Prosedur Pengerjaan Uji HA-HI

Pembuatan RBC (Red Blood Cell)

Darah ayam dimasukkan ke dalam tabung dan disentrifuse 1000 rpm selama 10 menit (tabung sentrifuse berisi antikoagulan dengan perbandingan volume antikoagulan dan volume darah adalah 1:4).

Hasil sentrifuse diperoleh supernatan dan endapan darah atau plasma dan sel darah merah yang mengendap.

Supernatan kemudian dibuang dan ditambah NaCl fisiologis sebanyak jumlah supernatan yang dibuang kemudian disentrifuse kembali. Hal tersebut dilakukan sebanyak empat kali sehingga diperoleh suspensi RBC 100%.

Untuk mendapatkan RBC 50% maka RBC 100% ditambahkan NaCl fisiologis dengan perbandingan 1 ml RBC 100% dan 1 ml NaCl fisiologis dan hasilnya berupa stok RBC 50%. Stok RBC 50% kemudian di masukkan ke dalam pipet hematokrit dan disentrifuse 2000 rpm 10 menit. Nilai yang diperoleh adalah 40%.

Stok RBC 40% kemudian diencerkan kembali menjadi 5%. Pengenceran ini dilakukan dengan menambahkan NaCl dengan perbandinga 1 ml RBC 50% dengan 7 ml NaCl fisiologis sehingga diperoleh RBC 5%. Kemudian dimasukkan ke pipet hematokrit dan disentrifuse 2000 rpm 10 menit sehingga diperoleh nilai 5%. RBC 5% tersebut dapat langsung digunakan atau dapat disimpan dalam suhu 4oC.

Persiapan Telur Ayam Berembrio Telur Ayam Berembrio berumur 9-12 hari yang memiliki ruang alantois optimal

disiapkan.
Pada telur tersebut kemudian di teropong (candling) untuk menentukan letak kepala

embrio dan batas rongga udara. Bagian-bagian tersebut kemudian diberi tanda dengan menggunakan pensil agar lokasi inokulasi benar.
Pembuatan Suspensi Virus

Contoh uji diperoleh dari ayam hasil nekropsi yang menunjukkan gejala klinis berupa diare berwarna hijau dan gangguan pernafasan. Hasil nekropsi menunjukan kelain patologi berupa pendarahan pada trakea, paru-paru berwarna lebih merah,

pada eosofagus ditemukan gelembung udara, enteritis, pembesaran ginjal dan distensi VU.
Contoh uji (potongan organ) berupa limpa diambil dan ditimbang sehingga

diperoleh berat limpa 0.05 gram.

Organ tersebut digerus di dalam mortar dengan ditambah NaCl fisiologis dengan

perbandingan 1:10 sehingga diperoleh suspensi 11%. Dalam percobaan ini NaCl yang ditambahkan sebanyak 0.5 ml. Suspensi organ yang dapat digunakan untuk inokulasi berkisar antara 10-20%. Kemudian hasil gerusan organ dimasukkan ke dalam eppendorf yang dimasukkan kedalam tabung centrifuge untuk di sentrifugasi selama 30 menit sampai terbentuk 2 lapisan yaitu endapan dan superatan. Seharusnya hasil gerusan disentrifugasi selama 15 menit 1500 rpm.
Supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf. Seharusnya,

supernatan dihitung volume nya.

Suspensi tersebut kemudian diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 C Tambahkan antibiotik. Stok antibiotik Pennicilin-Streptomycin yang tersedia adalah
0

200.000IU dan 100.000IU. Sedian antibiotik yang pakai adalah 100.000IU. Jumlah antibiotik yang digunakan untuk membiakan virus adalah 10.000IU sehingga diperoleh 0.1ml antibiotik yang harus ditambahkan ke suspense virus.
Menurut OIE, dosis antibiotik yang dibutuhkan untuk membiakan virus ND adalah

2000 IU/1ml. Seharusnya dari stok antibiotik 100.000IU yang dipakai, jumlah antibiotik yang diambil adalah 0.02ml/1ml suspensi virus.
Suspensi virus siap untuk diinokulasikan ke Telur Ayam Berembrio.

Inokulasi Suspensi Virus Telur yang telah dicandling dan diberi tanda diletakkan pada nampan dengan posisi rongga udara di atas, kemudian telur didesinfeksi dengan menggunkan alcohol 70% pada daerah rongga udara dan dibuat sumur pada daerah tersebut. Dengan menggunakan spoit, 0.1-0.3 ml inokulum diinokulasikan dengan cara memasukkan jarum secara vertikal ke dalam sumur sedalam panjang jarum. Dalam percobaan ini jumlah inokulum yang diinokulasikan adalah 0.2 ml.

 Sumur bekas penyuntikan kemudian ditutup dengan menggunakan kertas label dan dikembalikan kedalam inkubator kurang lebih selama 2-3 hari untuk kemudian diamati pertumbuhan embrio dan perubahan yang terjadi. Telur-telur tersebut diambil, baik yang telah mati maupun yang masih hidup. Untuk telur yang embrionya masih hidup didinginkan pada suhu 40C. Panen Virus Desinfeksi bagian tumpul dari telur berembrio (bagian rongga udara) dengan menggosokkan alkohol 70%. Dengan menggunakan pinset yang tajam, pecahkan kerabang telur lalu buat sumur sebesar rongga udara. Robek selaput dari membran korio allantois. Dengan menggunakan pinset, tekan embrio kesamping sehingga terlihat cairan korio allantois di sisi embrio, ambil cairan tersebut dengan menggunakan mikro pipet secukupnya. Pengamatan Embrio Pada telur yang telah diambil cairan allantoisnya, embrio dikeluarkan dan dipisahkan dari kantong kuning telur. Cairan allantois tersebut akan digunakan sebagai suspensi virus untuk uji HA dan HI. Berat embrio ditimbang dan diukur panjangnya untuk kemudian dibandingkan dengan embrio kontrol. Selain itu, diamati pula perubahan morfologi Berat dan panjang embrio yang diperoleh adalah 8.6 gram dan 5.5 cm. Nilai ini lebih rendah jika dibandingkan dengan embrio kontrol yang memiliki berat 11.6 gram dan panjang 6.9 cm. Perubahan morfologi yang tampak pada embrio adalah ukuran lebih kecil dan mengalami haemorraghi pada kepala. Uji HA Cepat Siapkan gelas objek yang telah dibersihkan dengan menggunakan alkohol 70%. Kemudian teteskan RBC 5% sebanyak 0.025ml dan campurkan dengan suspensi

virus dengan perbandingan 1:1.

Selain itu, kontrol negatif dibuat dengan

mencampurkan RBC 5% dengan NaCl fisiologis dengan perbandingan 1:1 Nilai positif didapat jika terlihat aglutinasi seperti butiran pasir. Hasil dari

percobaan menunjukkan bahwa suspensi virus dari organ limpa dapat mengaglutinasi sel darah merah. Pengujian HA Sumur-sumur mikroplet V yang terdiri dari no 1-11 pada deret A dan B (tergantung banyak material yang diuji) diisi masing-masing 0.025 ml larutan NaCl fisiologis menggunakan mikropipet Sebanyak 0.025 ml suspensi virus ditambahkan pada sumur deret A dan B kemudian dihomogenkan dengan cara menghisap dan melepaskan hisapan sebanyak lima kali menggunakan mikropipet. Setelah homogen, 0.025 ml cairan diambil dari sumur 1 dan dimasukkan ke sumur kedua dan dihomogenkan, diambil campuran tadi dari sumur 2 sebanyak 0.025 ml suspensi dan dimasukkan ke sumur 3. Begitu seterusnya hingga sumur 11 Kemudia sebanyak 0.025 ml NaCl dimasukkan lagi kedalam setiap sumur pengujian. Ditambahkan sebanyak 0.025 ml suspensi sel darah merah ayam 1 % pada setiap sumur pengujian. Sumur ke 12 pada baris A digunakan sebagai kontrol negatif. Kontrol negatif terdiri dari 0.025 ml NaCl dan 0.025 RBC 1%. Kontrol negatif akan nampak adanya endapan darah yang berbetuk seperti tetesan air mata. Sumur ke 12 pada baris B digunakan sebagai kontrol positif. Kontrol positif terdiri dari 0.025 ml NaCl, 0.025 suspensi virus, dan 0.025 RBC 1%. Kontrol positif akan nampak adanya butiran pasir yang berarti terjadi aglutinasi RBC. Pencampuran (homogenisasi) dilakukan dengan cara mengetuk-ketuk mikroplate secara perlahan-lahan, kemudian didiamkan beberapa menit pada suhu kamar (270C) sampai hasil uji HA dapat terbaca. Pembacaan hasil dilakukan dengan memiringkan plate 450 dan titer antigen yang diperoleh adalah 25 HAU.

KEGIATAN LANJUTAN Pengujian HI Penyiapan antigen 4 HAU Dari hasil yang diperoleh yaitu 25 HAU akan diencerkan menjadi 22 HAU dengan cara menambahkan 1 ml virus dengan 7 ml NaCl fisiologis. Kemudian dilakukan pengujian HA seperti perlakuan yang diatas untuk memastikan bahwa hasil yang diperoleh adalah benar 22 HAU. Sumur-sumur mikroplet V yang terdiri dari no 1-11 pada deret A dan B (tergantung banyak material yang diuji) diisi masing-masing 0.025 ml larutan NaCl fisiologis menggunakan mikropipet Pengenceran serum dengan cara sebanyak 0.025 ml serum ditambahkan pada sumur deret A dan B kemudian dihomogenkan dengan cara menghisap dan melepaskan hisapan sebanyak lima kali menggunakan mikropipet. Setelah homogen, 0.025 ml cairan diambil dari sumur 1 dan dimasukkan ke sumur kedua dan dihomogenkan, diambil campuran tadi dari sumur 2 sebanyak 0.025 ml dan dimasukkan ke sumur 3. Begitu seterusnya hingga sumur 11. Suspensi virus standar 4 HAU ditambahkan sebesar 0.025 ml ke dalam sumur no 1 sampai sumur no 11 baris A dan B. Mikroplate didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar. Suspensi sel darah merah ayam 1% ditambahkan sebanyak 0.025 ml ke dalam sumur no 1 sampai 12. Sumur ke 12 pada baris A digunakan sebagai kontrol negatif. Kontrol negatif terdiri dari 0.025 ml NaCl, 0.025 ml suspensi virus dan 0.025 RBC 1%. Kontrol negatif akan nampak adanya butiran pasir yang berarti terjadi aglutinasi RBC. Sumur ke 12 pada baris B digunakan sebagai kontrol positif. Kontrol positif terdiri dari 0.025 ml NaCl, 0.025 serum, 0.025 suspensi virus, dan 0.025 RBC 1%. Kontrol positif akan nampak adanya endapan darah yang berbetuk seperti tetesan air mata. Hal ini berarti serum memiliki antibodi terhadap antigen dari suspensi virus, sehingga proses aglutinasi tidak terjadi. Mikroplate kemudian didiamkan kembali kurang lebih 30 menit atau sampai hasil dapat dibaca pada suhu kamar.

Pembacaan hasil dimulai dengan memiringkan plate sebesar 450 .

Pembacaan hasil Titer hambatan hemaglutinasi serum (titer antibodi) dihitung jika pada pengenceran serum 1/16 (24) atau lebih, serum mampu menghambat hemaglutinasi secara sempurna terhadap virus standar 4 HAU.