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IBP1058_12 PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES PARA APLICAÇÃO NA REMOÇÃO DE CONTAMINANTES AMBIENTAIS GERADOS NA INDÚSTRIA DE PETRÓLEO Leonie A. Sarubbo1, Raquel D.

Rufino2, Juliana M. de Luna3, Charles B.B. Farias4, Valdemir A. dos Santos5
Copyright 2012, Instituto Brasileiro de Petróleo, Gás e Biocombustíveis - IBP Este Trabalho Técnico foi preparado para apresentação na Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012, realizado no período de 17 a 20 de setembro de 2012, no Rio de Janeiro. Este Trabalho Técnico foi selecionado para apresentação pelo Comitê Técnico do evento, seguindo as informações contidas no trabalho completo submetido pelo(s) autor(es). Os organizadores não irão traduzir ou corrigir os textos recebidos. O material conforme, apresentado, não necessariamente reflete as opiniões do Instituto Brasileiro de Petróleo, Gás e Biocombustíveis, Sócios e Representantes. É de conhecimento e aprovação do(s) autor(es) que este Trabalho Técnico seja publicado nos Anais da Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012.

Resumo
Este trabalho descreve a aplicação de surfactantes microbianos na remoção de petróleo e derivados de ambiente marinho localizado nas proximidades da Termelétrica de Pernambuco. Dois biossurfactantes foram produzidos pelas leveduras Candida sphaerica e C. lipolytica cultivadas em resíduos industriais durante 144 e 72 horas, respectivamente. As tensões superficiais das biomoléculas foram determinadas (25 mN/m), os rendimentos de produção calculados (8-9g/L) e as CMC’s estabelecidas (0,03%). Os biossurfactantes foram aplicados em amostras de água do mar e de pedras contaminadas com óleo de motor e petróleo. Os resultados demonstraram a ação dispersante do biossurfactante de C. sphaerica e emulsificante do biossurfactante de C. lipolytica sobre o óleo, bem como remoções de 100% do óleo e do petróleo. A possibilidade de aplicação de biossurfactantes na remediação de ambientes poluídos por hidrocarbonetos motiva o avanço das pesquisas no sentido de desenvolver essa tecnologia alternativa para utilização efetiva nos sistemas de tratamento da Termope.

Abstract
This paper describes the application of microbial surfactants in removing crude oil and marine environment located in the proximity of the Pernambuco Thermoelectric. Two biosurfactants were produced by yeasts Candida sphaerica and C. lipolytica grown in industrial wastes during 72 and 144 hours, respectively. The surface tensions of the biomolecules (25 mN/m) were determined, the production yields were estimated (8 and 9 g/L) and the CMC determined (0.03%). The biosurfactants were applied to samples of sea water and rocks contaminated with petroleum and motor oil. The results demonstrated the oil dispersant action of the biosurfactant from C. sphaerica and the emulsifying ability of the biosurfactant from C. lipolytica. Percentages removals of 100% of oil and petroleum were obtained for both biosurfactants. The possibility of application of biosurfactants in the remediation of oil polluted environments motivates the advancement of research to develop this alternative technology for effective use in the Termope Thermoelectric treatment systems.

1. Introdução
As refinarias são grandes geradoras de poluição. Elas consomem enormes quantidades de água e de energia, produzem muitos despejos líquidos, liberam diversos gases nocivos para a atmosfera e produzem resíduos sólidos de difícil tratamento e disposição. Em decorrência de tais fatos, a indústria de refino de petróleo, pode ser uma grande degradadora do meio ambiente, pois tem potencial para afetar o mesmo em todos os níveis: ar, água e solo (Gonzini et al., 2010; Satpute et al., 2010). O Pólo Petroquímico de SUAPE tem permitido ao Estado de Pernambuco alcançar níveis de desenvolvimento elevados em virtude da instalação de inúmeros empreendimentos econômicos. A instalação da Refinaria Abreu e Lima e do Estaleiro Atlântico Sul, entretanto, tem despertado a preocupação das indústrias instaladas no seu entorno. No caso específico da Termoelérica de Pernambuco (TERMOPE), com sua localização em termos de captação de água para

______________________________ 1 Doutora, Engenheira Química – UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO 2 Doutora, Bióloga – UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO 3 Doutora, Bióloga – UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO 4 Graduado, Engenheiro Ambiental – UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO 5 Doutor, Engenheiro Químico – UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 refrigeração de seu sistema gerador, à jusante de grandes tanques de armazenagem de derivados de petróleo, encontra-se sujeita ao risco iminente de derramamento ou vazamento desses produtos. Portanto, faz-se necessário o desenvolvimento de estratégias tecnológicas para prevenir problemas indesejáveis causados por possíveis acidentes ambientais. A utilização de biossurfactantes, agentes anfipáticos de origem microbiológica, tem se destacado como tecnologia alternativa no controle da poluição provocada por hidrocarbonetos do petróleo. Comparados com os surfactantes sintéticos, os derivados do petróleo, os biossurfactantes, em geral, exibem forte compatibilidade ambiental, maior atividade superficial, baixa toxicidade e alta biodegradabilidade (Mulligan, 2009), além de serem produzidos por fontes renováveis (Seydlová e Svobodová, 2008). Nesse trabalho, agentes surfactantes produzidos por espécies microbianas foram utilizados na recuperação de águas marinhas contaminadas por petróleo e derivados.

2. Material e Métodos
2.1. Micro-organismos As leveduras Candida sphaerica (UCP 0995) e Candida lipolytica (UCP 0998) foram utilizadas como microorganismos produtores dos biossurfactantes. As leveduras foram mantidas em meio YMA (Yeast Mold Ágar). Repiques foram mensalmente realizados para manter a viabilidade celular.

2.2. Meios de Produção Para a produção do biossurfactante de C. sphaerica foi utilizado o meio contendo 9% de resíduo de refinaria da indústria de óleo de soja e 9% do resíduo milhocina (Luna et al., 2009). A produção do biossurfactante de C. lipolytica foi realizada em meio mineral suplementado com 6% de resíduo de refinaria da indústria de óleo de soja e 1% ácido glutâmico (Rufino et al., 2008). Os meios foram esterilizados em autoclave 121ºC por 20 minutos, sendo o pH final ajustado para 5,3. Os resíduos industriais foram gentilmente cedidos por duas Empresas localizadas no Estado de Pernambuco.

2.3. Produção dos Biossurfactantes As fermentações para produção dos biossurfactantes foram realizadas em frascos de Erlenmeyer com 1000 ml de capacidade contendo 300mL do meio de produção e incubados com as respectivas suspensões celulares (10 4 células/mL para o biossurfactante de C. sphaerica e 108 células/mL para o biossurfactante de C. lipolytica). Os frascos foram mantidos sob agitação orbital de 150 rpm, durante 144 horas, à temperatura de 27ºC. O biossurfactante de C. sphaerica foi produzido durante 144 horas, enquanto que o biossurfactante de C lipolytica foi obtido após 72 horas.

2.4. Isolamento dos Biossurfactantes Após o cultivo da C. sphaerica, o líquido metabólico livre de células foi submetido ao processo de extração. O pH foi ajustado para 2 com uma solução de HCl 6,0M e precipitado com metanol (2:1 v/v). Após repouso durante 24 horas a -15°C, a amostra foi centrifugada à 4000g por 30 minutos, lavada com metanol gelado por duas vezes e seca em estufa a 37°C por 24-48 h., sendo mantida em dessecador até peso constante. O rendimento em produto isolado foi calculado em g/L (Luna et al., 2009). Após o cultivo da C. lipolytica, o líquido metabólico foi filtrado em papel Whatman N 1 e centrifugado a 2000g por 20 minutos. O filtrado livre de células foi submetido a extração com clorofórmio (1:1 v/v) em funil de separação a 25C. Após essa etapa a fase aquosa foi liofilizada e o rendimento de biossurfactante determinado por gravimetria (Rufino et al., 2008).

2.5. Determinação da Tensão Superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC) A tensão superficial e a CMC foram medidas em tensiômetro automático (Modelo Sigma 70, KSV Ltd., Finland) utilizando o anel de NUOY. A CMC foi determinada partindo-se de uma solução de concentração conhecida do biossurfactante isolado.

2.6. Aplicação dos Biossurfactantes na Dispersão de Poluente Hidrofóbico em Água do Mar A dispersão de óleo lubrificante de motor em água foi realizada utilizando-se 100 ml de água do mar, coletada nas proximidades da captação do sistema gerador de energia da Termope, Suape-PE. A contaminação foi realizada com 5% do óleo. A amostra de água do mar previamente contaminada foi submetida aos seguintes tratamentos: adição de 50 mL de água destilada (controle) e adição de 50 mL de solução aquosa dos biossurfactantes isolados de C. sphaerica ou C. 2

Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 lipolytica na concentração de 0,3% (CMC). As capacidades de dispersão, aglutinação, emulsificação e solubilização foram observadas visualmente.

2.7. Aplicação dos Biossurfactantes na Remoção de Poluentes Hidrofóbicos em Superfície Sólida A remoção de óleo lubrificante de motor e petróleo impregnados em superfícies sólidas (pedras) foi realizada utilizando-se soluções aquosas contendo as seguintes concentrações dos biossurfactantes: 0,05% (2xCMC), 0,125% (5xCMC) e 0,25% (10xCMC). A quantidade de poluente remanescente foi determinada no sólido lavado, por gravimetria, após extração com hexano, e expressa em percentual.

3. Resultados e Discussão
3.1. Rendimento em Biossurfactantes A obtenção de altos rendimentos de produção em biossurfactantes tem sido considerada um dos obstáculos nessa área da biotecnologia, uma vez que, além de produtos isolados em pequenas quantidades, gera-se um grande volume residual. Nesse contexto, o uso de biossurfactantes brutos, ou seja, o uso do líquido metabólico sem células obtido após a produção, tem sido considerado uma estratégia de aplicação pela indústria petrolífera, a qual não requer formulações puras, ao contrário das indústrias alimentícias e farmacêuticas (Atlas, 1991). Os rendimentos dos biossurfactantes foram de 9g/L e 8g/L, respectivamente. A despeito da possibilidade de inúmeras aplicações dos biossurfactantes, a indústria petroquímica apresenta maior potencial para essas biomoléculas, uma vez que requer especificações mínimas de pureza, de modo que o líquido metabólico possa ser usado, eliminando as etapas de purificação que representam cerca de 60% do custo total de produção (Dubey e Juwarkar, 2001). Várias pesquisas têm sido desenvolvidas com o objetivo de otimizar os rendimentos de produção de agentes surfactantes. Sarubbo et al. (2007), por exemplo, obtiveram resultados semelhantes aos obtidos nesse trabalho para um biossurfactante produzido por C. lipolytica utilizando óleo de canola e glicose como substratos. Estudos realizados por Sobrinho et al. (2008), utilizando dois resíduos industriais como fontes de carbono, demonstraram um rendimento de 4,5 g/L de biossurfactante produzido por C. sphaerica.

3.2. Tensão Superficial, Concentração Micelar Crítica (CMC) dos Biossurfactantes Uma importante propriedade dos surfactantes potentes é a habilidade de atuarem na formação de agregados micelares (Hua et al., 2003; Amaral et al., 2006). A formação de micelas está condicionada ao aumento da concentração do surfactante no meio aquoso até se atingir a Concentração Micelar Crítica (CMC), definida como a mínima concentração de surfactante necessária para que a tensão superficial seja reduzida ao máximo. Os biossurfactantes produzidos exibiram excelente capacidade de redução da tensão, uma vez que a tensão superficial da água foi reduzida de 70 mN/m para 25mN/m com o aumento da concentração do biossurfactante de C. sphaerica até 0,025% (Figura 1) e com o aumento da concentração do biossurfactante de C. lipolytica até 0,03 % (Figura 2). A partir da CMC, o aumento da concentração das soluções dos biossurfactantes não provocou maiores reduções na tensão superficial da água, indicando que a CMC havia sido atingida nessa concentração. Os biossurfactantes produzidos nas condições estudadas nesse trabalho demonstraram maior capacidade de reduzir a tensão do que os surfactantes de C. lipolytica (32 mN/m) (Rufino et al., 2007), de C. glabrata (31 mN/m) (Sarubbo et al., 2006), de C. antarctica (35 mN/m) [30], e de Yarrowia lipolytica (50 mN/m) [31]. Os biossurfactantes também demonstraram uma CMC muito inferior à CMC de outros surfactantes de leveduras descritos na literatura, considerando os valores de 2,5 % encontrados para os biossurfactantes de C. lipolytica (Sarubbo et al., 2007) e C. glabrata (Sarubbo et al., 2006) e valores de 1 % para o biossurfactante de C. lipolytica cultivada em resíduo de refinaria (Rufino et al., 2007) e valores de 0,08 % para o biossurfactante de C. sphaerica (Sobrinho et al., 2008).

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80 70
Tensão superficial (mN/m)

60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Concentração de biossurfactante (%)

Figura 1. CMC do biossurfactante produzido pela C. shaerica cultivada em meio contendo 9% de resíduo de refinaria de óleo de soja e 9% de milhocina
80 70
Tensão Superficial (mN/m)

60 50 40 30 20 10 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Concentração (%)

Figura 2. CMC do biossurfactante produzido pela C. lipolytica cultivada em meio contendo mineral suplementado com 6% de resíduo de refinaria de óleo de soja e 1% ácido glutâmico

3.3. Aplicação dos Biossurfactantes na Dispersão de Poluentes Hidrofóbicos em Água do Mar Os biossurfactantes podem aumentar a remoção de poluentes hidrofóbicos através dos processos de solubilização e mobilização. A capacidade de solubilização depende da habilidade do surfactante em aumentar a solubilidade dos constituintes hidrofóbicos na fase aquosa. Um grande aumento desta capacidade é observado acima da CMC, a qual é atribuída à partição do hidrocarboneto no sítio hidrofóbico das micelas surfactantes (Dubey e Juwarkar, 2001). O biossurfactante L apresentou elevada atividade dispersante do óleo lubrificante de motor, o que poderia facilitar o direcionamento de manchas oleosas no oceano, enquanto que o biossurfactante R apresentou atividade emulsionante sobre o óleo, sugerindo a solubilização do óleo com formação de pequenas gotículas que facilitariam o acesso de microorganismos degradadores de hidrocarbonetos e a consequente aceleração do processo de biorremediação. Os resultados obtidos foram observados quando baixas quantidades dos biossurfactantes foram utilizadas, demonstrando assim o potencial desses compostos no deslocamento e na solubilização de manchas de óleos em ambiente aquático marinho.

3.4. Aplicação dos Biossurfactantes na Remoção de Poluentes Hidrofóbicos Adsorvidos em Superfícies Sólidas As tabelas 1 e 2 apresentam os resultados de remoção dos compostos oleosos adsorvidos em superfícies sólidas pelos biossurfactantes produzidos. O biossurfactante L foi capaz de remover todo o petróleo e o óleo lubrificante de motor quando usado na maior concentração testada; entretanto, a solução do biossurfactante isolado na concentração de 0,125% também se mostrou efetiva nas remoções de ambos os poluentes. Já o biossurfactante R removeu percentuais elevados dos contaminantes quando usado na maior concentração, isto é, 0,3%.

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Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 Tabela 1. Remoção de óleo lubrificante de motor presente em pedra pelo biossurfactante isolado de Candida sphaerica UCP0995

Tratamentos (soluções aquosas) Biossurfactante a 0,05% Biossurfactante a 0,125% Biossurfactante a 0,25%

Óleo de motor (%) 46 64 100

Petróleo (%) 43 100 100

Tabela 2. Remoção de óleo lubrificante de motor presente em pedra pelo biossurfactante isolado de Candida lipolytica UCP0998

Tratamentos (soluções aquosas) Biossurfactante a 0,06% Biossurfactante a 0,15% Biossurfactante a 0,3% 4. Conclusões

Óleo de motor (%) 51 77 100

Petróleo (%) 13 26 70

Os resultados obtidos demonstram o potencial dos biossurfactantes na remediação de ambientes marinhos poluídos por petróleo e derivados. Estudos estão sendo conduzidos para caracterizar novas biomoléculas e assegurar a ausência dos efeitos toxicológicos desses agentes, bem como as melhores condições de obtenção de um produto comercializável.

5. Agradecimentos
Os autores agradecem o apoio financeiro da Termoelétrica de Pernambuco (TERMOPE), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e da Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE).

6. Referências
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Rio Oil & Gas Expo and Conference 2012 HUA, Z., CHEN, J., LUN, S., WANG, X. Influence of biosurfactants produced by Candida Antarctica on surface properties of microorganism and biodegradation of n-alkanes. Water Res., v. 34, p. 4143-4150, 2003. LUNA, J. M., SARUBBO, L.A., CAMPOS-TAKAKI, G.M. A new biosurfactant produced by Candida glabrata UCP1002: characteristics of stability and application in oil recovery. Braz. Arch. Biol. Technol., v. 52, p.785-793, 2009. MULLIGAN, C. N. Recent advances in the environmental applications of biosurfactants. Current Opinion In Colloid & Interface Science, v. 14, p. 372-378, 2009. RUFINO, R. D., SARUBBO, L. A., CAMPOS-TAKAKI, G. M. Enhancement of stability of biosurfactant produced by Candida lipolytica using industrial residue as substrate, World J. Microbiol. Biotechnol., v. 23, p. 729-734, 2007. RUFINO, R. D., SARUBBO, L. A., BENICIO, B. N., CAMPOS-TAKAKI, G.M. Experimental design for the production of tensio-active agent by Candida lipolytica. J. Industrial Microbiol. Biotechnol., v. 35, p. 907-914, 2008. SARUBBO, L. A., FARIAS, C. B. B., CAMPOS-TAKAKI, G. M. Co-utilization of canola oil and glucose on the production of a surfactant by Candida lipolytica. Curr. Microbiol., v. 54, p. 68-73, 2007. SATPUTE, S. K., BANAT, I. M., DHAKEPHALKAR, P. K., BANPURKAR, A. G., CHOPADE, B. A. Biosurfactants, bioemulsifiers and exopolysaccharides from marine microorganisms. Biotechnology Advances, v. 28, p. 436-458, 2010. SEYDLOVÁ, G., SVOBODOVÁ, J. Review of surfactin chemical properties and the potential biomedical applications. Central Eur. J. Med., v. 2, p. 123-133, 2008. SOBRINHO, H. B. S., RUFINO, R. D., LUNA, J. M., SALGUEIRO, A. A., SARUBBO, L. A. Utilization of two agroindustrial by-products for the production of a surfactant by Candica sphaerica UCP 0995. Process Biochem., v. 43, p. 912-917, 2008. SARUBBO, L. A., LUNA, J. M., CAMPOS-TAKAKI, G. M. Production and stability studies of the bioemulsifier obtained from a new strain of Candida glabrata UCP 1002. Electronic J. Biotechnol., v.9, p. 400 - 406, 2006.

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