UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE CINCIAS AGRRIAS E VETERINRIAS CMPUS DE JABOTICABAL

DETERMINAO DO PERODO RESIDUAL DE FUNGICIDAS PROTETOR E SISTMICO PARA O CONTROLE DE Guignardia citricarpa EM FRUTOS CTRICOS

Rachel Rattis Motta Orientador: Prof. Dr. Antonio de Goes Co-orientador: Marcel Bellato Spsito

Dissertao apresentada Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias Unesp, Cmpus de Jaboticabal, como parte das exigncias para a obteno do ttulo de Mestre em Agronomia (Produo Vegetal).

JABOTICABAL SO PAULO BRASIL Fevereiro de 2009

DADOS CURRICULARES DA AUTORA Rachel Rattis Motta, nascida na capital paulistana no dia 24 de maio de 1983. Cursou o primeiro e segundo grau no colgio estadual Ermano Marchetti e em 2001 ingressou no curso de Agronomia na Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias, Cmpus de Jaboticabal. Em 2002, foi aceita como voluntria do Programa de Educao Tutorial, em Agronomia (PET - Agronomia), onde realizou atividades que, em sua maioria, abrangiam o Ensino, a Pesquisa e a Extenso. Em 2003, foi monitora da disciplina de Solos e em seguida da disciplina de Economia Agrria. Durante o perodo de agosto de 2004 e agosto de 2005, obteve bolsa de Iniciao Cientfica (PIBIC/CNPq), com o projeto de pesquisa intitulado: Estresses hdrico e salino na germinao de sementes de guandu e labe-labe, sob a orientao da Prof. Dr. Durvalina Maria Mathias dos Santos. No segundo semestre de 2005, foi estagiria do Fundo de Defesa da Citricultura (FUNDECITRUS) com a realizao de atividades na rea de Epidemiologia, sob a orientao do pesquisador Dr. Renato Beozo Bassanezi.

Faa o melhor que puder e faa-o de acordo com seu padro interior prprio (ou conscincia, se assim preferir), no para o conhecimento e avaliao de seus atos pela sociedade. Fazer o melhor apenas uma frase de poucas palavras, mas significa que, em todas as ocasies de nossa vida diria, precisamos manter nossa mente sob controle, para mais tarde no nos arrependermos de nossos erros, mesmo que os outros nada saibam a respeito. Agindo assim, estaremos fazendo o melhor.. As bnos, por si s, no so o bastante. Devem vir de dentro. Sem nosso empenho, impossvel receb-las. Dalai-Lama

Dedico... quele, que est interiormente em ns e no infinito. fora inexplicvel que provm de nossa f. Que formalmente chamamos... Deus! Aos meus pais, Maria Aparecida Rattis Motta e Esternach Pereira Motta e irm, Rbia Rattis Motta por terem acreditado que meus objetivos poderiam ser realizados. Sem a nossa unio nada seria concretizado. Amo vocs eternamente... Ao meu grande amor e companheiro, Robert Anuario Pereira, que mesmo nos momentos mais difceis de sua vida nunca se quer pensou em deixar de acreditar em meus sonhos. Obrigada... Pelos dias de sono perdido, Pelos finais de semana sacrificados. Sua ajuda foi de extrema importncia para o desempenho deste trabalho. Amo-te eternamente...

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador Prof. Dr. Antonio de Goes, por ter conferido tal trabalho minha responsabilidade, sempre acreditando que seramos capazes de realiz-lo. Por seus ensinamentos, amizade e preocupao no s com a forma de realizao desta pesquisa, mas com minha formao acadmica.

Ao meu co-orientador Dr. Marcel Bellato Spsito, que juntamente ao Fundo de Defesa da Citricultura (FUNDECITRUS) ajudou grandemente a conduo e melhoria deste trabalho e atendeu prontamente aos pedidos de auxlio.

Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP), pela concesso da bolsa de estudo.

Fazenda Piratininga, na pessoa do Sr. Wardeley Rodas, pela concesso da rea experimental, que possibilitou a conduo dos experimentos.

Ao Engenheiro Agrnomo Cludio Gomes de Oliveira, por ter confiado na importncia dessa pesquisa e ter sido o precursor da parceria com a empresa BASF.

empresa BASF, pelo financiamento das anlises de resduos do produto comercial Comet. Ao GENCS (Global Environmental and Consumer Safety Laboratory) por ter concedido suas instalaes para a execuo das anlises e a todas as pessoas que contriburam diretamente para a realizao desta etapa, como Carla Steling, Renata Magale, Samuel Tsuchiya e em especial Fabiana Carvalho por sua ateno e orientao.

Aos Engenheiros Agrnomos Toshiaki Shitara e Roberto Luiz Trevisan Pimentel, por terem acreditado na importncia desta pesquisa e pelos conselhos de aprimoramento do trabalho.

 empresa IHARABRS, pelo financiamento das anlises de resduos do produto comercial Cercobin.

empresa AGROSAFETY, por ter concedido suas instalaes para a realizao das anlises.

Engenheira Agrnoma e amiga Tas de Almeida, que gentilmente me auxiliou com a metodologia de inoculao do trabalho compartilhando experincias e conselhos.

A todos os amigos do Laboratrio de Fitopatologia, do Departamento de Fitossanidade, Eliana, Gabi, Vanessa (Rapidex), Patrcia, Adriano, Vanessa, Andressa, Roberta, Fernanda, Ester, Marcelo, Ronilda, Elton, dentre outros inmeros sempre presentes, pela colaborao na execuo dos trabalhos e companheirismo.

Aos professores do Departamento de Fitossanidade, pelos valiosos conhecimentos, em especial Prof. Dr. Margarete Camargo pela convivncia e conselhos.

Aos membros da banca examinadora pelas correes e colaboraes no trabalho.

Aos funcionrios do Departamento de Fitossanidade, Lus Carlos, Vanderlei, Lcia Rita e Rosngela pela ateno e auxlio nos trabalhos executados.

As minhas queridas amigas Andressa, Michele, Aline, Josi e Patrcia, que estiveram sempre ao meu lado nos momentos de felicidade e tristeza. Agradeo a todas pela fora e compreenso. Nossa convivncia foi nica e ficar marcada em minha vida, para sempre. Amigas eternamente.

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SUMRIO Pgina

RESUMO......................................................................................................................... 1 SUMMARY ...................................................................................................................... 3 1. INTRODUO........................................................................................................... 5 2. REVISO DE LITERATURA ..................................................................................... 7 2.1. Histrico da doena ............................................................................................. 7 2.2. Importncia econmica........................................................................................ 8 2.3. Agente causal ...................................................................................................... 9 2.3.1. A espcie Guignardia citricarpa Kiely [anamorfo: Phyllosticta citricarpa (Mc Alpine) Van de Aa]..................................................................................................... 9 2.3.2. Etiologia e sintomatologia ............................................................................ 11 2.3.3. Epidemiologia .............................................................................................. 13 2.3.4. Controle ....................................................................................................... 14 2.3.4.1. 2.3.4.2. 2.3.4.3. Fungicidas protetores: os cpricos.................................................... 17 Fungicidas sistmicos: os benzimidazis.......................................... 19 Fungicidas mesosistmicos: as estrobilurinas .................................. 23

3. MATERIAL E MTODOS ........................................................................................ 26 3.1. Fase de campo .................................................................................................. 26 3.1.1. Conduo do experimento........................................................................... 26 3.1.1.1. 3.1.1.2. 3.1.1.3. Preparo do inculo e inoculao dos frutos ...................................... 27 Preparo da calda e aplicao dos fungicidas.................................... 28 Obteno das amostras de campo ................................................... 29

3.2. Fase analtica .................................................................................................... 29 3.2.1. Oxicloreto de cobre...................................................................................... 29 3.2.2. Tiofanato metlico ........................................................................................ 30 3.2.2.1. A. B. Preparo e processamento das amostras .......................................... 30 Superfcie dos frutos ................................................................................. 30 Casca dos frutos ....................................................................................... 30

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3.2.2.2. A. B. 3.2.2.3.

Mtodo analtico................................................................................ 31 Superfcie dos frutos ................................................................................. 31 Casca dos frutos ....................................................................................... 32 Monitoramento dos resduos............................................................. 32

3.2.3. Pyraclostrobin .............................................................................................. 35 3.2.3.1. A. B. 3.2.3.2. A. B. 3.2.3.3. Preparo e processamento das amostras .......................................... 36 Superfcie dos frutos ................................................................................. 36 Casca e polpa dos frutos .......................................................................... 36 Mtodo analtico................................................................................ 37 Superfcie dos frutos ................................................................................. 38 Casca e polpa dos frutos .......................................................................... 39 Monitoramento dos resduos............................................................. 40

3.3. Fase de avaliaes............................................................................................ 41 4. RESULTADOS ........................................................................................................ 43 4.1. Oxicloreto de cobre............................................................................................ 43 4.1.1. Monitoramento dos resduos ....................................................................... 43 4.1.2. Capacidade protetora .................................................................................. 45 4.1.3. Capacidade fungisttica .............................................................................. 46 4.2. Tiofanato metlico .............................................................................................. 47 4.2.1. Monitoramento dos resduos ....................................................................... 47 4.2.2. Capacidade preventiva ................................................................................ 49 4.2.3. Capacidade curativa .................................................................................... 49 4.3. Pyraclostrobin .................................................................................................... 50 4.3.1. Monitoramento dos resduos ....................................................................... 50 3.2.4. Capacidade preventiva ................................................................................ 52 3.2.5. Capacidade curativa .................................................................................... 53 5. DISCUSSO ........................................................................................................... 54 6. CONCLUSO .......................................................................................................... 59 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .............................................................................. 60

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LISTA DE FIGURAS Pgina

Figura 1. Tipos de sintomas em frutos causados pelo fungo Guignardia citricarpa. (A) mancha dura, (B) falsa melanose, (C) mancha sardenta, (D) mancha virulenta, (E) mancha trincada e (F) mancha rendilhada. Fonte: Fundecitrus, SP - 2007................... 12 Figura 2. (A) Asperso do inculo, contendo condios de Guignardia citricarpa no fruto e (B) proteo do respectivo fruto, contra inculo proveniente da rea experimental, com sacos de papel cristal. Bebedouro, SP - 2007. ...................................................... 28 Figura 3. Casca e polpa de frutos de laranja Valncia separadas e congeladas prontas para o processamento, respectivamente (A) e (B). Materiais e equipamentos utilizados para o processamento e homogeneizao das amostras (C) e quantidades de casca e polpa obtidas aps o processamento (D). BASF - Guaratinguet, SP - 2008. .............. 37 Figura 4. Padronizao do produto das lavagens da superfcie dos frutos (A). Amostras em vials de anlises para injeo no sistema cromatogrfico (B). BASF - Guaratinguet, SP - 2008....................................................................................................................... 39 Figura 5. Escala diagramtica para avaliao da severidade (%) da MPC (Guignardia citricarpa). Sintomas do tipo mancha dura (A) e sintomas do tipo falsa melanose (B) (SPSITO et al., 2004).................................................................................................. 42 Figura 6. Quantidades residuais de cobre existentes nos frutos de laranjeira Valncia (mg/fruto), aps aplicao de oxicloreto de cobre, sob a forma de imerso. Jaboticabal, SP 2008...................................................................................................................... 43 Figura 7. Curva de crescimento dos frutos de laranjeira Valncia (mg/fruto), entre a primeira semana de avaliao (7DAA) at a stima semana de avaliao (49DAA). Jaboticabal, SP 2008.................................................................................................. 44 Figura 8. Quantidades residuais de cobre existentes na rea dos frutos de laranjeira Valncia (mg/fruto), aps aplicao de oxicloreto de cobre, sob a forma de imerso. Jaboticabal, SP 2008.................................................................................................. 45

Figura 9. Efeito das aplicaes protetoras do fungicida oxicloreto de cobre na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC nos frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008............................................................................................................................... 46 Figura 10. Efeito das aplicaes de oxicloreto de cobre na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC, aps a inoculao dos frutos de laranjeira Valncia, em diferentes intervalos de tempo. Jaboticabal, SP 2008................................................................. 47 Figura 11. Quantidades residuais de tiofanato metlico e seu metablito carbendazim na superfcie (mg/cm) (A) e na casca (mg/kg) (B) de frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008.................................................................................................. 48 Figura 12. Efeito das aplicaes preventivas do fungicida tiofanato metlico na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC nos frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008...................................................................................................................... 50 Figura 13. Quantidades residuais de pyraclostrobin na superfcie (mg/cm), casca e polpa (mg/kg) de frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008. ..................... 51 Figura 14. Efeito das aplicaes preventivas do fungicida pyraclostrobin na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC nos frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008............................................................................................................................... 52 Figura 15. Efeito das aplicaes do pyraclostrobin na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC, aps a inoculao dos frutos de laranjeira Valncia, em diferentes intervalos de tempo. Jaboticabal, SP 2008. ................................................................................ 53

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DETERMINAO DO PERODO RESIDUAL DE FUNGICIDAS PROTETOR E SISTMICO PARA O CONTROLE DE Guignardia citricarpa EM FRUTOS CTRICOS

RESUMO - Este trabalho teve como objetivos monitorar a quantidade de resduo existente em frutos de laranjeira Valncia dos fungicidas oxicloreto de cobre, tiofanato metlico e pyraclostrobin, como tambm determinar a capacidade protetora e fungisttica (oxicloreto de cobre) e a capacidade preventiva e curativa (tiofanato metlico e pyraclostrobin) no controle da mancha preta dos frutos ctricos (MPC). No primeiro experimento, aproximadamente 1000 frutos, previamente ensacados, foram

primeiramente imersos nas caldas fungicidas e posteriormente inoculados com condios de Guignardia citricarpa em intervalos regulares de 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias aps a aplicao do fungicida, para o oxicloreto de cobre e de 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias aps a aplicao do fungicida, para o tiofanato metlico e pyraclostrobin. No segundo experimento, aproximadamente 1000 frutos, previamente ensacados, foram primeiramente inoculados e posteriormente tratados por imerso com os respectivos fungicidas nos mesmos intervalos regulares. Foram utilizados 16 frutos por perodo de inoculaes e oito frutos por perodo de aplicao do fungicida. Para o primeiro experimento, oito frutos foram utilizados para a realizao das anlises de resduo e outros oito frutos deixados na planta at a poca da colheita. Para o segundo experimento, somente avaliou-se a incidncia da doena e severidade na colheita. As anlises de resduos foram realizadas por tcnicas de Espectrofotometria de Absoro Atmica na superfcie dos frutos, para o oxicloreto de cobre e de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia acoplada ao detector de massas/massas (CLAE - EM/EM) na superfcie e casca dos frutos, para o tiofanato metlico e na superfcie, casca e polpa dos frutos para o pyraclostrobin. Na poca da colheita, os frutos foram avaliados quanto incidncia, severidade e tipo dos sintomas de G. citricarpa. O fungicida oxicloreto de cobre apresentou limitada capacidade protetora e nenhuma capacidade fungisttica, sob condies de alta presso de inculo. Observou-se que o resduo encontrado na superfcie dos frutos, ou seja, a porcentagem de recobrimento do produto apresentou-

se diretamente ligada ao crescimento dos frutos de laranja Valncia. O fungicida tiofanato metlico, logo aos sete dias aps a aplicao do fungicida nos frutos converteu-se em seu metablito carbendazim, estando estes em maior concentrao na casca dos frutos. Sob condies de alta presso de inculo, o fungicida apresentou capacidade preventiva por apenas um dia, no apresentando capacidade curativa. As maiores quantidades de resduo do fungicida pyraclostrobin foram encontradas na casca dos frutos e mesmo sob alta presso de inculo apresentou eficiente capacidade preventiva, por pelo menos 35 dias e capacidade curativa por sete dias.

Palavras-chave: Citrus sinensis, Phyllosticta citricarpa, pinta preta dos citros e HPLC.

DETERMINATION OF RESIDUAL PERIOD OF PROTECTIVE AND SYSTEMIC FUNGICIDES FOR THE CONTROL OF Guignardia citricarpa ON CITRIC FRUITS

SUMMARY - The objectives of this study were: (i) measure the amount of residues of copper oxychloride, methyl thiophanate and pyraclostrobin in 'Valencia sweet orange fruits after their application; (ii) to evaluate the protective and fungistatic capacity of copper oxychloride and (iii) to evaluate the preventive and curative capacity of systemic fungicides methyl thiophanate and pyraclostrobin for the control of citrus black spot (CBS). Two experiments were carried out, in the first on 1.000 fruits were first immersed in the fungicides and then inoculated with conidia of Guignardia citricarpa at regular intervals of 1, 7, 14, 21, 28 and 35 days, for the copper oxychloride and 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 and 56 days for methyl thiophanate and pyraclostrobin. In the second experiment, on 1.000 fruits were first inoculated with conidia of G. citricarpa and then treated by immersion with the fungicides in the same regular intervals as described. Sixteen fruits were used for each period of inoculations and eight fruits per application. For the first experiment, eight fruits were used for analysis of residues and eight fruits were left in the plant until harvesting to evaluate disease incidence and severity. For the second experiment it was evaluate only disease incidence and severity in the harvest. Analysis of residues were performed by Atomic Absorption Spectrometry on the fruits surface, for copper oxychloride and High Performance Liquid Chromatography coupled to the detector mass/mass (HPLC - MS / MS) on the fruits surface and peel for the methyl thiophanate, and on the fruits surface, peel and pulp for the fungicide pyraclostrobin. Under conditions of high inoculum pressure, copper oxychloride showed limited protective capacity and no fungistatic capacity. Residues found on the fruits surface were directly related to the fruits growth. Methyl thiophanate was converted on its metabolite carbendazim seven days after application and its residues were found in highest concentration in the fruit peel. Under conditions of high inoculum pressure, this later fungicide showed preventive capacity for only one day and no curative capacity. The highest quantity of pyraclostrobin residues vas found in the fruit. Under high

inoculum pressure this fungicide showed efficient preventive capacity, for at least 35 days and curative capacity for seven days.

Keywords: Citrus sinensis, Phyllosticta citricarpa and HPLC.

1.

INTRODUO

De todas as rvores frutferas, uma das mais conhecidas, cultivadas e estudadas em todo o mundo a laranjeira. A laranja constitui-se na fruta mais produzida no mundo, cuja produo em 2006/071 at o momento de aproximadamente 47 milhes de toneladas. Embora produzida em cerca de 100 pases, a produo concentra-se principalmente no Brasil, Estados Unidos e China (AGRIANUAL, 2008). O Brasil detm 30% da produo mundial e 59% da produo de suco. O Estado de So Paulo e a Flrida dominam a oferta mundial, um caso rarssimo em se tratar de commodities agrcolas. O sistema agroindustrial citrcola, um dos setores mais competitivos e de maior potencial de crescimento do agronegcio, movimenta R$ 9 bilhes por ano e gera mais de 400 mil empregos, diretos e indiretos, s no Estado de So Paulo. Inovaes em pesquisa, tecnologia e logstica esto na base da eficincia e liderana do Brasil neste setor (NEVES & JANK, 2006). Atualmente a citricultura brasileira ocupa uma rea de aproximadamente 800 mil hectares tendo o Estado de So Paulo cerca de 565 mil hectares distribudos em 330 municpios e em 29.000 propriedades (AGRIANUAL, 2008). Cerca de 85% dessa produo destinada industrializao, cujo suco produzido exportado para vrios pases, incluindo-se principalmente Blgica, Pases Baixos, Estados Unidos, Japo e China. O Brasil exportou em 2007 mais de 1 milho de toneladas de suco de laranja, refletindo em aumentos de 6,8% a mais que no ano anterior (ASSOCITRUS, 2008). Significativos valores, em divisas, so tambm oriundos das exportaes de frutas frescas que, apenas em 2007, foi responsvel por cerca de 53 mil toneladas, entre laranjas (ABECITRUS, 2009). As plantas ctricas so afetadas por vrios agentes fitopatognicos que, agindo isoladamente ou em conjunto, podem em determinadas circunstncias tornarem-se limitantes a citricultura. Dentre tais agentes fitopatognicos insere-se o fungo Guignardia citricarpa Kiely, cuja fase anamrfica corresponde a Phyllosticta citricarpa McAlp. Van Der Aa, agente causal da mancha preta dos frutos ctricos (MPC).
1

Dado atualizado em agosto de 2008.

A MPC, alm de afetar a aparncia dos frutos causa grandes prejuzos resultantes da queda precoce dos mesmos que, sob condies favorveis, pode exceder cerca de 80% dos frutos na planta (KLOTZ, 1978 & SPOSITO, 2003). Dada a possibilidade de contaminao microbiolgica, normalmente estes frutos cados tornamse rejeitados pela indstria, aumentando significativamente os prejuzos. Atualmente, o controle da MPC tem sido realizado mediante a combinao de prticas culturais e principalmente pelo uso de fungicidas protetores e, principalmente, pela combinao de fungicidas sistmicos associados com protetores e leos mineral ou vegetal. Entretanto, no Brasil, a liberao dos ascsporos tem se dada de forma intermitente, estendendo-se da primavera at os meses do vero, ao contrrio de outros pases, como a frica do Sul, onde se tem praticamente poucos picos de liberao de ascsporos, devido principalmente ao menor ndice pluviomtrico. Os resultados de controle obtidos no Brasil apresentam-se inferiores queles obtidos em outros lugares, possivelmente, tal diferena se deve a liberao freqente de ascsporos, ainda que com picos mais baixos, o que, porm, limita a eficincia dos tratamentos quando aplicados de forma semelhante adotada naqueles pases. Dessa forma, torna-se de fundamental importncia o conhecimento do poder efetivo de controle dos fungicidas utilizados atualmente, tanto preventivamente como curativamente, como tambm o perodo residual dos mesmos. Tais aspectos so desconhecidos na literatura, principalmente para o controle deste patgeno em especfico. Tais informaes podero propiciar otimizaes no controle da MPC, como tambm viabilizar a racionalizao do uso dos fungicidas. Os objetivos do presente trabalho foram determinar a quantidade de resduo existentes em frutos da laranjeira Valncia, bem como determinar a capacidade protetora e fungisttica, do fungicida oxicloreto de cobre, e a capacidade preventiva e curativa, dos fungicidas tiofanato metlico e pyraclostrobin, em diferentes intervalos de tempo, no controle de G. citricarpa.

2.

REVISO DE LITERATURA

2.1.

Histrico da doena

A MPC foi descrita pela primeira vez em 1895, na Austrlia, causando perdas considerveis em frutos de laranja Valncia, tanto em fase de pr como em pscolheita (SUTTON & WATERSTON, 1966). Posteriormente, em 1925, foi encontrada na frica do Sul, na regio litornea e mida da provncia de Natal. Vinte anos depois, o fungo j havia se disseminado para todas as principais regies produtoras deste pas, tornando imprprios para a exportao mais de 90% dos frutos produzidos nos pomares que no realizaram o controle da doena (KOTZ, 1964). Atualmente, essa doena encontra-se assinalada em vrios pases da frica como em Moambique, Zimbbue, frica do Sul, Qunia, Swazilndia, Nigria e Rodonsia; da sia, como na China, Coria, Hong-Kong, Filipinas, Taiwan e Japo; da Oceania como a Austrlia e da Amrica do Sul, como Argentina, Peru, Uruguai, Venezuela e Brasil (KOTZ, 1988; TIMMER et al., 2000). Dentre esses pases, as maiores perdas tm sido registradas na frica do Sul, Japo, Argentina e principalmente no Brasil. No Brasil, a primeira constatao de frutos sintomticos ocorreu em meados de agosto de 1937, quando estes foram coletados em uma feira livre na cidade de Piracicaba, Estado de So Paulo (AVERNA-SACC, 1940). Aps esta data, novos registros foram feitos no Estado do Rio de Janeiro em 1980 (ROBBS et al., 1980), afetando plantas de mexerica Rio, nos municpios de So Gonalo e Itabora, a partir dos quais o fungo disseminou-se rapidamente para outros municpios da Baixada Fluminense, afetando diferentes espcies ctricas. Em 1986, o mesmo autor relata a presena desta enfermidade no Vale do Ca, principal regio produtora do Rio Grande do Sul (FEICHTENBERGER, 1996). Em So Paulo, a doena s voltou a se manifestar em 1992, afetando pomares de limes verdadeiros e laranjas de maturao tardia, nos municpios de Conchal e Engenheiro Coelho (GOES & FEICHTENBERGER, 1993). A partir desta data, a doena teve uma expanso muito rpida para os municpios circunvizinhos, presumindo-se que,

alm do aspecto biolgico do agente causal, as condies climticas tenham tambm favorecido a sua disseminao, dada intensa desfolha das plantas, resultante do dficit hdrico acentuado, precedida de geada, ocorrido no ano de 1994

(FEICHTENBERGER, 1996). Sua expanso tambm foi rpida na regio de Limeira e, atualmente, encontra-se comprovadamente presente, de forma endmica em 72 municpios produtores do Estado de So Paulo2. A MPC tambm se encontra presente em vrios outros Estados como Esprito Santo (COSTA et al., 2003), Minas Gerais (BALDASSARI et al., 2004), Santa Catarina (ANDRADE et al., 2004; THEODORO et al., 2004), Amazonas (GASPAROTTO et al., 2004) e Paran (CAIXETA et al., 2005).

2.2.

Importncia econmica

A MPC, ou pinta preta dos citros, como tambm popularmente designada, causa danos em todas as espcies ctricas de valor comercial, exceo feita laranjeira azeda (Citrus aurantium L.) e seus hbridos (KOTZ, 1981) e limeira cida Tahiti (Citrus latifolia Osbeck) (AGUILAR VILDOSO et al., 2002). Praticamente todas as variedades de laranjeiras doces, principalmente as de maturao mdia e tardia, como o caso da Pra-Rio, Valncia e Natal, so suscetveis doena. Os sintomas mais severos so encontrados nas variedades tardias, como Valncia e Natal (FEITCHTENBERGER, 1996). O fungo Guignardia citricarpa especfico de citros (BAAYEN et al., 2002), causando leses em ramos, folhas e frutos. Nos frutos, as leses ficam limitadas no flavedo (CARDOSO FILHO, 2003), depreciando-os para a comercializao no mercado interno de fruta fresca e restringindo as exportaes para a Unio Europia, maior importador dos frutos ctricos brasileiros (NEVES et al., 2001). A doena considerada quarentenria A1 na Unio Europia, no estando presente em seus pases membros, e Estados Unidos da Amrica. A tolerncia em relao aos frutos importados com sintomas da doena zero (SPSITO, 2003).
2

GOES, Setembro de 2005, informaes pessoais.

A MPC no modifica a qualidade dos frutos (FAGAN & GOES, 2000), podendose utiliz-los na produo de suco ctrico concentrado (TIMMER et al., 2000). Do ponto de vista industrial, as referncias relativas s influncias da doena nas caractersticas tecnolgicas do suco so muito escassas, restringindo-se apenas ao trabalho CITRUS AND SUBTROPICAL FRUIT RESEARCH INSTITUTE (1989). De acordo com este trabalho, foi verificado que, enquanto os teores de slidos solveis totais sofrem alteraes desprezveis, o contedo de cidos muito baixo nos frutos infectados, o que os torna mais adocicados. Teores de cidos de 0,68% a 1,02% tm sido citados para frutos sintomticos e sadios, respectivamente. No Brasil, para o caso das variedades Natal e Valncia, foi verificada uma relao positiva entre os nveis de severidade da doena e teores de slidos solveis totais. Quanto s demais caractersticas como acidez total titulvel, ratio e porcentagem de suco no foram constatadas alteraes significativas (FAGAN & GOES, 2000). Alm de afetar a aparncia dos frutos, grandes prejuzos resultam-se da queda precoce dos mesmos que, sob condies favorveis, pode exceder cerca de 80% dos frutos na planta (KLOTZ, 1978 & SPOSITO, 2003). Dada a possibilidade de contaminao microbiolgica, normalmente estes frutos cados tornam-se rejeitados pela indstria, aumentando significativamente os prejuzos.

2.3.

Agente causal

2.3.1. A espcie Guignardia citricarpa Kiely [anamorfo: Phyllosticta citricarpa (Mc Alpine) Van de Aa]

O fungo responsvel pela MPC o ascomiceto Guignardia citricarpa Kiely, cuja fase perfeita (teleomorfa) foi descrita por KIELY (1948b), na Austrlia, na regio de New South Wales. A forma imperfeita (anamorfa) vem recebendo vrias denominaes desde a sua deteco: inicialmente foi classificado como Phoma citricarpa McAlpine, at 1973; posteriormente, Phyllostictina citricarpa (McAlp.) Petrak e, atualmente,

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Phyllosticta citricarpa (McAlp.) van der Aa. (SUTTON & WATERSTON, 1966). Existem descritas na literatura duas formas de Guignardia spp. morfologicamente idnticas: uma que provoca a MPC e pode produzir infeces assintomticas em folhas e frutos ctricos, e outra forma que somente provoca infeces assintomticas. Aparentemente, a forma que provoca a MPC s infecta tecidos de plantas ctricas, enquanto a forma avirulenta pode infectar outros hospedeiros (McONIE, 1964a). As estruturas de frutificao da forma assexuada so representadas pelos picndios que so formados em leses de frutos, folhas, folhas em decomposio (em grande nmero), pecolos (BEETON et al., 1996) e, ocasionalmente no pednculo dos frutos. As estruturas de frutificao da forma sexuada so representadas pelos pseudotcios, que somente ocorrem em folhas em decomposio, no sendo encontrados em leses de folhas aderidas e frutos contendo os sintomas tpicos da doena (SUTTON & WATERSTON, 1966). As formas anamorfa e teleomorfa geralmente so encontradas associadas. As estruturas de frutificao da forma assexuada so representadas pelos picndios, os quais so pequenos, globosos, pretos e semi-eruptivos. Em corte vertical eles so globosos, com 70 a 330m de dimetro, com parede marrom escura

pseudoparenquimatosa (JONNSTON & FULLERTON, 1988) A colnia de G. citricarpa cresce lentamente em meio de cultura, atingindo dimetro de sete centmetros em 20 dias, em vrios meios de cultura, a 20C, e o miclio fortemente pigmentado submerso, formando uma crosta plectenquimatosa. As clulas conidiognicas so cilndricas, com cerca de 4-8 x 2-3,5m. O condio unicelular, ovide, elptico ou subgloboso, algumas vezes clavado quando jovem, com uma base truncada, contendo gtulas, com apndice apical de 5 a 15m de comprimento e facilmente perdido caracterstico da espcie de Phyllosticta. O mesmo apresenta uma membrana gelatinosa que o recobre servindo de proteo contra o ressecamento durante a disperso (PUNITHALINGAM, 1982).

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2.3.2. Etiologia e sintomatologia

Os sintomas embora possam ser verificados em folhas e no pednculo dos frutos, so excepcionalmente raros nesses tecidos (KOTZ, 1981). As leses observadas em folhas, ramos e espinhos no tm importncia do ponto de vista econmico, e mesmo em variedades suscetveis como os limoeiros, no chegam a comprometer a produo (AGUILAR-VILDOSO et al., 2002). Tais sintomas, no entanto, so importantes do ponto de vista epidemiolgico, j que contribuem para a formao de inculo que pode incrementar o nvel de doena na planta. Nesses rgos, normalmente os sintomas caracterizam-se pela presena de leses necrticas pequenas, com centro acinzentado e bordas bem definidas, de colorao marromescura. As folhas de plantas debilitadas, de diferentes espcies ctricas, podem tambm exibir sintomas tpicos da doena. Todavia, as folhas mesmo que infectadas raramente exibem sintomas durante o seu tempo de vida til, de cerca de trs anos (MAUCHMANI, 1998). Em pomares com histrico da doena, os sintomas so verificados com grande freqncia nas fases iniciais de maturao dos frutos, intensificando-se nas etapas subseqentes. Entretanto, um fato de importncia relevante trata-se do aparecimento de sintomas nas fases de ps-colheita. Tem-se verificado que frutos, mesmo aps criteriosa seleo e tratamento ps-colheita, tm exibido sintomas nas fases de transporte e durante o armazenamento, no local do destino. Dessa forma, dado o carter quarentenrio da doena, a presena de uma nica leso em um fruto amostrado implica na suspenso do desembarque de todo o carregamento existente no navio. Assim o conhecimento dos mecanismos envolvidos na expresso desses sintomas e a determinao de alternativas que viabilizem a sua supresso tornam-se de importncia relevante, podendo significar a possibilidade de aumento do potencial de exportao de frutos pelas empresas brasileiras (SCALOPPI, 2006). Na literatura internacional constam quatro diferentes sintomas associados MPC: mancha dura, falsa melanose, mancha sardenta e mancha virulenta (TIMMER et

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al., 2000). No Brasil, entretanto, j foram relatados seis diferentes sintomas em frutos relacionados MPC (FUNDECITRUS, 2003) (Figura 1).

Figura 1. Tipos de sintomas em frutos causados pelo fungo Guignardia citricarpa. (A) mancha dura, (B) falsa melanose, (C) mancha sardenta, (D) mancha virulenta, (E) mancha trincada e (F) mancha rendilhada. Fonte: Fundecitrus, SP - 2007.

Os sintomas da doena so favorecidos por vrios fatores, dos quais os mais importantes so a radiao solar intensa e as altas temperaturas (FEICHTENBERGER, 1996). Um aspecto importante a ser destacado refere-se ao longo perodo de incubao apresentado pelo fungo. Na presena de umidade, o fungo emite um peg de infeco o qual penetra na cutcula e se expande para dentro do tecido, na forma de uma massa de miclio, permanecendo entre a cutcula e a epiderme. Essa se constitui na chamada infeco quiescente que, posteriormente, d origem s leses tpicas da doena.

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2.3.3. Epidemiologia

Os mecanismos envolvidos no processo de formao destas infeces no so completamente conhecidos. Porm, sabe-se que os sintomas mais severos, normalmente esto associados elevao de temperatura por ocasio da maturao dos frutos, maior incidncia de raios solares nos frutos mais expostos, estresse hdrico e debilidade das plantas (KOTZ, 1981). A doena pode ser originada por duas vias de infeco: por condios ou ascsporos. Os condios so produzidos principalmente em frutos sintomticos, em folhas ainda aderidas ou j cadas da copa, em ramos mortos e no pednculo dos frutos. Os ascsporos so produzidos apenas nas folhas cadas e em decomposio. Ambas as formas mostram-se efetivas, tanto para o estabelecimento da doena em reas anteriormente isentas (ascsporos), como para contribuir no incremento da doena (condio) nas reas afetadas (KOTZ, 1981). O perodo de suscetibilidade dos frutos corresponde desde a queda das ptalas, at cerca de 20-24 semanas aps (KLOTZ, 1978; BALDASSARI, 2001). Nas condies brasileiras, comum a ocorrncia de floradas simultneas em diferentes variedades de laranjas e limes. Certamente, esse fator deve contribuir de forma decisiva no sentido de que, a doena apresente nveis de severidade mais elevados no Brasil que, em outros pases, como por exemplo, na frica do Sul. No existe um consenso sobre quais das formas, entre condios e ascsporos, mostram-se de maior importncia uma vez que doena j tenha sido estabelecida. Para as condies da frica do Sul, os ascsporos constituem-se na principal fonte de inculo (McONIE, 1964a; KOTZ, 1981). No Brasil, em particular no Estado de So Paulo, dada ocorrncia de vrios fluxos de floradas e coexistncia simultnea de frutos de diferentes tamanhos e idade, associadas s chuvas freqentes nos perodos de suscetibilidade dos frutos, aparentemente ambas as fontes de inculo contribuem para o incremento da doena (FEICHTENBERGER, 1996). Os ascocarpos maduros podem ser encontrados durante o ano todo dentro do pomar, mais sua presena depende da freqncia de umidade e secamento das folhas cadas, assim como da presena de temperatura favorvel. O molhamento e secamento intermitente das folhas

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mostraram-se essenciais para o desenvolvimento do ascocarpo (KOTZ, 1981). Entretanto, a magnitude da importncia dessas formas no foi ainda determinada. Para se entender a epidemiologia desta doena, tem-se que considerar a disponibilidade de inculo, as condies climticas necessrias para ocorrer infeco, o ciclo de crescimento das rvores de citros e, particularmente, o desenvolvimento do fruto em relao ao desenvolvimento da doena (KOTZ, 1981).

2.3.4. Controle

Os nveis atuais de incidncia e severidade demonstrados pela MPC nos pomares ctricos do Estado de So Paulo demonstram a gravidade e as boas condies de adaptao climtica encontradas pelo fungo, neste Estado. O custo total de produo de uma caixa de 40,8 Kg de frutos passou de US$ 1,67 em 2003, para US$ 3,48 em 2005. A alta se deve a um conjunto de fatores, mas o que mais se destaca o aumento geral no custo dos insumos. Os gastos com a MPC so avaliados em US$ 0,46 por caixa. Somados, apenas esses tratamentos fitossanitrios equivalem a 20% do custo total de produo (AGRIANUAL, 2006). Dessa forma, as medidas de controle atualmente adotadas alicerado principalmente no controle qumico, apenas tm contribudo para minimizar as perdas potenciais. Essas medidas, alm de elevar o custo de produo ameaam de forma severa o potencial de exportao do Brasil. A produo de ctricos no Brasil apresentou durante todos esses anos diversas mudanas na forma de conduo dos pomares. Um dos principais fatores contribuintes para tal reforma so principalmente os problemas fitossanitrios encontrados pela cultura. Nos anos de 2001 a 2003 os preos pagos ao produtor pela caixa de laranja estiveram entre US$ 2,80 e US$ 3,50 e o controle da MPC elevou o custo de produo de uma caixa em US$ 0,37 na regio sul. Portanto apenas para o controle o valor despendido representou 10,5% a 13,2% do valor de venda de uma caixa. Caso a

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doena estenda-se para os demais municpios produtores, o custo anual passaria para cerca de 72 milhes de dlares (AGRIANUAL, 2005). Mesmo com estes elevados custos o controle da doena no totalmente eficiente, onde sob condies severas, com o melhor tratamento utilizado a incidncia de frutos com sintomas foi de 53%, enquanto que no tratamento com menor eficincia de controle a incidncia foi de 75,5% (SPOSITO, 2003). O controle da doena baseia-se no emprego de mtodos culturais e principalmente no uso de fungicidas. Os primeiros grupos qumicos que apresentaram bom controle da doena foram os fungicidas cpricos, especialmente o oxicloreto de cobre e calda bordalesa, os quais se mostravam como os mais prticos e econmicos. O uso de tais fungicidas foi inicialmente adotado na Austrlia e na frica do Sul, a partir da dcada de 50 (CALAVAN, 1960). Nesses pases, para o controle da doena eram realizadas de trs a quatro pulverizaes com fungicidas cpricos. A primeira aplicao era realizada no florescimento ou imediatamente aps a queda das ptalas, sendo as demais em intervalos de at seis semanas. Entretanto, em pomares mais velhos havia a necessidade de maior nmero de pulverizaes. No entanto, nos anos subseqentes constatou-se que o uso dos fungicidas cpricos, dependendo da quantidade de aplicaes e pocas as quais eram realizados havia a produo de sintomas de fitotoxicidade nos frutos, que apresentavam pequenas leses escuras. Tais manchas eram superficiais, restringindo-se casca, que, embora no afetasse suas caractersticas qumicas e/ou tecnolgicas, ocasionava a sua depreciao comercial, dado aos danos provocados na aparncia dos frutos (CALAVAN, 1960; KOTZ, 1964; KOTZ, 1981). Na dcada de 60 foram introduzidos os fungicidas ditiocarbamatos os quais, alm de proporcionarem bom controle da doena, no apresentavam efeito deletrio aparncia externa da casca dos frutos. Estes foram utilizados em conjunto com os fungicidas cpricos, at que a partir dos anos 70, com o advento dos fungicidas sistmicos, notadamente o benomyl, foi verificado um significativo avano no controle da doena. No caso da frica do Sul, apenas uma nica aplicao de benomyl

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associado com leo mineral era suficiente para o controle efetivo da doena, enquanto que, com fungicidas ditiocarbamatos, faziam-se necessrias de quatro a cinco aplicaes para obter um controle semelhante (KOTZ, 1981). Nessas reas, o controle prximo de 100% foi tambm obtido mediante o emprego de hidrxido de cobre ou calda bordalesa na fase de queda de ptalas, acompanhado da aplicao de benomyl 16 semanas aps essa pulverizao (BERTUS, 1981). Na frica do Sul, dada eficincia dos fungicidas sistmicos benzimidazis, esses foram popularizados, sendo utilizados com grande freqncia. Tal fato redundou em forte presso de seleo, ocasionando o aparecimento de linhagens de G. citricarpa resistentes aos benzimidazis (HERBERT & GRENCH, 1985), provocando mudanas nas estratgias que at ento estavam sendo empregadas com sucesso no controle da doena. Dentre as alteraes incluiu-se o retorno ao uso dos fungicidas protetores, notadamente os ditiocarbamatos e cpricos, e no emprego, pela primeira vez, da mistura em tanque de fungicida sistmico, benomyl ou carbendazim, e mancozeb acrescido de leo mineral (BOT et al., 1987 apud SCHUTTE et al., 1996). Tal tratamento vem sendo empregado com sucesso at os dias atuais. No Brasil, mediante avaliaes da sensibilidade de isolados de G. citricarpa procedentes de vrias regies do pas concluiu-se que os mesmos mostravam-se sensveis ao carbendazim, sem, pois, indcios de resistncia aos benzimidazis (MORETTO et al., 2005). Dentre os fungicidas benzimidazis, o benomyl foi empregado com sucesso por vrios anos, inclusive no Brasil. Entretanto, a partir de 2001 o produto teve sua fabricao e comercializao suspensa, em todo o mundo. Assim, atualmente dentre os benzimidazis so utilizados o carbendazim e tiofanato metlico. Estudos com novas molculas vm sendo desenvolvidos com o intuito de no apenas encontrar novas alternativas de controle, como tambm a minimizar os riscos de resistncia, como preconizado por BRENT (1995). Dentre os novos grupos de fungicidas testados incluem-se os pertencentes s estrobilurinas.

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Os fungicidas desse grupo qumico tm se mostrado eficientes na frica do Sul (SCHUTTE et al., 1997, TOLLIG et al., 1996), Argentina (FOGLIATA et al., 2004) e Brasil (FELIPPE et al., 2004).

2.3.4.1.

Fungicidas protetores: os cpricos

Os compostos base de cobre, como tambm os base de enxofre elementar e ditiocarbamatos so considerados fungicidas de modo de ao no-especfico. Tais compostos podem agir sobre mais de um metablito no organismo do fungo conectando-se a vrias enzimas e compostos biologicamente significativos, sendo efetivos por mais de um modo de ao (KLLER, 1998). A ao desses fungicidas pode ocorrer via interferncia na membrana celular, em diferentes enzimas ou outras micromolculas, ou ainda reagindo com aminocidos, com peptdeos ou outros metablitos (BURCHFIELD, 1967). A maioria desses compostos inibe aes vitais dos fungos pela formao de compostos com o protoplasma ou com metais, ou simplesmente por meio da deposio dos mesmos nas clulas. No entanto, podem causar efeito fitotxico quanto penetram na cutcula da planta (BURCHFIELD, 1967; HOLLOWAY, 1993). Outra caracterstica importante seria a pouca induo ou nenhum risco de resistncia. O efeito fungicida do cobre foi cientificamente estabelecido em 1807 em experimentos de avaliao de esporos do fungo causador do carvo. Em 1885, o mldio da videira foi prevenido com sucesso utilizando-se uma mistura de hidrxido de clcio (calcrio) e sulfato de cobre. Tal mistura conhecida at hoje por calda bordaleza ou mistura de Bordeaux. A absoro de cobre inorgnico solvel e ons livres de cobre causam severa fitotoxidade nas plantas, assim, os fungicidas base de cobre nada mais so que sais de cobre insolveis em gua. Dessa forma, o controle da germinao dos esporos efetuado por meio da cobertura da superfcie do vegetal. Entretanto, sais de cobre

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insolveis em gua e at mesmo a calda bordaleza causam fitotoxidade em plantas, especialmente em climas midos e frios (DELEN et al., 2000). Os fungicidas cpricos possuem largo espectro de ao, baixa toxicidade aguda e so efetivos contra bactrias, alm de sua produo ser relativamente barata quando comparados com produtos modernos. semelhana do enxofre elementar, os fungicidas cpricos tem sido largamente usados na agricultura orgnica (KLLER, 1998). A suposio de que ons de cobre so a causa da reao fungicida a mais simples hiptese a respeito do efeito fungicida dos compostos cpricos. Prvost afirmou que a baixa densidade do cobre inibe a germinao de esporos e que os esporos readquirem capacidade de germinao quando lavados com cido hipoclordrico logo aps a aplicao de sulfato de cobre. Entretanto, a alta solubilidade do acmulo seco da calda bordaleza com atividade txica contra esporos de Plasmopara viticola enfraquece esta concluso. Testes realizados com cobre em depsitos de calda bordaleza em 1938 concluram que o cobre solvel pode ser liberado sob condies de densidade suficiente para capacit-lo a ter ao fungicida. Este ponto de vista poderia no ser considerado e a germinao de esporo de fungos seria considerada inibida por depsitos de cobre insolveis, uma vez que, o crescimento ativo do tubo germinativo acompanhado por uma acidificao da rea que circunda o esporo. Nestas microscopicamente pequenas e acidificadas reas, em quantidades suficientes, ons de cobre so dissolvidos subsequentemente inibindo o avano no desenvolvimento do tubo germinativo (KLLER, 1998). Outro aspecto importante, de extrema importncia no controle, o tamanho das partculas de calda que chegam at o vegetal alvo. Devido alta capacidade de dissoluo, as partculas de menor tamanho foram consideradas mais txicas, indicando um significativo aumento da fitotoxidade do cobre (HEUBERGER & HORSFALL, 1939). O cobre passivamente absorvido nas clulas e, por isso, acumulam-se nas clulas do fungo. Sua disperso no esporo afetado varia de acordo com a espcie do fungo. Este fato est ligado desnaturao de protenas e enzimas como observado no

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grupo sulfidrila (SOMERS, 1963). A reposio de alguns metais em enzimas de cobre outro fator para a toxidade do cobre (LEVI, 1977).

2.3.4.2.

Fungicidas sistmicos: os benzimidazis

A partir dos anos 70, os primeiros fungicidas derivados dos benzimidazis que surgiram foram o thiabendazole, o fuberidazole e o benomyl. Tais compostos exercem ao fungicida contra um grande nmero de patgenos que atacam as folhas das plantas, sementes e alguns originados do solo. Logo aps foram introduzidos dois outros produtos deste grupo: o tiofanato e tiofanato metlico. Esses fungicidas apresentam grande similaridade, tanto em seu aspecto fungisttico como em suas estruturas qumicas. So ativos contra muitos fungos, incluindo os odios, porm no apresentam ao anti-bacteriana. Os fungicidas tiofanatos baseados em tiuria contm um ncleo aromtico e dependem da converso a um anel benzimidazol para exercer sua atividade antifngica. Por este fato os fungicidas tiofanatos so classificados por muitos autores como fungicidas benzimidazis. O primeiro relato da eficincia deste grupo de fungicidas constatou, no fungicida benomyl, propriedades preventivas, curativas e sistmicas, contra certos fungos, bem como efeito contra caros, alm de possuir largo espectro de ao contra fungos da classe Ascomycetos (DELP & KLOPPING, 1968 abud PICININI, 1994). O benomyl decompe-se rapidamente em gua metil benzimidazole carbamato (MBC). Como os efeitos antifngicos do benomyl e do MBC so semelhantes, acreditase que o benomyl atue somente aps sua converso em MBC (CLEMONS & SISLER, 1969, abud PICININI, 1994). A performance do tiofanato metlico e do tiofanato, no controle de doenas de plantas, bastante semelhante do benomyl possuindo espectro de ao muito semelhante. Devido s caractersticas similares destes produtos, sugere-se que o tiofanato metlico converta-se tambm ao MBC, princpio txico do benomyl. Quando

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em soluo aquosa, soluo tampo ou em meio de cultura estril, o tiofanato metlico forma o MBC lentamente. A atividade anti-fngica e a quantidade de MBC formada aumentam com a idade da soluo, entretanto, a fungitoxidade e a taxa de formao de MBC decrescem com a reduo do pH. Baseado nestas informaes, conclui-se que a ao anti-fngica do tiofanato metlico depende inteiramente da formao de MBC e que tal fungicida possui o mesmo modo de ao do benomyl (NENE & THAPLYIAL, 1994). A transformao do benomyl em MBC processa-se muito mais rapidamente do que a do tiofanato metlico, mesmo em pH 7, isto pode explicar a alta fungitoxidade do benomyl e a ocorrncia de raas resistentes de fungos comuns aos dois fungicidas. Os tiofanatos apresentam-se como um grupo de fungicidas sistmicos que tem como base a tiuria, derivado do cido tialofnico. Diferentemente dos fungicidas do grupo dos benzimidazis, os tiofanatos no apresentam um anel heterocclico, mas so considerados como derivados do O-phenilanediamina, com um tomo de hidrognio do grupo amino, substitudo pelo grupo C(S). NH.COOR, onde R representa um radical lcalil. Os fungicidas tiofanatos so compostos fracamente cidos, sintetizados pela reao da O-phenilanediamina e dos steres isotiocianofrmicos. A estrutura qumica dos cidos tialofnicos NH-CSNHCOOH. At o presente momento, trs fungicidas baseados na tiuria so conhecidos: dois deles, o tiofanato (TF) e o tiofanato metlico (MTF) so amplamente utilizados no controle de doenas em frutos e em hortalias em muitos pases. O terceiro anlogo, o BF-48, foi desenvolvido mais tarde (NENE & THAPLYIAL, 1994). O tiofanato metlico um fungicida sistmico levemente solvel em gua, forma complexos com sais de cobre, sua DL50 de 7500mg/kg por via oral em ratos, pode irritar os olhos e a pele. Seu peso molecular de 342,4 e txico a peixes. O tiofanato metlico no pertence estruturalmente ao grupo dos benzimidazis, entretanto, o estudo de sua transformao e seu espectro anti-fngico sugere que este produto atua via alquil benzimidazole carbamato, o MBC (carbendazim) e seu anlogo o EBC. Aplicado nas plantas, decompem-se em 2-metoxicarbonilamino-benzimidazol (carbendazim - MBC). Em soluo aquosa ou em soluo nutritiva estril, o MTF

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converte-se lentamente a MBC. A taxa desta converso diminui consideravelmente com o decrscimo do pH da soluo. A transformao em MBC ocorre tambm quando a soluo do fungicida irradiada por ultravioleta ou sob luz solar. O MTF substitui o tiofanato em vrias funes, pois possui grande atividade fungicida e grande poder sistmico. Quimicamente, o MTF o 1,2-di-(3-metoxicarbonil2-tiuredo)-benzeno. incompatvel com produtos cpricos e os de reao alcalina. No fitotxico nas doses recomendadas e atua como fungicida protetor, curativo e sistmico. Pode aumentar a cor verde das plantas e ainda pode ser aplicado no solo. bastante estvel luz solar e possui um longo poder residual. Possui atividades acaricidas e nematicidas. Previne danos causados por oznio (PICININI, 1994). Os benzimidazis so fungicidas que so absorvidos e translocados com facilidade pelas plantas, no entanto, o uso de adjuvantes ou de surfactantes, bem como a observncia de fatores como o pH da formulao, por exemplo, podero elevar a solubilidade e a absoro dos produtos, proporcionando aumento na performance do controle de doenas em algumas culturas. O movimento transcuticular nos benzimidazis decresce na seguinte ordem: MTF> TF> Benomyl> MBC> TBZ (ZOLEL & EDGITON, 1972 apud PICININI, 1994). O modo de entrada dos benzimidazis na clula do fungo no bem conhecido, no entanto, assume-se que o seja por difuso e que o movimento atravs da membrana seria em funo da solubilidade dos lipdios na molcula, que dependente do pH da concentrao de H+. Quando o pH foi de 4,5 a fungitoxidade observada foi relativamente menor pelo fato de as molculas estarem na forma ionizada, no entanto, com o pH em ndices de 8,6 as molculas dos benzimidazis estariam na forma no dissociada, sendo, portanto, mais facilmente permeveis atravs da membrana do fungo (SCHOOLEY & MACNEILL, 1971). Estudos do modo de ao desses compostos concluram que a sntese do DNA o processo afetado e que as divises nuclear e celular tambm poderiam estar envolvidas, no encontrando, portanto, efeito sobre a sntese de RNA e protena. Mais tarde, outros pesquisadores demonstraram que quando culturas de Saccharomyces pastorianus eram tratadas com MBC, as clulas filhas no se

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separavam das clulas paternas, formando agregados de clulas terminais e alongadas. Dessa forma concluram que, o benomyl ou MBC inibem o processo da mitose em fungos sensveis. O MBC atua como agente txico do fuso acromtico, no qual se encontra um receptor macromolecular com propriedades semelhantes tubulina. O processo de unio do MBC altamente especfico e restrito a grupos sensveis de fungos. Obviamente certa configurao especfica na protena do fuso ou no centro de formao do fuso requerida para que haja sensibilidade a estes fungicidas. Uma pequena mudana nesta regio por simples mutao gnica suficiente para causar resistncia na populao dos fungos sensveis. O modo de ao deste grupo de fungicidas pode explicar tambm a diferena em sensibilidade dos organismos ao MBC, pois h grande variabilidade na afinidade pela tubulina nas diferentes espcies. O grau de afinidade que determina se o organismo sensvel ou no a estes grupos de fungicidas. Trabalhos com Aspergillus nidulans provaram que a afinidade dos benzimidazis com a tubulina o principal fator que determina a atividade do fungicida no organismo. Quanto maior for afinidade do fungicida benzimidazol com a tubulina, maior ser a sensibilidade do organismo ao fungicida. Por outro lado, uma mutao que reduza a afinidade de ligao da tubulina com o fungicida, no afetando o funcionamento normal da tubulina origina uma linhagem resistente (DAVIDSE & FLACH, 1977). As aplicaes foliares tm sido utilizadas com sucesso com os fungicidas benzimidazis. No Brasil, tem-se obtido bons resultados de controle da doena mediante o uso de fungicidas benzimidazis, tanto isoladamente ou em mistura de tanque com fungicidas protetores e leos mineral ou vegetal (GOES et al., 1990; GOES, 1998; GOES & WIT, 1999; BRAZ et al., 2000; FEICHTENBERGER et al., 2000; GOES, 2002). Esses resultados tm sido similares aos obtidos na Argentina (GARRN, 1996) e na frica do Sul (SCHUTTE et al., 1997; TOLLIG et al., 1996). No entanto, a quantidade de frutos para o mercado in natura produzidos quando utilizados estes fungicidas ainda muito baixo e seu custo muito elevado.

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2.3.4.3.

Fungicidas mesosistmicos: as estrobilurinas

Na dcada de 60, observou-se que fungos de um determinado grupo conseguiam sobreviver em florestas europias. Tais fungos competiam por nutrientes com outros fungos existentes no ambiente, mas devido produo de substncias inibitrias, conseguiam se sobressair e sobreviver com xito (LANGE et al., 1993). Estes fungos pertencem ao grupo de cogumelos comestveis pertence diviso Basidiomycota, e duas espcies, em especial destacam-se por suas propriedades antifngicas: Strobilurus tenacellus (Pers.: Fr.) Sing e Oudemansiella mucida (Scha.: Fr.) Hhn. H relatos de que tais substncias podem ser produzidas tambm pelos fungos pertencentes classe dos Ascomicetes (YPEMA & GOLD, 1999). Existem na atualidade 16 tipos de estrobilurinas isoladas e caracterizadas. Cada molcula compreende um grupo (E)-methyl b-methoxyacrylate ligado a uma posio a de uma unidade phenylpentadienyl. O primeiro composto descoberto foi denominado mucidina, tambm conhecido como estrobilurina A. Por apresentar uma estrutura muito simples, todas as outras estrobilurinas conhecidas podem ser consideradas variantes desse composto. Na maioria dos casos, ocorre a variao de um anel benzeno, com a substituio de uma simples hidroxidrila ou complexa (HUTSON & MIYAMOTO, 1998). Os fungicidas derivados destes compostos atuam atravs da inibio da respirao mitocondrial, bloqueando a transferncia de eltrons entre o citocromo b e o citocromo c1 (Complexo III). Na cadeia respiratria ocorre liberao de energia livre em grande quantidade. Esta energia livre suficiente para a biossntese de uma molcula de ATP, assim, a interferncia do fungicida impedir a liberao de energia e conseqentemente a formao da molcula de ATP (YPEMA & GOLD, 1999). Dessa forma, os estdios de desenvolvimento do fungo que so mais prejudicados pelas estrobilurinas so a germinao de esporos e pr-infeco, pois so altamente exigentes em energia (BARTLET et al, 2002). A ao na germinao de esporos das estrobilurinas explica os altos nveis de atividade preventiva que tipicamente tais fungicidas apresentam. As estrobilurinas tambm vm demonstrando ao curativa contra uma gama de doenas, ou seja, h o

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controle da doena mesmo aps a infeco do patgeno, mas antes que os sintomas sejam visveis. Em estudo de microscopia eletrnica, por exemplo, geralmente evidenciada como um colapso do miclio do fungo patognico. A atividade erradicante (controle da doena aps sintomas aparentes) e/ou anti-esporulante (reduo da esporulao) por vezes tambm demonstrado. (PICCININI, 1994). Apesar do fato de todas as estrobilurinas terem o mesmo modo de ao, o espetro de ao contra fungos varia amplamente. Alm disso, as estrobilurinas variam em relao proteo de plantas e outras caractersticas, como a sistemicidade (STIERL et al., 2000a). O pyraclostrobin faz parte do grupo das estrobilurinas, anlogos sintticos da molcula natural estrobilurina A. Como as demais estrobilurinas, tal molcula tem a capacidade de inibir a germinao dos condios, o desenvolvimento do tubo germinativo e a esporulao dos fungos. Dentre as estrobilurinas estudadas e vendidas nas formulaes de produtos comerciais, o pyraclostrobin se apresenta como uma das menos sistmicas, sendo classificada como locosistmica (GODWIN et al., 1992). A substncia ativa absorvida e se difunde no interior do tecido vegetal somente a curtas distncias, formando depsitos nas reas de cobertura cerosa da epiderme que no foram atingidas diretamente pelo fungicida (BASF, 2004). Mesmo no sendo classificado como um fungicida sistmico, o pyraclostrobin apresenta alta estabilidade no tecido vegetal, isto , fica por muito mais tempo ativo. Alm disso, possui liberao lenta, proporcionando elevado efeito residual (STIERL et al., 2000a). Na frica do Sul duas aplicaes de kresoxin metil a 0,2g de i.a./L proporcionaram a obteno de at 97% de frutos comercializveis, mesmo em reas de elevado nvel de inculo (TOLLIG et al., 1996). Na Argentina as estrobilurinas azoxystrobin, pyraclostrobin e trifloxystrobin foram eficientes para o controle de G. citricarpa em limoeiro. A eficincia de cada um esteve condicionada poca de aplicao e ao fungicida includo para o controle (FOGLIATA et al., 2004).

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Em relao severidade da doena importante destacar que quando se compara o percentual de frutos assintomticos obtidos nas condies da frica do Sul (KOTZ, 1964; SCHUTTE et al., 1996; TOLLIG et al., 1996; SCHUTTE & KOTZ, 1997), Austrlia (BERTUS, 1981) e Argentina (RODRIGUEZ & MAZZA GAIAD, 1996; GARRN, 1996) e os obtidos no Brasil (GOES & WIT, 1999; SPSITO, 2003), verificase que nesses pases, o nvel de incidncia e severidade da doena significativamente mais baixo. Normalmente o nmero de frutos assintomticos nesses pases superior a 90%, enquanto que, no Brasil, esse percentual tem sido verificado, muitas vezes, abaixo de 50%, mesmo aps vrias pulverizaes com fungicidas (GOES, dados no publicados). Nas condies brasileiras tais fungicidas, em determinadas combinaes e perodos de aplicao, podem aumentar o peso mdio de frutos e tambm apresentar uma menor quantidade de doena (FELIPPE et al., 2004). Nveis elevados de controle tambm foram obtidos em laranja Natal, em Conchal/SP, na safra 2003/4, onde mediante o emprego de pyraclostrobin, em duas pulverizaes a 0,0375 mL/L, foi obtido 87% de frutos com zero a trs leses (GOES, dados no publicados). No Brasil, o pyraclostrobin normalmente aplicado aps duas pulverizaes de fungicidas cpricos, realizadas em intervalos de 28 dias, sendo a primeira na fase de de ptalas cadas. A aplicao das estrobilurinas normalmente realizada em intervalo de 35 a 42 dias aps a segunda aplicao dos fungicidas cpricos.

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3.

MATERIAL E MTODOS

3.1.

Fase de campo

A primeira etapa, denominada como a fase de campo foi implantada em propriedade particular situada no municpio de Bebedouro, SP. As plantas ctricas utilizadas foram da variedade Valncia, enxertadas em tangerinas Clepatra, mantidas em condio de campo e sob sistema de irrigao por gotejamento.

3.1.1.

Conduo do experimento

No dia 18/10/07 foram ensacados 2.500 frutos com aproximadamente 14,5 mm de dimetro em 50 plantas. Os experimentos referentes aos fungicidas oxicloreto de cobre e tiofanato metlico foram instalados na rea experimental no dia 14/12/07 e conduzidos at o dia 26/02/08, e os experimentos referentes ao fungicida pyraclostrobin foram instalados na rea experimental no dia 11/01/08 e conduzidos at o dia 15/03/08. Durante todo o perodo experimental os frutos permaneceram protegidos por sacos de papel cristal para evitar qualquer infeco externa por esporos de G. citricarpa ou de outros fungos eventualmente presentes na rea. Para os trs fungicidas foram realizados dois experimentos, onde no primeiro experimento, frutos previamente ensacados foram primeiramente imersos na calda fungicida e posteriormente inoculados com condios de G. citricarpa em intervalos regulares de 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias (DAA), para o oxicloreto de cobre e de 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias (DAA), para os fungicidas tiofanato metlico e pyraclostrobin. Para o segundo experimento, frutos previamente ensacados foram primeiramente inoculados com condios de G. citricarpa e posteriormente tratados por imerso em intervalos regulares de 1, 7, 14, 21, 28 e 35 dias (DAI), para o oxicloreto de cobre e de 1, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49 e 56 dias (DAI), para os fungicidas tiofanato metlico e pyraclostrobin.

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Foram utilizados 16 frutos por perodo de inoculaes (DAA) e oito frutos por perodo de aplicao do fungicida (DAI), sendo para o primeiro experimento (DAA), oito frutos utilizados para a realizao das anlises de resduo e oito frutos deixados na planta at a poca da colheita para a avaliao da incidncia da doena e severidade dos sintomas de MPC. Para o segundo experimento (DAI) somente avaliou-se a incidncia da doena e severidade dos sintomas na colheita.

3.1.1.1.

Preparo do inculo e inoculao dos frutos

O inculo utilizado em todo o perodo experimental foi obtido do isolado patognico de G. citricarpa, denominado PC 17-3, proveniente da regio de Conchal, SP. O fungo foi cultivado em placas de Petri em meio batata-dextrose-gar (BDA), e a produo de condios deu-se em BOD com temperatura de 23C ( 1C) e fotoperodo alternado (12h/12h). O monitoramento da esporulao do fungo foi efetuado constantemente e a confirmao da produo de condios feita em microscpio ptico. A suspenso conidial (inculo) foi obtida por meio da raspagem de colnias esporuladas de G. citricarpa acrescentando-se 10mL de gua destilada.

Posteriormente, a suspenso foi filtrada em camada de dupla gaze e ajustada para 1x104 condios/mL, aferida mediante hemocitmetro (cmara de Newbauer). Antes da inoculao em campo adicionou-se suspenso sacarose (10g/ L) e suco de laranja da variedade Pra-Rio (1% v/v) (ALMEIDA et al., 2008). A inoculao procedeu-se por meio da asperso do inculo nos frutos e a quantidade de condios foi padronizada a uma concentrao mdia de 15 mil condios por fruto. Aps a inoculao os frutos foram protegidos por sacos de papel cristal (Figura 2).

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Figura 2. (A) Asperso do inculo, contendo condios de Guignardia citricarpa no fruto e (B) proteo do respectivo fruto, contra inculo proveniente da rea experimental, com sacos de papel cristal. Bebedouro, SP - 2007.

3.1.1.2.

Preparo da calda e aplicao dos fungicidas

Os fungicidas utilizados foram o cprico oxicloreto de cobre (protetor), o benzimidazol tiofanato metlico (sistmico) e a estrobilurina pyraclostrobin

(mesosistmico). Os produtos comerciais utilizados foram: Cobox (870g/kg ou 87% m/m do ingrediente ativo oxicloreto de cobre; 500g/kg ou 50% m/m equivalente em cobre metlico), na formulao granulado dispersvel, na dosagem de 2g de p.c./L; Cercobin 500 (500g/L do ingrediente ativo tiofanato metlico), na formulao suspenso concentrada, na dosagem de 0,75mL de p.c./L; Comet (250g/L ou 25% m/v do ingrediente ativo pyraclostrobin), na formulao concentrado emulsionvel, na dosagem de 0,15mL de p.c./L. O preparo das caldas fungicidas foi realizado conforme as condies especificadas no rtulo dos produtos acrescentando-se 0,5% (v/v) do leo mineral Assist, para os fungicidas oxicloreto de cobre e pyraclostrobin e 0,5% (v/v) do leo mineral Iharol para o fungicida tiofanato metlico. As aplicaes procederam-se sob a forma de imerso e o tempo de contato dos frutos com os fungicidas foi padronizado em 10 segundos. Aps o escorrimento do excedente de calda os frutos foram ensacados.

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3.1.1.3.

Obteno das amostras de campo

As amostras, de oito frutos, foram retiradas sempre uma semana aps os tratamentos, ou seja, aps as inoculaes ou aplicaes dos fungicidas. Os frutos foram depositados diretamente em sacos plsticos anulando-se a possibilidade de perdas do ingrediente ativo na superfcie dos frutos. Aps a coleta, as amostras foram armazenadas em freezer com temperatura de -20C ( 2C) at o momento da realizao das anlises de resduo.

3.2.

Fase analtica

3.2.1.

Oxicloreto de cobre

A segunda etapa, denominada como fase analtica, para o fungicida oxicloreto de cobre foi realizada no laboratrio de Ecotoxicologia do Departamento de Fitossanidade da FCAV/UNESP. As anlises de resduos foram realizadas por tcnica de Espectrofotometria de Absorbncia Atmica, com o intuito de se quantificar o remanescente de ons de cobre na superfcie dos frutos. Alm dessas anlises, os frutos foram individualmente avaliados em peso, dimetro, volume e rea. Para a quantificao dos resduos de cobre, as amostras coletadas em campo foram divididas em quatro sub-amostras de dois frutos cada. Desta forma, cada tratamento constituiu-se de quatro repeties. Posteriormente, cada sub-amostra foi submersa em 0,25L de HCl 2N, permanecendo em repouso por quatro horas. Aps tal procedimento, as suspenses foram filtradas e em seguida levadas ao

Espectrofotmetro de Absorbncia Atmica, GBC 932 AA, onde se quantificou os ons de cobre remanescentes por meio de comparaes com os padres internos de 0,125; 0,250; 0,500; 1,00; 2,00 e 3,00 mg de cobre/L de HCL 2N. O processamento dos dados foi realizado pelo software GBC Avanta verso 1.3.3.

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3.2.2.

Tiofanato metlico

A segunda etapa, denominada como fase analtica, para o fungicida tiofanato metlico foi realizada no laboratrio de anlises de resduos da empresa AGROSAFETY Monitoramento Agrcola Ltda, Piracicaba, SP. As anlises de resduos foram realizadas por tcnica de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia acoplada ao detector de massas/massas (CLAE - EM/EM) na superfcie e casca dos frutos. Alm dessas anlises, os frutos foram individualmente avaliados em peso, dimetro, volume, rea e rendimento em casca. As substncias de referncia analisadas e quantificadas pela tcnica foram tiofanato metlico (MTF) e seu metablito carbendazim (MBC).

3.2.2.1.

Preparo e processamento das amostras

A. Superfcie dos frutos

Para a remoo dos resduos deslocveis da superfcie, os frutos das amostras foram lavados com soluo de surtem (dioctilsulfocinato de sdio, 70%). A quantidade de soluo foi padronizada em 300mL para cada amostra e a lavagem dos frutos deuse em trs etapas. Em cada etapa adicionou-se 100mL da soluo de surtem no prprio saco plstico utilizado na coleta, sob agitao por 30 segundos. Logo em seguida, o lquido das lavagens foi transferido para recipientes plsticos e acondicionados em cmara fria -20C (2C).

B. Casca dos frutos

medida que se procedeu s lavagens determinou-se, o peso individual, o dimetro e o volume dos frutos. Para determinao do volume os frutos foram, individualmente, mergulhados numa proveta graduada contendo gua, onde, o lquido

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deslocado foi considerado igual ao volume do fruto ctrico. Finalizada as medies separou-se a casca dos frutos (periderme = exoderme + albedo) da polpa, ainda congelados. O processamento das amostras constituiu-se em triturar a quantidade de casca obtida, para cada tratamento, com gelo seco, em triturador de alta potncia (cutter). Aps serem trituradas estas foram peneiradas, identificadas e armazenadas em cmara fria, onde se esperou por 12 horas a sublimao do gelo seco contido nas amostras. Desta forma, pde-se obter a homogeneizao do ingrediente ativo em todo o contedo amostral.

3.2.2.2.

Mtodo analtico

A quantificao do resduo de tiofanato metlico (MTF) e seu metablito carbendazim (MBC), presentes na superfcie e casca dos frutos foi realizada conforme o Procedimento Operacional Padro de Determinao de Multiresduos em Hortifruti e Sucos por CLAE-EM/EM de tiofanato metlico e carbendazim, na matriz citros (POPMET021), com algumas adaptaes. Tal metodologia utilizada pelo laboratrio de anlises de resduos da AGROSAFETY Monitoramento Agrcola Ltda, Piracicaba, SP.

A. Superfcie dos frutos

Os recipientes contendo o lquido das lavagens dos frutos foram retirados da cmara fria e aclimatados temperatura ambiente (25C). Ulteriormente, retiraram-se dos recipientes das amostras alquotas de 1mL, transferindo-as para vidrarias especficas contendo 9ml de acetonitrila/gua (7:3). Os tubos foram encaminhados para a mesa agitadora, onde se procedeu a homogeneizao das alquotas. Parte destes homogeneizados foram filtrados e transferidos para frascos de injeo prprios para CLAE EM/EM, sendo em seguida injetados no sistema cromatogrfico.

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B. Casca dos frutos

Em recipientes de extrao devidamente esterilizados (tubos shotts), pesou-se 10g de cascas processadas de cada amostra. Em seguida, realizou-se a extrao dos ingredientes ativos das amostras, por meio da adio de 100mL de metanol, sob agitao contnua, por um minuto, em homogeneizador (Turrax). Tais amostras foram centrifugadas por 10 minutos a aproximadamente 1400 rpm. A prxima etapa consistiu na transferncia de 1mL do sobrenadante das amostras centrifugadas para vidrarias graduadas, onde ocorreu a evaporao das alquotas em chapa aquecedora a 34C, sob injeo de ar comprimido. Os extratos secos obtidos foram ressuspendidos em 1mL de acetonitrila/gua (7:3),

homogeneizados e filtrados para frascos de injeo prprios para CLAE EM/EM, sendo em seguida injetados no sistema cromatogrfico.

3.2.2.3.

Monitoramento dos resduos

A validao de um mtodo analtico consiste na elucidao, por meio da concordncia com padres pr-estabelecidos, de que os requisitos ou parmetros avaliados em laboratrio foram atendidos para determinada fonte de anlise. Esse procedimento de extrema importncia, pois serve de relato comprobatrio das condies de anlise do estudo, bem como balizador, instituindo a faixa de trabalho a ser utilizada e o limite de deteco (LOD) do mtodo. Anteriormente a injeo das amostras de lquido da superfcie e casca dos frutos no sistema cromatogrfico, realizou-se a validao do procedimento analtico para as substncias de referncia tiofanato metlico e carbendazim, no limite de quantificao (LOQ) proposto pelo estudo. As avaliaes dos parmetros laboratoriais foram

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realizadas por meio da injeo da amostra controle3 no sistema cromatogrfico. Desta forma, os parmetros avaliados foram: Seletividade: possibilitou a verificao da presena ou ausncia de interferentes no processo analtico provenientes de solventes, vidrarias e reagentes. A avaliao deste parmetro consistiu na anlise do branco de testemunha, representado por uma amostra com ausncia da matriz citros e dos analitos tiofanato metlico e carbendazim. Preciso de Medio: avaliou a disperso dos resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, em condies experimentais pr-definidas. As duas formas mais usadas para express-la so por meio da repetitividade e da reprodutibilidade, sendo usualmente expressa como desvio padro ou desvio padro relativo (INMETRO, 2003). Para o estudo em questo, tal parmetro foi determinado por desvios padro relativos (DPR, %) e coeficientes de variao percentual (CV, %) em relao mdia, obtidos dos resultados de tempo de reteno (RT) e resposta do detector em rea, respectivamente. O estudo foi balizado pela injeo de uma das solues padres de calibrao em mistura (SPCm) consecutivamente, em cinco replicatas (n=5), no CLAE/EM/EM, considerando-se aceitvel Dvp 3% e CV% 5%. Faixa Linear de Trabalho: o intervalo entre os nveis inferior e superior de concentrao do analito no qual foi demonstrado ser possvel a deteco com exatido, preciso e linearidade exigidas, sob as condies experimentais utilizadas. Tal intervalo deve cobrir a faixa de aplicao do ensaio a ser realizado. Os valores medidos devem estar linearmente correlacionados s concentraes. Isso requer que os valores medidos prximos ao limite inferior da faixa de trabalho possam ser distinguidos dos brancos de testemunha do mtodo. As solues padro de calibrao (SPC) foram elaboradas com o intuito de se obter concentraes conhecidas dos analitos, ou substncias de
3

A amostra controle caracterizou-se por uma amostra de fruto total de citros isenta de resduos de tiofanato metlico e carbendazim.

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referncia, para a construo da curva de calibrao (concentrao x resposta do detector), por meio da injeo dos padres no equipamento. Os padres de calibrao utilizados foram: 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 e 10,00 pg/mL (dissolvidos em acetonitrila) e representaram, respectivamente, em valores aproximados LOQ, LOQ, 2 LOQ, 5 LOQ e 10 LOQ. Exatido: definido como sendo a concordncia entre o resultado de um ensaio e o valor de referncia aceito como convencionalmente verdadeiro. Os procedimentos normalmente utilizados para avaliar a exatido de um mtodo so: uso de materiais de referncia, participao de ensaios laboratoriais e realizao de ensaios de recuperao, em trs nveis de fortificao com sete repeties cada (INMETRO, 2003). Para a anlise de resduos de agrotxicos em alimentos exige-se um mnimo de dois nveis de fortificao com cinco repeties nos estudos de recuperao e validao de mtodos (ANVISA, 2006). O intervalo de aceitabilidade para os valores individuais de recuperao de 70 a 110% (EUROPEAN COMISSION, 2000b) ou valores de variabilidade para a determinao da aceitabilidade de mtodos de recuperaes entre 70 a 120% (ANVISA, 2006). Neste estudo, a tendncia foi determinada com base nos resultados de recuperao analtica (%), realizada em dois nveis de fortificao, com cinco repeties cada. Limite de Quantificao (LOQ): definido como a menor concentrao do analito em uma amostra que se pode determinar com preciso aceitvel (EUROPEAN COMISSION, 2000a). O intervalo de aceitabilidade para os valores individuais de recuperao para cada nvel de fortificao de 70 a 110% e o CV% em relao mdia para cada nvel estudado deve ser igual ou menor que 15% ou valores de recuperao entre 70 a 120 % (EPA, 1996). O LOQ, aps ser

determinado pela curva e anlise da matriz, foi testado com a adio dos analitos (tiofanato metlico e seu metablito carbendazim) s amostras controle. As anlises foram realizadas com cinco repeties e foram calculadas as recuperaes em porcentagem, as mdias e o desvio padro para a verificao

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da aceitabilidade dos resultados. O LOQ proposto pelo mtodo foi de 0,01 mg/Kg. Limite de Deteco (LOD): definido como a menor quantidade do analito presente em uma amostra que pode ser detectado, porm no necessariamente quantificado, sob as condies experimentais estabelecidas (EUROPEAN COMISSION, 2000a).

Aps o teste de validao do mtodo, as amostras de gua de lavagem e casca dos frutos foram injetadas no equipamento. As condies cromatogrficas foram otimizadas de modo a se obter um cromatograma com resoluo adequada para os picos de interesse e as determinaes foram feitas no espectrmetro de massas. As anlises foram realizadas em modo de Monitoramento de Reaes Mltiplas (MRM), selecionando-se duas transies de massa/carga (m/z). A aquisio e tratamento dos dados foram realizados com software Analyst verso 1.4.1. Com a obteno dos dados no software, as quantidades de tiofanato metlico e carbendazim remanescente nas amostras foram calculadas em miligrama dos ingredientes ativos por litro de soluo, para os dados de resduo encontrados na superfcie dos frutos (mg/L), e em miligrama dos ingredientes ativos por quilograma de casca, para os dados de resduo encontrados na casca dos frutos (mg/kg).

3.2.3.

Pyraclostrobin

A segunda etapa, denominada como fase analtica, para o fungicida pyraclostrobin, foi realizada no laboratrio de anlises de resduos da BASF (Global Environmental and Consumer Safety Laboratory - GENCS), Guaratinguet, SP. As anlises de resduos foram realizadas por tcnica de Cromatografia Lquida de Alta Eficincia acoplada ao detector de massas/massas (CLAE - EM/EM) na superfcie, casca e polpa de frutos. Alm dessas anlises, os frutos foram individualmente avaliados em peso, dimetro, volume, rea e rendimento em casca e polpa. As

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substncias de referncia analisadas e quantificadas pela tcnica foram pyraclostrobin (BAS 500F) e seu metablito BF 500-3.

3.2.3.1.

Preparo e processamento das amostras

A. Superfcie dos frutos

Para a remoo dos resduos deslocveis da superfcie, os frutos das amostras foram lavados com soluo de extrao especfica para o fungicida pyraclostrobin (metanol: gua: HCl 2mol/L, 70/25/5, v/v/v). A quantidade de soluo foi padronizada em 400mL para cada amostra e a lavagem dos frutos deu-se em duas etapas. Em cada etapa adicionou-se 200mL da soluo no prprio saco plstico utilizado na coleta, sob agitao por 30 segundos. Logo em seguida, o lquido das lavagens foi transferido para recipientes plsticos e acondicionados em cmara fria -20C (2C).

B. Casca e polpa dos frutos

medida que se procedeu s lavagens determinou-se o peso individual, o dimetro e o volume dos frutos. Para determinao do volume os frutos foram, individualmente, mergulhados numa proveta graduada contendo gua, onde, o lquido deslocado foi considerado igual ao volume do fruto ctrico. Finalizada as medies de todos os frutos, estes foram separados em casca (periderme = exoderme + albedo) e polpa, ainda congelados (Figura 3A e 3B). Tanto a casca como a polpa foi pesada separadamente para se obter o rendimento. O processamento das amostras constituiu-se em triturar a quantidade de casca e polpa obtidas para cada tratamento com gelo seco, em liquidificador de alta rotao. Aps serem trituradas estas foram peneiradas, identificadas e armazenadas em cmara fria, onde se esperou por 12 horas a sublimao do gelo seco contido nas amostras.

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Desta forma, pde-se obter a homogeneizao do ingrediente ativo em todo o contedo amostral (Figura 3C e 3D).

Figura 3. Casca e polpa de frutos de laranja Valncia separadas e congeladas prontas para o processamento, respectivamente (A) e (B). Materiais e equipamentos utilizados para o processamento e homogeneizao das amostras (C) e quantidades de casca e polpa obtidas aps o processamento (D). BASF - Guaratinguet, SP 2008.

3.2.3.2.

Mtodo analtico

A quantificao do resduo de pyraclostrobin (BAS 500F) e seu metablito (BF 500-3) presente na superfcie, casca e polpa dos frutos foi realizada conforme o Procedimento Operacional Padro de Determinao de Resduos de BAS 500F (pyraclostrobin) e o seu metablito BF 500-3 em matriz citros (POP-PA.0243), com

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algumas adaptaes. Tal metodologia utilizada pelo laboratrio de anlises de resduos da BASF (Global Environmental and Consumer Safety Laboratory GENCS), Guaratinguet - SP.

A. Superfcie dos frutos

O lquido das lavagens dos frutos foi retirado da cmara fria, aclimatado temperatura ambiente (25C) e avolumado para 500mL em balo volumtrico calibrado, padronizando-se um volume fixo para todas as amostras (Figura 4A). Foram retiradas alquotas de 4mL dos bales volumtricos, transferindo-as para tubos de centrfuga contendo 2mL de gua e 10mL de ciclohexano. Os tubos foram encaminhados para a mesa agitadora, onde se realizou a partio das amostras por 15 minutos. Finalizada a partio, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a aproximadamente 2000 rpm. Novamente uma alquota de 4mL foi retirada do sobrenadante e transferida para vidraria especfica, onde se realizou a concentrao da mesma em turbo Vap, a 40C. A ressuspenso das amostras foi realizada a partir da adio de 0,250mL de soluo de diluio final4 e transferidas para frascos de injeo prprios para CLAE EM/EM, sendo injetados no sistema cromatogrfico (Figura 4B).

50% da fase mvel A (0,1% de cido frmico em gua) + 50% da fase mvel B (0,1% de cido frmico em metanol).

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Figura 4. Padronizao do produto das lavagens da superfcie dos frutos (A). Amostras em frascos de anlises prprios para injeo no sistema cromatogrfico (CLAE - EM/EM) (B). BASF - Guaratinguet, SP - 2008.

B. Casca e polpa dos frutos

Em recipientes de extrao devidamente esterilizados, pesou-se 5g de cascas e polpas processadas de cada amostra. A extrao dos ingredientes ativos realizou-se, por meio da adio de 100mL de soluo de extrao especfica (metanol: gua: HCl 2mol/L, 70/25/5 v/v/v), sob agitao contnua (Turrax), por cinco minutos. O lquido das extraes foi centrifugado por 10 minutos a aproximadamente 2000 rpm. A prxima etapa consistiu na transferncia de 4mL do sobrenadante das amostras centrifugadas para vidrarias especficas, contendo 2mL de gua e 10mL de ciclohexano, no qual se realizou a partio em mesa agitadora por 15 minutos. Finalizada a partio, as amostras foram novamente centrifugadas. Uma alquota de 4mL foi retirada do sobrenadante das amostras centrifugadas e concentradas at a secura, em turbo Vap a 40C. Os extratos secos obtidos foram ressuspendidos em 1mL de soluo de diluio final, homogeneizados e filtrados para frascos de injeo prprios para CLAE EM/EM, sendo injetados no sistema cromatogrfico.

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3.2.3.3.

Monitoramento dos resduos

Os padres analticos utilizados foram pyraclostrobin (BAS 500F) e seu metablito (BF 500-3), ambos produzidos pela BASF Aktiengesellschaft, com pureza de 99,9% e 100%, respectivamente, de acordo com o certificado de anlise emitido pelo laboratrio de anlises de resduos da BASF (Global Environmental and Consumer Safety Laboratory - GENCS), em Guaratinguet. A validao do mtodo para o BAS 500F e seu metablito BF 500-3 seguiram as mesmas etapas apresentadas para o ingrediente ativo tiofanato metlico e seu metablito carbendazim, descritos no item 3.3.2.3. Dessa forma, apresentam-se a seguir somente os detalhes divergentes dos parmetros analisados: Seletividade: a amostra controle foi considerada aquela que obteve o maior desempenho dentre as caractersticas avaliadas, sendo ela uma amostra de fruto total de citros identificada como 1819 LPA 015 27A. Faixa Linear de Trabalho: os padres de calibrao utilizados foram: 0,40; 0,80; 1,60; 4,00 e 8,00 ng/mL e representaram, respectivamente, em valores aproximados LOQ, LOQ, 2 LOQ, 5 LOQ e 10 LOQ. Exatido: neste estudo, a tendncia foi determinada com base nos resultados de recuperao analtica (%), realizada em dois nveis de fortificao. Os nveis de fortificao (NF) so valores associados ao limite de quantificao (LOQ), tanto que o primeiro nvel de fortificao ou NF=1, sempre ser correspondente a menor concentrao do analito em uma amostra que pode ser determinada com exatido e preciso aceitveis. Os NF utilizados foram o NF=1, que representou o valor do LOQ proposto para tal estudo (0,01 mg/Kg), e o NF=8, que representou 4000 vezes o valor do LOQ proposto, com cinco repeties cada. Limite de Quantificao (LOQ): o LOQ, aps ser determinado pela curva e anlise da matriz, foi testado com a adio dos analitos (pyraclostrobin e seu metablito BF 500-3) s amostras controle. As anlises foram realizadas com cinco repeties, as recuperaes foram calculadas em porcentagem e as

41

mdias e o desvio padro para a verificao da aceitabilidade dos resultados. O LOQ proposto pelo mtodo foi de 0,01 mg/Kg.

As condies cromatogrficas foram otimizadas de modo a se obter um cromatograma com resoluo adequada para os picos de interesse (pyraclostrobin e BF 500-3). As determinaes foram feitas em espectrmetro de massas triploquadrupolo API 4000 (Applied Biosystems/ MDS Sciex). A tcnica de electrospray no modo de ons positivos foi utilizada para a ionizao das substncias de referncia. As anlises foram realizadas em modo de Monitoramento de Reaes Mltiplas (MRM), selecionando 2 transies de massa/carga (m/z). As transies de massa para pyraclostrobin e seu metablito (BF 500-3) foram, 388/194 e 358/164, respectivamente. O clculo da quantidade de resduo contido nas amostras foi baseado nas respostas do detector (rea ou altura) dos princpios ativos (BAS 500F e BF 500-3) relativo respectiva injeo da amostra no sistema CLAE-EM/EM. A aquisio e tratamento dos dados foram realizados com software Analyst verso 1.4.1. Aps o tratamento dos dados as quantidades de resduo de BAS 500F foram ajustadas pela frmula: BAS 500F+1,08*BF 500-3, onde somou-se a quantidade de resduo encontrada de BF 500-3 a cada amostra analisada. Com a obteno dos dados no software, a quantidade de pyraclostrobin remanescente nas amostras foi calculada em miligrama do ingrediente ativo por litro de soluo, para os dados de resduo encontrados na superfcie dos frutos (mg/L), e em miligrama do ingrediente ativo por quilograma, para os dados de resduo encontrados na casca e polpa dos frutos (mg/kg).

3.3.

Fase de avaliaes

Alm das avaliaes da quantidade de resduos dos fungicidas, avaliou-se, aps a colheita dos frutos, a capacidade protetora e fungisttica do oxicloreto de cobre e a

42

capacidade preventiva e curativa do tiofanato metlico e pyraclostrobin. Para tal as variveis analisadas foram: Incidncia da doena: considerou-se como a porcentagem de frutos com algum tipo de sintoma da MPC. Severidade: para a avaliao dos sintomas de mancha dura e falsa melanose utilizou-se a diagramtica (Figura 5). Para a avaliao dos sintomas do tipo mancha sardenta considerou-se escala desenvolvida mediante observaes experimentais do presente trabalho. A severidade foi expressa em ndice de doena (ID), conforme WHEELER (1969) sendo:

1 ID = N

i.n , onde:
i =0 i

ID = ndice de doena; N = nmero total de frutos avaliados; i = nota da doena; ni = nmero de frutos com nota i; m = nota mxima.

Tipos de sintoma predominantes da MPC A

Figura 5. Escala diagramtica para avaliao da severidade (%) da MPC (Guignardia citricarpa). Sintomas do tipo mancha dura (A) e sintomas do tipo falsa melanose (B) (SPSITO et al., 2004).

43

4.

RESULTADOS

4.1.

Oxicloreto de cobre

4.1.1.

Monitoramento dos resduos

Avaliando-se os teores residuais de cobre existentes nos frutos (mg/fruto), observou-se que, temporalmente, a quantidade de cobre no demonstrou grandes variaes durante as semanas de avaliao, denotando, dessa forma, perdas pequenas da quantidade inicial de calda fungicida ao longo do tempo (Figura 6).

0,50 Oxicloreto de Cobre 0,45 0,40 Resduo de cobre (mg/fruto) 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0 7 14 21 28

y = 7,49E-05x - 5,56E-03x + 4,79E-01 R = 0,71

35

42

49

56

Dias aps a aplicao (DAA)

Figura 6. Quantidades residuais de cobre existentes nos frutos de laranjeira Valncia (mg/fruto), aps aplicao de oxicloreto de cobre, sob a forma de imerso. Jaboticabal, SP 2008.

44

Porm, quando os teores residuais de cobre foram relacionados com o crescimento dos frutos (Figura 7), ou seja, obtendo-se a quantidade remanescente de cobre por rea (mg/cm), verificou-se que, o resduo encontrado diminuiu

consideravelmente ao longo do tempo (Figura 8).

50,00 Oxicloreto de Cobre 45,00 40,00 rea dos frutos (cm) 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0 7 14 21 28 Semanas 35 42 49 56 y = 1,23E-02x - 3,96E-02x + 1,43E+01 R = 0,98

Figura 7. Curva de crescimento dos frutos de laranjeira Valncia (mg/fruto), entre a primeira semana de avaliao (7DAA) at a stima semana de avaliao (49DAA). Jaboticabal, SP 2008.

45

0,050 0,045 0,040 Resduo de cobre (mg/cm) 0,035 0,030 0,025 0,020 0,015 0,010 0,005 0,000 0 7 14 21 28 35 42 49 56 Dias aps a aplicao (DAA) Oxicloreto de Cobre y = 1,08E-05x - 1,14E-03x + 3,96E-02 R = 0,97

Figura 8. Quantidades residuais de cobre existentes na rea dos frutos de laranjeira Valncia (mg/fruto), aps aplicao de oxicloreto de cobre, sob a forma de imerso. Jaboticabal, SP 2008.

4.1.2.

Capacidade protetora

Em todos os perodos de avaliao, inclusive 24 horas aps a aplicao do fungicida oxicloreto de cobre (1DAA), os frutos avaliados apresentaram sintomas tpicos da doena, porm com severidade muito baixa (ID=0,3), predominando 80% de frutos assintomticos (Figura 9). A incidncia e a severidade aumentaram temporalmente, sendo observada, aos 28 dias da aplicao (28 DAA), a presena de 87,5% dos frutos com ID=4, considerada elevada e suficiente para ocasionar expressiva queda de frutos (FAGAN & GOES, 2000) (Figura 9). Os sintomas predominantes em todas as semanas de avaliao foram do tipo falsa melanose e mancha sardenta.

46

100 Incidncia da doena (%) 90 80 Incidncia da doena (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 1 7 Severidade (ID)

y = 5,89E+00x 2 - 1,91E+01x + 3,55E+01

R2 = 0,95

6,00

y = 2,53E-01x 2 - 7,33E-01x + 7,21E-01 R2 = 1,00

5,00

4,00 Severidade (ID)

3,00

2,00

1,00

0,00 14 Dias aps a aplicao (DAA) 21 28

Figura 9. Efeito das aplicaes protetoras do fungicida oxicloreto de cobre na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC nos frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008.

4.1.3.

Capacidade fungisttica

Em todos os perodos de avaliao observou-se a presena da doena nos frutos avaliados, variando entre 75 a 100% de frutos sintomticos. Mesmo com a aplicao do fungicida 24 horas aps a inoculao (1DAI), houve a presena de 75% de frutos sintomticos, com nveis elevados de severidade (ID=2) (Figura 10). A severidade aumentou ao longo das semanas de avaliao, apresentando-se, aos 21dias aps a inoculao (21DAI) a presena de 100% de frutos sintomticos com ID=5, considerado muitssimo elevado (Figura 10). Os sintomas predominantes em todas as semanas de avaliao foram do tipo mancha dura e mancha virulenta.

47

100 90 80 Incidncia da doena (%) 70 60 50 40 30 20 10 0 1 7 14 21 Dias aps a inoculao (DAI) Incidncia da doena (%) Severidade (ID)

6,00

5,00

4,00 Severidade (ID)

3,00

2,00

y = -1,14E-13x 2 + 5,00E+00x + 7,50E+01

R2 = 0,20 1,00

y = -6,25E-02x + 1,09E+00x + 1,31E+00 R2 = 0,80 0,00

Figura 10. Efeito das aplicaes de oxicloreto de cobre na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC, aps a inoculao dos frutos de laranjeira Valncia, em diferentes intervalos de tempo. Jaboticabal, SP 2008.

4.2.

Tiofanato metlico

4.2.1.

Monitoramento dos resduos

Os dados referentes s quantidades residuais de tiofanato metlico (MTF) e seu metablito carbendazim (MBC) na superfcie e casca dos frutos, encontram-se contidos nas Figuras 11A e 11B, respectivamente. O fungicida tiofanato metlico, aos sete dias aps a aplicao nos frutos (7DAA), a quantidade de resduo na casca (Figura 11B), tanto de tiofanato metlico, como de seu metablito carbendazim foi muito mais elevada do que as quantidades presentes na superfcie dos frutos (Figura 11A).

48

A
Resduo na superfcie dos frutos (mg/cm)

5,00E-06 Tiofanato Metlico 4,50E-06 Carbendazim 4,00E-06 3,50E-06 3,00E-06 2,50E-06 2,00E-06 1,50E-06 1,00E-06 5,00E-07 0,00E+00 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Dias aps a aplicao (DAA)
5,00 Tiofanato Metlico 4,50 Resduo na casca dos frutos (mg/Kg) 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Dias aps a aplicao (DAA) Carbendazim Tiofanato Total

y = -1,15E-12x + 1,24E-11x + 5,33E-09 R = 0,11 y = 6,59E-10x - 6,87E-08x + 1,93E-06 R = 0,90 y = 1,17E-09x - 1,22E-07x + 3,44E-06 R = 0,90

Tiofanato Total

y = 0,00x - 0,01x + 0,53 R = 0,67

y = 0,00x - 0,04x + 1,78

R = 0,93

y = 0,00x - 0,08x + 3,80

R = 0,92

Figura 11. Quantidades residuais de tiofanato metlico e seu metablito carbendazim na superfcie (mg/cm) (A) e na casca (mg/kg) (B) de frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008.

49

Do total do fungicida aplicado nos frutos, grande parte converteu-se em seu metablito carbendazim, sendo detectado em maiores quantidades do que seu precursor, desde a primeira semana de avaliao (07DAA). Os teores residuais de MTF e MBC detectados na superfcie e casca dos frutos reduziram progressivamente ao longo das avaliaes realizadas, apresentando-se, para a superfcie dos frutos, quantidades remanescentes prximas ao limite de deteco do mtodo (0,01mg/kg).

4.2.2.

Capacidade preventiva

A presena de sintomas foi observada aos sete dias aps a aplicao de tiofanato metlico (07DAA), embora, com baixo nvel de severidade (ID=0,4). Ao longo das avaliaes observou-se que houve aumento da incidncia da doena, alcanando 75% aos 42 dias aps a aplicao do fungicida (42DAA), assim como em relao severidade (ID=2,4) aos 35 dias aps a aplicao de tiofanato metlico (35DAA). Diante de tais dados infere-se que o fungicida tiofanato metlico apresentou efeito preventivo por apenas um dia, j que os primeiros sintomas foram observados a partir dos sete dias aps a aplicao (Figura 12). Os sintomas predominantes em todas as semanas de avaliao foram do tipo mancha sardenta.

4.2.3.

Capacidade curativa

A aplicao de tiofanato metlico um dia aps a inoculao (01DAI) mostrou-se insuficiente para proporcionar o controle completo do patgeno, e consequentemente supresso dos sintomas. Os sintomas predominantes na avaliao de um dia (01DAI) foram do tipo mancha dura e mancha virulenta. A incidncia de frutos doentes foi de 100% e a severidade apresentada foi muitssimo elevada (ID=4,5), acompanhada de expressiva queda de frutos. Assim, diante da acentuada queda de frutos as avaliaes que seriam realizadas foram suspensas, independente das combinaes avaliadas.

50

100 Incidncia da doena (%) 90 80 Incidncia da doena (%) 70 60 50 40 30 20 Severidade (ID)

y = -6,58E-01x 2 + 1,82E+01x - 1,05E+01

R2 = 0,87

6,00

y=

-1,18E-01x 2

+ 1,28E+00x - 1,37E+00 R2 = 0,93

5,00

4,00 Severidade (ID)

3,00

2,00

1,00

0,00 10 0 1 7 14 28 35 42 Dias aps a aplicao (DAA) -1,00

Figura 12. Efeito das aplicaes preventivas do fungicida tiofanato metlico na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC nos frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008.

4.3.

Pyraclostrobin

4.3.1.

Monitoramento dos resduos

Os dados referentes s quantidades residuais de pyraclostrobin na superfcie, casca e polpa dos frutos, encontram-se contidos na Figura 13. Verificou-se que, desde a primeira semana de avaliao, aos sete dias aps a aplicao do fungicida pyraclostrobin nos frutos (7DAA), a quantidade do ingrediente ativo presente na casca foi muito mais elevada do que as quantidades presentes na superfcie e polpa dos frutos. Os teores residuais da superfcie dos frutos, logo aos 35 dias aps a aplicao (35DAA) apresentaram-se bem inferiores ao limite de

51

quantificao do mtodo (0,01mg/L), estando prximo ao limite de deteco (LD), ou seja, apenas na forma de traos. Em relao polpa dos frutos, a partir de sete dias aps a aplicao (7DAA) os teores residuais apresentavam-se prximos ao limite de quantificao do mtodo (0,01 mg/kg). Ao longo das avaliaes, a quantidade de pyraclostrobin na casca dos frutos diminuiu consideravelmente, apresentando reduo de at 78% aos 63 dias aps a aplicao (63DAA).

2,00 Superfcie Casca Resduo nos frutos (mg/cm e mg/kg) Polpa 1,50

y = 2,26E-09x - 2,15E-07x + 5,05E-06

R = 0,65

y = 1,31E-04x - 2,32E-02x + 1,18E+00

R = 0,55

y = -1,19E-05x - 6,44E-04x + 1,93E-02

R = 0,10

1,00

0,50

0,00 0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 Dias aps a aplicao (DAA)

Figura 13. Quantidades residuais de pyraclostrobin na superfcie (mg/cm), casca e polpa (mg/kg) de frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008.

52

3.2.4. Capacidade preventiva

O aparecimento de sintomas foi observado apenas aos 42 dias aps a aplicao do fungicida pyraclostrobin (42DAA), cuja severidade, no entanto, deu-se em baixo nvel (ID=0,63) (Figura 14). Os sintomas predominantes foram do tipo mancha dura e mancha sardenta. Dessa forma, o fungicida pyraclostrobin apresentou capacidade de prevenir o desenvolvimento do fungo, por pelo menos 35 dias.
100 90 80 70 Incidncia da doena (%) Severidade (ID) 60 0,50 50 40 0,25 30 20 10 0 1 -10 Dias aps a aplicao (DAA) 7 14 21 28 35 42 -0,25 0,00 Incidncia da doena (%) Severidade (ID) 1,00 y = 2,98E+00x 2 - 1,85E+01x + 2,14E+01 R2 = 0,72 2 y = 3,75E-02x - 2,33E-01x + 2,70E-01 R2 = 0,72 0,75

Figura

14.

Efeito

das

aplicaes

preventivas

do

fungicida

pyraclostrobin na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC nos frutos de laranjeira Valncia. Jaboticabal, SP 2008.

53

3.2.5. Capacidade curativa

A presena de sintomas foi observada aps 14 dias da inoculao (14DAI) em aproximadamente 72% dos frutos avaliados, sendo a severidade em nvel intermedirio (ID=1,88), segundo escala de Fagan & Goes (1999). Assim a aplicao do fungicida 14 dias aps a inoculao (14DAI) no foi suficiente para impedir a expresso dos sintomas (Figura 15). A incidncia alcanou o nvel mais elevado, de 100%, 49 dias aps a inoculao (49DAI). Nessa avaliao o nvel de severidade foi elevado (ID=3,13), considerado como potencial para a queda de frutos (Figura 15). Os sintomas predominantes nos frutos em quase todas as semanas de avaliao foram do tipo falsa melanose e mancha virulenta. Dessa forma, o fungicida pyraclostrobin apresentou capacidade curativa, por pelo menos sete dias (Figura 15).

100 Incidncia da doena (%) 90 80 Incidncia da doena (%) 70 60 50 40 30 20 10 Severidade (ID)

y = 6,80E-01x 2 + 8,72E+00x - 5,36E+00

R2 = 0,70

6,00

y=

6,10E-02x 2

- 9,83E-02x + 2,84E-01 R2 = 0,60

5,00

4,00 Severidade (ID)

3,00

2,00

1,00

0,00 0 1 -10 Dias aps a inoculao (DAI) 7 14 21 35 42 49 -1,00

Figura 15. Efeito das aplicaes do pyraclostrobin na incidncia (%) e severidade (ID) da MPC, aps a inoculao dos frutos de laranjeira Valncia, em diferentes intervalos de tempo. Jaboticabal, SP 2008.

54

5.

DISCUSSO

Os fungicidas cpricos, considerados de ao no-especfica, ou seja, que apresentam mais de um modo de ao contra fungos, so amplamente utilizados na agricultura. O fato de apresentarem eficiente ao protetora, baixa presso de seleo sobre os agentes fitopatognicos, amplo espectro de ao contra vrios fitopatgenos e fornecer uma quantidade aprecivel de ons cobre, fundamentais para a fisiologia da planta, faz desse produto uma excelente alternativa no manejo de muitas doenas associadas s plantas ctricas. A diminuio da quantidade de oxicloreto de cobre depositada na superfcie dos frutos esteve diretamente relacionada ao crescimento dos frutos, ou seja, houve diminuio dos teores de cobre devido ao aumento da rea dos frutos. Em toranjas, na Flrida a mesma relao foi encontrada, ou seja, a diminuio nos teores residuais de cobre ao longo das semanas, para frutos com altas taxas de crescimento, esteve muito mais relacionada ao aumento da superfcie dos frutos do que as perdas por intemperismo (TIMMER et al., 1998). Embora o oxicloreto de cobre apresente eficiente capacidade protetora, os sintomas da doena foram observados 24 horas aps a aplicao do fungicida. Possivelmente, o aparecimento de sintomas no perodo descrito esteve relacionado a quantidade de inculo aplicada (concentrao mdia de 15 mil condios por fruto) de forma dirigida e sob condies de ambiente favorvel para o desenvolvimento do processo infeccioso, j que foi proporcionada a formao de cmara mida. As aplicaes de fungicidas base de cobre para o controle de doenas fngicas do citros, como a MPC, devem respeitar intervalos de no mximo 28 dias entre as aplicaes (GOES, 1998). Os dados obtidos neste trabalho, mesmo sob condies controladas, corroboram com as recomendaes citadas, onde se observa um aumento expressivo da severidade dos sintomas aos 28 dias aps a aplicao de oxicloreto de cobre. Dessa forma, mesmo para os frutos destinados ao processamento industrial, o intervalo inferior a 28 dias entre as aplicaes deve ser respeitado, pois o potencial de

55

queda de frutos, em uma rea com alta presena de inculo, pode aumentar em 45% em apenas uma semana, conforme clculos realizados utilizando-se os dados coletados. Avaliando-se a ao fungisttica dos ons de cobre, pode-se verificar que, mesmo a aplicao 24 horas aps a inoculao, no impediu o aparecimento de sintomas, assim como o aumento da severidade da doena. No intervalo de 24 horas muitos dos condios presentes na superfcie dos frutos foram capazes de germinar e penetraram no tecido vegetal, tornando a ao deste fungicida invivel, pois o mesmo no absorvido pelo tecido vegetal. Tais resultados so indicaes de que o fungicida oxicloreto de cobre, em aplicaes ps-infeco do fungo, incapaz de proporcionar uma ao fungisttica sobre o patgeno Em frutos de tangerina Fortune, o oxicloreto de cobre, na formulao suspenso concentrada, apresentou elevada capacidade residual, mesmo sob condies de chuva de 71 mm e o controle da mancha marrom de Alternaria deu-se satisfatoriamente at 28 dias aps a aplicao (VICENT et al., 2007). Em folhas ctricas, o fungicida hidrxido de cobre apresentou capacidade protetora prxima a 50% dos patgenos Diaporthe citri, Elsinoe fawcettii e Alternaria alternata, at dois dias aps a aplicao. Porm, no quarto dia da aplicao tal fungicida no apresentou controle efetivo das doenas. Em relao capacidade fungisttica, o hidrxido de cobre no apresentou resultados satisfatrios (MONDAL et al., 2007). O tiofanato metlico, um fungicida tipicamente sistmico, amplamente usado na agricultura devido ao seu amplo espectro de ao contra diversos patgenos causadores de doenas em muitas culturas de importncia econmica para o pas. As maiores quantidades residuais de tiofanato metlico foram observadas na casca. Tal fato confirma as informaes existentes na literatura quanto sistemicidade do fungicida. Por outro lado, o carbendazim, seu metablito de maior importncia, esteve presente em maior quantidade que o mesmo, desde a avaliao realizada aos sete dias aps a aplicao da sua formulao.

56

Avaliando-se os resultados obtidos, tanto para as aplicaes preventivas, como curativas, verificou-se que o tiofanato metlico no proporcionou o desempenho esperado de um produto tipicamente sistmico. Possivelmente, a concentrao de inculo aplicada de forma dirigida nos frutos, as condies favorveis proporcionadas ao desenvolvimento do patgeno e a aplicao da calda fungicida por imerso nos frutos, somadas, tenham contribudo de forma decisiva para o insatisfatrio desempenho deste agroqumico. Muitos questionamentos surgem em relao metodologia de aplicao pontual, ou seja, sob a forma de imerso dos frutos, principalmente no caso de fungicidas sistmicos, pois sabe-se que o depsito de calda efetuado nas folhas, contribui grandemente para o desempenho desses fungicidas em campo. Em experimentos realizados por GOES (comunicao pessoal5) o ingrediente ativo tiofanato metlico, em pulverizaes de alto volume em campo, tem obtido resultados altamente satisfatrios, ou seja, o nvel de controle da doena alcanado. Admite-se que, quando do emprego de pulverizaes a quantidade de ingrediente ativo que alcana as folhas e ramos jovens contribuam ao incremento do mesmo nos tecidos internos da planta, incluindo os frutos, com conseqente melhoria na deposio e sistemicidade. Segundo Miller, 1969 os fungicidas sistmicos, como no caso dos benzimidazis, fenilamidas e triazis, so absorvidos pela planta e transportados dentro destas, onde revelam suas propriedades fungitxicas em qualquer localizao para onde tenham sidos transportados, alm disso, a propriedade antifngica que lhes so conferidos est condicionada absoro do ingrediente ativo pela planta em quantidades suficientemente elevadas para apresentar ao fungisttica. As estrobilurinas, consideradas como fungicidas de ao especfica, so as mais recentes molculas lanadas no mercado, constituindo-se como uma nova alternativa de controle de doenas de diversas culturas. Com o monitoramento das quantidades de pyraclostrobin remanescentes na superfcie, casca e polpa dos frutos pode-se verificar que, na casca foram detectadas as maiores concentraes do ingrediente ativo, independente do perodo de avaliao.
5

A. de Goes, Professor da UNESP/FCAV - Campus de Jaboticabal; Departamento de Fitossanidade.

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Aparentemente, tal fato deve-se forte aderncia da substncia ativa a camada cerosa da planta, dado especialmente afinidade entre a sua molcula e camada de cutina (BASF, 2004). O fungicida pyraclostrobin mostrou eficiente capacidade preventiva, pois somente 42 dias aps a aplicao observou-se o aparecimento de sintomas. A preveno da doena ocorreu at 35 dias, mesmo sob elevada presso de inculo e boas condies de ambiente ps-inoculao. Tal resultado mostra-se coerente s informaes contidas na literatura, j que os intervalos de pulverizaes em campo, de fungicidas sistmicos e mesosistmicos, so de no mximo 42 dias (GOES, 1998). O nvel de incidncia observado (62% de frutos sintomticos) aos 42 dias da aplicao, ainda que elevada, apresentou nvel de severidade baixo, no apresentando frutos com potencial de queda prematura (FAGAN & GOES, 1999). O eficiente desempenho preventivo do fungicida pyraclostrobin deve-se s caractersticas intrnsecas do princpio ativo como, baixa solubilidade em gua, forte adeso camada lipoflica das plantas e baixa presso de vapor, o que permite uma liberao contnua da substncia ativa por muitas semanas (STIERL et al., 2000b). O pyraclostrobin apresentou capacidade curativa at sete dias aps a inoculao, apresentando sintomas, em aproximadamente 70% dos frutos, aos 14 dias. Tal resultado mostra-se coerente ao contido na literatura, j que o mesmo mostra-se mais eficiente quando aplicado preventivamente (BARTLET et al., 2002). O efeito curativo resulta da atenuao da expresso dos sintomas ou reparao dos danos provocados pelo patgeno, sendo, pois, uma ao dirigida contra o patgeno, aps o estabelecimento efetivo com o hospedeiro (KIMATI, 1995). Quando fungicidas so aplicados curativamente, o sucesso do tratamento depende de vrios fatores como, a espcie do patgeno, a sua fase de desenvolvimento quando do momento da aplicao do fungicida, da concentrao e do grau de metabolizao dos fungicidas, entre outros. A medio do grau de metabolizao torna-se importante na determinao da capacidade curativa do fungicida, pois quanto mais estvel for o composto, mais tempo este ir ficar em contato com o patgeno. Em estudos in vitro, o pyraclostrobin

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apresentou metabolizao de 25% em 24 horas em teste com Botrytis cinerea, permanecendo ativo por muito mais tempo (STIERL et al., 2000a, b). Possivelmente, este nvel de absoro e metabolizao no s confere boa capacidade curativa, mas tambm excelente capacidade preventiva, pois o ingrediente ativo fica por muito mais tempo sobre a superfcie do vegetal, atuando nas fases iniciais do patgeno, que ir diminuir a fonte de inculo, evitando, nos casos de total controle, a esporulao do patgeno. Em folhas ctricas, o fungicida pyraclostrobin apresentou altos nveis de controle dos patgenos Diaporthe citri, Elsinoe fawcettii e Alternaria alternata (>75%), quando aplicado at cinco dias antes da inoculao, ou seja, apresentou satisfatria capacidade preventiva. Em relao capacidade curativa, o pyraclostrobin obteve elevados nveis de controle (>75%) quando aplicado at dois dias aps a inoculao de esporos de Diaporthe citri e Elsinoe fawcettii (MONDAL et al., 2007).

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6.

CONCLUSO

Os resultados permitiram concluir que:

O fungicida oxicloreto de cobre apresentou limitada capacidade protetora e ausncia de capacidade fungisttica; Os maiores teores residuais de tiofanato metlico foram encontrados na casca dos frutos; As quantidades remanescentes do ingrediente ativo pyraclostrobin estiveram, respectivamente, em maiores quantidades na casca>polpa>superfcie. Este fungicida apresentou capacidade preventiva por 35 dias e curativa por sete dias.

Para os trs fungicidas estudados, o nvel de controle da doena diminuiu em relao ao aumento dos intervalos entre a aplicao e as inoculaes, como tambm entre a inoculao e as aplicaes.

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