36%) mempunyai riwayat aborsi, dan 8 pasien (57%) pernah melakukan

operasi kelamin di masa lalu. Gejala klinis dari ditunjukkan pada Tabel 3.

Chlamydia trachomatis pasien positif

Tabel 3 : frekuensi gejala wanita cervicitis

DISKUSI Mengumpulkan sampel untuk diagnosa Chlamydia trachomatis sering disebabkan rasa tidak nyaman dan kadang-kadang memalukan bagi pasien wanita. Urin biasanya sampel yang lebih baik dibandingkan dengan swab. Mengumpulkan sampel urin lebih baik bagi pasien. Lebih mudah untuk mendapatkan sampel urin yang tepat dan tidak memerlukan personil medis untuk melakukan pemeriksaan spekulum vagina. Dapat dikatakan bahwa

menghilangkan pemeriksaan di klinik dapat menyebabkan penyakit lain, seperti kutil kelamin. Kebiasaan yang sebelumnya dianggap sebagai standar emas, namun studi PCR menunjukkan bahwa sensitivitas kebudayaan bahkan dalam ahli adalah rendah berkisar antara 75% sampai 85%. Hal ini diterima secara universal yang tidak bisa lagi berfungsi sebagai referensi metode dalam evaluasi tes diagnosa untuk Chlamydia trachomatis. Keuntungan lain sampel urin diuji dengan amplifikasi uji adalah bahwa penyatuan sampel tidak akan kompromi sensitivitas tetapi mengurangi biaya. Beberapa studi telah menunjukkan bahwa menggunakan metode DNA amplifikasi pada sampel urin untuk deteksi klamidia adalah biaya efektif. Jorma Paavonen et al., menganjurkan penggunaan tes PCR untuk urin. PCR mungkin adalah tes yang paling sensitif terhadap Chlamydia trachomatis nonculture yang tersedia saat ini.. Penggunaan metode amplifikasi asam nukleat seperti PCR telah meningkatkan kemampuan peneliti untuk mendiagnosa infeksi kelamin Chlamydia trachomatis. Metode ini

juga memungkinkan untuk penggunaan noninvasif spesimen untuk pengujian yang lebih diterima oleh pasien. PCR-baru ini telah dilaporkan sebagai metode untuk mendeteksi protein luar utama (MOMP) gen dari 15 serovarian Chlamydia trachomatis. Analisis urutan gen MOMP menunjukkan bahwa gen memiliki domain baik konstan dan variabel. Semua serovarian dari Chlamydia trachomatis MOMPs memiliki beberapa daerah yang sangat baik dengan nukleotida yang berurutan, yang digunakan untuk pemilihan primer. Uji ini memberikan hasil positif yang benar dari kultur sel. Oleh karena itu, alternatif yang baik untuk budaya dan seharusnya mudah diterima untuk penggunaan. Yang paling menarik dari aspek metode DNA amplifikasi adalah kepekaan yang sangat baik dan kinerja yang baik dengan sampel urin. Untuk mencegah hilangnya sensitivitas uji PCR, semua sampel menjadi sasaran ekstraksi standar fenol-kloroform dan presipitasi etanol. Ekstraksi DNA sebagian besar sukses dan sampel sebagian besar bebas dari inhibitor potensial. Frekuensi infeksi serviks Chlamydia trachomatis tertinggi ditemukan pada wanita dengan usia antara 28-38 tahun (Tabel 1), tingkat kelompok pendidikan dasar (Tabel 2), dan pengguna IUD untuk kontrasepsi. Peneliti menemukan tanda umum pada pasien adalah mukopurulen (Tabel 3). Perempuan terinfeksi seksualnya pada usia aktif dan apabila tidak diobati mungkin wanita tersebut beresiko penyakitnya berkembang. Hasil penelitian ini menunjukkan menggunakan kondom memiliki efek protektif terhadap infeksi Chlamydia trachomatis dan menggunakan IUD meningkatkan resiko klamidia cervicitis. Ada beberapa studi yang menentukan frekuensi Chlamydia trachomatis pada wanita dengan cervicitis. Sebuah penelitian di Papua Nugini ditentukan prevalensi 17% dengan menggunakan PCR dan tes imunofluoresensi langsung tes. Di Australia, prevalensi berkisar antara 2,5%-14%, dengan tingkat tertinggi di antara pasien yang mengunjungi klinik penyakit menular seksual. Studi lain di Senegal bahwa prevalensi dari Chlamydia trachomatis pada pekerja seks di Dakar komersial adalah 29%. Meskipun lebih tinggi dari hasil kita (15%), perilaku resiko tinggi bahwa populasi studi dapat menjelaskan seperti Prevalensi tinggi pada infeksi kelamin Chlamydia trachomatis. Ada beberapa studi di Iran. Darugar et al. Chlamydia trachomatis terisolasi di leher rahim wanita yang terinfeksi sebesar 6,9% pada tahun 1978. Studi lain menentukan prevalensi Chlamydia trachomatis di Teheran sebesar 22% dan di Bandar Abbas 10%. Juga studi lain menunjukkan prevalensi Chlamydia trachomatis pada wanita yang terinfeksi di Shiraz sebesar 6,5% pada kultur sel dan teknik

microimmunoflorsence. Frekuensi dilaporkan dalam penelitian kami adalah tinggi, terutama untuk populasi yang dianggap beresiko rendah. Kenyamanan menggunakan sampel urin untuk
7

pengujian pasien wanita merupakan langkah besar dalam deteksi dan kontrol STD ini. Skrinning urin penting dilakukan karena merupakan metode non-invasif untuk deteksi Chlamydia trachomatis. Singkatnya, metode amplifikasi asam nukleat, seperti PCR, secara signifikan lebih sensitif dan karena itu harus digunakan dalam preferensi untuk tes lain untuk mendeteksi infeksi kelamin Chlamydia trachomatis. JURNAL 2 Mycobacterium Kansasii: Kerentanan Antibiotik Dan Pcr-Restriksi Analisis Isolat Klinis

Mycobacterium kansasii adalah penyebab paling umum kedua penyakit non-TB mikobakteri di Sao Paulo, Brasil. Salah satu komponen penting dari pengelolaan infeksi yang disebabkan oleh organisme ini adalah uji kerentanan antibiotik. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menentukan kerentanan profil obat dan genotipe isolat klinis M. kansasii diperoleh dari pasien dengan atau tanpa infeksi yang memenuhi kriteria kasus definisi American Thoracic Society penyakit M. Kansasii. Seratus enam puluh sembilan isolat klinis M. kansasii dikumpulkan antara 1993 dan 1998 di Sao Paulo, Brasil, diuji secara berurutan. Isolat genotyped dengan PCR pembatasan-enzim pola analisis (PRA). Sebagian besar strain kansasii M. rentan terhadap isoniazid, streptomisin, rifabutin, rifampisin, klaritromisin, etionamid, amikasin, dan klofazimin cycloserine, dan tahan terhadap etambutol, siprofloksasin dan doksisiklin. Dari 169 isolat, 167 milik genotipe tipe I PRA dan masingmasing milik ketik genotipe II dan III. Ada korelasi antara subtipe PRA dan M. penyakit kansasii menurut American Thoracic Masyarakat kasus definisi. Uji klinis mungkin diperlukan untuk lebih berkorelasi nilai MIC dengan pengobatan hasil untuk mengidentifikasi parameter yang sesuai untuk obat-perlawanan pengujian M. kansasii. Mycobacterium kansasii menyebabkan kedua paru-paru terinfeksi (Bolivar et al, 1980;Wolinsky,1979;Woods&Washington,1987). Selain kronis penyakit TB merupakan presentasi klinis yang paling sering terjadi, M. kansasii dapat menyebabkan limfadenitis leher rahim, dermatitis, osteomielitis dan arthritis. Infeksi diseminata terjadi paling sering pada immunocompromised pasien (Sherer et al, 1986;. Valainis et al, 1991.). Sebelum human immunodeficiency virus (HIV) epidemi, M. kansasii paru adalah penyakit sering dilaporkan dari Amerika Serikat dan Eropa Barat, terutama dari pasien dengan paru-paru yang sudah ada patologi sebelumnya(Schraufnagel et al., 1986). Pada periode awal epidemi AIDS dan sebelum munculnya anti retroviral terapi (ART), M. kansasii peringkat kedua di belakang Mycobacterium avium kompleks dinyatakan sebagai nontuberkulosis mikobakteri (NTM)
8

spesies yang diisolasi dari AIDS terkait infeksi oportunistik NTM (Valainis et al, 1991.). Penelitian terbaru menunjukkan meningkatnya insiden infeksi M. kansasii di kedua HIVpositif (Shafer&Sierra, 1992; Witzig et al, 1995) dan pasien HIV-negatif. (Bittner et al., 1996). Saat ini, di banyak daerah di dunia, M. kansasii adalah NTM yang paling sering terisolasi (Bloch et al. 1998; Chobot et al, 1997;. Taillard et al, 2003).. Salah satu fitur rumit infeksi M. kansasii dalam penilaian signifikansi klinis infeksi. Itu masalah kontaminasi spesimen klinis dengan lingkungan strain yang dikenal dengan baik, dan telah menyebabkan beberapa penulis untuk mengembangkan satu set ketat kriteria untuk M. kansasii infeksi (Ahn et al, 1982.). Pendekatan lain untuk menilai signifikansi klinis M. infeksi kansasii disarankan oleh Alcaide dkk. (1997, 1999) melibatkan genotip M. kansasii oleh restrictionfragment PCR analisis gen hsp65 (PRA).

METODE Isolat. Semua 169 isolat klinis M. kansasii dikembangkan di laboratorium Instituto Adolfo Lutz (IAL) di Sao Paulo, Brasil, 1993-1998 dianalisis. Isolat dibiakkan dari sputa (141 sampel), abses dari situs yang tidak dikenal(8 sampel), pencucian bronkial(5 sampel), urin(3 sampel), biopsi kulit(2 sampel), pencucian lambung(2 sampel), darah(2 sampel), tulang sumsum(2 sampel), cairan serebrospinal(1 sampel), cairan perikardial(1 sampel) dan cairan sinovial(2 sampel). Kedua isolat tersebut telah diidentifikasi sebagai M. Oleh tes standar biokimia di IAL. M. kansasii galur ATCC 12478 digunakan sebagai referensi untuk pengujian strain MIC. Isolat klinis diperoleh dari 106 pasien, di antaranya 26 (24%) memenuhi American Thoracic Society (1997) dengan definisi kriteria untuk penyakit M. kansasii yaitu, mereka memiliki setidaknya tiga isolat pulih dari tidak steril situs atau satu isolat dari sisi steril diidentifikasi sebagai M. kansasii. Pasien yang memiliki kurang dari tiga isolat dari nonsteril situs didefinisikan sebagai kasus yang dicurigai. Di antara 26 pasien yang memenuhi kriteria ATS definisi kasus, 19 (73%) adalah HIV positif, salah satu (4%) adalah HIV-negatif dan enam (23%) tidak mempunyai informasi mengenai status HIV. Kedua isolat tersebut telah dikirim ke referensi laboratorium tanpa informasi klinis. Kebanyakan dari mereka adalah pertama mengisolasi dari pasien, tetapi beberapa pasien memiliki lebih dari satu mengisolasi dianalisis. Untuk analisis PRA, hanya satu isolat (yang pertama mengisolasi) dari setiap pasien diteliti (n = 106). Determinasi MIC. MIC penentuan dilakukan pada 96-baik microtitre piring dengan U-berbentuk sumur. Semua sumur diisi dengan 0,1 ml Middlebrook 7H9 menengah ditambah dengan albumin dextrosecatalase (ADC) pengayaan (Difco) (Telles & Yates, 1994; Wallace
9

et al, 1996;. Witzig & Franzblau, 1993). Para agen antimikroba dan konsentrasi yang diuji adalah sebagai berikut: streptomisin (SPT), isoniazid (INH), etambutol (EMB), rifampisin (RIF), Rifabutin (RFB), Amikasin (AMK), Ciprofloxacin (CIP), Clofazimine (CLO), Klaritromisin(CLR), Etionamid (ETH), Cycloserine (CS), Doksisiklin (DOX). Semua agen antimikroba disimpan sebagai larutan stok 1% dalam air suling kecuali RIF, yang dilarutkan dalam metanol, dan RFB, CLR dan ETH, yang dilarutkan dalam dimetil sulfoksida. Obat-obatan disimpan pada 200C. Solusi saham dari obat diencerkan dalam Middlebrook 7H9 menengah (Difco) dan 0,1 ml masing-masing obat ditambahkan ke masingmasing dari 12 kolom. Dua kali lipat pengenceran adalah kemudian dibuat di setiap baris dengan multi-channel pipet dengan transfer dari 0,1 ml. Baris terakhir (H) termasuk menengah saja, sebagai drugfree mengontrol pertumbuhan bakteri. Pertumbuhan kultur dipindahkan dengan 10L loop dari sebuah Lo wenstein- Jensen miring menjadi 2 menengah Middlebrook 7H9 ml dan diinkubasi pada 36 8C selama 7 hari. Ini suspensi kemudian diencerkan 1: 10 dengan segar media dan 5 l suspensi? diinokulasikan ke dalam sumur masing-masing. Pelat kemudian ditutup dengan cover plastik dan diinkubasi pada 36 8C selama 7-14 hari. MIC didefinisikan sebagai konsentrasi terendah dari obat yang menghambat semua pertumbuhan bakteri. Preparasi DNA untuk PCR. Sebuah loopful koloni bakteri dibuat pada medium kultur lowenstein-Jensen dan resuspended dalam 500 L air suling. Sampel kemudian direbus selama 10 menit, dibekukan semalam dan sekitar 5L dari supernatan digunakan untuk PCR amplifikasi. PRA identifikasi. DNA mikobakteri telah ditambahkan ke 45 L PCR campuran dengan primer Tb11 dan Tb12 dengan prosedur yang diuraikan oleh Telenti dkk.(1993). Produk amplifikasi menjadi sasaran BstEII dan HaeIII enzim pencernaan, dan fragmen dipisahkan oleh elektroforesis pada Gibco 3% gel agarosa (Life Technologies). Gel difoto pada Transilluminator UV dan pola pembatasan dievaluasi dengan bantuan sebuah algoritma

HASIL DAN PEMBAHASAN Sebelumnya, telah dilakukan tes standar cepat dan murah untuk menentukan MIC obat antimikroba untuk spesies Mycobacterium (Telles & Yates, 1994; Wallace et al, 1996;. Witzig & Franzblau, 1993). Kami menerapkan prosedur ini untuk menguji M. kansasii. Tabel 1 menunjukkan rentang MIC, MIC di mana 90% dari isolat menghambat (MIC90), MIC50 dan profil kerentanan terhadap 12 agen antimikroba untuk 103 isolat dari 80 pasien yang dicurigai dan 66 isolat dari 26 pasien yang memenuhi definisi kasus ATS bakteriologis
10

kriteria untuk penyakit kansasii M.. Rentang KHM dari 12 obat bervariasi. Para MIC yang dihasilkan dikategorikan ke konsentrasi rentan dan tahan (Wallace et al. 1996; Witzig & Franzblau, 1993). Sebagian besar isolat M. kansasii rentan terhadap CLR (99% dari strain), AMK (97%), ETH (95%), RFB (93%), INH (92%), RIF (88%), SPT (86%) dan CLO (57%). Sebagian besar isolat menunjukkan resistensi terhadap DOX (99%), EMB (94%), CS (86%) dan CIP (66%). Ketika analisis dilakukan dengan mengisolasi satu sumber per pasien (n=106), kerentanan keseluruhan pola tetap sama. Suatu perbandingan dari frompatients isolat yang melakukan (n = 26) dan tidak (n = 80) memenuhi kriteria definisi kasus ATS untuk penyakit menunjukkan bahwa MIC90 untuk ETH mendekati signifikansi seperti yang lebih tinggi untuk isolat dari tersangka pasien (14% tahan) dibandingkan kelompok lainnya (3%), sedangkan untuk 11 obat lain ada perbedaan yang signifikan adalah ditemukan. Pada awal tahun 1980 di negara bagian Sao Paulo, Brasil, M. kansasii adalah NTM yang paling sering diisolasi terkait dengan pulmon- ary penyakit (Silva et al., 1987). Dalam studi lain yang lebih baru dilakukan dengan isolat dari seluruh wilayah negara (Ferrazoli et al., 1992), 60 (21%) dari 289 isolat NTM disebut IAL 1985-1990 diidentifikasi sebagai M. kansasii. Namun, hanya 12 pasien dikonfirmasi M. memiliki penyakit kansasii.

Tabel 1. In vitro kerentanan M. kansasii isolat dari 26 kasus yang memenuhi definisi kriteria kasus ATS (ATS) dan 80 tersangka (Sus) pasien

11

Frekuensi isolasi kansasii M. dari spesimen klinis menurut wilayah sangat bervariasi. Di Pennsylvania, 1,6% dari semua Spesies Mycobacterium terisolasi adalah M. kansasii, sedangkan di Cincinnati, M. kansasii menyumbang 6,3% spesies terisolasi (Nachamkin et al., 1992). Sebuah studi berdasarkan populasi M. kansasii infeksi di San Francisco antara tahun 1992 dan 1996 menemukan kejadian kumulatif dari 2,4 kasus per 100 000 Orang dewasa terinfeksi HIV, yang hampir lima kali lebih tinggi dari tingkat nasional isolasi pada tahun 1980; kejadian kumulatif kalangan non-orang dewasa terinfeksi HIV (0,75 per 100 000) tetap sama dengan tingkat dari California pada tahun 1980 (0,58 per 100 000) (Bloch et al., 1998). M. kansasii tampaknya memiliki isolasi stabil tingkat di Inggris, meskipun ini adalah yang paling umum penyebab pulmonaryNTM infection di non-HIV populasi (Evans et al., 1996). Antara 1968 dan 1995, M. kansasii infeksi paru terus meningkat di non- Terinfeksi HIV penduduk di utara Moravia dan Silesia (Chobot et al., 1997). Sebuah gambar yang sama telah diamati di Sao Paulo, Brasil (Ferrazoli et al., 1992). Isolat dari Inggris dan Sao Paulo diuji dengan metode MIC yang sama, dan maka untuk alasan frekuensi resistensi yang tinggi terhadap EMB di antara isolat Sao Paulo tidak jelas. Selama periode yang sama, laboratorium referensi diuji ratusan M. tuberculosis isolat klinis dengan metode yang sama dan menemukan frekuensi EMB-resistansi rendah. Ini EMB-tahan M. kansasii isolat dapat mewakili strain klonal dominan di negara bagian. Sebuah penelitian sebelumnya (Sato et al., 1993) dari 30 isolat klinis dari negara juga menunjukkan EMB tinggi resistensi (90% resisten pada konsentrasi 8 dan 16 G ml 1). Menurut American Thoracic Society (1997), perbedaan geografis yang diamati dalam M. Kansasii kerentanan obat pola. Dalam sebuah penelitian terhadap paru M. kansasii infeksi, Evans dkk. (1996) melaporkan bahwa dari 47 isolat, semuanya sensitif terhadap RIF dan EMB. Studi lain, dalam London, mempelajari 10 isolat klinis; semuanya sensitif terhadap EMB dan tahan terhadap INH, sembilan sensitif terhadap RIF, dan enam isolat diuji untuk CIP, semua sepenuhnya atau sebagian sensitif (Rooney dkk, 1996.). Di Brazil, karena fakta bahwa tes asam-cepat BTA positif adalah dianggap mewakili TBC, dan dahak tidak sering dikirim untuk kultur pada awal pengobatan, dapat terjadi keterlambatan dalam mendiagnosis penyakit M. kansasii. Hanya ketika ada ini kegagalan pengobatan, kultur dahak dilakukan dan akhirnya spesies identifikasi dilakukan. Dengan demikian, paling dari isolat yang tidak memenuhi definisi kasus ATS kriteria mungkin mewakili strain lingkungan yang sebelumnya tidak terkena narkoba. Dengan tidak adanya informasi klinis yang baik yang menyertai M. kansasii isolat, kami menggunakan PRAmethod untuk genotipe M. kansasii isolat untuk melihat apakah genotipe diusulkan untuk menjadi terkait dengan penyakit klinis oleh peneliti lainnya hadir
12

dalam koleksi kami. Mengetik ketegangan analisis molekuler telah menunjukkan bahwa M. kansasii terdiri dari heterogen kelompok termasuk subtipe yang berbeda beberapa (Alcaide et al, 1997a;. Picardeau et al, 1997;. Ross et al, 1992;. Zhang et al, 2004.). Di seluruh dunia, M. kansasii genotipe saya, seperti yang didefinisikan oleh PRA, tampaknya sangat klonal dan adalah yang paling umum genotipe yang terkait dengan penyakit manusia (Zhang et al., 2004). Namun, HIVinfected pasien tampaknya sangat rentan terhadap infeksi dengan subtipe M. kansasii II (Taillard et al., 2003). Menurut Taillard dkk. (2003) dan Alcaide dkk. (1997a), identifikasi M. kansasii di tingkat subtipe mungkin tidak hanya suatu alat epidemiologi menarik tetapi juga relevan kepada manajemen klinis, karena memungkinkan diferensiasi berpotensi patogen subtipe dari patogen non-subtipe. Dalam penelitian kami, dari 106 isolat tipe genotipe PRA, 104 genotipe I dan yang lainnya tipe II dan III (masing-masing). ke-26 pasien yang memenuhi kriteria penyakit ATS terinfeksi genotipe strain I. Para tipe II dan III jenis isolat yang ditemukan dalam kasus dugaan yang hanya satu isolat M. kansasii. Tipe I strain diisolasi dari dua pasien yang terinfeksi HIV dan non-pasien terinfeksi HIV yang memenuhi definisi kriteria kasus ATS. Dengan demikian karakterisasi, genotipe M. Kansasii isolat di Sao Paulo tidak berkorelasi dengan baik dengan penyakit klinis. Sebagai kesimpulan, berbagai MIC diwakili oleh isolat klinis M. kansasii dalam penelitian kami menunjukkan bahwa sulit untuk mengkorelasikan kerentanan ketegangan terhadap hasil pengobatan, terutama karena banyak pasien dari M. Kansasii yang diisolasi tidak memenuhi definisi kriteria penyakit ATS. Studi selanjutnya diperlukan untuk menyediakan rekomendasi untuk metode yang tepat dan standar untuk menentukan profil resistensi isolat M. kansasii klinis, terutama yang terisolasi dari penyakit.

13

JURNAL 3 Pendekatan Baru Berbasis PCR Untuk Amplifikasi Spesifik Dna Dari Spesies Schistoma Yang Diaplikasikan Pada Sampel Urin Manusia

Metode untuk mendiagnosis schistosomiasis pada manusia yang tersedia untuk saat ini tidak memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang cukup. Baru-baru ini beberapa peneliti telah mengembangkan metode diagnostik yang lebih spesifik dan sensitif, terutama didasarkan pada teknik Polimerase Chain Reaction (PCR). Namun demikian, ini telah diterapkan hanya untuk diagnosis 1 dari 4 spesies Schistosoma yang mempengaruhi manusia (S. mansoni). Selain itu, penerapan PCR tertentu telah secara eksklusif digunakan untuk sampel darah atau feses pasien. Di sini, kita mengembangkan, pendekatan PCR baru dengan sensitifitas yang tinggi yang memungkinkan amplifikasi spesifik dari genus dan spesies dari 4 spesies utama Schistosoma menyebabkan penyakit pada manusia ditambah S. bovis. Selanjutnya kami berhasil menerapkan teknik ini untuk mendeteksi DNA parasit pada sampel urin dari pasien dengan schistosomiasis. Dengan sampel ini, kami telah menemukan sensitivitas 94-4% dan spesifisitas 99-9% ketika diterapkan pada genus spesifik (Schistosoma spp.) pasangan primer, dan 100% sensitivitas dan 98-9% spesifisitas dalam suatu spesies spesifik (S. mansoni) dengan menggunakan PCR. Schistomiasis pada manusia adalah masalah kesehatan yang signifikan pada pada daerah endemik, khususnya Afrika. Selain itu, juga terlihat peningkatan jumlah pasien Schistomiasis telah terdeteksi pada daerah bebas Schistoma, karena adanya pendatang yang berpariwisata di daerah non-endemik. Dan baru-baru ini imigran dari negara-negara endemik mencapai eropa. Diagnosis Schistomiasis berdasarkan uji dengan menggunakan sampel urin dan feses untuk deteksi telur parasit. Kadang, serologi spesifik atau eosinofilia tinggi juga mendukung diagnosis. Namun, sensitivitas diagosis masih rendah, dengan demikian sampel positif salah didiagnosa. Selain itu, koleksi sampel diagnostik seperti tinja dan darah bisa sulit dalam beberapa kelompok populasi, yang dapat menghambat prosedur diagnostik. Selama beberapa tahun terakhir, beberapa peneliti mencoba untuk mengatur peralatan diagnostik baru dengan spesifisitas dan selektifitas yang lebih tinggi berdasarkan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk mendeteksi Schistomiasis. Khususnya, urutan basa
14

S. mansoni terdiri dari 121 pasang basa yang digunakan sebagai desain primer spesifik, dimana telah diaplikasikan pada amplifikasi dari urutan serum pasien. Urutan dari Schistomiasis yang lain telah digambarkan dan digunakan untuk desain reaksi PCR, meskipun belum diaplikasikan pada sampel manusia. Di sini, telah dibentuk pendekatan PCR berdasarkan amplifikasi spesifik dari suatu genus yang spesifik dari ribosom DNA 28S Schistoma spp. dan beberapa amplifikasi spesies spesifik untuk 4 spesies utama Schistoma yang mempengaruhi manusia dan S. bovis. Telah diaplikasikan juga untuk peralatan baru PCR untuk sampel urin dari pasien Schistomiasis dan penyakit helmintik serta protozoa untuk mengevaluasi kinerja baru dari sampel klinis. Model Experimen dan Parasit Trichinella spiralis, Strongyloides venezuelensis dan Schistosoma bovis dikumpulkan dari model experimental yang sudah ada. Fasciola hepatica dan cacing dewasa Ascaris lumbricoides dikumpulkan dari sapi dan babi yang terinfeksi secara alami, dalam sebuah rumah jagal lokal. DNA Genom DNA dari S. bovis, F. hepatica, T. spiralis dan cacing S. venezuelensis, dan dari sampel darah Homo sapiens, diekstraksi dengan Jaringan NucleoSpin kit. DNA S. mansoni, Trypanosoma cruzi, Giardia lamblia, Entamoeba histolytica dan E. multilocularis, Leishmania panamensis dan Plasmodium falciparum adalah hadiah dari Drs GV Hillyer. Semua sampel DNA diencerkan dengan air destilasi 1 mg / ml dan disimpan pada XC x20 sampai digunakan. Diagnostik sampel Delapan belas sampel urin manusia yang terinfeksi Schistosoma dikumpulkan dalam Rumah Sakit Insular, Gran Canaria, dan Rumah Sakit Carlos III, Madrid, Spanyol. Ini dipilih dari pasien yang eosinofilia dan dikonfirmasi dengan diagnosis schistosomiasis yaitu S. mansoni (n = 6), S. haematobium (n = 10) dan S campuran. Infeksi Mansoni / S. haematobium (n = 2), melalui deteksi telur parasit dalam tinja atau urin (lihat Tabel 2). Dua puluh dua sampel urin dari pasien dengan selain Schistosoma yaitu 7 filariae, 7 cacing uncinaria, 2 Strongyloides stercoralis, 4 Trichuris trichura, 1 Enterobiusvermicularis and1 Taeniasolium, 7 dengan parasit protozoa, 2 Plasmodium spp, 1. Trichomonas vaginalis, 3 Giardia lamblia dan 1 Blastocystis hominis dan 35 dari donor sehat dari schistosomiasis daerah endemik (subSahara) dikumpulkan dalam Insular Rumah Sakit, Gran Canaria, Spanyol. Lima belas sampel dari donor sehat dari daerah non-endemik dikumpulkan di laboratorium kami (Lihat Tabel 2). Ekstraksi DNA dari urin manusia (masing-masing 3 ml) dilakukan dengan menggunakan
15

NucleoSpin Jejak kit (machery Nagel, Jerman), menggunakan produsen yang ada pada instruksi.

Desain primer dan PCR Urutan 28S rDNA dan-ITS dari Schistosoma spp. (S. mansoni, AY157173, S. japonicum, Z46504; S. intercalatum, AJ223840; S. bovis, AY157266 dan S. haematobium, AJ223838) dan parasit lainnya (Fasciola hepatica, AY222244; Strongyloides stercoralis, U39489 dan Ascaris lumbricoides, U94751) tersedia di GenBank dibandingkan menggunakan fasilitas MultAlin di http://www.expasy.ch. Dari urutan konsensus yang sesuai, beberapa daerah dipilih untuk desain primer lebih lanjut. Daerah yang dipilih menjadi sasaran kesamaan pencarian melalui program BLAST untuk memeriksa urutan yang mungkin cocok dengan organisme lain. Reaksi PCR dilakukan dalam volume akhir 20 l dengan 2 l dari 10 x reaksi buffer, 3 mM MgCl2 2-5 unit Taq polimerase (Bioline, Jerman), 2 M untuk tiap primer (TIBMOLBIOL, Jerman), 0,5mM dNTP (Roche) dan 1 ml DNA template, baik dari ekstrak parasit 'atau dari ekstraksi sampel urin manusia. PCR dilakukan pada 35 siklus, masing-masing terdiri dari 940C selama 20 detik, 65 atau 610C selama 20 detik (Lihat Tabel 1) dan 72 0C selama 30 detik. Produk PCR setelah dielektroforesis bersamaan dengan penanda berat molekul (XVI, Roche) dalam 1% agarosa dalam gel Tris-borat EDTA dengan 0-5 g / ml etidium bromida, dan divisualisasikan dalam UV transilluminator. Sensitivitas dan spesifisitas PCR Sensitivitas diukur untuk masing-masing pasangan primer menggunakan dua kali pengenceran g/ l DNA dari S. mansoni, S. japonicum, S. haematobium dan S. intercalatum (untuk masing-masing-masing pasangan primer CF1/CR2, CF2/CR2 dan SMF / SMR; CF1/SjR; SHF / SHR, dan SibF / SibR) dalam reaksi PCR dilakukan seperti yang disebutkan di atas

16

Potensi reaksi penghambatan atau kehilangan DNA selama prosedur ekstraksi urin manusia dinilai sebagai berikut: 3 mg S. mansoni DNA ditambahkan 3 ml urin dari donor yang sehat baik sebelum atau setelah Ekstraksi DNA. Selanjutnya, khusus amplifikasi dengan CF1/CR2 dilakukan dengan pengenceran dari (i) DNA parasit saja, (ii) ekstrak parasit DNA dalam urin dan (iii) parasit DNA ditambahkan pada ekstrak urin. Spesifisitas PCR diuji dengan cara yang sama. Pertama, amplifikasi PCR dilakukan dengan 1 mg S. mansoni, S. intercalatum, S. bovis, S. haematobium, S. japonicum, Fasciola hepatica, Echinococcus multilocularis, Strongyloides venezuelensis, Ascaris lumbricoides, Toxocara canis,

Trichinella spiralis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Trypanosoma cruzi, Leishmania panamensis, Plasmodium falciparum atau DNA Homo sapiens dengan pasangan primernya masing-masing. Kedua, uji spesifisitas diuji dengan 79 urin sampel manusia (Tabel 2) dengan pasangan primer CF1 / CR2, CF2/CR2 dan SMF / SMR menggunakan kondisi PCR yang telah disebutkan di atas.

17

Limit Deteksi PCR Sensitivitas PCR diukur pada DNA S. mansoni dengan pasangan primer CF2/CR2 dan SMF / SMR ditunjukkan pada 1-9 pg (Gambar 1). Batas deteksi yang lebih rendah memperkuat DNA S. mansoni dengan pasangan primer CF1/CR2 (0-98 pg; Gambar. 1). Batas deteksi reaksi PCR pada DNA S. haematobium, S. japonicum dan S. intercalatum atau S. bovis dengan pasangan primer SHF / SHR, SJF / SjR dan SibF / SibR, masing-masing adalah 3-7, 15 dan 3-7 pg, (Gambar 1). PCR dapat kehilangan sensitivitasnya ketika dilakukan pada sampel urin manusia, baik karena kehilangan DNA selama prosedur ekstraksi atau komponen penghambatan hadir dalam urin juga diuji (lihat Bahan dan Metode). Fenomena penghambatan ini menurunkan batas deteksi dari 0-98 ke 3-7 pg DNA parasit.Bersamaan dengan kehilangan DNA selama prosedur ekstraksi, sensitivitas PCR dalam 30 pg DNA parasit untuk sampel urin manusia (data tidak ditunjukkan).

18

Sensitifitas PCR Dalam sampel urin manusia, primer CF1/CR2 menunjukkan sensitivitas 94-4% pada sampel yang dipilih (Tabel 2). Primer CF2/CR2 memberikan sensitivitas yang lebih rendah (72-2%; Tabel 2). Primer SMF / SMR spesifik ditampilkan untuk menjadi yang paling sensitif (100%; Tabel 2). Ketika SHF dan SHR primer digunakan dalam sampel manusia, sensitivitasnya jauh lebih rendah dari yang diharapkan (40%, data tidak ditampilkan). Spesifisitas PCR Pasangan primer yang dirancang khusus untuk mengenali DNA S. mansoni, S. haematobium atau S. japonicum menunjukkan spesifisitas 100% pada DNA masing-masing, dan yang khusus dirancang pada urutan S. intercalatum dan S. bovis rDNA mengakibatkan amplifikasi DNA S. haematobium juga, dan dengan demikian pasangan primer terakhir ini tidak digunakan untuk sampel manusia (Gbr. 2). Tidak ada produk amplifikasi terdeteksi dengan pasangan primer yang disebutkan di atas ketika ditambahkan DNA parasit dan host sebagai template untuk reaksi PCR yang digunakan dalam penelitian kami, dengan pengecualian dari pita lemah, meskipun berat molekul berbeda dari amplikon tertentu, ketika DNA dari Trichinella spiralis digunakan sebagai template dengan SMF / SMR primer (Gambar 2). Demikian pula, CF1/CR2 dan CF2/CR2 pasangan primer berhubungan dengan produk PCR hanya ketika Schistosoma spp. DNA digunakan sebagai template untuk reaksi PCR (gambar 2). Pada sampel manusia, spesifisitas bervariasi tergantung pada pasangan primer yang digunakan untuk amplifikasi. Dengan demikian, genus spesifik CF1/CR2 (Gambar 3) dan pasangan primer CF2/CR2 menunjukkan masing-masing 99-9% dan spesifisitas 100%. Amplifikasi primer dengan SMF / SMR terbukti spesifisitasnya 98-9 %, untuk mendeteksi positif palsu tunggal dari S. haematobium pada sampel pasien (Tabel 2). Dengan salah satu pasangan primer yang disebutkan di atas, amplifikasi tidak terdeteksi pada sampel dari donor sehat (Tabel 2). Akhirnya, primer SHF / SHR tidak diuji tentang spesifisitasnya dalam sampel manusia karena sensitivitasnya rendah pada sampel ini.

PEMBAHASAN Schistosomiasis adalah penyakit kronis dan diperkirakan telah membunuh 200.000 orang sub-Sahara Afrika setiap tahunnya. Selain itu, kasus schistosomiasis telah terdeteksi meningkat di daerah non-endemik, terutama disebabkan oleh gelombang terakhir imigran yang mencapai Eropa dari negara endemik tersebut.

19

Tes yang paling umum untuk diagnosis schistosomiasis masih diperiksa secara mikroskopis dari tinja atau urin. Namun, mikroskop memiliki sensitivitas yang terbatas, terutama bila parasitemia rendah. Selama dekade terakhir, metode diagnostik untuk schistosomiasis berdasarkan pada deteksi antigen spesifik atau antibodi yang telah dikembangkan, tetapi kurangnya kepekaan dan spesifisitas tetap menjadi masalah. Dengan demikian, sejumlah besar pasien schistosomiasis dapat salah didiagnosa. Selain itu, positif palsu dikarenakan reaktivitas silang dari alat serologi yang merupakan frekuensi relatif. Akibatnya, diperlukan adanya pengembangan alat baru yang spesifik mendiagnosis dengan lebih sensitif dengan aplikasi potensial dalam diagnosis rutin schistosomiasis. Di sini, kita diminta untuk mengembangkan PCR yang lebih baru serta sensitif dan spesifik berbasis pendekatan untuk amplifikasi daerah didefinisikan dari 28S atau ITS ribosomal DNA dari 5 spesies Schistosoma. Pertama, kita bisa menemukan 2 pasangan primer yang memperkuat 2 genus spesifik 28S rDNA dari daerah schistosomes dari 877 dan 1032 bp. PCR dengan pasangan primer yang sama tidak terdeteksi sebagai produk amplifikasi ketika DNA dari 11 parasit, berbeda dari Schistosoma spp. dan sering ditemukan di daerah endemik yang sama dan digunakan sebagai template. Amplifikasi dengan kedua pasangan primer mencapai sensitivitas tinggi (0,98-1,9 pg). Sampai saat ini, ini merupakan alat PCR pertama untuk deteksi spesifik S. mansoni, S. haematobium, S. intercalatum, S. japonicum dan S. bovis DNA, yang mungkin memfasilitasi amplifikasi genus spesifik dari semua spesies Schistosoma lainnya. Kedua, kami merancang primer spesifik untuk amplifikasi yang berbeda dari setiap spesies Schistosoma yang telah disebutkan. Jadi, kita secara khusus dapat mendeteksi sebagai amplikon PCR tunggal S. mansoni, S. haematobium dan S. japonicum DNA, dengan sensitivitas berkisar antara 1-9 sampai 15 pg. Hasil yang diperoleh mirip dengan Pontes dkk. (2002) untuk PCR S. mansoni tertentu, meskipun dengan sensitivitas lebih tinggi (1 fg) yang dianggap target PCR yaitu sebuah urutan berulang dalam genom parasit. Namun demikian, spesifisitasnya diuji hanya dengan 4 DNA parasit lain dan amplifikasinya tidak ada. Selain itu, kami bisa mendeteksi produk PCR yang umum untuk S. intercalatum, S. bovis dan S. haematobium dengan primer yang dirancang pada urutan S. intercalatum / S. bovis rDNA. Jadi, diferensiasi antara infeksi S. intercalatum dan S. haematobium bisa dilakukan dengan menggabungkan kespesifikan sepasang primer S. haematobium dan S. intercalatum pada kondisi percobaan kami, karena masing-masing produk PCR berbeda dalam ukuran. Kami lebih ingin tahu tentang kinerja dari reaksi PCR baru dirancang pada sampel manusia. Untuk ini, kita memperhitungkan fakta bahwa pengumpulan sampel diagnostik
20

seperti tinja atau darah mungkin sulit dilakukan di beberapa kelompok populasi, sehingga menghambat prosedur diagnostik. Oleh karena itu menerapkan metode PCR baru di mudah menangani urin pasien sampel, menghitung bahwa kerugian selama prosedur ekstraksi DNA dan potensi inhibitor hadir dalam sampel menurunkan sensitivitas dari pengujian kami sampai 30 pg. DNA patogen spesifik sebelumnya telah dideteksi dalam urin dengan PCR pada penyakit parasit lainnya, menunjukkan ekskresi DNA patogen dalam urin pasien. Kami menduga bahwa kematian cacing Schistosoma dan mengeluarkan telur dalam sirkulasi DNA pasien, fragmen DNA Schistosoma diekskresikan dari dalam urin yang cukup untuk mendeteksi parasit dengan PCR. Asumsi ini telah dikonfirmasi melalui deteksi DNA schistosomal di 17 dari 18 sampel urin yang dipilih dari pasien penderita schistosomiasis, menghasilkan sensitivitas 94-4% untuk alat diagnostik PCR kami menggunakan genus primer spesifik CF1/CR2. PCR gagal mendeteksi satu sampel dari pasien terinfeksi S. haematobium awalnya dikonfirmasi oleh deteksi telur parasit dalam urin, dan dengan demikian sudah pasti salah didiagnosis oleh amplifikasi DNA. Hal ini dapat dikaitkan dengan Inhibitor khusus pasien yang ada di urin atau degradasi DNA selama transportasi dan / atau manipulasi sampel. Selain itu, bisa jadi diasumsikan bahwa DNA dari S. japonicum, S. antarcalatum dan S. mekongi juga dapat langsung dideteksi di urin dengan PCR menggunakan pendekatan kami. Penggunaan primer S. mansoni spesifik pada sampel yang sama memberi sensitivitas 100 %. Nilai ini lebih tinggi dari yang diperoleh oleh Pontes dkk. (2003) dalam PCR dari S. mansoni pengulangan urutan pada sampel tinja dari individu yang hidup dalam daerah endemik S. mansoni. Sebaliknya, ketika primer spesifik S. haematobium yang digunakan dalam PCR pada sampel urin dari pasien dengan parasit ini, kita hanya bisa mendeteksi 40% dari kasus. Sensitivitasnya lebih rendah bisa digunakan untuk kinerja primer S. haematobium dalam sampel nyata, yang dapat terhambat oleh inhibitor, atau dengan fakta bahwa primer dirancang pada daerah ITS, sedangkan pasangan primer yang paling sensitif dari CF1/CR2 dan SMF / SMR berada di subunit DNA 28S dari parasit. Mengenai pasangan primer yang didesain untuk memperkuat DNA S. intercalatum, ini tidak diterapkan pada sampel manusia karena penggunaannya mengakibatkan amplifikasi S. intercalatum, S. haematobium dan S. bovis DNA, dan dengan demikian kita menganggap mereka kurang berguna untuk praktek pendekatan diagnosis. Demikian pula, primer spesifik S. japonicum tidak diterapkan pada sampel urin manusia, karena asal geografis dari pasien (Sub-Sahara), di mana kita tidak akan mendapatkan infeksi S. japonicum.

21

Kami lebih lanjut membuktikan spesifisitas tinggi dari uji kami (Dari 99,9-100% untuk 3 pasangan primer yang diuji), PCR dilakukan dengan kedua genus dan primer spesifik S. mansoni pada urin dari 29 pasien dengan parasit selain Schistosoma dan 50 sampel dari donor sehat yang tinggal di schistosomiasis baik daerah endemik dan non-endemik. Sampel positif tunggal dideteksi dengan primer CF1/CR2 bisa mewakili individu yang benar terinfeksi Schistosoma, yang didiagnosis salah oleh coprology / urologi. Singkatnya, kami telah mengembangkan pendekatan PCR baru yang memungkinkan amplifikasi spesifik dan sensitif dari genus dan spesies khusus untuk amplikon 5 Schistosoma spesies. Selain itu, hasil penelitian kami menunjukkan bahwa urin digunakan sebagai sumber template untuk diagnosis klinis schistosomiasis.

22

JURNAL 4 Evaluasi Nested-Pcr Untuk Deteksi Mycobacterium Tuberculosis Dalam Sampel Darah dan Urine

ABSTRAK Polimerase Chain Reaction (PCR) dan variasinya, seperti nested-PCR, telah digambarkan sebagai teknik menjanjikan untuk diagnosis cepat tuberkulosis (TB). Dengan tujuan untuk mengevaluasi kegunaan metode nested-PCR pada sampel darah dan urine pasien yang diduga TB kami menganalisis 192 sampel klinis, menggunakan sebagai target molekul penyisipan elemen IS6110 spesifik dari genom M. tuberculosis. Metode Nested-PCR menunjukkan sensitivitas yang lebih tinggi pada pasien dengan TB ekstrapulmonary (47,8% dan 52% dalam darah dan urin) bila dibandingkan dengan pasien dengan penyakit pulmonary (sensitivitas 29% dan 26,9% dalam darah dan urin), terlepas dari jenis sampel biologi yang digunakan. Metode nested-PCR merupakan teknik yang cepat, bahkan jika tidak menunjukkan sensitivitas yang baik, harus dianggap sebagai alat yang berguna terutama dalam kasus-kasus ekstrapulmonari atau dalam kasus di mana diagnosis konfirmasi cukup sulit untuk dicapai dengan metode rutin. Kinerja PCR berbasis teknik harus dipertimbangkan dan diuji dalam karya-karya di masa depan dengan jenis-jenis spesimen biologi selain dahak, seperti darah dan urin, mudah diperoleh dalam banyak kasus. Adanya peningkatan deteksi M. tuberculosis dengan nested-PCR pada pasien TB yang terkena akan memberikan kemungkinan deteksi dini dari basil sehingga mengganggu rantai penularan penyakit. PENDAHULUAN Di antara semua penyakit menular yang mempengaruhi manusia, tuberkulosis (TB) tetap salah satu yang paling mematikan. Di Brazil, 80.000 kasus terdaftar per tahun dengan tingkat kejadian 37,1 / 100.000 penduduk, menurut data dari Departemen Kesehatan. Negara ini menempati urutan 19 di antara 22 negara, bertanggung jawab untuk 80% dari semua kasus TB di seluruh dunia, dengan angka kematian sebesar 3,07 per 100.000 penduduk. Pada tahun 2005, 9,7% kasus yang dilaporkan terjadi pada anak-anak dan remaja. Tingkat kejadian bervariasi 14-70 kasus per 100.000 penduduk, menurut wilayah nasional yang berbeda. Amerika dengan kasus yang dilaporkan tertinggi yang melebihi rata-rata tingkat kejadian di Brazil adalah Amazonas, Rio de Janeiro, Pernambuco, Par, Cear dan Rio Grande do Sul, yang sesuai dengan 63% dari kasus Brasil. Pada tahun 2004, 4.583 kasus baru TB yang terdaftar di Negara Bagian Pernambuco, Brasil Timur Laut, dengan kejadian 55,6 dan 28.7/100000 penduduk untuk semua bentuk TB dan bentuk masing-masing basil.
23

Salah satu prioritas untuk pengendalian penyakit terdiri dalam diagnosis awal dan pengobatan yang tepat, mengakibatkan penyembuhan pasien dan intervensi dalam rantai transmisi. Prosedur laboratorium standar untuk mendiagnosis penyakit ini, berdasarkan pemeriksaan mikroskopis basil asam-cepat, memiliki sensitivitas rendah, dan budaya mikobakteri membutuhkan sekitar delapan minggu untuk melepaskan hasil. Tes molekuler berdasarkan amplifikasi fragmen urutan genom M. tuberculosis telah terbukti menjadi alat yang berguna, mampu mendeteksi basil dalam sampel biologi. Polymerase Chain Reaction (PCR) saat ini dianggap sebagai metode yang cepat dan sensitif untuk mendeteksi M. tuberculosis, mampu mendeteksi kurang dari 10 basil per mL pada spesimen biologis yang berbeda. Meskipun PCR konvensional sangat berguna untuk mendeteksi M. tuberculosis, prosedur yang mengaitkan dua PCR (nested-PCR)

menggabungkan kepekaan dan spesifisitas yang lebih besar. Biaya PCR rutin untuk diagnostik TBC adalah wajar, mengingat bahwa diagnosis dilakukan lebih cepat pada pasien paucibacillary, pengobatan tertentu dapat diberikan semakin cepat, sehingga mengurangi sumber basil dan, dengan mereka yang memiliki risiko infeksi oleh M. tuberculosis. Pengembangan dan standarisasi tes membuat biaya lebih terjangkau, mengingat bahwa teknologi ini harus disediakan untuk pusat referensi dalam penyelidikan kasus yang menuntut diagnosis sulit (bentuk paucibacillary / BTA negatif) dan tingkat keparahan penyakit. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengevaluasi penerapan teknik nested-PCR sebagai alat untuk membantu diagnosis TB, mulai dari mengumpulkan sampel klinis sederhana, seperti darah dan urin pasien dengan kesulitan untuk meludah atau yang BTA negatif, dengan tujuan untuk menentukan sensitivitas dan spesifisitas teknik ini, dan menilai pentingnya dalam konteks kriteria klinis dan laboratorium yang digunakan dalam penjelasan diagnostik rutin penyakit. PASIEN DAN METODE Populasi studi Kami menganalisa sampel darah dan urin dari 96 pasien (usia rata-rata 32,2 tahun 30.03, dengan 53 laki-laki dan 43 perempuan) yang dicurigai TB, mengakui pada periode dari bulan Oktober 2006 sampai Mei 2008 di klinik rawat jalan berikut atau lembaga publik acuan untuk diagnosis tuberkulosis terletak di Recife (Pernambuco, Brasil): Instituto de Medicina Integral Profesor Fernando Figueira - IMIP, Rumah Sakit Universidade federal de Pernambuco - HC / UFPE; Rumah Sakit Baro de Lucena, dan rumah sakit umum lainnya

24

dari Sistem Kesehatan Bersatu (SUS) yang berusaha Pusat Penelitian Aggeu Magalhes CPqAM / FIOCRUZ. Kriteria pemilihan pasien berdasarkan adanya gejala klinis mengarah ke TB, seperti batuk berkepanjangan, demam tanpa sebab yang jelas, penurunan berat badan dan keringat malam. Untuk mengevaluasi kinerja nested-PCR kami digunakan sebagai standar emas kriteria yang digunakan oleh layanan kesehatan dalam definisi diagnostik TB seperti kombinasi dari epidemiologi, data klinis dan laboratorium (sinar-X dada, tes tuberkulin, BTA atau budaya) dan riwayat pasien. Pasien yang memulai pengobatan anti-TB, kekebalandikompromikan atau di bawah kortikosteroid berbasis obat dikeluarkan dari penelitian. Dari 96 pasien terduga TB, 58 (60,4%) memiliki TB sesuai dengan kriteria yang dijelaskan di atas, sementara 38 telah ditandai dengan gejala klinis tidak sugestif TB. Di antara pasien TB, 33 memiliki TB pulmonary dan 25 memiliki TB ekstrapulmonary. Bentuk ekstrapulmonary termasuk 11 kasus TB pleura, 3 ganglionary, 2 ginjal, 2 osteoartikular, 2 miliaria, 2 kulit, 1 meningoencefalic, 1 peritonitis tuberkulosis dan 1 perikardial. Kami juga mendaftar 60 subyek sehat (usia rata-rata 20,4 14,0 tahun, dengan 37 perempuan dan 23 laki-laki), tanpa gejala klinis TB, menggunakan mereka sebagai kontrol. Pengumpulan Sampel Klinis dan Pengolahan Laboratorium Kami mengumpulkan 4,0 mL darah perifer dari setiap pasien menggunakan tabung dengan EDTA dan 10,0 mL sampel urin diperoleh dalam tiga pagi berturut-turut. Spesimen biologis disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4C sampai 24 jam, sampai ekstraksi DNA. Sampel urin pertama kali didekontaminasi menurut protokol Sechi dkk. untuk mencegah kemungkinan bakteri lain yang hadir dalam sampel. Sesudah itu urines disentrifugasi selama 20 menit pada 4500 rpm. Selanjutnya supernatan dibuang, pelet resuspended dalam 2 mL NaOH 2% dan diinkubasi selama 15 menit pada 37C. Kemudian 40 mL PBS ditambahkan untuk menghambat NaOH dan, setelah itu, sampel disentrifugasi pada 4500 rpm selama 20 menit. Selanjutnya, pelet itu resuspended dalam 1 mL PBS dan disimpan pada -20C untuk ekstraksi DNA berikutnya. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA mengikuti protokol yang diusulkan oleh Rossetti dkk. dengan beberapa modifikasi. Sebuah alikuot dari 500 L dari setiap sampel yang dikumpulkan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit dan dicuci 3X dengan Tris-EDTA (TE) 1X. Pelet itu resuspended dalam 100 L TE 1X dan thermoblock dipanaskan pada 100C selama 10 menit. Setelah sentrifugasi, supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan ditambahkan 5 l dari resin (Sephaglas BandPrep Kit, Amersham Pharmacia Biotech) dan 6
25

M natrium iodida 2:1, maka eppendorf diaduk secara manual selama 5 menit dan diinkubasi pada suhu kamar selama 5 menit. Tabung disentrifugasi pada 13000 rpm selama 1 menit, supernatan dibuang, dan 200 liter etanol 70% ditambahkan, kemudian tabung disentrifugasi selama 1 menit. Endapan dikeringkan pada suhu kamar selama 60 menit, resuspended dengan 40 l TE 1X dan diinkubasi dalam penangas air pada 50C selama 10 menit. Setelah sentrifugasi selama 1 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru dan disimpan pada -20C sampai sampel diproses. Sebuah kontrol negatif menggunakan TE dimasukkan selama ekstraksi DNA dan itu dimanipulasi sebagai satu sampel biologis untuk menilai semua jenis kontaminasi antara sampel. Amplifikasi DNA genom M. tuberculosis Urutan penyisipan IS6110 M. tuberculosis (GenBank NP_215310.1) menjadi sasaran digunakan untuk nested-PCR. Dalam reaksi pertama suatu fragmen DNA dari 409 bp diamplifikasi menggunakan sepasang primer eksternal: TJ5 (5'-

CCGCAAAGTGTGGCTAAC-3') dan TJ3 (5'-ATCCCCTATCCGTATGGT G-3'); dalam reaksi kedua, PCR pertama amplikon digunakan sebagai template untuk amplifikasi nested dari fragmen 316 bp menggunakan dan sepasang primer internal: OLI5 (5'-

AACGGCTGATGACCAAAC-3') semua dijelaskan oleh Ritis dkk.

STAN3

(5'-GTCGAGTACGCCTTCTTGTT-3'),

Reaksi amplifikasi telah dijalankan pada MasterCycler Gradient (Eppendorf) termalcycler. Campuran reaksi amplifikasi pertama terdiri dari 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, dNTP (200 mM masing-masing), 30 pmol dari setiap unit TJ5 dan TJ3 dan 2,5 oligonukleotida DNA polimerase Taq (Gibco BRL) dalam akhir volume 50 mL. Proses denaturasi dilakukan pada 94C selama 30 detik, annealing pada 68C selama 1 menit. dan perpanjangan sampai 72C selama 1 menit, selama 30 siklus. Dalam reaksi kedua 2 mL amplikon dari PCR pertama ditambahkan dalam campuran reaksi sebagai template. Kondisi untuk amplifikasi nested-PCR adalah 94C selama 30 detik, 57C selama 30 detik dan 30 detik perpanjangan pada 72C selama 30 siklus menggunakan primer OLI5 dan STAN3. Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 2%, diwarnai dengan etidium bromida, divisualisasikan dalam translumination ultraviolet dan dipotret oleh sistem dokumentasi Polaroid (Kodak MP4 + Sistem). Untuk amplifikasi masing-masing, kontrol positif mengandung DNA diekstraksi dari strain M. tuberculosis H37Rv referensi untuk memverifikasi jika tidak ada komplikasi pada amplifikasi selama reaksi NPCR, dan kontrol negatif berisi Milli-Q air untuk mengecualikan kemungkinan kontaminasi dimasukkan.
26

Pertimbangan Etis Semua pasien menandatangani informed consent tertulis, menyetujui untuk berpartisipasi pada studi, disetujui oleh Komite Etika dalam Penelitian Aggeu Magalhes Research Center - CPqAM / FIOCRUZ, Recife (CEP - N 55/05, disetujui pada 5 Maret 2005). Tindakan yang diperlukan untuk melestarikan kebebasan persetujuan dari pasien yang diamati. Analisis Statistik Setiap pasien menjalani kuesioner klinis epidemiologis dikembangkan dan distandarisasi oleh tim peneliti. Epi-Info epidemiologi perangkat lunak (Versi 6,02) digunakan untuk merekam data dan analisis statistik, dengan interval kepercayaan (CI) 95%. P nilai kurang dari 0,05 dianggap signifikan secara statistik. HASIL Hasil yang diperoleh oleh Nested-PCR (NPCR) ditunjukkan pada Tabel 1. Di antara 58 pasien TB, 31 (53,4%) adalah NPCR positif dan 27 (46,6%) negatif. Dari 38 pasien tanpa gejala klinis sugestif TB, 10 (26%) diidentifikasi sebagai positif oleh NPCR. Membandingkan hasil NPCR sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif dan negatif masing-masing adalah 53,4% (CI: 40,0-66,5), 89,8% (CI: 81,6-94,7), 75,6% (CI: 59,4-87,1) dan 76,5% (CI: 67,583,7). NPCR negatif pada semua sampel kelompok kontrol. Tabel 1 menunjukkan korelasi antara bentuk TB dan hasil NPCR. Pada pasien dengan bentuk pulmonary, NPCR yang positif sebanyak 42,4% kasus, sedangkan pada pasien dengan bentuk ekstrapulmonary, NPCR positif dalam 68% kasus. Seratus sembilan puluh dua sampel biologis (96 seluruh darah dan urin 96) dikumpulkan dari 96 pasien yang diduga TB. Dalam kelompok ini, NPCR yang positif sebanyak 53,4% (31/58) kasus TB terlepas dari jenis sampel biologis dianalisis. Namun ketika mempertimbangkan sensitivitas dan spesifisitas NPCR sesuai dengan jenis sampel biologis dianalisis, mengingat sebagai standar emas diagnosis klinis akhir, penelitian menunjukkan sensitivitas 38% (22/58) (p <0,046) dan 40% (23 / 58) (p <0,028) masing-masing, dan spesifisitas 93,8% (92/98) dan 90,8% (89/98), dalam darah dan air seni masing-masing (Tabel 2). Membandingkan hasil NPCR untuk mendeteksi M. tuberculosis dalam darah dan urin dalam bentuk yang berbeda dari TBC, kami mengamati bahwa pada kelompok pasien dengan TB pulmonary, NPCR itu positif dalam 30,3% (10/33) dalam sampel darah dan urin. Pada kelompok TB ekstrapulmonary, NPCR menunjukkan positif lebih tinggi di kedua darah 48% (12/25) dan urin 52% (13/25) ketika dibandingkan dengan kelompok sebelumnya. Namun,

27

tidak ada perbedaan yang signifikan antara sampel dan dalam kelompok-kelompok yang diamati (Tabel 2). Tabel 1. Perbandingan antara hasil NPCR untuk IS6110 dan bentuk klinis TB.

Tabel 2. Hasil NPCR untuk IS6110 sehubungan jenis sampel dianalisis dan bentuk klinis TB.

PEMBAHASAN Tuberkulosis adalah masalah serius dalam kesehatan masyarakat, terutama di negara berkembang, dan bertanggung jawab atas tingginya angka morbiditas dan mortalitas. Karena kebutuhan untuk mendapatkan diagnosis dini, cepat dan sensitif secara signifikan meningkat, kita dianggap sebagai metode diagnostik yang dapat membantu dalam memajukan diagnosis bentuk paucibacillary tuberkulosis. PCR dan variasinya, seperti nested-PCR, telah ditunjukkan sebagai suatu teknik molekuler menjanjikan untuk diagnosis cepat tuberkulosis. Miyazaki dkk. meneliti potensi dari nested-PCR untuk diagnosis TBC. Kepekaan nested-PCR dievaluasi dengan menggunakan 10 kali lipat pengenceran bakteri. Deteksi batas jumlah bakteri untuk PCR pertama adalah 102 Colony Pembentukan Unit (CFU) untuk M. tuberkulosis, tetapi sensitivitas meningkat sekitar 1.000 kali lipat menjadi 0,1 CFU, mengikuti PCR kedua. Hasil NPCR bertepatan dengan diagnosis klinis terakhir dalam 61,5% (59/96) kasus (Tabel 1). Dari 27 NPCRs false-negatif, pada kelompok pasien TB, 41% dari mereka berasal dari pasien di bawah 15 tahun. Oleh karena itu, tes negatif tidak mengesampingkan out diagnosis TB. Menimbang bahwa anak dan remaja pada umumnya memiliki bentuk paucibacillary, mungkin hasil negatif dari teknik ini dapat dikaitkan dengan sejumlah basil yang beredar cukup untuk dideteksi oleh NPCR.

28

Menurut Bach, sampel klinis sering mengandung zat penghambat yang dapat mengganggu reaksi PCR, sehingga perlu untuk mengadopsi prosedur yang dapat menghapus semua inhibitor secara bersamaan. Namun, menurut Bddinghaus dkk., sampai sekarang, tidak ada prosedur tunggal yang telah dibuktikan ideal untuk memblokir inhibitor, diantaranya hemoglobin, polisakarida dalam dahak, beberapa reagen dan komponen pembersih. Menurut penulis, hasil negatif palsu dapat dideteksi melalui dimasukkannya reaksi kontrol positif. Dalam penelitian kami, kami menggunakan referensi strain M. tuberculosis H37Rv sebagai kontrol positif dan reagen kosong (tidak ada DNA target) sebagai kontrol negatif. Pendekatan Nested-PCR kami memungkinkan kami untuk mendeteksi 10 pasien positif NPCR pada kelompok TB dibuang, yang berbasis di kriteria klinis dan epidemiologi. Mereka disajikan sebagai diagnosis akhir penyakit imunosupresif seperti rheumatoid arthritis, karsinoma paru, pneumonia nonspesifik, meningitis meningokokus, osteomielitis kronis dan pleuritis uremik. Dari pasien ini, dari segi usia, 4 kurang dari 5 tahun dan 6 di atas 30 tahun, dan salah satunya (52 tahun) meninggal tanpa masalah yang dapat dijelaskan. Ini 9 pasien diteliti, meskipun fakta bahwa diagnosis mereka TB telah dibuang, karena mereka disajikan kontak dengan individu yang terkena TB, atau karena kasus-kasus sebelumnya tuberkulosis atau gejala klinis sebelumnya yang menyebabkan kecurigaan penyakit. Dalam praktek klinis, pelaksanaan skrining TB dengan menggunakan kriteria klinis standar emas agak cacat karena rendahnya spesifisitas gejala TB dalam kaitannya dengan penyakit lain, yang tidak akan mengesampingkan kemungkinan bahwa pasien memiliki TB laten terkait dengan patologi lainnya. Selain itu NPCR dapat mendeteksi keberadaan DNA M. tuberculosis karena menguatkan materi genetik yang berasal dari basil tidak aktif / nonviable. Kasus pasien dengan infeksi oleh mikobakteri tidak didiagnosis segera setelah diperlukan sehingga orang yang terinfeksi nontreated terus menyebar basil tersebut. Pentingnya metode molekuler adalah sebagai alat untuk meningkatkan efisiensi diagnostik dalam pelayanan kesehatan. Di sisi lain, PCR mungkin menyajikan tingkat tinggi kontaminasi, seperti yang dijelaskan oleh Kox dkk., bahkan, untuk NPCR, di mana dua amplifikasi dilakukan, ada kemungkinan besar kontaminasi pada pembukaan tuba antara reaksi pertama dan kedua. Dalam penelitian kami kami menambahkan kontrol negatif dalam semua ekstraksi DNA dan dalam reaksi NPCR dengan tujuan untuk mengontrol risiko hasil positif palsu. Ketika mempertimbangkan metode diagnostik baru, kinerja standar emas adalah parameter penting. Karena kesulitan mengisolasi M. tuberculosis dalam sampel

paucibacillary, penggunaan diagnosis rutin didasarkan pada indikasi tidak langsung, seperti
29

kriteria epidemiologi, klinis, laboratorium data (dalam uji tuberkulin Mantoux dan Xray dada), evolusi dan respon terhadap pengobatan. Tidak adanya standar emas diagnostik tetap merupakan masalah serius untuk mengevaluasi diagnostik baru, terutama dalam orang yang terinfeksi HIV dan penyakit paucibacillary (misalnya, TB ekstrapulmonary dan penyakit pediatrik). Pada pasien anak, meskipun ada beberapa studi dalam literatur mengenai evaluasi pelaksanaan uji molekuler untuk identifikasi TB pada anak, kebanyakan dari mereka menggunakan metode "tidak langsung" sebagai kriteria standar emas, dan ini dapat mengakibatkan kasus dengan diagnostik ketidaktelitian. Selain itu, anak dengan TB tidak dapat menghasilkan dahak dan untuk memperoleh bahan sering membutuhkan prosedur invasif yang tidak dapat dengan mudah diulang. Karena sifat paucibacillary spesimen dan distribusi tidak teratur dari basil yang cenderung mengumpul, kepekaan mikroskopi sangat rendah. Namun demikian, interpretasi hasil dari NPCR harus digunakan dan ditafsirkan dalam hubungannya dengan data konvensional dan klinis. Perluasan dari penelitian ini sedang dikembangkan dengan lebih banyak subyek dengan smear dan atau kultur positif pada spesimen biologis yang berbeda, untuk lebih menilai besarnya keterbatasan di atas. Sehubungan dengan bentuk klinis TB, tingkat tertinggi deteksi NPCR dan korelasi dengan diagnosis klinis yang diamati dalam bentuk ekstrapulmonary, termasuk pasien yang lebih muda dari 15 tahun, mungkin karena sirkulasi peningkatan basil dalam cairan tubuh dan jaringan. Meskipun temuan kami adalah awal dan diperoleh pada rendahnya jumlah individu, juga dalam hal bentuk paucibacillary, kepositifan dari NPCR itu ditemukan baik dalam darah dan dalam urin bahkan pada subyek dengan bentuk penyakit pulmonary. Penerapan PCR dalam sampel biologi telah dikembangkan dan diuji selama bertahuntahun. Namun, standardisasi PCR sebagai alat diagnostik untuk diterapkan di laboratorium rutin memerlukan pengolahan yang cermat sampel untuk menghindari komplikasi, seperti kontaminasi dan produksi nonspesifik atau false positif / negatif yang dapat mengganggu hasil tes. Dalam literatur, hanya dahak, darah dan cairan serebrospinal (CSF) yang telah ditunjukkan untuk mewakili substrat yang baik untuk analisis PCR. Meskipun rendahnya jumlah pasien dianalisis dan penggunaan beberapa parameter (seperti yang ditunjukkan di atas) sebagai standar emas dapat diamati bahwa sensitivitas dan spesifisitas NPCR untuk deteksi M. tuberculosis dalam sampel darah dan urin, dianggap bersama-sama, menunjukkan kecenderungan untuk kinerja yang lebih baik, bahkan dalam TB pulmonary dan

30

ekstrapulmonary, bila dibandingkan dengan hasil yang didapat pada darah atau urin untuk sampel yang dianalisis secara terpisah. Para NPCR dalam sampel darah terdeteksi TB di 38% (22/58) pasien dengan diagnosis klinis TB, memberikan akurasi 72,4% (113/156). Hasil tidak setuju dengan mereka Khan et al. yang menemukan sensitivitas 14,5%, lebih rendah dari budaya dan smear dengan 62,5% dan 35,5% masing-masing. Namun, sensitivitas PCR sangat bervariasi bila dibandingkan dengan penelitian lain, di mana hasil dapat bervariasi antara 13% dan 97,4%. Mengenai penggunaan NPCR dalam sampel urin untuk informasi sedikit pengetahuan kami tersedia dalam literatur. Dalam penelitian kami, kami menemukan sensitivitas 40% (23/58) dan spesifisitas 90,8% (89/98). Variasi dalam sensitivitas tes dalam sampel darah dan urin telah ditunjukkan pada beberapa penelitian. Kafwabulula dkk. menemukan sensitivitas 55% ketika mengevaluasi pasien dengan TB pulmonary, tetapi Sechi dkk. dan Torrea dkk. menunjukkan bahwa sensitivitas NPCR pada pasien TB dengan TB pulmonary berkisar antara 23% sampai 40%. Kafwabulula dkk. melaporkan bahwa variasi sensitivitas dalam urin mungkin disebabkan oleh faktor yang berbeda. Pasien dengan TB pulmonary biasanya tidak beredar DNA mikobakteri yang menyaring melalui urin. Kita juga bisa berhipotesis bahwa M. tuberculosis atau fragmen diekskresikan dalam urin pasien dan karena itu mungkin lebih bijaksana untuk mengumpulkan urin dalam setidaknya tiga hari berturut-turut atau lebih banyak sampel lebih dari 24 jam. DNA pada urin didapat dari: beredarnya mikobakteri keseluruhan dalam darah dan disaring ke dalam urin, adanya fragmen mikobakteri, DNA bebas atau mikrobakteri tidak aktif yang ada pada ginjal, yang menjadi aktif setelah timbulnya penyakit di paru-paru. Namun, hasil negatif palsu dapat terjadi karena pengumpulan beberapa sampel dari setiap pasien atau distribusi non-homogen mikobakteri dalam urin. Rebollo dkk. menunjukkan bahwa deteksi PCR mikobakteri lebih sensitif pada pasien HIV-positif dibandingkan pada pasien imunokompeten dengan TB, karena beban mikobakteri lebih besar dalam kasus ini dan fragmen DNA lebih tersedia. Namun, penulis menemukan sensitivitas lebih rendah dari penelitian kami. Variasi dalam sensitivitas adalah salah satu hambatan yang mencegah penyebaran penuh dan standardisasi teknik ini di laboratorium pusat analisis klinis. Variasi ini secara langsung berkaitan dengan banyak faktor seperti protokol yang berbeda yang digunakan, prosedur dekontaminasi sampel dan variasi dalam komposisi bufer lisis. PCR telah digunakan dengan sampel biologis yang berbeda sebagai alat untuk diagnosis TB. Namun, koleksi dari beberapa spesimen memerlukan proses invasif dan melelahkan (cairan bronchoalveolar,
31

lavage lambung, biopsi). Penggunaan sampel darah dan urin adalah prosedur sederhana, nyaman dan tidak invasif, menghindari penggunaan teknik pengumpulan agresif. Perlu dicatat bahwa spesimen biologi lainnya, terutama pada anak-anak, remaja dan bentuk paucibacillary penyakit harus dipertimbangkan dalam standarisasi sistem dasar PCR sebagai alat bantu dalam mengkonfirmasikan diagnosis klinis. Selanjutnya pilihan target IS6110 disukai kinerja salinan nested-PCR karena beberapa dari target dalam genom M. tuberculosis. Bahkan, dalam studi Ogusku dkk., uji PCR untuk daerah IS6110 telah menunjukkan hasil yang lebih baik dari target rDNA 16S, yang hadir dalam satu salinan dalam genom M. tuberculosis. Protokol NPCR disajikan dalam penelitian ini cocok untuk diagnosis TB di negara-negara terbelakang karena sederhana, memiliki biaya yang terbatas dan kebutuhan peralatan beberapa yang umum tersedia di laboratorium biologi dasar molekuler.

32