Biosynthesis of Geraniol and Nerol and their P-D-Glucosides in Pelargonium graveolens and Rosa dilecta 1.

3R-[2-14C] mevalonate dimasukkan ke geranyl dan neryl, BD-glukosida di kelopak Rosa dilecta pada sampai dengan 10,6% yield, dan bagian terpenoid adalah ekuivalen secara khusus dan diberi label dalam gugus berasal dari pirofosfat isopentenil dan 3,3dimethylallyl pirofosfat. Sebuah pola pelabelan yang sama, dengan incorporations dari 0,06-0,1% ditemukan untuk geraniol atau nerol dibentuk pada daun Pelargonium graveolens Hasil sebelumnya memberikan bukti terbaik untuk rute mevalonoid untuk reguler monoterpen pada tumbuhan tingkat tinggi. 2. Pendirian studi dengan 3R-[2 - '4 C, (4R)-4-3H1]-mevalonate dan (4S) nya-isomer menunjukkan bahwa pro-4R hidrogen atom prekursor dipertahankan dan atom hidrogen pro-4S telah dieliminasi di kedua alkohol dan keduanya glukosida. Hasil ini menunjukkan bahwa korelasi retensi dari atom hidrogen pro-4S dari mevalonate dengan pembentukan ikatan cis tersubstitusi ganda, seperti ditemukan di terpenoid tinggi tertentu, tidak berlaku untuk biosintesis monoterpen. Diusulkan bahwa nerol baik berasal dari isomerisasi geraniol atau dua alkohol secara langsung dibentuk oleh prenyltransferases berbeda. Mekanisme yang mungkin untuk proses yang dibahas. 3. Percobaan dengan [14C, 3H] mevalonate juga menunjukkan bahwa dalam tanaman lebih tinggi, karena sebelumnya telah ditemukan dalam jaringan hewan dan ragi, pro-4S hidrogen atom mevalonate hilang dalam konversi pirofosfat isopentenil menjadi 3,3-dimethylallyl pirofosfat. Monoterpene biosintesis diyakini melibatkan konversi mevalonate ke isopentenil pyrophosphateand 3,3-dimethylallyl pirofosfat, yang pada gilirannya mengembun membentuk pirofosfat geranyl (Francis, 1971). Namun, incorporations dari mevalonate ke monoterpen tanaman yang lebih tinggi biasanya sangat rendah, sering di bawah 0,01% (Banthorpe et al, 1972a.), Dan nilai-nilai ini tidak akan memenuhi syarat senyawa yang menjadi prekursor obligat tanpa: (a) dengan baik-dikonfirmasi peran dalam biosintesis terpene ofhigher (Clayton, 1965a, b), (b) pola pelabelan tertentu diamati pada beberapa monoterpen setelah penggabungan materi dengan tepat berlabel (Banthorpe et al, 1970;. Banthorpe & Baxendale, 1970; Banthorpe & Charlwood, 1971; Banthorpe dkk, 1972b);. (c) tidak adanya jalur alternatif yang wajar untuk senyawa ini. 3R-[2-14C] mevalonate baru-baru ini ditemukan digabungkan sangat efisien (sekitar 22%) ke dalam monoterpen terbentuk di kelopak Rosa dilecta cv. Lady Seaton (Francis & O'Connell, 1969; Francis & Allcock, 1969). Kami sekarang melaporkan pola pelabelan diperoleh geraniol (I; 3,7-dimethylocta-trans-2,6-dien-1-ol), nerol (II; 3,7-dimethylocta-cis-2,6-dien-1 -ol) dan mereka fl-D-glukosida terbentuk dalam eksperimen serupa. Kami juga telah menentukan stereokimia

hilangnya proton dalam pembentukan ikatan rangkap trans-cis dan diganti dalam senyawa ini. Bagian dari pekerjaan ini telah disajikan sebagai komunikasi awal (Francis et al., 1970). Geraniol dan nerol terjadi bebas dalam daun Pelargonium graveolens Ait. (Keluarga Geraniaceae) dan diperoleh enzymic hidrolisis fl-D-glukosida yang diekstrak dari kelopak Rosa dilecta cv. Lady Seaton (Keluarga Rosaceae) diisolasi setelah pemberian [2-14C] mevalonate ke dua spesies tanaman. Alkohol monoterpen isolasi ketat dimurnikan untuk radioaktivitas spesifik konstan dan yang kemudian terdegradasi seperti yang ditunjukkan dalam Skema 1. Alkohol bebas dari kelopak R. dilecta diberi label untuk sebagian yang relatif kecil (sekitar 0,9% dari diberikan [2-14C] mevalonate dalam percobaan ini dibandingkan dengan up yang membawa ke dalam glukosida yang sesuai (lihat Tabel 1), dan adalah tidak diteliti lebih lanjut faktor Pengenceran tidak dicatat, karena ini memiliki sedikit berarti kecuali mereka sebut kolam metabolik benar,. dan ada alasan untuk percaya (Banthorpe et al., 1972a) yang compartmentation efek dan situasi terisolasi dari situs biosintesis dapat menyebabkan besar, variabel dan terisolasi kolam terpenoid banyak. Dalam hal apapun itu yang bagian dari gula glukosida mengandung pelacak. The radioaktivitas spesifik monoterpenols setelah penambahan operator dan degradasi produk dicatat dalam Tabel 1. Kegiatan ini memiliki standar deviasi dalam percobaan yang berbeda +2 untuk 5% dari nilai dikutip. Ganda pelabelan percobaan Tersebut 3H / '4 C rasio dalam terpenols bebas / Bglucosides mereka terisolasi setelah jaringan tanaman telah diberi label khusus [14C, 3H] mevalonate dicatat dalam Tabel 2. Dalam percobaan dengan R. dilecta, 3R-[2-14C] mevalonate dimasukkan ke glucosides dan alkohol bebas untuk tingkat 8,2 dan 3,0% masing-masing. Dalam perusahaan ke dalam alkohol bebas dalam rangkaian eksperimen yang jauh lebih tinggi daripada yang tercantum dalam bagian sebelumnya. Alasan untuk perbedaan ini tidak diketahui namun mungkin berkaitan dengan kenyataan bahwa bunga yang digunakan dalam percobaan dengan ['4 C] mevalonate diproduksi pada kondisi rumah kaca, sedangkan percobaan dengan V14C, 3H] mevalonate bunga digunakan tumbuh di bawah kondisi alam. Dalam perusahaan dari 3R-mevalonate ke alkohol bebas di P. graveolens hampir identik dengan yang ditemukan di set sebelumnya. Kedua set percobaan pada spesies ini digunakan bunga tumbuh di bawah kondisi alam.

Terfosforilasi turunan mevalonate Kromatografi ekstrak daun P. graveolens di 5.5h setelah penyerapan [2-14C] mevalonate menunjukkan bahwa asam mevalonat 5-fosfat, asam mevalonat 5-pirofosfat dan pirofosfat isopentenil hadir, dengan incorporations dari 0,8, 0,6 dan pelacak 0,2% masing-masing dari prekursor 3R-mevalonate. Diskusi Pola pelabelan 14C Degradasi geraniol dan nerol terisolasi dari, BD-glukosida disentesis di kelopak Rosa dilecta cv. Lady Seaton mengungkapkan bahwa tracer dimasukkan dari [2-14C] mevalonate tersebar merata (dalam kesalahan percobaan) antara (C-4 + C-5) dan (C-8 + C-10) (lihat rumus XVI). Atas dasar biogenetis lokasi dapat hampir pasti ditetapkan ke (C-4 + C-10). Dalam perusahaan diamati untuk glucosides terpene (Tabel 1) merupakan peningkatan dengan faktor 102_103 atas orang biasanya diperoleh untuk monoterpen terbentuk di dedaunan tanaman lebih tinggi (Banthorpe et al., 1972a), dan bersama-sama dengan spesifisitas posisi pelabelan memberikan bukti terbaik sampai saat ini untuk rute mevalonoid untuk monoterpen dari jenis konvensional, meskipun incorporations tinggi dan posisi spesifik telah direkam untuk monoterpen tidak teratur tertentu dan orang-orang tersebut yang cyclopentanoid kelompok (Banthorpe et al., 1972a). Tersebut incorporations dari pelacak ke monoterpen bebas di kelopak juga beberapa 10102 kali lipat lebih besar daripada yang umumnya ditemukan pada jaringan daun. Rasionalisasi telah diajukan (Banthorpe et al., 1970) untuk incorporations rendah umumnya ditemukan dari mevalonate ke monoterpen daun, dan dua dari khususnya (terjadinya efek compartmentation dan shunting prekursor menjadi karotenoid dan steroid) dapat kurang penting dalam kelopak daripada di jaringan daun. Perbandingan dengan biosintesis dan geraniol unconjugated nerol dalam daun ini disediakan oleh pekerjaan dengan Pelargoniumgraveolens. Di sini, penyerapan [2-14C] mevalonate lagi menghasilkan pelabelan setara di C-4 dan C-10, tetapi incorporations ke geraniol (meskipun tinggi untuk monoterpen daun) adalah sekitar 100 kali lipat kurang dari dalam kelopak

mawar. Waktu berdiri maksimum dari pelacak diberikan [2-14C] mevalonate adalah tentang 1h untuk glucosides terpena R. dilecta (Francis & O'Connell, 1969). Kami menemukan waktu yang sesuai untuk geraniol dan nerol di P. graveolens menjadi approx. 24h, ini adalah jauh lebih dari itu (sekitar 4-5 hari) untuk mono-dan bi-siklik monoterpen lebih lanjut sepanjang jalur biosintesis dianggap (Banthorpe dkk, 1970;. Banthorpe & Baxendale, 1970; Banthorpe & Charlwood, 1971; Banthorpe et al, 1972b.) Sebuah perbedaan penting antara kedua set pola pelabelan dan yang diperoleh untuk thujane derivatif (Banthorpe et al., 1970), kamper (Banthorpe & Baxendale, 1970), keton artemisia (Banthorpe & Charlwood, 1971), pulegone (Banthorpe dkk. , 1972b), (mungkin) citral (Neethling et al, 1963) dan untuk seskuiterpen tertentu (Biollaz & Arigoni, 1969;. Croteau & Loomis, 1972) adalah bahwa dalam pelabelan karya ini sama gugus berasal dari pirofosfat isopentenil dan 3 ,3dimethylallyl pirofosfat diamati, sedangkan label khusus (biasanya lebih besar dari 95%) menjadi bagian yang berasal dari pirofosfat isopentenil (rumus XVII, A) ditemukan sebelumnya. Sebuah priori, tidak ada alasan untuk menganggap bahwa radioaktivitas spesifik dari gugus A dan B dalam kerangka (XVII) harus sama, karena isopentenil pirofosfat dan 3,3-dimethylallyl pirofosfat dapat diencerkan untuk luasan yang berbeda dengan prekursor aktif dalam kolam metabolisme berbagai ukuran, tetapi pola asimetris pelabelan itu bertentangan dengan harapan (Clayton, 1965a; Waller, 1969). Contoh kami saat ini dilaporkan pelabelan simetris dan laporan terbaru serupa untuk linalool dibentuk pada Cinnamonum camphora (Suga et al., 1971) menunjukkan bahwa pola tersebut dapat terjadi baik di kelopak (di mana incorporations tinggi prekursor terjadi) dan daun (dengan incorporations rendah ) dan keduanya di terpenols bebas dan pada mereka terkonjugasi sebagai glukosida. Mungkin penting bahwa pelabelan simetris terjadi untuk pertama terbentuk monoterpen (geraniol, nerol dan linalool) sedangkan pola alternatif ditemukan untuk monoterpen berasal. Ini mungkin menunjukkan bahwa ketiga monoterpen (yang mungkin mudah yg menukar satu sama lain secara in vivo, lihat di bawah) mungkin ada lebih dari satu kolam metabolik. Mevalonate dapat dengan cepat dimasukkan ke dalam konstituen dari satu kolam tersebut untuk memberikan produk dengan pola pelabelan simetris yang menumpuk atau digunakan sebagai prekursor untuk terpenoid lebih tinggi, sedangkan prekursor yang sama dapat dimasukkan ke dalam komponen kolam lain dalam tingkat yang jauh lebih rendah untuk memberikan asimetris label produk yang dapat bertindak sebagai prekursor dari monoterpen lainnya. Asimetri pelabelan KOF dapat

dihasilkan dari kehadiran endogen 3,3-dimethylallyl pirofosfat (Banthorpe et al., 1970). Gagasan kolam metabolisme yang berbeda konsisten dengan terjadinya sintesis dari monoterpen dan terpene yang lebih tinggi di lokasi yang berbeda di pabrik (Waller, 1969; Croteau & Loomis, 1972) dan dengan hasil yang terbatas (Clayton, 1965a, b; Waller, 1969) menunjukkan bahwa, berbeda dengan pola pelabelan asimetris ditemukan di monoterpen, pitosterol dan karotenoid terbentuk dalam tanaman dari [2-14C] - mevalonate menunjukkan pola pelabelan simetris. Incorporations dari 0,8, 0,6 dan 0,2% dari 3R-[2-14C] - mevalonate menjadi asam mevalonat 5-fosfat, asam mevaIonic 5-pirofosfat dan pirofosfat isopentenil dalam daun P. graveolens terjadi dalam 5h pemberian makan, waktu yang ditunjukkan oleh kontrol percobaan untuk memungkinkan penggabungan maksimum ke dalam intermediet. Ini incorporations yang jauh lebih besar dibandingkan ke monoterpen terbentuk dalam jaringan yang sama. Double-label studi Pertanyaan mendasar dalam biosintesis monoterpene merupakan sifat dari rute ke pirofosfat geranyl dan pirofosfat neryl, prekursor dugaan asiklik dan terpenoid yang lebih tinggi atau monoterpen siklik masing-masing. Ada kemungkinan bahwa jalur ke kelas terakhir dari senyawa yang ada dalam tanaman yang tidak hadir dari hewan, di mana senyawa tersebut jarang ditemukan. Hasil yang diperoleh dari pemberian pakan dengan [14C, 3H] - mevalonate (Tabel 2) menunjukkan bahwa pro-4R hidrogen atom prekursor hampir seluruhnya dipertahankan dimana atom hidrogen pro-4S sangat sebagian besar dihilangkan dalam pembentukan geraniol dan nerol, keduanya gratis dan terikat sebagai glukosida. Penggabungan pelacak dari [2-14C, (4S)-43HI] mevalonate biasanya secara signifikan lebih besar dari nol, dan ini nilai sisa, yang diyakini tidak mewakili kontaminasi oleh kotoran radioaktif, mungkin hasil dari beberapa proses yang merandomisasi lokasi dari 3H label (lihat paragraf kedua terakhir dari Diskusi ini). Percobaan dengan P. graveolens melibatkan rasio 3H/14C dalam prekursor yang lebih rendah dari yang digunakan dalam percobaan dengan R. dilecta, tetapi nilai adalah cukup untuk tujuan tersebut. Incorporations dari mevalonate ke monoterpen P. graveolens yang relatif rendah dengan yang ada di R. dilecta, dan untuk mendapatkan kedua penghitungan radioaktivitas memadai 14C dan 3H tinggi / '4 rasio C dalam produk, sampel yang lebih besar dari mevalonate harus digunakan dengan P graveolens.. Namun, penelitian awal menggunakan 10 kali lipat dosis yang lebih besar daripada

yang tercatat pada bagian Eksperimental memberikan hasil tidak menentu, karena mungkin untuk pengoperasian proses yang mengacak posisi pelacak. Hasil kami adalah tak terduga, meskipun untuk stereokimia hilangnya hidrogen belum menunjukkan untuk monoterpen, biosintesis trans-olefin hubungan dalam beberapa seskuiterpenoid dan terpenoid yang lebih tinggi telah ditemukan untuk melibatkan penghapusan dari atom hidrogen pro-4S dari mevalonate (lihat, misalnya, Batu & Hemming, 1965; Goodwin & Williams, 1965, 1966; Archer dkk, 1966;.. Dada dkk, 1968), sedangkan pembangunan cis-olefin hubungan di karet (Archer et al, 1966) dan dalam tertentu. polyisoprenols Batu & Hemming, 1967; Gough & Hemming, 1967, 1970) menyebabkan hilangnya atom hidrogen pro-4R. Korelasi antara geometri linkage olefin dan stereospecificity hilangnya hidrogen tampak mapan (Batu & Hemming, 1967). Salah satu penjelasan dari hasil penelitian kami adalah bahwa pirofosfat neryl (atau nerol) diperoleh dengan isomerisasi pirofosfat geranyl (atau geraniol) (rute c atau d, Skema 2). Seperti isomerisasi langsung dari ikatan ganda memiliki analogi biokimia yang sedikit (bdk. Parke & Williams, 1951; Hubbard, 1955; Kurangnya, 1961), tetapi rute tidak langsung mungkin dalam kasus ini bisa menjadi katalis enzim-cis-penambahan elemen dari XH ke ikatan rangkap, diikuti dengan eliminasi lintas. Sebuah kasus khusus menarik dari mekanisme ini melibatkan penambahan Michael air untuk geranial (III): yang terakhir ini dapat dibentuk dari geraniol oleh sistem enzim yang sama dengan yang ditandai dari beberapa sumber (Varma & Chichester, 1962; Donninger & Ryback, 1964; Potty & Bruemmer, 1970). Awal ganda pelabelan percobaan pada pembentukan geranial dan neral (IV) di Cymbopogon martinii (sereh) menunjukkan bahwa senyawa ini cepat interconverted in vivo (M. Mort & GNJ Le Patourel, pekerjaan diterbitkan), dan selanjutnya, seluruh redoks-isomerisasi rute dari geraniol untuk nerol (I-* 1II-IIV- II) baru-baru ini ditandai dengan menggunakan aseton-kering bubuk dari kelopak mawar (P. Dunphy, Unilever Penelitian, komunikasi pribadi). Sebuah reduktase geraniol-nerol yang mengubah substrat baik ke sitronelol (XVIII) telah diisolasi dari kelopak mawar (Dunphy & Allcock, 1972); sambungan pada ini dengan dehidrogenase yang sesuai dapat merupakan sebuah sistem yang mampu interconverting geraniol dan nerol, meskipun rincian dari langkah dehidrogenase yang disarankan adalah tidak jelas. Penjelasan-satunya alternatif yang masuk akal hasil penelitian kami membutuhkan baik prenyltransferases berbeda atau prenyltransferase tunggal dengan dua situs aktif yang berbeda yang

mengkatalisis kopling langsung pirofosfat isopentenil dengan 3,3-dimethylallyl pirofosfat untuk membentuk baik atau pirofosfat pirofosfat neryl geranyl (langkah a dan b, skema 2). Jika orientasi relatif dari reaktan pada situs aktif adalah mereka yang ditunjukkan pada rumus (XIX) dan (XX), digabungkan (SN2 + E2) proses yang melibatkan trans-eliminasi akan mengakibatkan hilangnya dari atom hidrogen pro-4S dari mevalonate terlepas dari apakah geranyl pirofosfat atau pirofosfat neryl dibentuk. Sebuah rute yang sama telah disarankan (Profesor 0 Cori,. Universitas Chili, komunikasi pribadi) untuk menjelaskan kegagalan untuk mendeteksi interconversions dari pirofosfat geranyl dan pirofosfat neryl dalam sel yang bebas dari sistem jeruk atau dari Pinus radiata (George-Nascimento & Cori , 1971; Yakub et al, 1972). Hasil kami tidak memungkinkan pilihan harus dibuat pada saat ini antara alternatif ini, dan pekerjaan lebih lanjut diperlukan untuk menjelaskan titik mendasar dalam biosintesis monoterpen. Korelasi diamati sebelumnya dari hilangnya atom hidrogen pro-4R dengan pembentukan hubungan cis-olefin bertumpu hampir sepenuhnya pada hasil melibatkan biosintesis karet dalam lateks, dan ini hasil stereokimia mungkin tidak berlaku untuk terpene sintesis pada umumnya. Tidak ada studi rinci telah dibuat pada prenyltransferases dari tanaman lebih tinggi, tetapi enzim dari hati babi (EC 2.5.1.1) telah terbukti dapat mengkatalisis pembentukan kedua pirofosfat geranyl dan pirofosfat farnesyl, meskipun stereokimia hilangnya proton dalam kopling tidak diketahui Hasil kami lakukan, bagaimanapun, mengecualikan suatu mekanisme dimana dalam reaktan terdapat dalam orientasi tertentu pada permukaan enzim, seperti dalam rumus (XIX), dan di mana tranis-eliminasi dari situs pengikatan tunggal akan menyebabkan hilangnya pro-4S atau pro-4R. hidrogen atom inevalonate ketika geranyl pirofosfat atau pirofosfat neryl dibentuk masingmasing. Situasi (XIX, R C5H9 dll) bisa memperhitungkan hasil dengan karet dan bersamaan membentuk trans-trans-farnesol. Varian dari proses ini adalah sebuah mekanisme 'X-kelompok seperti telah diusulkan menjadi umum untuk perpanjangan rantai terpenoid (Comforth, 1968, 1969): di sini perantara (rumus XXII; Scheme4) (? Enzim ikatan) dapat baik memecah dengan trans-penghapusan HX untuk memberikan pirofosfat geranyl atau pirofosfat neryl (dengan hilangnya atom hidrogen approprate epimeric) atau dimodifikasi untuk membentuk linalool (XXIII). Sekali lagi ini mekanisme tertentu dikecualikan oleh hasil kami, meskipun kompatibel dengan salah satu dari dua prenyltransferases berbeda atau satu enzim dengan dua situs aktif yang berbeda. Dua poin tambahan timbul dari hasil pada Tabel 2. Pertama, nerol dan glukosida yang

dibentuk pada kelopak R. dilecta dari [2-14C, (4R) 43Hi] mevalonate baik memiliki rasio 3H/14C signifikan lebih tinggi dari nilai dalam prekursor atau di geraniol dan glukosida nya yang bersamaan terbentuk. Kontaminasi akan telah dieliminasi oleh pemurnian ketat untuk radioaktivitas spesifik konstan dan sulit untuk melihat bagaimana fraksinasi isotop bisa saja terjadi. Hasil penelitian menunjukkan penggabungan 3H asing, dan penjelasan yang sangat tentatif adalah bahwa pelacak yang berasal dari degradasi oksidatif stereospesifik kelebihan prekursor (atau fisiologis tidak aktif 3S-mevalonate) di lokasi biosintesis dipindahkan ke C-1 dari neral dalam redoks proses (Skema 2: I-III *-Div-II). Apapun rincian mekanisme, terjadinya pelacak rupanya asing dalam nerol tetapi tidak dalam geraniol konsisten dengan formasi tersebut yang mantan dari yang kedua. Kedua, situasi di kedua tanaman yang lebih tinggi dipelajari dikonfirmasi menjadi serupa dengan yang di jaringan hewan dan dalam ragi (Cornforth, 1968, 1969) dalam pro-4S hidrogen atom mevalonate telah hilang dalam konversi pirofosfat isopentenil menjadi 3 , 3 - pirofosfat dimethylallyl. Bahan R. dilecta dan P. graveolens diperoleh dari Unilever Research Laboratory, Sharnbrook, Bedford, Inggris Spesimen sebelumnya ditanam baik di luar ruangan atau di rumah kaca, yang terakhir adalah di luar rumah tumbuh (lihat bagian Hasil. Makanan dengan bahan radioaktif Flowerheads R. dilecta dalam tahap pra-sempurna (Francis & Allcock, 1969), 8 hari setelah pemisahan awal kelopak, adalah makan (Francis & Allcock, 1969; Francis & O'Connell, 1969) dalam kondisi steril dengan baik garam dibenzylethylenediamine dari [2-14C] mevalonate (5, Uci; 0.23mg per kepala bunga.) atau dengan garam kalium dari [4_3H1] - mevalonate isomer (1,0, uCI) dicampur dengan [2-14C]. mevalonate (0,5, UCI) sebagai penanda. 3R-[2 - '4 C] - dan 3R-[4R (S)4-3H1]-mevalonate (dari Pusat Radiokimia, Amersham, Bucks, Inggris.) Digunakan di radioaktivitas spesifik dari 6,4 dan 116mCi / mmol masing-masing. Setelah memanen bahan tanaman, nerol dan geraniol, keduanya gratis dan sebagai, BD-glukosida, diekstraksi dan

dimurnikan (Francis & Allcock, 1969; Francis & O'Connell, 1969) dan glukosida yang dibelah dengan fl-glukosidase [emulsin; dari Sigma (London) Chemical Co, London SW6, Inggris] dan monoterpenols itu ditemukan untuk eksperimen degradasi. Daun muda (1-2 minggu setelah tunas; rata berat 0,07 g) P. graveolens diberi makan dalam kondisi steril dan transpirasi dengan paksa (Banthorpe et al, 1970.) Dengan pelacak pada enam sampai sepuluh kali jumlah radioaktivitas digunakan untuk R dilecta.. Rasio isotop tersebut seperti ditunjukkan pada Tabel 2. Pemantauan daun mengungkapkan bahwa radioaktivitas dalam lamina menjadi konstan dalam 20 menit penyelesaian penyerapan pelacak dan tetap demikian selama 24jam. Pada akhir periode metabolisme, daun adalah tanah dalam N2 cair dan bubuk yang dihasilkan dicampur (1:1, b / b) anhidrat Na2SO4 dan diekstraksi dengan eter (20ml). Ekstrak dipekatkan pada tekanan rendah (untuk 2ml) dan dikromatografi kolom MgO (15cm x 1cm eksternal diam.), Dengan heksana sebagai eluen, untuk memberikan campuran nerol dan geraniol. Pembawa (50mg geraniol atau nerol) ditambahkan dan alkohol dimurnikan oleh preparativescale GLC pada Carbowax 20M (6m x 1 cm diameter eksternal; 20%, b / b.) pada 150 C dengan laju alir 5 liter N2 / jam. Bagian dilepas (30cm) pada akhir saluran masuk dari GLC kolom terjebak non-volatile kotoran dan terus menerus dengan radioaktivitas tinggi suhu membersihkan latar belakang diaktifkan menjadi menurun menjadi sekitar 6d.p.m. di atas latar belakang. Sampel dikumpulkan dalam tabung U-(kapasitas 20ml) yang setengah penuh dengan manik-manik kaca (1mm diam.), Yang pada gilirannya ditutupi dengan operator heksana nerol mengandung atau geraniol (50mg); keseluruhan didinginkan pada -70 C. Dengan perangkat ini, geraniol dapat dikumpulkan dengan pemulihan 90% pada laju aliran hingga 18 liter / jam. Radiokimia metode Padatan atau turunan cairan padat yang rekristalisasi atau resublimed, biasanya paling tidak tiga kali, untuk radioaktivitas spesifik konstan. Tes Radiokimia dibuat dengan menggunakan Beckman tiga sistem saluran kilau, umumnya dengan 5 - (4 - biphenylyl) - 2 - (4 - t - butylphenyl) - 1 - oxa - 3,4 - diazole (butil-PBD) (CIBA Ltd) dalam natrium-kering toluena (8g/litre) sebagai scintillant. Menghitung efisiensi yang biasanya sekitar. 96 dan 55% untuk I4C dan 3H masing-masing dan tidak berubah oleh redistillation dari toluena atau penghapusan 02 dari larutan sintilasi dalam aliran N2. Butil-PBD (5

g) dalam toluena (500 ml) dan metanol (500mI), atau (1960) solusi Bray yang, digunakan untuk sampel yang tidak larut dalam toluena. Biasanya sekitar sampel 20mg bahan berlabel digunakan; sampel ini kadang-kadang terdiri dari fraksi gabungan dari beberapa menyusui dilakukan pada waktu yang sama. Metodologi sampel diikuti menghitung bahwa dalam teks definitif (Turner, 1967). '4 C dan radioaktivitas 3H biasanya ditentukan dari jumlah radioaktivitas dalam jalur yang tepat setelah koreksi telah dibuat untuk pendinginan dan efisiensi menghitung. Koreksi ini diperoleh dari kurva kalibrasi yang menghubungkan sifat pendinginan dari berbagai jumlah kloroform pada solusi standar [14C] - dan [3H]-heksadekana dengan efisiensi menghitung yang secara otomatis dihitung oleh counter, dengan 137Cs sebagai standar eksternal di saluran -rasio modus operasi. Untuk sampel yang dipadamkan atau lemah radioaktif beberapa metode internal-standar digunakan untuk menentukan efisiensi menghitung dengan menggunakan heksadekana tepat berlabel. Setiap set percobaan makan, isolasi dan degradasi dilakukan dalam rangkap dua, dan tes radioaktif individu diulangi dua atau tiga kali untuk menumpuk (dalam setiap periode menghitung) approx. 4 x 104 scintillations, ini memastikan bahwa 2a adalah 1%. Tidak ada koreksi dibuat untuk kerusakan 3H, sebagai [I4C, 3HL] mevalonate diuji langsung setelah produk turunan. Dikombinasikan kesalahan dalam menimbang, menghitung prosedur dll diperkirakan mencapai sekitar. 2% dan kemampuan untuk memproduksi antara percobaan yang berbeda adalah approx. 3%.

Degradasi skema Umum. Semua senyawa memiliki titik leleh (dikoreksi) dalam perjanjian ( 1lC) dengan nilai-nilai sastra dan ir, proton-magnetik-resonansi dan massa spektra yang konsisten dengan struktur diterima. Skema degradasi berikut berbagai dilakukan pada 100-500mg bahan awal. Kuantitas yang diberikan untuk sekumpulan degradasi. Pemurnian dan oksidasi geraniol dan nerol. Geraniol (98% murni, oleh GLC) untuk digunakan sebagai pembawa dimurnikan dari bahan komersial melalui CaCl2 kompleks (Simonsen, 1947); nerol untuk digunakan mirip dibeli (Fluka AG, Buchs, Swiss; 98% murni). Tersebut radioaktivitas spesifik geraniol dan nerol, dimurnikan sebagai 3,5-dinitrobenzoates, tidak bisa diukur secara akurat karena pendinginan yang luas; akibatnya alkohol yang dioksidasi menjadi

geranial dan neral (III, IV) dan turunannya ini disusun. Dalam beberapa percobaan geraniol dimurnikan melalui kompleks CaCl2 nya. Alkohol (450mg) dalam cahaya cair (bp 40-60'C; 30ml) diperlakukan dengan MnO2 (3 g) di bawah N2 pada 20 C untuk 15h. Oksidan ini baru disiapkan dan disimpan dalam kaleng tertutup: penyimpanan dalam desikator memberikan materi kegiatan yang lebih rendah. Geranial dan neral dipisahkan pada kolom MgO dengan heksana sebagai eluen dan dikonversi menjadi semicarbazones (69% \ yield), titik leleh 162 C dan 183 C (setelah rekristalisasi dari aq alkohol.). Oksidasi geranial dan neral. Aldehid yang sesuai (100mg) dalam dimurnikan metanol (10 ml) atau karbon tetraklorida (12ml) telah ozonized (ozonizer Model 15-69K;. Nu-aire Ltd, Kings Langley, Herts, Inggris) pada -70 C atau -15 C masing-masing dan ozonides mentah itu ditemukan sebagai minyak kental dan telah didekomposisi dengan pengobatan selama 3 hari pada 20 C dengan campuran asam format (98%, b / b; 1.5ml) dan hidrogen peroksida (30vol.; 1,1 ml) , setelah itu peroksida dihancurkan oleh pengobatan dengan MnO2 (2mg) untuk 3h pada 0 C. Penelitian ini dilakukan beberapa kali dengan geranial radioaktif dan neral dan hasil keseluruhan adalah: asam laevulinic (V) 55%, aseton 72%, asam oksalat 5%. Tidak ada formaldehida (bandingkan Knights & Waight, 1955) ditemukan. Aseton didestilasi keluar dari mixturenand reaksi dimurnikan sebagai 2,4-

dinitrofenilhidrazon, mp 128 C. Keton ini regenerasi dari ini dengan refluks (5h) dengan sepuluh kali lipat lebih dari aq. natrium piruvat, dan menjadi sasaran reaksi iodoform (Hickinbottom, 1957) untuk memberikan hasil (10%) miskin. Dalam percobaan kemudian, aseton dimurnikan sebagai 4 phenylcarbazone (mp 160 C), thiosemicarbazone (mp 179 C) atau tosylhydrazone (mp 146 C) (semua setelah rekristalisasi dari aq alkohol.); Derivatif tersebut lebih tinggi dari yang 2,4dinitrofenilhidrazon untuk menghitung sintilasi. Residu asam laevulinic dan asam oksalat (sekitar jumlah 180mg.) Diasamkan (dengan HCl 10%) dan terus-menerus diekstraksi (5h) dengan eter (50ml) untuk menghilangkan asam laevulinic. Ekstrak eter diuapkan sampai kering, dan kembali diekstraksi dengan kloroform dan ekstrak yang terakhir (sekitar 0,5 ml) ditambahkan ke asam silikat (2g, tipe CC7, 100-200 mesh; Mallinckrodt Inc, St Louis, Mo , USA) dan terguncang untuk membentuk bubuk. Ini ditambahkan ke bagian atas kolom (20 cm x 1 cm ext. Diam.) Yang telah dibuat di benzena dengan asam silikat (log), yang pada gilirannya telah terguncang dengan 0.025M-H2SO4 (6ml), dan kolom dielusi

dengan benzena-eter (1:1, v / v), yang telah sama disetimbangkan dengan H2SO4, untuk memberikan asam laevulinic (155mg),dimurnikan sebagai 4- phenylsemicarbazone (hasil 70%; tl 185 C, setelah rekristalisasi dari aq. alkohol) atau tosylhydrazone (menghasilkan 80%; mp 1 59 C, setelah rekristalisasi dari kloroform). Residu dari ekstraksi eter sama dikromatografi dan dielusi dengan eter untuk memberikan asam oksalat (hasil 14mg; tl 189 C, setelah rekristalisasi dari ethanolbenzene). Degradasi asam laevulinic. Asam laevulinic diperoleh seperti dijelaskan di atas biasanya diencerkan empat kali lipat dengan operator dan lebih terdegradasi. Reaksi iodoform pada asam (600mg) memberikan asam suksinat (IX) (hasil 85%; tl 185 C), yang dimurnikan dengan kromatografi pada asam silikat withbenzene-eter (2:1, v / v; 60ml), benzena -eter (1:2, v / v; 30ml) dan akhirnya eter (30ml) sebagai eluen. Asam (500mg) diubah menjadi ester dimetil dengan diazomethane (195mg) dalam eter: Produk ini tidak dimurnikan tetapi terguncang dengan hidrazin hidrat (300mg) selama beberapa menit, ketika dihydrazide (menghasilkan 95%; tl 173 C , dari alkohol) diendapkan. Perawatan dari dihydrazide (400mg) dalam air (4ml) dengan kuantitas stoicheiometric asam nitrat memberikan diazide (XI), yang diekstraksi ke dalam eter (lSml) tetapi tidak dimurnikan lebih lanjut karena ketidakstabilan. Diazide ini mengalami penataan ulang Curtius untuk membentuk uretan (XIII), mp 11 1 C (dari karbon tetraklorida), dalam hasil secara keseluruhan (dari dihydrazide) dari approx. 40%, bila solusi halus diperoleh atas dan etanol (SML) yang direfluks selama 1 jam. Produk ini (160mg) adalah pada gilirannya dekarboksilasi dengan HBr (konstan-didih campuran, 3 ml), pada pemanasan sampai 130 C untuk etilendiamina bentuk (XIV), yang dimurnikan dengan sublimasi dihydrobromide nya (terurai di atas 180 C); yang terakhir dibentuk pada hasil 83%, berdasarkan uretan tersebut. CO2 yang bersamaan dikumpulkan (88% yield berdasarkan uretan) sebagai BaCO3. Sebuah prosedur alternatif untuk mempengaruhi penataan ulang ini adalah untuk refluks diazide yang (100mg) dalam benzena (5 ml) selama 1 jam: isosianat (XII) yang dibentuk tidak terisolasi tetapi terurai oleh HCl (12M, 0.5ml) pada suhu kamar untuk memberikan dihidroklorida dari etilendiamin (43% hasil berdasarkan yang diazide) dan CO2 (87% yield). CO2 yang diregenerasi dari BaCO3 dan telah diundangkan etanolamin-metoksietanol 2-(2:1, v / v; lOml); sebagian (SML) dari ini ditambahkan ke cairan kilau (lomi) untuk penghitungan radioaktivitas.

Terfosforilasi intermediet dari mevalonate. Daun kecil (sekitar 0,5 g) dari P. graveolens (4weekold tanaman) ditempatkan dalam vial yang mengandung [2-14C] - mevalonate (2, Uci; 0,1 ml) dan diterangi dengan sinar matahari alami ditambah dengan lampu tungsten 1OOW pada jarak 1 m. Setelah 54h dedaunan dengan buffer natrium fosfat (0,1 M, pH7.0; 2.Oml) dan filtrat dipanaskan pada 100 C selama 1 menit,didinginkan dan dikromatografi kolom (15 cm x 1,5 cm diameter eksternal.) dari Dowex 1 (X8; bentuk format; 200-300 mesh) dan dikenakan elusi gradien dengan aq. formiat asam amonium format (Bloch et al., 1959). Fraksi (lOml) dikumpulkan dan radioaktivitas sampel (LML) dari masing-masing diukur dalam porsi (20ml) dari media kilau terdiri dari naftalena (16g) dan butil-PBD (1.4g) dalam toluena (120ml) dan 2 - methoxyethanol (80ml). Peaks radioaktivitas terjadi pada fraksi 18-26, 68-73 dan 3745, dan ditugaskan untuk asam mevalonat 5 - fosfat, asam mevalonat 5-pirofosfat dan pirofosfat isopentenil dibandingkan dengan standar dengan menggunakan kromatografi kertas dengan empat sistem pelarut (tchen, 1958 ; Benediktus et al, 1965.; Chesterton & Kekwick, 1968) dan oleh t.l.c. dengan berbagai benzenaeter-etil asetat campuran. Kami mengakui banyak membantu dari Dr G. Ayrey (Isotop Unit, Ratu Elizabeth College, London) dengan menghitung teknik dan kami berterima kasih kepada Unilever Ltd (London) untuk beasiswa untuk GNJ Le P. dan izin untuk M. J. 0. F. untuk melakukan dan mempublikasikan pekerjaan ini. Kami adalah juga sangat berterima kasih kepada Dr P. Dunphy (Unilever Penelitian,Sharnbrook) dan Profesor 0. Cori (Santiago) untuk membuat tersedia bagi hasil kami sebelum publikasi.