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LABORATORIO II: GEL FILTRACIN

Introduccin
El trmino cromatografa abarca una variedad de tcnicas de separacin de molculas basadas en la capacidad de las mismas de distribuirse en forma diferencial sobre una fase estacionaria (slida o lquida), cuando sobre sta fluye una fase mvil (lquida o gas). Fase mvil y fase estacionaria se seleccionan de acuerdo a la propiedad fisicoqumica de los componentes de la mezcla, en base a la cual se van a separar. De esta forma se tiene cromatografa de adsorcin, cromatografa de intercambio inico, cromatografa deafinidad, cromatografa de exclusin (gel filtracin o filtracin molecular), cromatografa gas lquido, entre otras. En la cromatografa de gel filtracin, o exclusin molecular, los componentes de la mezcla se separan en base a su masa molecular o ms precisamente en base a su radio de Stokes (el radio de Stokes describe una esfera con un comportamiento hidrodinmico igual al de la partcula irregular). En una separacin por gel filtracin el medio o matriz se empaqueta en una columna obtenindose un lecho empaquetado. El medio es una matriz porosa en forma de partculas esfricas que debe ser fsica y qumicamente estable e inerte (incapaz de reaccionar con o adsorber componentes de la muestra). El lecho empaquetado se equilibra con el buffer que llena los poros de la matriz y el espacio que queda entre las partculas. La matriz slida y el lquido dentro de los poros (el gel) constituyen la fase estacionaria. El liquido interno de las partculas esta en equilibrio con el liquido fuera de ellas. Este ltimo constituye la fase mvil. Existe una gran variedad de matrices, algunas se forman por el entrecruzamiento de polmeros como dextranos (polmeros de glucosa), agarosa (polmero de D-galactosa y 3,2-anhidro-L-galactosa) o polmeros sintticos (poliacrilamida, polivinilo) unidos con agentes de entrecruzamiento.

Hoy en da hay disponibles diferentes marcas comerciales de estos geles, ver tabla 1. Fabricante BioRad Nombre comercial Bio Gel P Bio Gel A Sephadex Sepharose Pharmacia Sephacril Superdex Merck Amicon Fractogel TSK HW Toyopearl Matrex Cellufine matriz poliacrilamida agarosa dextrano agarosa poliacrilamida agarosadextrano polivinilo polivinilo celulosa

Tabla 1. Fabricante nombre comercial del gel y la matriz.

Caractersticas de la matriz
Geles de Sephadex Los Sephadex son matrices de dextranos entrecruzados con epiclorhidirna. Se hinchan en soluciones acuosas, formamida dimetilsulfxido, formando geles. Controlando el grado de entrecruzamiento (ms epiclorhidrina ms entrecruzado) y el tamao de las partculas se pueden lograr medios con altas selectividades para diferentes rangos de peso molecular. Estos vienen en forma de polvo, para su uso deben hincharse (swelling) en el medio en el que se va a trabajar. Hay varios tipos de Sephadex, tipo G, tipo LH; los G son aptos para trabajar en medio acuoso, en algunos casos en dimetilformamida o en soluciones hidro-alcohlicas. En los Sephadex-LH se ha modificado la cadena de dextranos con grupos hidroxipropilo, lo que hace posible que se utilicen en solventes orgnicos poco

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polares o en mezcla de solventes orgnicosagua. El nmero despus de la G o LH (ver tabla 2), por ejemplo Sephadex-G 200, esta relacionado con el rendimiento en volumen luego del hinchamiento en agua, en este caso con 1 g de gel seco se obtienen aproximadamente 20 mL de gel hinchado. El rango de fraccionamiento expresado en unidades de peso molecular es el rango entre cuyos lmites la matriz puede separar. Un Sephadex G-50 podr fraccionar molculas cuyo tamao est entre 1.500 y 30.000 Da. tamao de rango de partcula fraccionaseca miento * (m) 40-120 100-300 50-150 20-80 10-40 100-300 50-150 20-80 10-40 0-700 1000-5000 1000-5000 1000-5000 1000-5000 1500-30000 1500-30000 1500-30000 1500-30000

cual pasa el eluyente (fase mvil). La muestra cuyos componentes se quieren separar, se aplica en la parte superior de la columna. Luego se va adicionando eluyente en forma continua, a medida que ste recorre la columna las molculas de la muestra se van distribuyendo entre el lquido que est dentro de las partculas del gel, y el lquido que esta fuera. Aquellas molculas cuyo tamao sea menor que el tamao de los poros del gel, podrn difundir al interior de las esferas y se irn retardando en su recorrido, mientras que las molculas de tamao mayor a los poros quedarn excluidas de las esferas del gel y recorrern la columna junto con el eluyente. Por lo tanto las molculas eluyen de la columna en orden decreciente de peso molecular, las ms grandes eluyen primero y luego las ms pequeas que se retardaron en su recorrido (ver figura 1).

tipos de gel

Sephadex G-10 Sephadex G- 25 coarse Sephadex G- 25 medium Sephadex G- 25 fine Sephadex G- 25 superfine Sephadex G- 50 coarse Sephadex G- 50 medium Sephadex G- 50 fine Sephadex G- 50 superfine

Tabla 2. Algunos tipos de matrices sephadex G * Para protenas globulares en Da

Figura 1: Esquema de la separacin de molculas de 2 tamaos diferentes

El sephadex se encuentra disponible en diferentes tamaos de partculas que determinan que existan, adems de los diferentes tipos-G; geles de partculas finas, medias o superfinas. Las partculas finas se empaquetan mejor que las gruesas dando menor ensanchamiento de bandas y por lo tanto mejor resolucin.

Aspectos prcticos
Una vez hinchado el gel se empaqueta en una columna formando un lecho a travs del

Los geles de Sephadex son estables en un rango amplio de condiciones de trabajo, generalmente se trabaja en condiciones moderadas de pH y fuerza inica. El gel se hincha en el mismo buffer que se utilizar como eluyente, el que a su vez debe mantener incambiadas las condiciones de la muestra. Cualquier cambio de condiciones puede provocar que los solutos precipiten en la columna o se desnaturalicen en el caso de protenas lo que adems llevara a la perdida de actividad biolgica.

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A la salida de la columna el eluyente se recoge en fracciones de determinado volumen. En cada una de ellas se monitorea la presencia del componente de inters. Para protenas y cidos nuclicos se controla la absorbancia a 280nm y 260 nm, respectivamente. El resultado de la separacin se visualiza en el diagrama de elucin o cromatograma (figura 2), que muestra la variacin de concentracin de los solutos en el eluyente en funcin del volumen de eluyente que ha pasado a travs de la columna.

B) Cuando el volumen de la muestra no es despreciable con respecto al volumen de elucin, el Ve se mide desde la mitad del volumen de la muestra a la posicin del mximo de pico (B).

C) Cuando el volumen de muestra es muy grande, lo cual da una regin plateau en la curva de elucin, el Ve se mide desde que se aplic la muestra hasta el punto de inflexin en la parte ascendente del pico de elusin (C).

Figura 2: Izquierda esquema de separacin de molculas, derecha diagrama de elucin.

A partir de este diagrama puede determinarse volumen de elucin (Ve) para cada uno de los solutos. Diferentes criterios se utilizan determinar el volumen de elucin: para

A) Cuando la muestra aplicada a la columna de gel filtracin tiene un volumen despreciable comparado con el volumen de elucin, la posicin del mximo de pico en el diagrama de elucin se toma como l Ve (A).

Ve no define completamente el comportamiento de un soluto ya que depende del volumen total del lecho empaquetado (Vt) y geometra de la columna (dimetro y altura) y tambin del empaquetamiento, por lo tanto para el mismo soluto en el mismo gel pero en diferentes columnas el volumen de elucin no es comparable. Al igual que otras cromatografas de particin la elucin del soluto est mejor caracterizada por una constante de distribucin, Kd definida como sigue: K d = (Ve Vo ) / Vi (1)

Kd representa la fraccin de fase estacionaria en el cual puede difundir libremente el soluto.

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El volumen muerto Vo, es el volumen de elucin de las molculas que son mayor tamao que los poros ms grandes de la matriz y por lo tanto no pueden ingresar al interior de las esferas. Puede determinarse experimentalmente eluyendo un soluto de alto peso molecular y de fcil deteccin. Por ejemplo Blue Dextrano de 2.000.000 de Da, que en cualquiera gel que se utilice siempre eluye en el volumen muerto y tiene color azul (mximo de absorcin a 600 nm). El volumen de buffer interno (Vi) es el volumen dentro de las esferas que est disponible para molculas muy pequeas. Por lo tanto, es el volumen de elucin de las molculas que se distribuyen libremente entre la fase mvil y estacionaria menos el volumen muerto. En la prctica Vi es difcil determinar, en (1) se sustituye Vi por la expresin (Vt Vo ) y se obtiene: K av = (Ve Vo ) / (Vt Vo ) (2) Kav es una constante de distribucin aparente, pero para cada tipo de gel se relaciona de manera constante con Kd. Vt es el volumen total del lecho empaquetado (volumen geomtrico de la columna). Para un soluto el mnimo Ve es el Vo , con lo cual para cualquier soluto que eluya en el volumen muerto Kav vale 0 (ecuacin 2). Para un soluto que eluya en el Vt , Kav vale 1; para aquellos solutos que entren dentro del rango de fraccionamiento del gel, el volumen de elucin estar entre el volumen muerto y el volumen total del gel y Kav estar entre 0 y 1.

Para ello debe elegirse el gel apropiado segn el peso molecular estimado o conocido de los componentes de la mezcla. 4.2.- Determinacin de pesos moleculares. En el caso de protenas globulares es posible determinar su peso molecular mediante gel filtracin, para ello se calibra la columna con patrones de peso molecular, hay una relacin lineal, entre el PM y Kav , se debe trabajar en el rango lineal del gel. Una vez eluda la protena de inters se interpola de la curva para conocer su PM. La figura 2 muestra una curva de calibracin en una columna G-200.

Figura 3: Curva de calibracin en una columna sephadex G200

Aplicaciones de la gel filtracin

4.1.- Anlisis de mezclas. Una de las aplicaciones ms comunes de la gel filtracin es el anlisis de la mezcla de solutos de diferente tamao molecular, como polisacridos, cadenas de cidos nucleicos de diferente tamao, protenas, pptidos y oligopptidos.

4.3.- Desalado Es muy comn en las primeras etapas de la purificacin de protenas, la precipitacin salina con sulfato de amonio, una forma fcil de eliminarlo es desalando, habitualmente se utiliza Sephadex G-25 que tiene un rango de fraccionamiento de 1000 5000 Da, las protenas eluyen en el volumen muerto y las sales en el volumen total.

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4.4.- Aplicaciones industriales Columnas de Sephadex se utilizan para la purificacin en gran escala en la industria farmacutica y bioqumica, por ejemplo el desalado de seroalbumina bovina en plantas de produccin se lleva a cabo en columna de G-25 grado grueso.

Referencias Bibliogrficas
-Gel filtration in Scopes, R. Protein purification. Principles and practice. 2da edicin. Springer- Verlag. 1988. -Gel filtration. Principles and Methods. http://www.chromatographyamershambiosciences. com/aptrix/upp00919.nsf/ content/6EEE4799 0D9F933EC1256F90000DD697?OpenDocument -Sephadex LH-60 chromatography in organic solvents. Folleto tcnico Pharmacia Fine Chemicals

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Informacin general sobre Hemoglobina

Introduccin: Las hemoprotenas, son protenas que contienen un grupo prosttico (no proteico), llamado grupo hemo, que consiste en un anillo orgnico porfirnico con un tomo de hierro unido (ver figura 1). El hierro del grupo hemo es capaz de ser oxidado y reducido. Hay muchos tipos de grupos hemo (hemo A, hemo B, hemo C, hemo M, hemo S, hemo L y hemo O)

Figura 1.: Grupo Hemo B

La hemoglobina es una hemoprotena que transporta el oxgeno en los eritrocitos de la sangre de mamferos y otros animales. Est constituida por subunidades proteicas globulares con un grupo hemo B cada una. La forma ms comn de la hemoglobina es un tetrmero de aprox 68 KDa, (aprox. 17 KDa por subunidad). El color de la hemoglobina cambia con el grado de oxigenacin. La hemoglobina oxigenada es roja intensa, mientras que la deoxigenada es prpura. El cambio de coloracin implica un cambio en el espectro de absorcin. La hemoglobina totalmente oxigenada tiene dos mximos de absorcin a los 575 nm y 540 nm. La hemoglobina deoxigenada tiene un solo pico a los 565 nm.

Figura 2.: Estructura tridimensional de la hemoglobina. Las cuatro subunidades se muestran en amarillo y rojo, mientras que el grupo hemo aparece en verde.

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Separacin de los componentes de una mezcla por gel filtracin

Objetivo: Separar una mezcla de: Hemoglobina (Hg, 68KDa)-Azul Dextrano (AD, 2000 KDa) y/o Naranja de metilo (MO, 327Da), mediante cromatografa de gel-filtracin en sephadex G-100. Materiales: columna de Sephadex G-100 en PBS (buffer fosfato salino) Buffer PBS para eluir Soporte con pinza Pipetas Pasteur Tubos para recoger los eludos Espectrofotmetro visible

Procedimiento: 1. Cada subgrupo trabajar con una columna de Sephadex G-100 empaquetada y una de las mezclas arriba indicadas. Se deben tener los siguientes cuidados: La columna debe estar vertical en el soporte El empaquetamiento debe ser uniforme, sin caminos preferenciales ni grietas. El gel no debe secarse, para evitarlo siempre debe haber buffer sobre la superficie del gel. No debe distorsionarse la superficie superior del lecho, para ello aplicar la muestra y el buffer de elucin lentamente, contra las paredes de la columna ayudados por una pipeta Pasteur. 2. Adicionar cuidadosamente fracciones de buffer hasta completar un volumen de 10 mL. Para ello se debe abrir la salida de la columna y adicionar buffer a medida que este eluye. 3. Cerrar la salida de la columna dejando aprox. 1 ml de buffer en la superficie del gel. 4. Inmediatamente antes de aplicar la muestra a la columna abrir la salida y dejar un volumen mnimo de buffer en la superficie del gel. Cerrar la columna. 5. Aplicar cuidadosamente la muestra, dejar caer por la pared de la columna sin distorsionar la superficie del gel: 100 l de mezcla Hg-AD/MO. Abrir la salida de la columna para que la muestra entre al gel y cerrar la llave. 6. Adicionar cuidadosamente 200 l de buffer en la parte superior de la columna, dejando correr sobre las paredes de la columna, para lavar la misma. Abrir la salida de la columna y comenzar a recoger el volumen eludo en un tubo. Cerrar la llave de salida de la columna. No dejar secar el gel. 7. Adicionar cuidadosamente buffer hasta completar la columna. Para eluir, abrir la salida de la columna y recoger fracciones de 0.5 mL en tubos (estos deben contener 0.5 ml de PBS para asegurar un volumen final de 1 ml por tubo). Observar el color de las bandas en la columna y en los diferentes tubos. 8. Despus de la ltima fraccin coloreada recoger 3 fracciones ms y dejar la columna cerrada. Lavar la columna con 15 ml de PBS. 9. Leer en cada tubo la absorbancia a: 600 nm y 450 nm . 10. Dibujar el diagrama de elucin o cromatograma.

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11. Calcular: Vt de la columna Vo de la columna Ve para cada componente de la muestra. Cuestionario: Cul es el rango de fraccionamiento del Sephadex G-100? Calcule el Kav de los componentes de su muestra. Est dentro de lo esperado? Considerando los pesos moleculares de la hemoglobina, Azul Dextrano y naranja de metilo: en qu orden espera que eluyan de la columna cada una de estas molculas si se siembran juntas en un mismo gel de Sephadex G100? Cmo se puede mejorar la separacin o resolucin de dos molculas de tamao similar en una misma matriz de gel filtracin? En qu fraccin de volumen o volumen de elucin espera obtener una sal inorgnica (tamao muy pequeo)?