Control de neosporosis en ganado con Bovilis Neoguard: la experiencia en el campo.

Muoz Bielsa J , Romero JJ , Heuer C

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Intervet International bv, PO Box 31, 5830 AA Boxmeer, The Netherlands 2 Programa de Investigacin en Medicina Poblacional. Escuela de Medicina Veterinaria. Universidad Nacional, Barreal, Heredia, Costa Rica. PO Box 304-3000 Heredia, Costa Rica. 3EpiCentre, Institute of Veterinary, Animal and Biomedical Sciences, Massey University, Palmerston North, NZ;
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Resumen
Bovilis Neoguard es una vacuna Neospora caninum inactivada creada para reducir la tasa de abortos debido al N. caninum en el ganado. La eficacia de la vacuna se evalu en dos pruebas de campo distintas. En ambas la vacuna demostr ser eficaz en la reduccin de la tasa general de abortos. Puesto que el aborto en el ganado es causado por una variedad de distintos factores infecciosos y no infecciosos, la reduccin esperada en la incidencia de abortos inducidos por N. caninum debera ser mayor. Entre establos, las diferencias pueden deberse a distintos factores, siendo los ms relevantes la tasa de infeccin por N. caninum y el tiempo que ocurre la infeccin..

Introduccin
N. caninum es un parsito protozoario de la familia Apicomplexa que fue identificado como causa de aborto en el ganado en 1989 (Thilsted y otros, 1989). Desde entonces se ha demostrado que los efectos negativos de la infeccin por N. caninum incluyen no solo aborto sino tambin mortalidad de embriones, reduccin en la produccin de leche, una mayor tasa de vacas descartes (Trees y otros, 1999), nacimiento de terneros con anormalidades congnitas y disminucin en la tasa de crecimiento en terneros (Barling y otros, 2000). Las consecuencias de la infeccin por N. caninum depende en el tiempo de gestacin en que el parsito llega al tero y consiguientemente al feto (Williams y otros, 2000). Cuanto ms temprana se presente la parasitemia, mayor ser el efecto patognico para el feto. Es en el primer y segundo trimestre de gestacin cuando las infecciones por N. caninum tienen el peor efecto sobre la reproduccin, las cuales se caracterizan por una alta mortalidad de embriones durante el primer trimestre y aborto durante el segundo. La infeccin en la gestacin tarda rara vez resulta en aborto sino ms bien en el nacimiento de terneros congnitamente infectados o terneros con anormalidades congnitas. La mayora de las infecciones en el ganado est recrudeciendo por infecciones previamente adquiridas (transmisin Vertical) pero tambin pueden darse despus del nacimiento (transmisin Horizontal) debido a la ingesta de oocistos expulsados por los perros (Dubey y otros, 2003). El perro (McAllister y otros, 1998) y el coyote (Gondim y otros, 2004) son los nicos huspedes definitivos demostrados de N. caninum, pero lso anticuerpos contra este parsito han sido detectados en otros carnvoros (Schares y otros, 2001). Una de las consecuencias de la transmisin vertical del parsito es el nacimiento de animales congnitamente infectados. Estos animales tienen una apariencia normal pero el parsito se ha enquistado en distintos tejidos del animal.

Cuando estos animales congnitamente infectados quedan preados, se produce la reactivacin del parsito que se sospecha es el resultado de una regulacin descendente del sistema inmunolgico de la vaca durante la gestacin (Innes y otros, 2002). La reactivacin ha sido documentada durante el segundo trimestre de gestacin con las consecuencias negativas sobre la reproduccin arriba mencionadas (Guy y otros, 2001). El aborto no sucede solo una vez sino que puede volverse a presentar en futuras gestaciones (Anderson y otros, 1995). El ganado puede ser infectado por una fuente externa durante cualquier etapa de sus vidas. Sin embargo, cuando un animal sin exposicin previo se infecta durante la gestacin, las consecuencias variarn dependiendo de la fase de gestacin en la que se produzca la infeccin. En estudios con exposicin controlada se ha demostrado que la infeccin experimental de animales no preados y sin exposicin previo no tiene ningn efecto negativo durante la subsiguiente gestacin (Innes y otros, 2001). Asimismo, la infeccin con el parsito durante el tiempo de pre-apareamiento indujo una respuesta inmunolgica que protegi contra una exposicin administrada a mediados de la gestacin (Innes y otros, 2001). El control de la enfermedad hasta hace poco se basaba principalmente en el control de la poblacin canina en el establo as como en la eliminacin de la posible fuente de infeccin para ellos (placenta y feto abortado). Estas medidas pueden ser eficaces para evitar nuevos brotes, sin embargo no tendrn ningn efecto para controlar la recrudescencia de infecciones latentes. Resulta necesaria la creacin de una vacuna que reduzca los efectos negativos de la infeccin N. caninum debido ya sea a recrudescencia de infecciones latentes o infecciones post-natales, a fin de mantener la rentabilidad de las empresas de carnes y leche. Aunque estos animales congnitamente infectados ya hayan sido inmunizados en tero por el parsito, la respuesta inmunolgica inducida no es suficiente para protegerlos cuando la reactivacin del parsito tenga lugar durante subsiguientes gestaciones. Lograr la inmunizacin protectora de los animales que ya han sido sensibilizados por el parsito lleg a ser un gran reto. La proteccin efectiva contra el parsito requiere no slo la induccin de anticuerpos especficos N. caninum sino tambin la estimulacin de respuestas de inmunidad celular mediata. Teniendo en mente estos objetivos claros Intervet desarroll una vacuna inactivada que reducira la tasa de abortos debido a N. caninum. Bovilis Neoguard contiene taquizotos inactivados de N. caninum con adyuvante de SPUR. La seleccin de adyuvante se basa en la capacidad de SPUR de estimular no slo la respuesta humoral sino tambin una de inmunidad celular mediata. Asimismo, se ha demostrado que SPUR induce una reaccin mnima en el sitio de inyeccin, convirtindolo en un adyuvante seguro y eficaz. Los resultados positivos logrados con Bovilis Neoguard en estudios de desafos controlados en laboratorio (Purtle y otros, 2001) necesitaban ser confirmados en pruebas de campo. Se realizaron dos pruebas de campo en hatos lecheros de Costa Rica y Nueva Zelanda. El objetivo de estos estudios consista en evaluar el efecto de Bovilis Neoguard al reducir la tasa de aborto global en establos que se sospechaba estaban infectadas por N. caninum.

Prueba de campo en Costa Rica

Materiales y mtodos
Descripcin de la prueba El diseo de estudio fue un experimento comparativo con 2 grupos: un grupo conformado por animales vacunados y otro grupo de animales tratados con un placebo. El tamao de muestra por grupo se calcul mediante WinEpiscope 2.0 (Thrusfield, 2001) con un porcentaje esperado de aborto de 8% en el grupo vacunado y 15% en los de control, un nivel de confianza de 95% y una potencia de 90%. El porcentaje global de abortos en los establos seleccionados se calcul que era de aproximadamente 15%. El tamao de muestra requerido es entonces de 433 animales preados por grupo. Se incluy animales de 25 hatos lecheros costarricenses. Los hatos estaban ubicados en las reas lecheras de Pos, Cartago y San Carlos. Establos Los establos involucrados fueron seleccionadas intencionalmente, porque todas ellas usan VAMPP 5.1 (Veterinary Automated Management and Production control Programme. (Noordhuizen y Buurman, 1984)) Y cuentan con un veterinario que es responsable del programa de salud de hatos. Las enfermedades abortivas como IBR, BVD y leptospirosis fueron previamente diagnosticadas en los establos mediante pruebas serolgicas, pero no como parte de este estudio. Las prevalencias de estas enfermedades eran desconocidas por cada establo. En algunos hatos la brucelosis estuvo presente en niveles bajos (menos del 2%). Los establos en estudio son altamente tcnicos y los niveles de productividad son cercanos a los hallados en pases templados. Una alta proporcin de vacas es criada por inseminacin artificial. Las vacas son ordeadas dos veces al da y tienen acceso a pastizales todo el ao. El uso de concentrados, como complemento de la alimentacin en praderas naturales, es relativamente alto, representando hasta 45% del total de costos. A continuacin se presenta algunos parmetros reproductivos de los hatos incluidos en el estudio. Parmetro Tamao del hato Produccin lctea 305 das Intervalo de paricin Edad en la primera paricin (meses) Periodo de lactancia Servicios por preez Promedio 92 (mediana = 83) 5487 395 27 328 1.90 Rango 40 217 4500 9750 375 420 25 32 270 340 1.7 1.97

Animales Las vacas preadas (confirmado mediante palpacin rectal por un veterinario) fueron elegibles para su inclusin. Se excluy a vacas con un diagnstico positivo previo de IBR, BVD, brucelosis, leptospirosis o neosporosis. El estado serolgico hacia las enfermedades abortivas para el resto de las vacas seleccionadas era desconocido pero debido al gran nmero de animales se espera que las vacas con un historial desconocido de infecciones potencialmente abortivas fuesen uniformemente distribuidas entre los grupos de tratamiento. Las vacas tratadas que dejaron el establo mientras estaban en prueba (antes de la paricin y sin aborto) fueron retiradas de la base de datos. El nmero de vacas seleccionadas de un hato fue proporcional al tamao del establo. Por cada vaca tratada con el componente activo, se seleccion un animal de control del mismo hato, raza y categora de edad. Se consideraron cuatro categoras de edad: parto 0 (vaquillonas), paridad 1, partos 2 y 3, parto 4 o mayor. Caractersticas de las vacas como edad, paridad, raza, edad gestacional al final de la preez, diagnsticos previos de otras enfermedades, etc., fueron extradas de la base de datos central del VAMPP. Tratamientos Los tratamientos se aplicaron entre junio y noviembre 2000 durante las visitas rutinarias de los veterinarios para la salud de los hatos. Estas visitas tuvieron un intervalo de 2 a 4 semanas entre s. La vacuna se bas en taquizotos inactivados de N. caninum (3 x 106 por ml en la cosecha), adyuvante al 10%, estabilizadores al 5% y Solucin Salina Amortiguada en Fosfato al 5% (BovilisNeoguard, Intervet). El placebo consisti en una infusin salina isotnica especialmente preparada para esta prueba por Laboratorios Alcames, Costa Rica. El placebo tena una apariencia como la vacuna y ambos estaban envasados en frascos idnticos. El primer tratamiento fue administrado entre el da 75 y 90 de gestacin seguido de una dosis de refuerzo 4 semanas despus. Las vacunas y los placebos fueron almacenados todo el tiempo a 4- 6 Celsius. Una dosis de 5 ml de vacuna fue inyectada subcutneamente (en el cuello con una aguja desechable de 18 x 1.5) siguiendo las instrucciones del fabricante. Diagnstico Los veterinarios siguieron todas las vacas tratadas desde la primera aplicacin del tratamiento hasta el nacimiento o la prdida fetal. Hubo dos formas de deteccin de prdida fetal: 1) observacin directa del feto abortado y 2) vaca diagnosticada como vaca por palpacin rectal despus de que haba sido hallada positiva previamente. Las vacas fueron revisadas para detectar si haba prdida fetal a los 4 y 7 meses de gestacin. Anlisis de datos La variable de resultado tuvo una naturaleza dictoma indicando el tipo de final de la gestacin: 0) parto de un ternero saludable despus del da 270 de gestacin o 1) cualquier evento aparte de un parto normal indicativo de infeccin de Neospora como: momificacin, aborto, muerte neonatal o parto de feto muerto con trastornos neurolgicos. La momificacin fue diagnosticada por palpacin rectal. Se realiz una descripcin de proporciones de tratamientos administrados por establo, raza y paricin. Se utiliz la fraccin prevenida (Rothman y Greenland, 1998) para evaluar la eficacia de la vacuna. Esta medida se calcul como sigue: 4

PFvacuna = 1 incidencia vacuna incidencia placebo Igualmente, se calcul la tasa del riesgo (RR) con su 95% de intervalo de confianza. Se efectu un anlisis de supervivencia para comparar las curvas de falla de ambos grupos de tratamiento y evaluar la relacin entre el tratamiento y el tiempo hasta el aborto. Este anlisis se realiz empleando una grfica de supervivencia Kaplan-Meier y una prueba Wilcoxon mediante STATA. Tambin se compararon las funciones de supervivencia en cuanto los vacunados y placebos empleando la regresin de peligro proporcional Cox mientras se tom en cuenta el efecto del hato y el efecto de par (modelo de fragilidad) mediante S-PLUS 2000 versin 3.

Resultados
Ms de 900 vacas (464 en el grupo de vacuna y 467 en el grupo placebo) estaban registradas en el estudio. Diecisiete animales (10 vacas vacunadas y 10 de control) se perdieron debido a eliminacin durante el estudio. Treinta animales (16 en el grupo de vacuna y 14 de control) no fueron emparejados ya sea debido al hecho de que su pareja fue eliminada o a que fueron tratados justo antes que la prueba terminase. Cuatro de estos 30 animales tuvieron un aborto, 2 en cada grupo. En 4 parejas ambos animales fueron codificados como tratados en forma similar y estos fueron excluidos. Por lo tanto, el nmero total de parejas apareadas utilizado en el anlisis fue de 438. El nmero de parejas por establo vari entre 2 y 49 (mediana 15). En 2 de los 25 hatos no se observ abortos en los animales tratados. Estos 2 hatos estuvieron presentes con 2 y 7 pares respectivamente (Figura 1). Se trataron 240 vacas Holstein, 587 Jersey y 49 (Holstein x Jersey). Con respecto al nmero de partos, 186 fueron vaquillonas, 274 fueron de primera paricin, 221 haban tenido 2 o 3 partos y 195 vacas haban tenido 4 o ms partos.
Figura 1. Nmero de abortos por nmero de parejas por hato.

Con respecto a la seguridad de la vacuna, no se reportaron efectos adversos en el lugar de la aplicacin de la vacuna ni otros efectos secundarios como disminucin de la produccin de leche o cambios en el comportamiento de las vacas.

La incidencia cruda del aborto entre todas las vacas tratadas fue de 16.0% (140/876). La incidencia de aborto especfica del tratamiento fue de 11.2% (49/438) en el grupo vacunado y 20.8% (91/438) en el grupo placebo. La incidencia de aborto para Holstein y Jersey fue de 15.8% (38/240) y 15.7% (92/587) respectivamente. La fraccin prevenida por vacunacin ascendi a (1-11.2/20.8) = 0.46 (95% CI: 0.26, 0.61). Las curvas de aborto Kaplan-Meier (o curvas de fallo de preez) (Figura 2) son estadsticamente distintas que las de la prueba Wilcoxon (el valor Chi cuadrado es 15.4, p < 0.001) que indica que ambas curvas son distintas. Un posterior anlisis del tiempo hasta el aborto empleando la regresin de peligro proporcional demostr que no haba efecto nmero de parto, raza ni hato sobre el aborto, lo cual se esperaba debido al diseo emparejado. Asimismo el efecto de parejas dentro de los hatos fue insignificante, reduciendo el modelo a un modelo con tratamiento nicamente. Luego, el ndice de peligro Cox fue de 0.51 (95% CI: 0.36, 0.72), lo que quiere decir que la fuerza del aborto en el grupo vacunado es la mitad de la fuerza en el grupo placebo.

Figure 2: Curvas de aborto Kaplan-Meier en los grupos placebo y los tratados con vacuna.

Discusin
El anlisis indic que la vacuna, en comparacin con los placebos, evit el 46.2% de abortos. En otras palabras, casi la mitad de los abortos en el grupo vacunado podra haberse evitado con la vacuna. Igualmente, el anlisis que emplea tcnicas de supervivencia demostr que la fuerza de abortos en el grupo vacunado fue de aproximadamente la mitad de la del grupo tratado con placebo. Esta reduccin en la tasa de abortos es muy significativa al considerar que el aborto puede ser inducido por varias causas infecciosas y no infecciosas, no solo la neosporosis. Bien podra ser que el nivel de infecciones por Neospora en Costa Rica sea mayor que en cualquier otra parte (Romero y otros, 2002), y que por tanto el efecto de la vacuna sea considerablemente alto. En esta prueba se minimiz el error sistemtico empleando un diseo de parejas en el cual un par consista en 2 animales con el mismo nmero de partos y de la misma raza y se originaban del mismo hato. Los clculos de tamao de muestra indicaron que deba incluirse ms de 400 animales por grupo (tasas de aborto estimadas 15% y 8%, potencia de 90%, nivel de confianza de 2 colas de 95%).

Debido a estas grandes cantidades, otras posibles fuentes que pueden afectar la tasa de abortos, como la ocurrencia de aborto en otras enfermedades abortivas, se asumen que son igualmente distribuidas sobre ambos grupos de tratamiento. Una crtica sobre esta prueba podra ser que el placebo no contena adyuvante que hubiera tenido algn efecto sobre el estado inmunolgico. No obstante, no consideramos que el adyuvante nicamente pudiera haber ejercido el efecto marcado que se hall. Otra crtica podra ser que los animales no fueron probados con respecto a otras enfermedades abortivas pero debido al gran tamao de muestra consideramos que tales efectos se han nivelado. Asimismo, no se ha realizado pruebas de fetos abortados, como en la mayora de casos el feto abortado ser absorbido o no ser hallado debido al apacentamiento anual. Un previo estudio realizado por Innes y otros (2001) demostr que la infeccin experimental de vacas con taquizotos N. caninum antes del apareamiento fue protectora contra la transmisin vertical cuando a los animales se les aplic N. caninum en la media gestacin. Los anticuerpos maternales al N. caninum per se no evitan la infeccin fetal (Barr y otros, 1993). Sin embargo, Par y otros (1997) y Piergili-Fioreti y otros (2000) demostraron que era menos probable que las vacas seropositivas con altos niveles de anticuerpos en el tercer trimestre de gestacin abortaran que las vacas con bajos niveles de anticuerpos en ese momento. Esto podra deberse a un efecto combinado del nivel de anticuerpos en la madre y la inmuno-competencia del feto en esta etapa de la preez (Osburn, 1986). El destino del feto depende del momento de la infeccin, la carga parasitaria y la edad gestacional del feto (Williams y otros., 2000). Por tanto, es posible que la vacuna que investigamos provoque una respuesta inmunolgica que evite que se alcance la dosis mnima que causa muerte fetal. Desafortunadamente, no tenemos evidencia de una reducida transmisin in tero porque no se tomaron muestras pre-colostrales de los terneros ya que en general los terneros nacen en el campo sin ayuda alguna. Nuestros resultados respaldan la hiptesis de que la vacunacin lleva a una respuesta inmunolgica maternal que protege al feto contra la muerte durante su periodo de inmadurez inmunolgica (antes de los 6 meses), resultando en un ternero clnicamente saludable. Nuestro estudio demuestra que toda la preparacin de taquizotos Neospora caninum inactivada tuvo una eficacia razonable. Asimismo, este estudio da ms evidencia sobre la importancia de la neosporosis como causa abortiva en los hatos lcteos de Costa Rica.

Prueba de campo en Nueva Zelanda

Materiales y mtodos
Descripcin de la prueba El diseo del estudio fue un experimento comparativo con dos grupos: un grupo conformado por animales vacunados y un grupo de animales en emparejados y tratados con placebo. El tamao de muestra logr una potencia de 80% para probar la hiptesis de que la vacunacin reduca la tasa de aborto de alrededor de 8% en las vacas de control a 4% en las vacas vacunadas con un 95% de confianza . Los establos registrados tenan una historia de >8% tasas de aborto previas.
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Establos En la prueba se registraron cinco establos lecheros con paricin estacional. Su sistema de cultivo pareca el de los establos lecheras con pasto tpico en Nueva Zelanda. Como todas las vacas parieron en primavera (agosto-septiembre), la alimentacin con pasto se suplement con ensilaje de maz o pasto-maz para sostener la alta produccin lctea al inicio de la lactancia. El nivel de produccin de estos establos de prueba estuvo ligeramente por encima del promedio nacional; todos los granjeros utilizaron sistemas de registro electrnicos (DairyWIN). Los establos fueron seleccionadas para la prueba porque tenan una historia documentada de altas tasas de aborto (>8%) y con presencia confirmada de infeccin N. caninum. Los animales en el hato #3 haban sido vacunados para BVD inmediatamente antes del inicio de la prueba, y todos los hatos fueron vacunados contra Leptospira interrogans serovariantes hardjo, copenhageni, pomona anualmente durante la preez temprana (Marzo Mayo). Tratamientos Las vacas y vaquillonas fueron probadas en cuanto a preez para identificar la poblacin de prueba de los animales preados. La mitad de todos los animales preados dentro de cada hato fue seleccionada por asignacin aleatoria sistemtica y vacunada dos veces con 5ml subcutneamente (s.c.) a intervalos de 3-4 semanas con vacuna N. caninum (Bovilis Neoguard, Intervet). La otra mitad fue simultneamente inyectada con un placebo 5ml s.c. (solucin de cloruro de sodio al 0.9%). La segunda vacunacin no fue aplicada posteriormente a los tres meses despus de la concepcin. Las concepciones tardas fueron registradas a la confirmacin de preez en el momento de la segunda vacunacin de las vacas originalmente registradas en cada uno de los hatos de prueba. Se les dio una segunda vacunacin tres a cuatro semanas despus. La respuesta del anticuerpo de todos los animales se midi antes y, en un subgrupo aleatorio (n = 414), despus de la vacunacin. En el subgrupo aleatorio se incluy controles para diferenciar una respuesta de ttulo despus de la vacunacin a partir de la exposicin natural o recrudescencia.
1 El

tamao de muestra considera un efecto de diseo de 2, es decir el tamao de la muestra se duplic porque se asumi que el efecto de la vacuna no era el mismo en cada hato (de ah que se esperaba que la respuesta se correlacionara dentro del hato). La potencia es la probabilidad de que una diferencia detectada de <5% de abortos sea realmente <5%, por tanto esta probabilidad es la potencia para detectar una diferencia existente de = 5%; la confianza es la probabilidad de que una diferencia detectada de = 5% de abortos sea realmente = 5%, por tanto no se produjo al realizar el muestreo de la variacin independientemente (es decir, probabilidad).

La respuesta de los anticuerpos se clasific como ausente (ttulo 0 o 100) o presente (etapas de ttulo de 200, 600, 800, 1000, 2000 o 4000). Las reacciones en el sitio de la inyeccin fueron monitoreadas en una muestra de animales vacunados y de control 72 horas despus de la vacunacin (n = 354). La respuesta se midi en una escala de 0-2 (0 = sin respuesta, 1= respuesta leve, 2 = respuesta fuerte). Anlisis de datos Los datos fueron analizados por regresin logstica con el aborto (s/no) como resultado binomial. El modelo incluy trminos de interaccin para vacunacin por hato, vacunacin por edad (vaca/vaquillona) y vacunacin por estado NEO-suero antes de la vacunacin (positivo/negativo). El anlisis de un efecto de vacunacin se bas en la diferencia entre medias de cuadrados mnimos de los sub-grupos de vacunacin de estos efectos de interaccin.

Resultados
En total, 2240 vacas fueron registradas y distribuidas aleatoriamente a vacunadas (n = 1125 incluyendo 245 vaquillonas) y placebo (n = 1115 incluyendo 241 vaquillonas). En ambos grupos de prueba, 11% de todos los animales resultaron sero-positivos a los anticuerpos N. caninum (IFAT = 200), y esto fue similar en vacas y vaquillonas. La distribucin del establo, edad y ttulo IFAT antes de la vacunacin fue similar en las vacas vacunadas y placebo, por tanto la distribucin aleatoria fue exitosa. Se observ una ligera reaccin en el sitio de inyeccin en 14% despus de la primera vacunacin y en 13% despus de la segunda en animales vacunados. Slo 1 de 168 vacas placebo mostraron una reaccin leve (Tabla 1). Tres por ciento de las vacas vacunadas y ninguna de placebo mostraron una fuerte reaccin en el sitio despus de la segunda vacunacin. Las cuatro reacciones fuertes provinieron de un solo establo (Establo 8), por tanto no pudieron ser diferenciadas de sesgo del observador. La tasa de reacciones leves fue similar en todos los establos.
Tabla 1: Reaccin en el sitio despus de la 1 y 2 vacunaciones (n = 354)

Reaccin Ninguna Leve Fuerte

1 vacunacin Neoguard 57 9 0

Placebo 59 0 0

2 vacunacin Neoguard 99 16 4

Placebo 109 1 0

En la Figura 1 se muestra la respuesta inmunolgica de las vacas seleccionadas aleatoriamente (n=314) y vaquillonas (n=100) medida como el incremento promedio de ttulo IFAT. Hubo una respuesta positiva significativa en todos los establos. La respuesta fue similar en vacas y vaquillonas. Aunque hubo un aumento de ttulo significativo en el establo 7 (p = 0.06), fue en promedio 346 unidades de ttulo menor que en el establo 8 (p = 0.0002). El aumento de anticuerpos en todos los dems hatos fue similar al establo 8. La sero-prevalencia en las vacas vacunadas aument de 11.6% a 88.0% y en las vacas placebo de 10.5% a 22.7% (p < 0.001; Figura 3). 9

Figura 3: Estado de anticuerpos antes y despus de la vacunacin en vacas seleccionadas aleatoriamente y vaquillonas (n=242 en Neoguard; n=172 en placebo)

Hubo 111 abortos entre las vacas registradas en la prueba. El material abortado fue recuperado del 66% (73/111) de dichas vacas. Se hall que el otro 34% (38/111) no estaba preado al inicio del siguiente periodo de lactancia y por tanto no haba material fetal disponible de dichos abortos. Se hizo un diagnstico provisional en 49% (36/73) de los casos en que se recolect muestras cerca al momento del evento. Se hall que N. caninum fue la causa ms probable de 23 abortos, BVD de 4, L. interrogans serovariantes Pomona o hardjobovis de 3, y bacterial placentitis bacteriana de 6 abortos. La fecha del momento del aborto dependi de la intensidad por la cual los dueos de hatos observaban las vacas pastando, y esto fue probablemente distinto entre establos. Sin embargo, la comparacin del momento de la ocurrencia de aborto entre los animales vacunados y placebo fue imparcial por establo debido a la distribucin aleatoria de la vacas en dichos grupos dentro del establo. La figura 4 muestra que el mes de ocurrencia pareca variar entre las vacas vacunadas y placebo. A travs de toda la gestacin hasta cerca de la paricin, la frecuencia acumulada de abortos fue menor en las vacas vacunadas que en las de placebo. No obstante, hubo un repentino aumento en cuanto a vacas halladas vacas en la paricin, especialmente en el grupo vacunado. Esto pudo haberse debido a abortos algo tempranos porque un feto pequeo quizs tena menos probabilidades de ser observado que un feto grande. Por tanto, tales vacas presumiblemente permanecieron vacas hasta que fueron examinadas en el momento esperado de paricin en agosto/septiembre. Sin embargo, la proporcin de vacas abortantes que se hallaron vacas en la paricin tendi a ser mayor en el grupo vacunado que en el placebo (p = 0.07).

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Figura 4: Cantidades mensuales de abortos observados

Las tasas de aborto globales en las cinco establos participantes en la prueba fueron menores que lo esperado: 94 entre 1754 vacas abortaron (5.4%) y 17 entre 486 vaquillonas abortaron (3.5%) siendo la diferencia significativamente limtrofe (p = 0.099). Entre los 1115 animales no vacunados, 63 (5.7%) abortados, y 48 abortados entre 1125 animales vacunados (4.3%); la tasa cruda de 5.7% en el grupo placebo fue Considerablemente menor que la tasa esperada de aproximadamente 8-10%. La tasa de abortos global de 4.3% en animales vacunados versus 5.7% en animales no vacunados result en un riesgo relativo (RR) de 4.3/5.7 = 0.754 (p = 0.131). Por consiguiente, la eficacia global de la vacuna, calculada como 1 RR, fue de 24.6%. Independientemente de las diferencias entre establos, los abortos tendieron a ser ms frecuentes en las vacas placebo que en las vacas vacunadas (p <0.1), pero la diferencia fue pequea y no significativa en las vaquillonas. La figura 5 muestra que solo dos hatos (establo 6 y establo 8) tuvieron tasas de aborto tan altas como las esperadas. La vacuna tuvo una eficacia significativa de 54% en uno de dichos hatos (Establo 6; p < 0.05); este hato tambin tuvo la ms alta prevalencia de anticuerpos antes de la vacunacin (22% IFAT, Tabla 2). El otro hato no mostr efectos de la vacuna y tuvo un 14% de prevalencia de anticuerpos antes de la vacunacin. El establo 4 dio como resultado una eficacia de vacuna no significativa de 27% (IFAT 7.4% antes de la vacunacin) y el establo 7 una eficacia no significativa de 30% (IFAT 5.2% antes de la vacunacin). Estas ltimos dos establos tuvieron bajas tasas globales de aborto. No se pudo hallar una eficacia de la vacuna en el establo 8 a pesar de una alta prevalencia antes de la vacunacin y frecuencia de abortos, ni en el establo 3 que tena una baja tasa de abortos.

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Figura 5: Medias de cuadrados mnimos de incidencias de aborto de animales vacunados y placebo en los cinco hatos de prueba

Como se esperaba, las incidencias de aborto fueron sustancialmente mayores en las vacas que eran seropositivas antes de la vacunacin. La eficacia de la vacuna fue similar en ambos grupos (19%) (Figura 6).
Figure 6: Medias de cuadrados mnimos de incidencias de aborto en vacas vacunadas y placebo segn estado NEO-sero antes de la vacunacin

Como se describiera anteriormente (Figura 4), se hall que 38 de las 111 vacas abortantes estaban vacas en el momento de la paricin esperada. Una probable razn para la deteccin tarda es que estos abortos ocurrieron en gestacin temprana, posiblemente antes de que la vacuna pudiera inducir un efecto protector. En lo sucesivo, por tanto se les denominar abortos tempranos. La proporcin de vacas abortantes tempranamente fue mayor en el grupo vacunado (43.8%) que en el grupo placebo (27.0%; p = 0.07), siendo la diferencia principalmente atribuible a el establo #7 (p = 0.058) que tena un nivel bajo de abortos (2.8%). En el establo que experimentaba una alta incidencia de abortos y que no respondi a la vacunacin (#8), ms vacas abortantes tempranas que tardas fueron sero-positivas antes de la vacunacin (6/27 (22.2%) versus 10/16 (62.5%); p = 0.012). Hubo una tendencia entre los animales abortantes de que los abortos tempranos fueron ms frecuentes en las vaquillonas que en las vacas (p = 0.098). Un ao despus de la prueba, el establo #8 (sin respuesta a la vacunacin) volvi a experimentar abortos tempranos en 24 vacas aproximadamente a las 8-12 semanas de gestacin. Una muestra de suero despus del aborto de dichas vacas y de 22 vacas preadas 12

seleccionadas aleatoriamente mostr que las vacas abortantes tenan significativamente ms probabilidades de ser NEO sero-positivas que las vacas no abortantes sugiriendo que dichos abortos tempranos estaban relacionados con la infeccin por neospora. El aborto fue independiente de la vacunacin contra NEO en el ao anterior. Actualmente se les est haciendo un seguimiento a los ttulos de suero de estas vacas y muestras de sangre total son sometidas a prueba mediante la prueba de PCR que en la actualidad est siendo desarrollado en el Instituto de Ciencias Veterinarias, Animales y Biomdicas de Massey University, Palmerston North, Nueva Zelanda.

Discusin
La dinmica de la transmisin de N. caninum entre vacas y la consecuencia de infeccin an son escasamente comprendidas. Mientras que la transmisin horizontal (postnatal) debido a perros infectados y portadores parece ocurrir en muchos hatos lecheros infectados con tasas de aborto consistentemente elevadas (Dijkstra y otros, 2002), la transmisin vertical (transplacental) es aparentemente mucho ms frecuente que la transmisin postnatal (Davison y otros, 1999b). Ambas vas pueden estar presentes y este fue presumiblemente el caso en los hatos de prueba. La transmisin vertical estuvo indicada por un historial de infeccin crnica en todos los hatos. El aumento en la prevalencia de vacas sero-positivas en el grupo placebo sugiri que tambin haba ocurrido transmisin horizontal o recrudescencia en la lactancia temprana. Claramente, la neosporosis es una enfermedad factorial en la que una variedad de causas contribuyentes puede llevar a infeccin oral y recrudescencia. Por tanto, la respuesta variable a la vacunacin en las distintas establos no fue sorprendente. No obstante, hubo evidencia de un efecto protector de vacunacin con eficacias de hasta 54% para los diversos subgrupos en los datos incluyendo todas las vacas y vaquillonas registradas. La prueba revel evidencia para la hiptesis de que N. caninum puede inducir aborto no solo en aproximadamente la gestacin media sino tambin en una etapa de gestacin temprana. Si se asume que las vacas que se hallaron vacas en la fecha de paricin esperada haban perdido sus fetos temprano en la gestacin y sus abortos fueron pasados por alto, la evidencia serolgica de un hato (#8) sugiri que era ms probable que dichas vacas fuesen NEOpositivas antes de la vacunacin que las vacas que abortaron posteriormente. Por tanto, los procesos patofisiolgicos que llevan al aborto podran haberse iniciado en un momento cuando la segunda vacunacin no hubiese an sido aplicada o an no se hubiese desarrollado la respuesta inmunolgica. Innes y otros (2002) sugiri que el aborto puede ser causado por la presencia de citocinas pro-inflamatorias tipo T1 en la interfase maternofetal a medida que el sistema inmunolgico materno combate la infeccin. Asimismo los autores plantearon la hiptesis de que el proceso inflamatorio daa la interfase materno-fetal dando lugar a una absorcin fetal y retorno al estro. Hacia finales del tercio medio de la preez, estos tejidos empiezan a reconocer y responder a los microorganismos (Osborne 1986). En vista de estos hallazgos, quizs deba revisarse el actual programa de vacunacin de dos inoculaciones con cuatro semanas de distancia, todo dentro de los primeros 80 das de gestacin. Sugerimos monitorear el tiempo de infeccin o recrudescencia mediante PCR, y comparar con el tiempo de aborto. Resulta de sumo inters medir los ttulos IFAT en relacin con parasitemia y aborto.

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