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Biomarcadores epigenticos
NICOLS JOUVE DE LA BARREDA *
Departamento de Biologa Celular y Gentica. Universidad de Alcal

RESUMEN La epigentica estudia un tipo de modificaciones heredables y estables que alteran la capacidad de expresin sin afectar a la secuencias de los genes. La modificacin consiste en la metilacin del ADN, la acetilacin de las histonas o la interferencia postranscripcional por medio de ARN. Este tipo de alteraciones puede deberse a factores ambientales incontrolados y puede afectar a genes implicados en mltiples funciones. Debido a la estabilidad de las modificaciones epigenticas, stas pueden mantenerse en el linaje celular durante generaciones y originar diversas enfermedades cuya manifestacin puede surgir mucho despus de haberse producido la modificacin. Con el fin de detectar las modificaciones epigenticas se estn desarrollando mtodos analticos especficos, que tratan de detectar los cambios a travs de unos biomarcadores moleculares relacionados con el estado activo o silenciado de las regiones en que se encuentran los genes candidatos. Del conjunto de biomarcadores que se estn desarrollando destacan en primer lugar los que exploran la metilacin de ADN o de histonas alteradas en los flui* Informacin de contacto: Doctor Nicols Jouve de la Barreda. Catedrtico de Gentica. Departamento de Biologa Celular y Gentica, Universidad de Alcal. Campus Universitario. 28871 - Alcal de Henares (Madrid). Spain. Telfono: +34 91 885 47 50. Fax: +34 91 885 47 99. e-mail: nicolas.jouve@uah.es

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dos corporales. Entre el conjunto de biomarcadores epigenticos desarrollados hasta el momento destacan los que se destinan al diagnstico del cncer. En este captulo se resume el fundamento y tipos de modificaciones epigenticas, se registran algunas de las enfermedades debidas a este tipo de alteraciones y se indican los mtodos de anlisis de los biomarcadores para el diagnstico de algunas patologas. Se concluye acerca del gran futuro que ofrecen los biomarcadores para la prevencin y el tratamiento de las enfermedades debidas a las modificaciones epigenticas. Palabras clave: Acetilacin de histonas. Biomarcadores. Epigentica. Epigenmica. Metilacin ADN. ABSTRACT Epigenetic biomarkers The epigenetics studies a type of hereditary and stable modifications that alter the expression capacity, without affecting the sequences of the genes. The modification consists of DNA methylation, histones acetylation or postranscripcional interference by means of antisense RNA. This type of alterations can be due to uncontrolled environmental factors and could affect to genes involved in multiple functions. Due to the stability of the epigenetic modifications, these can be maintained in the cellular lineage during generations and originate diverse diseases whose manifestation can arise much later after the onset of the modification. In order to detect the more precociously the epigenetic modifications a series of techniques has been developed that try to identify the changes through molecular biomarkers, related to the active or silenced state of the regions in which the genes candidates are. Of the set of biomarkers that has been developed until now many of them explore the variations in the methylation of the DNA or the acetylation of histones in the corporal fluids. In this chapter is reviewed the fundamentals and types of the epigenetic modifications. Some of the diseases due to this type of alterations and the methods of analysis of the biomarkers for the diagnosis of some diseases are indicated. The greater investigating activity in this field is destined to the diagnosis of the cancer, although already they are obtained other markers for the diagnosis of lupus, asthma, etc. It is 86

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concluded of the great future that offers the biomarkers for the prevention and treatment of the diseases due to the epigenetic modifications. Keywords: Epigenetics. Epigenomics. DNA methylation. Histone acetylation. 1. INTRODUCCIN

Tras la culminacin del Proyecto Genoma Humano se ha iniciado la fase de la genmica funcional, que intenta desvelar el repertorio de instrucciones contenidas en el ADN de las que dependen el desarrollo, la constitucin morfogentica y la construccin fenotpica del ser humano en interaccin con el medio ambiente. Si bien el desarrollo embrionario de los seres superiores responde a las instrucciones de los genes del genoma individual, mediante el cumplimiento de una secuencia programada de actividades gnicas, sta se ejecuta de forma escalonada y controlada bajo la direccin de una serie de genes reguladores cuya actividad est siendo descubierta. Sin embargo, el conocimiento del programa gentico del desarrollo requiere algo ms que desvelar el orden de actuacin de los genes que intervienen a lo largo del proceso morfogentico. El desarrollo obedece en primer lugar a los genes estructurales propios del embrin bajo la batuta de los genes reguladores, cuyas instrucciones quedan constituidas por la adicin de los complementos gnicos de los gametos en el momento de la fecundacin, pero a esta programacin se sobreaade una oleada de marcas moleculares en el ADN destinadas a la interpretacin en clave de activacin o silenciamiento de los genes. Estas marcas no suponen modificaciones en el programa de desarrollo gentico, simplemente completan el camino a seguir dentro de un rango de variacin. De acuerdo con Antonio Garca Bellido, investigador del campo de la Gentica del Desarrollo, los marcas extracigticas o modificaciones epigenticas ejercen un papel inductor cuya funcin es permisiva ms que instructiva (1). El trmino epignesis indica el inicio de un proceso destinado al desarrollo de un ser vivo a partir de una clula indiferenciada, el cigoto. El trmino epigentica fue acuado en 1942 por Conrad H. Waddington para referirse a la ejecucin del fenotipo a partir de las instrucciones potenciales de un genotipo (2), bajo los supuestos de que estas instruc87

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ciones han de recorrer un camino hasta que se reflejan en el fenotipo y que en dicho camino pueden ocurrir unos reajustes, que finalmente se reflejarn en una manifestacin determinada del carcter dentro de un rango de variacin. En este concepto inicial de epignesis quedaba implcito que al desplegarse el programa gentico del cigoto a lo largo del desarrollo se pueden producir reajustes, que consisten en el borrado de unas marcas previas y la adicin de otras nuevas, sin prdida de la informacin gentica del genoma individual del cigoto. De este modo, la informacin gentica se mantiene debido a la replicacin conservativa del genoma individual en las mitosis que alimentan la proliferacin de todas las clulas, tejidos y rganos que se van produciendo a lo largo de la vida, pero las modificaciones epigenticas comportan la alteracin de la capacidad de expresin de algunos genes en las distintas etapas y en diferentes lugares del organismo en desarrollo. El uso actual del trmino epignesis acenta el hecho de los cambios hereditarios en la expresin de los genes sin que se produzca variacin de la informacin gentica. Del concepto original de Waddington se conserva la idea de la existencia de estados alternativos de la expresin gnica, pero ahora se hace nfasis en el hecho de que los estados de expresin gnica son estables y transmitidos a las clulas hijas durante el proceso de desarrollo, pudiendo perpetuarse en ausencia de las condiciones que los establecieron (3). En resumen, a la informacin de los genes se aade un sistema de marcas o modificaciones en el ADN que van a contribuir a que un mismo gen se exprese o deje de hacerlo en diferentes clulas o tejidos del organismo. El anlisis de estas modificaciones corresponde al campo de la epigentica que de acuerdo con Peter Jones se puede definir como el estudio de la regulacin heredable de la actividad de los genes que no est determinada por las secuencias gnicas (4). De este modo, la epigentica, se convierte en una disciplina que se dedica a estudiar los cambios heredables que no dependen de la secuencia de bases del ADN, y la epigenmica sera la parte de la genmica que trata del estudio de las marcas epigenticas en una clula tipo determinada. Asentado el concepto de epigentica, lo que interesa conocer es qu tipo de modificaciones fsico-qumicas afectan al material hereditario e influyen en la expresin de los genes sin alterar sus secuencias. Para ello, debemos considerar la conformacin estructural del ADN en los cromo88

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somas, ya que de la forma en que se encuentre empaquetada cada regin de estas biomolculas depender su funcionamiento. La epigentica tiene en cuenta el hecho de que la fibra de cromatina, que constituye la unidad estructural longitudinal de organizacin cromosmica, est compuesta al 50% por el ADN y unas protenas bsicas denominadas histonas. La observacin de la cromatina interfsica mediante tcnicas de microscopia electrnica revela una estructura compuesta por la repeticin de una subunidad proteica esfrica o globular (los nucleosomas) sobre cuya superficie giran las molculas de ADN, a modo de cuentas de un rosario. Un nucleosoma tpico est asociado a 200 pares de bases (pb) y est formado por un ncleo, formado por un octmero constituido por dos subunidades de cuatro tipos de histonas [H2A, H2B, H3 y H4), que conforman el ncleo del nucleosoma (complejo H2A, H2B, H3 y H4)2] sobre cuya superficie gira el ADN (140 pb) dando casi dos vueltas (una vuelta y tres cuartos). El resto del ADN (60 pb) forma parte del linker que establece una especie de puente hacia el siguiente nucleosoma. A su vez, el linker est interaccionando con otra histona, denominada H1. El ADN es un polianin mientras que las histonas son protenas bsicas, por lo que la asociacin del ADN alrededor de estas protenas es de carcter inico, sin que existan enlaces qumicos entre ambos tipos de molculas. Esta organizacin supone que tanto el ADN como las histonas intervienen en los procesos de la transcripcin, replicacin, recombinacin y reparacin del ADN y tambin constituyen en su conjunto el material heredable que se transmite a las clulas hijas, tanto en la formacin de los tejidos somticos a travs de la mitosis como en la constitucin de los gametos en la meiosis. De este modo, las modificaciones epigenticas determinan los estados fisiolgicos de la expresin de los genes y proveen una memoria celular para el control de la transcripcin en las clulas de los organismos superiores. Dichas modificaciones consisten en cuatro mecanismos que cooperan de forma integrada: a) La adicin de grupos metilo al carbono 5 de la citosina en las molculas de ADN de doble hlice en dinucletidos palndrmicos 5-CpG-3 de los genes, cuya consecuencia es el silenciamiento de su expresin. Los cambios de la estructura de la cromatina por modificacin covalente de los extremos de las histonas. 89

b)

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c) d)

La interferencia de molculas de ARN (micro-ARN, miRNA, siRNA) asociado al silenciamiento de los genes. La remodelacin de los nucleosomas.

La principal modificacin epigentica del ADN de los mamferos consiste en la adicin de un grupo qumico llamado metilo al carbono 5 de la Citosina en los dinucletidos CpG (metilacin) (5). De acuerdo con Esteller entre el 3 y el 6% del ADN genmico humano est metilado (6, 7). Tras la metilacin, C5m sirve de gua para el emplazamiento y mantenimiento de otras marcas epigenticas, tal como un repertorio de modificaciones post-traduccionales de las protenas de los nucleosomas que contribuyen al grado de compactacin del ADN en las fibras de la cromatina (8, 9). La maquinaria de metilacin del ADN de los mamferos est sometida a la accin de dos componentes, las ADN metiltransferasas (DNMTs), que establecen y mantienen los patrones de metilacin, y las protenas de unin metil-CpG (MBDs), que estn implicadas en la lectura de las marcas de metilacin. Tambin hay evidencia de que una ADN metilasa contribuye a regular los patrones de metilacin durante el desarrollo embrionario, aunque se desconoce su modo de accin (10). El segundo tipo de modificacin epigentica afecta a las protenas histonas que forman parte de la cromatina, influye en el grado de relajacin de la fibra y depende de la adicin de un grupo qumico llamado acetilo en determinados aminocidos de los extremos de las histonas (acetilacin). Lo que interesa conocer es que las histonas tienen una gran importancia para la expresin de los genes, dado que la forma en la que est compactada la fibra de cromatina es determinante de la capacidad del ADN para su expresin. Para la transcripcin es preciso un estado relajado, con el fin de que puedan adherirse los factores proteicos y las polimerasas a los promotores de los genes que han de expresarse. Los nucleosomas se descondensan y relajan como consecuencia de la disminucin de afinidad entre el ADN y las histonas, debido a la acetilacin de estas protenas. La metilacin del ADN no es suficiente para inducir la modificacin de las histonas en el modo de silenciamiento gnico, pero las protenas de unin metil-CpG desencadenan el reclu90

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tamiento de las enzimas de remodelacin de la cromatina, y en particular las desacetilasas de histonas (HDACs). La transformacin se produce por el efecto de las acetilasas, que provocan la eliminacin de los grupos acetilo de las e-N-acetil-lisinas de la cola de las histonas, lo que finalmente promueve el empaquetamiento intenso del ADN caracterstico de la heterocromatina inactiva (11, 12). La modificacin de las histonas altera la afinidad de las protenas que intervienen en la actividad transcripcional y puede afectar tambin a las interacciones de orden superior entre los nucleosomas y la organizacin de las fibras de cromatina. Un estudio reciente apunta al papel trascendental para el silenciamiento de la transcripcin a largo plazo de los tres nucleosomas inmediatamente aguas abajo del punto de iniciacin de la transcripcin de un gen y las unidades CpG del ADN alrededor de este punto (13). En cualquier caso las modificaciones epigenticas son de una gran diversidad y complejidad y de alguna manera constituyen la llave de la actividad de los genes del genoma, ya que inducen su silenciamiento o permiten su actividad (14). En definitiva, las modificaciones epigenticas en el ADN a nivel nucleosomal y cromosmico afecta a la expresin gnica y en ltimo trmino al fenotipo. La metilacin del ADN tiene lugar predominantemente en las regiones ricas en genes del genoma, incluido el ADN satlite y los dos tipos principales de secuencias repetidas dispersas, unas cortas, denominadas Alu o SINES (Short Interspersed Transposable Elements), de 100-300 pb, y otras largas, denominadas L1 o LINES (Long Interspersed Transposable Elements), de 6.000 a 8.000 pb. Las secuencias Alu y L1 corresponden a un tipo de retrotransposones carentes de las regiones terminales largas o LTR, presentes en los extremos de otros elementos mviles. En su lugar poseen un extremo que asemeja las tpicas colas de poliAdenina de los trnscritos de los genes tras su procesamiento, por la abundancia de pares de bases A-T. En el genoma humano se supone la existencia de unas 50.000 copias de secuencias L1 por complemento haploide, lo que representa entre el 3,5% y el 13,5% de la masa total del genoma (640 Mb en el total del genoma). Adems, hay ms de 2.000.000 de copias de elementos Alu dispersas por todos los cromosomas, lo que supone un 20% de la masa total del genoma (420 Mb en el total del genoma humano). Los elementos Alu tienden a encontrase en regiones 91

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ricas en pares de bases GC y los elementos L1 se localizan preferentemente en regiones ricas en AT. En la proximidad de los genes de los genomas de los vertebrados, hay unas regiones conocidas como islas CpG, que se encuentran en posicin cis, aguas arriba de la regin 5 de los promotores y que constituyen las zonas de accin de los activadores (enhancers) y silenciadores de la expresin. Estas regiones se extienden adems por las regiones UTR (transcribibles no traducibles) y el exn 1 y corresponden a secuencias de ms de 500 pb, con un contenido en GC = 55%, y una proporcin de CpG observada respecto a la esperada de = 0,65 (15). Las islas CpG se pueden utilizar para la bsqueda y anotacin de genes en los estudios de la genmica de nuevas especies, al constituir un indicador de la presencia de las regiones codificantes y dada su distincin de los pseudogenes que son genes inactivos por deterioro de sus secuencias (16). Usualmente, en las regiones de actividad gentica, las islas CpG estn desmetiladas y los genes estn dispuestos para su expresin bajo la accin de los activadores de la transcripcin. Por el contrario, cuando se produce la metilacin del ADN en estas regiones se reprime directamente la transcripcin de los genes, debido a la inhibicin del anclaje de los factores de transcripcin e indirectamente por el reclutamiento de protenas de unin a los lugares CpG metilados. Como consecuencia se desencadena una remodelacin de la cromatina asociada a la represin de la actividad gnica. Se sabe poco respecto a cmo se dirige la metilacin del ADN en regiones especficas, aunque se supone que el mecanismo molecular incluye la interaccin entre las ADN metiltransferasas y una o ms protenas asociadas a la cromatina (17). En la Tabla 1 se registran los fenmenos genticos normales y alterados en los que estn implicadas las modificaciones epigenticas. La metilacin de los dobletes CpG trabaja como un interruptor molecular que puede apagar de forma estable la transcripcin. Los patrones de metilacin del ADN son esenciales para el desarrollo morfogentico en los mamferos as como para el normal funcionamiento de las clulas en el organismo adulto. Las clulas troncales embrionarias, que son deficientes en ADN metiltransferasa, son viables, pero mueren en cuanto se induce su diferenciacin. Adems, la prdida de los patrones de metilacin normal del ADN en clulas somticas conduce a una modificacin del ciclo celular y como consecuencia se altera el control 92

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TABLA 1.

EPIGENTICOS

Incidencia de mecanismos epigenticos y sus consecuencias Funciones alteradas reguladas por mecanismos epigenticos Hipermetilacin del ADN Provoca la condensacin de la cromatina y el silenciamiento de los genes Activacin de oncogenes; movilizacin de elementos transponibles, y como consecuencia inestabilidad cromosmica Alteraciones de la expresin gnica

Funciones normales reguladas por mecanismos epigenticos Organizacin de la cromatina Control de estados activo o silenciado de genes en clulas embrionarias y somticas Control de patrones epigenticos genespecficos y tejidoespecficos

Metilacin especfica del ADN y modificaciones de las histonas

Hipometilacin del ADN

Silenciamiento de elementos repetidos

Correcto ordenamiento de la cromatina y mantenimiento de los patrones de expresin Esencial para el desarrollo Compensacin de dosis gnica entre machos y hembras

Mutaciones en las citosinas metiladas

Impronta genmica Inactivacin de un cromosoma X en las hembras de mamferos (lyonizacin)

Defectos en la impronta

Prdida de la identidad parental

de crecimiento (18). Las modificaciones epigenticas del genoma regulan muchos procesos celulares: facilitan la expresin especfica de los genes necesarios de cada tejido; aportan un mecanismo robusto para el silenciamiento gentico a largo plazo de una actividad transcripcional no conveniente de genes no especficos de cada tejido, ya desde el desarrollo embrionario; contribuyen a la expresin correcta de un cromosoma X en las mujeres, al inhibir la actividad del segundo mediante el proceso de la Lyonizacin, que representa un mecanismo compensador de la dosis gnicas con relacin a los varones que solo poseen un cromosoma X (19); determinan la impronta genmica y mantienen la estabilidad de los cromosomas y del genoma, al proporcionar la anulacin de los elementos de transposicin endoparasitos adquiridos a lo 93

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largo de la evolucin, que pueden ocasionar fenmenos de recombinacin ilegtima o no-homloga, con la consiguiente alteracin de la regulacin de la expresin de los genes prximos (20). Recientes investigaciones han permitido conocer la relacin existente entre la metilacin del ADN y la modificacin de la maquinaria de modificacin de las histonas, demostrando adems la participacin potencial de pequeas molculas de ARN (21) generadas por la maquinaria de interferencia del ARN (22). Los micro-ARN (miRNA) conforman una familia de ARNs de interferencia no codificantes de pequeo tamao que regulan negativamente la expresin de genes a nivel post-transcripcional. La accin de los ARN de interferencia (RNAi) se considera como un mecanismo epigentico adicional que interfiere la expresin gentica por conducir a la degradacin de los transcritos producidos de secuencia complementaria e interferir o impedir la traduccin en protenas. Estas pequeas molculas de ARN dirigen la accin de ARNasas que intervienen en la eliminacin de los transcritos, y pueden servir tambin como cebadores para la produccin de precursores de molculas de ARN de cadena doble (ARNds) que se utilizan en la produccin de ARNs ms pequeos bajo la accin de la transcriptasa inversa o polimerasa ARN dependiente. Por lo tanto, los ARN de interferencia representan un tipo de estado metablico que puede afectar a los estados de la expresin gnica sin cambio de las secuencias del ADN. El silenciamiento de los estados post-transcripcionales mediados por los ARNi no se heredan de forma estable a travs de la meiosis, por lo que constituyen por s mismos, un mecanismo importante para la variacin epigentica heredada. Una vez descritos los mecanismos epigenticos, interesa sealar que el programa de expresiones genticas mediado por estas modificaciones puede alterarse como consecuencia de influencias ambientales. Las modificaciones epigenticas individuales estn influidas por muchos factores: exposicin a agentes qumicos durante las etapas embrionaria, fetal y postnatal, variantes genticas en los genes que intervienen en la sntesis de las enzimas ADN metiltransferasa o histona desacetilasa, radiaciones, metabolitos de la dieta, etc. De hecho, se ha demostrado que los hbitos alimenticios y mltiples factores ambientales pueden influir en las modificaciones epigenticas del ADN y de las histonas. Los grupos metilo son adquiridos a travs de la dieta y donados al ADN 94

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a travs de la va del folato y la metionina, por lo que el desajuste en la dieta de estos metabolitos puede conducir a una hipometilacin lo que puede provocar una inestabilidad gentica y cromosmica (23, 24). Es interesante indicar que as como las alteraciones fsico-qumicas del ADN pueden ser restauradas mediante varios tipos de mecanismos efectivos de reparacin, los desajustes epigenticos no cuentan con sistemas tan eficaces de vigilancia, tal vez por su aparicin tarda en la evolucin de los sistemas biolgicos. Debido a la influencia de los factores ambientales internos y externos, es posible el hecho de que personas que poseen los mismos genes desarrollen de forma distinta una enfermedad o un carcter que de ellos depende. De este modo nos explicamos las diferencias en el desarrollo del cncer, o en la respuesta a las infecciones o en las manifestaciones fenotpicas cuyas diferencias se pronuncian a lo largo de la vida en gemelos monocigticos que comparten el mismo genoma. 2. METILACIN DEL ADN Y ENFERMEDADES

Adems de las enfermedades causadas por mutaciones o aberraciones heredables de los genes, en los ltimos aos se ha acumulado la evidencia de que en una serie de enfermedades estn implicadas las alteraciones epigenticas, que suponen variaciones en la expresin de los genes que no afectan a las secuencias del ADN. Cada vez va cobrando mayor certeza el hecho de que la modificacin de los patrones de actividad gnica, como consecuencia de la alteracin de los lugares de accin de las enzimas que intervienen en las modificaciones epigenticas, puede provocar la prdida de estabilidad de regiones del genoma que se convierten en estructuras frgiles, que pueden desencadenar la aparicin de variaciones estructurales cromosmicas o la transformacin de las clulas, hacindolas perder los mecanismos de control del crecimiento celular, o su actividad especfica e incluso provocando la muerte celular (apoptosis), todo lo cual puede determinar la alteracin del fenotipo con consecuencias en la aparicin de determinadas patologas. La importancia de la metilacin del ADN se pone de relieve por su relacin con un nmero creciente de enfermedades humanas en las que estn implicados fenmenos de alteracin o mantenimiento de los patrones normales de modificacin epigentica. Debido a ello existe un inte95

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rs creciente en el desarrollo de biomarcadores, para la deteccin precoz de las modificaciones epigenticas, y la bsqueda de tratamientos farmacolgicos para tratar de corregirlas o paliar sus efectos (25). La implicacin de los fenmenos epigenticos en enfermedades humanas se puso en relieve en 1983 al demostrarse el papel de la hipometilacin de regiones repetitivas del genoma en clulas cancergenas (26), lo que se traduce en una inestabilidad genmica que provoca roturas cromosmicas y fenmenos de recombinacin no homloga. Tambin se ha observado la metilacin de regiones ricas en islas CpG en las clulas tumorales en las fases iniciales de la tumorognesis, lo que puede traer consigo la inhibicin de la expresin de genes implicados en el control del crecimiento celular. Por otra parte, la hipometilacin de algunas regiones repetitivas prximas a los promotores de determinados genes podra generar trnscritos antisentido que a su vez diesen lugar a molculas de ADN de doble cadena (ADNds) homlogas a los genes o a sus promotores. Adems, en las clulas tumorales se aprecia una elevada produccin de molculas pequeas de ARN de interferencia (ARNi) que podran estar implicadas en los procesos de modificacin epigentica del ADN. Entre las perspectivas futuras para la solucin de estos problemas se propone el reclutamiento de la maquinaria de produccin de los ARNi, lo que podra conducir a la represin de las modificaciones epigenticas, incluyendo la metilacin en estos lugares. Por otra parte, los genomas paterno y materno reunidos en el cigoto pueden incorporar modificaciones epigenticas en el momento de la fecundacin, lo que se denomina impronta genmica. Este mecanismo implica la hipermetilacin del ADN del alelo de un gen de uno de los parentales, quedando anulada su expresin y convirtiendo en monoallica y uniparental la herencia del carcter implicado. La alteracin de las modificaciones epigenticas determinantes de la impronta existente en el cigoto, debida a variaciones en la metilacin del ADN, puede alterar la capacidad de expresin de las copias materna y paterna de un gen durante el desarrollo embrionario y como consecuencia desencadenar una enfermedad. En la Tabla 2 vemos una serie de enfermedades en las que estn implicadas las modificaciones en la impronta gentica. Probablemente los casos incluidos en esta tabla son solo la punta del iceberg y existen muchas enfermedades todava no relacionadas con modificaciones epigenticas que tienen su origen en alteraciones de la impronta 96

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gentica. En relacin con esto es importante sealar el riesgo de la aplicacin de las diferentes tecnologas de reproduccin asistida en la incidencia de este tipo de modificaciones en los embriones producidos in vitro (27, 28). Un perodo especialmente delicado en el que puede tener especial incidencia la alteracin de la expresin gentica debida a modificaciones epigenticas es la etapa del desarrollo embrionario. Tras la fecundacin hay un perodo pronunciado de cambios epigenticos, durante el cual se produce una desmetilacin rpida que determina el borrado de las marcas epigenticas del genoma paterno seguida de la desmetilacin tras la replicacin del genoma materno. A continuacin, tras la implantacin del blastocisto en el tero, durante la embriognesis se produce una gran actividad de sntesis del ADN y de expresiones gnicas acompaada de una onda de metilacin de novo que contribuye a la diferenciacin de los tejidos somticos (29). De acuerdo con esto deben tenerse en cuenta las condiciones ambientales, toxicolgicas y nutricionales del embrin, el feto y el neonato, como posible causa de las modificaciones en el epigenoma individual. En este sentido, se ha extendido la preocupacin por los defectos epigenticos debidos a la influencia de factores incontrolados debidos al uso de la tecnologa de la fecundacin in vitro (FIV) y la inyeccin intracitoplsmica (ICSI). Aunque la mayora de los nios procedentes de la reproduccin asistida tienen un desarrollo normal, se aprecia un aumento de casos de neonatos con bajo peso en el nacimiento y un aumento del orden de tres a seis veces de ocurrencia de los sndromes de Beckwith-Wiedemann (BWS) y Angelman (AS) entre los nacidos a partir de estas tecnologas. Aunque se desconoce la incidencia de los factores ambientales del cultivo in vitro sobre los embriones, se ha demostrado que las condiciones de los cultivos pueden afectar de forma importante a la impronta de marcas epigenticas durante el desarrollo embrionario en modelos de ratn (30, 31). Un grupo de patologas que tambin se han relacionado con las modificaciones epigenticas son las que se asocian a la estabilidad de las regiones repetitivas del genoma y en particular a la expansin de tripletes de nucletidos (TNRs) durante la gametognesis, lo que puede conducir a la aparicin de enfermedades por el silenciamiento o mutacin de los genes asociados a la regin repetitiva (32). La repeticin de tripletes es causa de enfermedades tan graves como el Corea de Huntington, el sndrome del frgil-X, una serie de ataxias y otras patologas. En estos casos, lo que suele ocurrir es que las personas afectadas tienen 97

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un nmero de veces repetido el triplete por encima de un umbral mnimo. Superado ese mnimo se produce la patologa. Estos sistemas a los efectos de su manifestacin suelen actuar como alelos dominantes. En general, los cambios en el estado de metilacin de los genes pueden conducir a muy diversas patologas, incluyendo diversos tipos de cncer, sndromes, enfermedades autoinmunes, infertilidad masculina, autismo, trastornos psiquitricos y neurodegenerativos (revisin en Anway y Skinner, 2008) (42).
TABLA 2. Enfermedad Cncer (33) Enfermedades relacionadas con alteraciones epigenticas Alteracin epigentica Hipometilacin de genes en las clulas tumorales Defecto Prdida de metilacin en las secuencias repetitivas del genoma e inestabilidad genmica Sobrepeso fetal y postnatal y tumores embrionarios (tumor de Wilms) Hyperfagia y obesidad durante la niez, retraso mental y problemas conductuales

Sndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS) (34)

Alteracin con impronta de transmisin materna. Se debe a modificaciones de la impronta materna en una regin de ~1 Mb del cromosoma 11 (11p15.5) Alteracin con impronta de tipo paterno, Se pierde la expresin de genes canalizados por via gamtica paterna por metilacin en una regin de ~2 Mb dal cromosoma 15 (15q11q13). Participacin de ARN antisentido. Alteracin con impronta de tipo materno con prdida de la expresin del gen UBE3A por alteracin de la metilacin en una regin de ~2 Mb dal cromosoma 15 (15q11-q13) Alteracin con impronta por fallos en los patrones de metilacin que afecta al locus GNAS del cromosoma 20: 20q13

Sndrome de PraderWilli (PWS) (35)

Sndrome de Angelman (AS) (36)

Hiperactividad, delgadez, retraso mental

Osteodistrofia hereditaria de Albright (AHO), Pseudohipoparatiroidismo tipo 1a e Ib (PHP-Ia y PHPIb) (37)

Retraso mental y osificacin subcutnea.

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TABLA 2. Enfermedad Diabetes mellitus neonatal transitoria (TNDM) (38)

EPIGENTICOS

Enfermedades relacionadas con alteraciones epigenticas (cont.) Alteracin epigentica Alteracin de la impronta materna por metilacin en islas CpG aguas arriba del gen HYMAI que acta como un represor transcripcional Expansin no metilada del triplete (CAG)n (n > 36), en el gen de la Huntingtina localizado en el cromosoma 4 (4p16.3). Herencia dominante Expansin no metilada del triplete (CAA)n, de diferentes genes repartidos en diversos cromosomas. Herencia dominante Expansin no metilada del triplete (CTG)n, aguas abajo del gen DM1 localizado en 19 q13. Herencia dominante Expansin no metilada del triplete (GAA)n, siendo n > 200 en el intrn 1 del gen FRDA localizado en 9 q13-q21.1. Herencia recesiva Expansin metilada del triplete (CGG)n, siendo n > 52, aguas arriba del gen FMR1 localizado en Xq27.3. La metilacin conlleva el silenciamiento de la expresin del gen. Herencia recesiva, ligada al X Defecto Diabetes hasta los 3-6 meses de edad. Muchos pacientes desarrollan la diabetes en su vida ms adelante Demencia presenil (a partir de la cuarta dcada de la vida), con movimientos desordenados (coricos) Familia de patologas del sistema nervioso con oftalmoplegia, demencia y neuropatas perifricas Miotona, distrofia muscular, cataratas, hipogonaidismo Manifestaciones diversas antes de la adolescencia con prdida de reflejos, descoordinacin de movimientos, escoliosis, etc. Retraso mental asociado al cromosoma X de manifestacin en varones

Enfermedad de Huntington (HD) (39)

Ataxia espinocerebelar (SCA1, 2, 3, 6,7,17) (40) Distrofia miotnica tipo 1 (DM1) (40)

Ataxia de Friedrich (FRDA) (40)

Sndrome del Frgil-X (FRAXA) (41)

3. 3.

LA UTILIZACIN DE BIOMARCADORES EPIGENTICOS PARA LA DETECCIN PRECLNICA

En el anlisis gentico se denomina biomarcador a cualquier variacin en el material hereditario cuya presencia se puede detectar en el individuo portador mediante la aplicacin de pruebas analticas. Los marcadores en general han sido la base del desarrollo de la gentica 99

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tradicional, de modo que los primeros mapas genticos que se hicieron se basaron en marcadores visibles, determinados por sistema genticos polimrficos, de modo que las variantes allicas eran distinguibles mediante observacin fenotpica directa. Con posterioridad, a estos marcadores se fueron aadiendo otros de carcter oculto, para cuyo anlisis se requera la extraccin de muestras de fluidos u homogeneizados de tejidos que permitan la utilizacin de mtodos bioqumicos o moleculares. De este modo se desarrollaron las tcnicas de electroforesis para el anlisis de las variantes gnicas que determinan polimorfismos de protenas o enzimas. En este caso lo que se estudia son los productos de expresin primaria de los genes, las protenas, dado que diferentes alelos de un mismo gen codifican protenas en los que se pueden apreciar diferencias. Estas se refieren sobre todo a la estructura primaria de las cadenas polipeptdicas, y en particular a las variaciones de carga o masa, por sustituciones, adiciones o prdidas de aminocidos, en los pptidos que codifican los distintos alelos de un mismo gen. Con el desarrollo de las tcnicas de biologa molecular se disearon una serie de marcadores moleculares para el anlisis del polimorfismo existente en las secuencias del ADN relativos a diferencias de sustitucin de bases nucleotdicas (SNPs), delecin o adicin de bases (indels), polimorfismos del nmero de repeticiones en tndem de pequeas secuencias (microsatlites y minisatlites), dianas de accin de endonucleasas de restriccin (RFLPs), etc. Toda esta tecnologa ha permitido ir completando el conocimiento de la diversidad existente en las secuencias de cada regin del genoma humano y la comprensin de su implicacin en las manifestaciones fenotpicas y particularmente en mltiples patologas. En su conjunto los marcadores de ADN han permitido conocer la diversidad existente en las poblaciones, desarrollar pruebas de identidad gentica o establecer mtodos de diagnstico gentico mediante la utilizacin de metodologas de ADN (PCR, anlisis de secuencias, etc.). Con el desarrollo del Proyecto Genoma Humano se complet la informacin sobre la organizacin estructural de todas las secuencias del ADN de nuestro genoma, dotado de un total aproximado de 25.000 genes, con un amplio repertorio de alelos en muchos de ellos. Las alteraciones de muchos de estos genes son causa de determinadas enfermedades, cuya recopilacin y descripcin puede ser consultada en la base 100

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de datos OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), a cargo del Dr. Victor A. McKusick, de la Facultad de Medicina de de la Universidad John Hopkins de Baltimore (43). El Proyecto Genoma Humano nos ha dotado de una informacin extraordinaria sobre las causas de muchas enfermedades, lo que ha producido un creciente inters por el desarrollo de nuevas metodologas de diagnstico, incluida la ms compleja y maligna de todas ellas, el cncer. Tras el conocimiento de la implicacin de las variaciones epigenticas en numerosas patologas, se ha dirigido la atencin hacia el desarrollo de nuevos marcadores para su deteccin. Es evidente que para este tipo de anlisis se han de desplegar unos mtodos analticos especficos, ya que las modificaciones detectables utilizadas hasta ahora se basan en los polimorfismos de las secuencias del ADN, que permanecen inalteradas en las modificaciones epigenticas. Por ello se ha hecho necesario desarrollar nuevas pruebas analticas para identificar los cambios epigenticos a travs de unos biomarcadores moleculares relacionados con el estado activo o silenciado de las regiones en que se encuentran los genes candidatos y as facilitar el diagnstico de las patologas debidas a estas modificaciones y la adopcin de estrategias de tratamiento. En esta direccin se estn desarrollando numerosas investigaciones y ensayos con el fin de detectar los cambios en la metilacin de las citosinas, la acetilacin de las histonas o la presencia de los microARNs, relacionados con determinadas patologas, cuya manifestacin puede ser revelada con anterioridad a la emergencia de la enfermedad, incluido el cncer con carcter general. Un buen biomarcador requiere una recoleccin de muestras en forma mnimamente invasiva o no invasiva (como sangre o esputo) y debe evidenciar una diferencia significativa entre la situacin normal y la existencia de la modificacin epigentica en el gen o la regin del genoma relacionada con la progresin de la enfermedad. De esta forma, del conjunto de biomarcadores que se estn desarrollando destacan en primer lugar los que exploran en los fluidos corporales la presencia de determinados metabolitos relacionados con los cambios epigenticos. Cada clula del cuerpo humano, incluyendo las pequeas y precoces lesiones cancerosas, deja un registro de su estado fisiolgico que queda reflejado en los fragmentos de ADN, productos protemicos y metablicos que se liberan a la sangre. De este modo, la exploracin de ADN 101

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y proteoma srico se convierte en un archivo de informacin del organismo a analizar y cubre un rango dinmico de diez rdenes de magnitud. Las molculas en circulacin componen un archivo de biomarcadores, que constituyen un reservorio potencial de informacin diagnstica del conjunto del organismo, cuyo uso clnico depende de la sensibilidad de los mtodos de deteccin y cuantificacin a partir de los fluidos corporales. Entre el conjunto de molculas en circulacin hay fragmentos de grandes protenas y de secuencias de ADN que aunque estn en escasa cantidad, pueden ser analizados con una serie de tcnicas especficas. As, por ejemplo, el Profesor Kenneth Nephew, de la Universidad de Indiana, est estudiando los cambios epigenticos de metilacin gnica como indicadores del cncer de mama y ovario. Estos biomarcadores cuentan con la ventaja potencial de su estabilidad, repetitividad, generalidad en las clulas cancergenas y facilidad de anlisis. Esta ltima ventaja se debe al hecho de que al morir las clulas cancergenas su ADN pasa al torrente circulatorio, de modo que se pueden desarrollar tcnicas de diagnstico utilizando el anlisis del ADN metilado presente en los fluidos corporales, como la sangre, orina, heces y esputo (44). A pesar de la urgente necesidad clnica de aadir nuevos predictores de enfermedades debidas a alteraciones epigenticas, el nmero de biomarcadores epigenticos desarrollados hasta el momento es realmente bajo. La mayora de los biomarcadores desarrollados inicialmente se refieren a las alteraciones de la metilacin del ADN, que pueden implicar a un nmero importante de genes. Dada su estabilidad, la metilacin de las islas CpG constituye un biomarcador epigentico muy favorable, lo que permite disear mtodos para detectar las seales del ADN metilado de regiones especficas del genoma usualmente no metiladas. En principio se han diseado tres tipos de marcadores: el anlisis basado en la accin de endonucleasas de restriccin sensibles a la metilacin; el anlisis basado en la accin del bisulfito; y el anlisis de SNuPE (= Single Nucleotide Primer Extension) o mtodo modificado de la accin del bisulfito. En los apartados siguientes nos referiremos a estas metodologas. Inicialmente las tcnicas se basaban en el uso de enzimas de restriccin capaces de distinguir el ADN metilado del no metilado en sus lugares especficos de reconocimiento de los genes de inters. Para ellos 102

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se ha de proceder en primer lugar a la digestin del ADN genmico con una endonucleasa cuya accin de corte sea especfica del ADN no metilado. A continuacin se ha de llevar a cabo el estudio de los fragmentos producidos, para lo que se pueden aplicar anlisis de hibridacin con sondas especficas (Southern blot) o proceder a la amplificacin de las regiones candidatas mediante una PCR que permita determinar si la regin de inters ha sido digerida. La ausencia de cortes en la regin a investigar significa que el ADN est metilado, mientras que la accin de la endonucleasa y la correspondiente produccin de fragmentos indica que la regin no estaba metilada. Sin embargo, estas tcnicas tienen limitaciones debido a la falta de disposicin de endonucleasas de restriccin para muchas regiones de inters del genoma. Una metodologa diseada para analizar el ADN genmico metilado es la PCR especfica para este tipo de ADN (MSP = Methylation Specific PCR). En este sentido el Doctor Peter Laird de la Facultad de Medicina de la Universidad de California (Los ngeles) ha desarrollado un mtodo denominado MethyLight que utiliza la reaccin del bisulfito (45). Mediante el tratamiento del ADN genmico procedente de los pacientes con bisulfito, se produce un cambio de las citosinas no metiladas por uracilo, dejando intactas las citosinas metiladas. Tras este tratamiento se lleva a cabo la amplificacin con la PCR con cebadores especficos para las secuencias del ADN genmico de las regiones candidatas ricas en CpG a investigar. Las secuencias no metiladas son amplificadas por PCR semi-cuantitativa en tiempo real, seguida de una deteccin con fluorescencia. Este anlisis permite una exploracin simultnea de varios genes mediante la amplificacin mltiple (multiplex) con cebadores y marcas fluorescentes especficas para cada regin CpG de inters. La empresa Biotage AB de Upsala (Suecia) ha desarrollado un mtodo de pirosecuenciacin para el anlisis de los genes de inters a partir de la amplificacin del ADN no metilado tratado con bisulfito. La ventaja de esta metodologa es su gran sensibilidad dada la capacidad de deteccin de las modificaciones epigenticas en la metilacin de las regiones analizadas con muy poca cantidad de ADN. Con el mtodo MethyLight se puede detectar un 0,1% de ADN metilado frente a un 99,9% de ADN no metilado. Una variacin del anlisis del bisulfito consiste en utilizar los dideoxinucletidos exclusivamente en el paso de la amplificacin de PCR 103

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antes del anlisis de la secuencia, seguido de la secuenciacin para una nica base (mtodo SNuPE) en combinacin con cromatografa lquida de par inico en fase reversa (IP RP HPLC). La presencia de citosina (C) indica que la regin del ADN est metilada, mientras que la presencia de la Timina (T) indica que la regin no est metilada (46). El ADN de las regiones ricas en CpG metiladas y no metiladas pueden ser discriminadas y cuantificadas en base a las diferencias de masa e hidrofobicidad de los fragmentos amplificados con la PCR. El anlisis es lineal, altamente reproductivo y se pueden realizar anlisis mltiples al igual que en el caso anterior. Adems se puede automatizar facilitando el anlisis de los productos individuales amplificados con la PCR. Una variante, que representa la segunda generacin de reconocimiento de las diferencias en las islas de CpG metiladas a analizar, consiste en hacer fragmentos del ADN genmico que tras la desnaturalizacin son inmunoprecipitados con un anticuerpo contra la citosina metilada C5m (47). El ADN C5m inmunoprecipitado es entonces sometido a pruebas de hibridacin sobre un chip de ADN. La firma comercial NimbleGen Systems, Inc., de Madison (Wisconsin), ofrece varios microarrays (NimbleChips) para los anlisis de las secuencias metiladas, incluyendo un arsenal entero de regiones del genoma que abarca 385.000 secuencias, incluyendo las regiones promotoras de mltiples genes candidatos. Otro acercamiento al anlisis de las modificaciones epigenticas debidas a la metilacin es el ensayo GoldenGate puesto a punto por la firma Illumina, Inc. (San Diego, California), que detecta diferencias en la metilacin en los sitios especficos CpG con una resolucin de una sola base nucleotdica. En primer lugar, el ADN genmico tratado con bisulfito se somete a hibridacin con una serie de cebadores correspondientes a sitios especficos de CpG, tanto metilados como no metilados. Cada secuencia especfica de CpG a analizar es amplificada con PCR, mediando la adicin de marcas fluorescentes con dos fluorocromos distintos, Cy3 y Cy5, que permiten distinguir y cuantificar la metilacin en las regiones CpG metiladas y no metiladas, respectivamente, lo que va a facilitar la cuantificacin diferencial de las regiones CpG. El ADN marcado se hibrida a un arsenal universal de oligonucletidos sobre microchips, desarrollado por Illumina (48). Un caso particular del desarrollo de los biomarcadores epigenticos es el que se destina al diagnstico del cncer. En realidad el cncer no 104

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es una enfermedad hereditaria, aunque si gentica, en el sentido de que lo que lo provoca es una alteracin de diversos tipos de genes, que afecta a la normal proliferacin de las clulas somticas y puede sobrevenir en muy diferentes momentos a lo largo de la vida y en diversidad de tejidos. Adems, se puede heredar alguna alteracin en los genes que regulan el normal desarrollo del ciclo celular por la va germinal y en tal caso podramos decir que, para estos casos, el cncer es hereditario o tiene una predisposicin hereditaria. En el cncer estn involucrados mltiples genes relacionados con el control del ciclo celular. En el caso del cncer los biomarcadores pueden ser tiles no solo para identificar la presencia de un tumor sino tambin para determinar su estado, subtipo y la capacidad de respuesta a determinadas terapias. As por ejemplo, las modificaciones epigenticas del promotor de los genes implicados en la sntesis de los inhibidores de kinasa dependientes de ciclinas p15, p16 y RASSF1A, que funcionan como genes supresores, representan unos biomarcadores potencialmente muy valiosos para el diagnstico precoz y preclnico del carcinoma hepatocelular (49-51). Frecuentemente estos genes aparecen metilados en el carcinoma heptico, detectndose la presencia de secuencias metiladas de estos genes en muestras de suero sanguneo de los pacientes en el momento en que se lleva a cabo el diagnstico de este tipo de cncer. Las secuencias de ADN metilado que pasan de los tumores a la sangre suponen unos biomarcadores muy valiosos para la deteccin de neoplasmas u otras alteraciones que todava no han mostrado otro tipo de manifestaciones. De este modo, Zhang y col. investigaron un grupo de pacientes de carcinoma hepatocelular de una poblacin de alto riesgo, utilizando como control individuos de la propia poblacin. En esta investigacin se detect la hipermetilacin de las regiones promotoras de los genes p16, p15, y RASSF1A en el 44, 24 y 70%, respectivamente (52). Adems, determinaron que la secuencias metiladas de estos genes podan ser detectadas en el suero del orden de uno a nueve aos antes de que diese la cara el carcinoma. En la investigacin de Zhang y col., el tiempo medio previo al diagnstico clnico del cncer en que la metilacin de los genes poda ser detectada a partir de las muestras del suero, permiti hacer una estimacin de la sensibilidad para la deteccin de neoplasmas ocultos en el hgado. Dicho intervalo fue de 4,3 aos para p16 (rango de uno a ocho aos), 3,4 aos para p15 (rango de dos a cinco aos) y 105

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4,4 aos para RASSF1A (rango de uno a nueve aos). En aquellos casos en que se repiti la recogida de muestras a intervalos de tiempo en los mismos pacientes, se detect la conservacin de los patrones de metilacin de los genes, lo que sugiere una fuerte relacin entre la hipermetilacin aberrante y el desarrollo del proceso cancergeno. Los resultados de estas investigaciones son una buena muestra del potencial que ofrecen los biomarcadores epigenticos en el suero, como una estrategia no invasiva para detectar la posible aparicin de un carcinoma hepatocelular en una poblacin de alto riesgo de contraerlo. Este mtodo de deteccin podra suponer una aplicacin tcnica clnica inmediata en la exploracin rutinaria y en la monitorizacin de los individuos en las regiones con alta incidencia de la enfermedad, como ocurre en el Este de Asia y en frica sub-sahariana, o incluso en los pases desarrollados. Tambin se ha demostrado la sensibilidad del mtodo al analizar los datos del grado de desarrollo del cncer en los distintos pacientes. De importancia son tambin las investigaciones conducentes a la bsqueda de biomarcadores epigenticos capaces de detectar alteraciones epigenticas en genes relacionados con enfermedades, debidas a efectos del ambiente. De este modo, un campo de investigacin de gran trascendencia es el relativo al equilibrio fisiolgico interno en el claustro materno-fetal durante la gestacin. As, investigadores de la Universidad de Columbia estn desarrollando un biomarcador epigentico, detectables en tejidos fetales, asociado al riesgo de asma en nios nacidos tras una gestacin en zonas altamente contaminadas. El biomarcador podra detectar la alteracin epigentica del ADN en la sangre, debida a la metilacin del gen ACSL3, que est implicado en el metabolismo de los cidos grasos catalizado por la enzima Acetil Coenzima-A sintetasa. La alteracin epigentica de este gen durante la gestacin se debe a una exposicin a niveles por encima de lo normal a hidrocarburos policclicos aromticos (PAHs). Este contaminante ambiental se produce por la combustin incompleta de fuel y est presente en las zonas de trfico elevado (53). El segundo tipo de modificaciones epigenticas que ha motivado la bsqueda de biomarcadores son las que afectan a las histonas. Todas las histonas (H3, H4, H2A, H2B y H1) se pueden aislar con HPLC, y se pueden analizar las fracciones por diferentes mtodos cromatogrficos y espectrofotomtricos. Las modificaciones especficas de cada aminocido se pueden caracterizar tambin utilizando anticuerpos en Western 106

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blot, inmunotincin o espectrometra total en tndem (MS/MS) (54). Sin embargo, adems de determinar los tipos y las cantidades relativas de modificacin de las histonas que estn presentes en un tipo particular de clulas o muestras tumorales, tambin hace falta informacin sobre las secuencias de ADN con las que estn asociadas las histonas modificadas. Actualmente, la tcnica de mayor resolucin para lograr este objetivo es el uso de CHIPS con anticuerpos contra modificaciones especficas de las histonas. Mediante modificaciones de esta tecnologa se han llegado a analizar hasta cien tipos de clulas diferentes con una aplicacin particular en el diagnstico del cncer (55). La compaa SensiGen LLC, una empresa biotecnolgica americana dedicada al desarrollo de mtodos de diagnstico molecular de enfermedades genticas, adquiri en exclusiva una opcin de la Universidad de Michigan para elaborar un juego de biomarcadores epigenticos para la deteccin y monitorizacin temprana de Lupus. Esta patologa es una enfermedad autoinmune crnica mediante la que las clulas B del sistema inmunolgico desarrollan anticuerpos que atacan a los rganos y tejidos del propio paciente. Los sntomas del Lupus incluyen una intensa fatiga, dolores, fiebre, picores y deterioro de la funcin renal. El origen de la enfermedad es desconocido y no tiene cura. No obstante, si se detecta pronto hay tratamientos para ayudar a los pacientes a conocer su enfermedad y reducir el impacto de episodios peridicos de sntomas que son comunes en el Lupus. La tecnologa desarrollada por SensiGen LLC, incluye un panel de biomarcadores epigenticos para detectar nicamente las modificaciones asociadas a los genes cuya alteracin promueve el Lupus. La investigacin sobre este tipo de marcadores se debe al equipo que lidera el Doctor Richardson, que lleva a cabo su actividad investigadora en el campo de los efectos de la metilacin en la expresin gnica. En sus investigaciones descubri que los niveles de metilacin de determinados genes estn asociados con la aparicin del Lupus (56). En estos trabajos se observ que en los pacientes de Lupus se encontraban grandes diferencias en la produccin de micro-ARNs con respecto a individuos sanos utilizados como control. Jena y Mishra del Departamento de Dermatologa y Venerologa de la Facultad de Medicina de Sambalpur (India) estn investigando el papel de la modificacin de las histonas en el Lupus (57). El resultado ha 107

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sido la creacin de unos biomarcadores altamente sensibles que permiten hacer un diagnstico precoz del Lupus Eritematoso Sistmico. En este anlisis se descubri que en los pacientes de Lupus se presenta un conjunto de 40 micro-ARNs con una sobreexpresin de 1,5 veces con respecto a los individuos control, enfocndose la atencin en los niveles de 5 micro-ARNs que alcanzan un nivel de sobreexpresin superior a tres veces la cantidad de estas pequeas molculas de ARN en los individuos sanos, y un micro-ARN llamado miR95 que en los pacientes de Lupus se reduce a un tercio respecto a los individuos control. La presencia reducida de miR95 es el resultado de una modificacin epigentica de determinados genes en los enfermos de Lupus. Las variaciones en la presencia de los micro-ARN en estos enfermos estn asociadas a la presencia de enzimas desacetilasas que promueven la desacetilacin de las histonas que se asocian a los genes que intervienen en el Lupus. Debido a ello se est ensayando la utilizacin de inhibidores de las desacetilasas de histonas (HDI) para el tratamiento del Lupus. En esta direccin se han diseado dos frmacos denominados Trichostatin A (HDI-TSA) y el cido suberoilanilida hidroxmico (SAHA) en pacientes de Lupus, con resultados positivos en un conjunto de los sntomas del Lupus. A la vista de los resultados que ofrecen los biomarcadores epigenticos desarrollados hasta el momento se pone de manifiesto su importancia en el diagnstico precoz de una serie de patologas potenciales que, debido a su base molecular, no se pueden analizar con mtodos tradicionales. En cualquier caso, el diagnstico de cada tipo de enfermedad causada por las modificaciones epigenticas en el ADN, las histonas o por la presencia de ARN de interferencia, exige un buen conocimiento de las secuencias de los genes y las potenciales alteraciones de su expresin. Partiendo de esta informacin se pueden desarrollar nuevos marcadores, cuya utilidad depender de su especificidad y sensibilidad. Esto implica que ha de investigarse especialmente para cada caso el valor pronstico positivo o negativo de cada nuevo biomarcador epigentico. En cualquier caso, el creciente conocimiento de los genes implicados en muchas enfermedades de origen epigentico, constituye un punto de partida excelente para impulsar el descubrimiento de nuevos biomarcadores que permitan dirigir tratamientos quimiopreventivos o quimioteraputicos en enfermos potenciales en la etapa preclnica de la enfermedad. 108

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BIBLIOGRAFA
Garca-Bellido, A. (1984) Hacia una gramtica gentica. Real Academia de Ciencias Exactas, Fsicas y Naturales. Madrid. Waddington, C. H. (1942) The epigenotype. Endeavour. 1: 18-20. Bird, A. & Macleod, D. (2004) Reading the DNA methylation signal. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 69: 113-118. Jones, P. A. (2006) The Human Epigenome: Dawn of a New Era for Cancer Prevention, Diagnosis, and Therapy Presiden-tial Address. AACR Annual Meeting. Bird, A. (2002) DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes. Dev. 16: 6-21. Esteller, M. (2005) Aberrant DNA methylation as a cancerinducing mechanism. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 45: 629-656. Esteller, M. (2007) Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. www.nature.com/reviews/genetics. vol. 8: 286-298. Jaenisch, R. & Bird, A. (2003) Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genet. 33: S245-S254. Wang, Y., Wysocka, J., Perlin, J. R., Leonelli, L., Allis, C. D. & Coonrod, S. A. (2004) Linking covalent histone modifications to epigenetics: the rigidity and plasticity of the marks. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 69: 161-169. Mayer, W., Niveleau, A., Walter, J., Fundele, R. & Haaf, T. (2000) Demethylation of the zygotic paternal genome. Nature. 403: 501-502. Wade, P. A. (2001) Methyl CpG-binding proteins and transcriptional repression. Bioessays. 23 (12): 1131-1137. Ballestar, E. & Wolffe, A. P. (2001) Methyl-CpG-binding proteins. Targeting specific gene repression. Eur. J. Biochem. 268(1): 1-6. Appanah, R., Dickerson, D. R., Goya, P., Groudine, M. & Lorincz, M. C. (2007) An Unmethylated 3' Promoter-Proximal Region Is Required for Efficient Transcription Initiation. PLoS Genet. 3(2): e27. Fischle, W., Wang, Y. & Allis, C. D. (2003) Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425: 475-479. Bird, A. (1986) CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature. 321: 209-213. Bock, C., Walter, J., Paulsen, M. & Lengauer, T. (2007) CpG island mapping by epigenome prediction. PLoS Comput. Biol. doi: 10.1371/journal. pcbi. 0030110.eor. Robertson, K. D. (2002) DNA methylation and chromatin -unraveling the tangled web. Oncogene. 21: 5361-5379. Panning, B. & Jaenisch, R. (1996) DNA hypomethylation can activate Xist expression and silence X-linked genes. Genes. Dev. 10: 1991-2002. Reik, W. & Lewis, A. (2005) Co-evolution of X-chromosome inactivation and imprinting in mammals. Nature Rev. Genet. 6: 403-410.

109

NICOLS JOUVE 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.

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BARREDA

30. 31. 32. 33. 34.

35.

Slotkin, R. K. & Martienssen, R. (2007) Transposable elements and the epigenetic regulation of the genome. Nat. Rev. Genet. 8(4): 272-285. Novina, C. D. & Sharp, P. A. (2004) The RNAi revolution. Nature. 430: 161164. Jia, S., Noma, K. & Grewal, S. I. (2004) RNAi-independent heterochromatin nucleation by the stress-activated ATF/CREB family proteins. Science. 304: 1971-1976. Feil, R. (2007) Environment and nutritional effects on the epigenetic regulation genes. Mutation Research. 1: 12. Rodenhiser, D. & Mann, M. (2006) Epigenetics and human disease: translating basic biology into clinical applications. Canadian Medical Association Journal. 174 (3): 341-348. Brown, R. & Strathdee, G. (2002) Epigenomics and epigenetic therapy of cancer. Trends Mol. Med. 8 (Suppl.): S43-S48. Feinberg, A. P. & Tycko, B. (2004) The history of cancer epigenetics. Nature Rev. Cancer. 4: 1-11. De Baun, M. R., Niemitz, E. L. & Feinberg, A. P. (2003) Association of in vitro fertilization with Beckwith-Wiedemann syndrome and epigenetic alterations of LIT1and H19. Am. J. Hum. Genet. 72: 156-160. Behr, B. & Wang, H. (2004) Effects of culture conditions on IVF outcome. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 115 (Suppl. 1): S72-S76. Mellissa, R. W., Mann, S., Lee, S. S., Doherty, A. S., Verona, R. I., Nolen, L. D., Schultz, R. M. & Bartolomei, M. S. (2004) Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development. 131: 3727-3735. De Baun, M. R., Niemitz, E. L. & Feinberg, A. P. (2003) Association of in vitro fertilization with BeckwithWiedemann syndrome and epigenetic alterations of LIT1 and H19. Am. J. Hum. Genet. 72: 156-160. Cox. G. F., Burger, J., Lip, V., Mau, U. A., Sperling, K. & Wu, B. L. (2002) Intracytoplasmic sperm injection may increase the risk of imprinting sefects. Am. J. Hum. Genet. 71: 162-164. Everett, C. M. & Wood, N. W. (2004). Trinucleotide repeats and neurodegenerative disease. Brain. 127: 2385-2405. Feinberg, A. P. & Tycko, B. (2004) The history of cancer epigenetics. Nature Rev. Cancer. 4: 1-11. Lee, M. P., DeBaun, M. R., Mitsuya, K., Galonek, H. L., Brandenburg, S., Oshimura, M. & Feinberg, A. P. (1999) Loss of imprinting of a paternally expressed transcript, with antisense orientation to KvLQT1,occurs frequently in Beckwith-Wiedemann syndrome and is independent of insulin-like growth factor II imprinting. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 96: 5203-5208. Runte, M., Frber, C., Lich, C., Zeschnigk, M., Buchholz, T., Smith, A., Van Maldergem, L., Brger, J., Muscatelli, F., Gillessen-Kaesbach, G., Horsthemke, B. & Buiting, K. (2001) Comprehensive methylation analysis in typical and

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36.

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45. 46. 47.

48. 49. 50.

atypical PWS and AS patients with normal biparental chromosomes 15. Eur. J. Hum. Genet. 9: 519-526. Lossie, A. C., Whitney, M. M., Amidon, D., Dong, H. J., Chen, P., Theriaque, D., Hutson, A., Nicholls, D., Zori, R. T., Williams, C. A. & Driscoll, D. J. (2001) Distinct phenotypes distinguish the molecular classes of Angelman syndrome. J. Med. Genet. 38: 834-845. Liu, J., Nealon, J. G. & Weinstein, L. S. (2005) Distinct patterns of abnormal GNAS imprinting in familial and sporadic pseudohypoparathyroidism type IB. Hum. Mol. Genet. 14: 95-102. Arima, T., Drewell, R. A., Arney, K. L., Inoue, J., Makita, Y., Hata, A., Oshimura, M., Wake, N. & Surani, M. A. (2001) A conserved imprinting control region at the HYMAI/ZAC domain is implicated in transient neonatal diabetes mellitus. Hum. Mol. Genet. 10: 1475-1483. Walker, F. O. (2007) Huntingtons disease. Lancet. 369: 218-228. Everett, C. M. & Wood, N. W. (2004) Trinucleotide repeats and neurodegenerative disease. Brain. 127: 2385-2405. Sutherland, G. R. (2003) Rare fragile sites. Cytogenet. GenomeRes. 100: 77-84. Anway, M. D. & Skinner, M. K. (2008) Epigenetic programming of the germ line: effects of endocrine disruptors on the development of transgenerational disease. Reprod. Biomed. Online. 16(1): 23-25. McKusick, V. (1997) Mendelian Inheritance in Man: A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders, Johns Hopkins University Press, Baltimore: http://www. ncbi.nlm.nih.gov/omim. Ahluwalia, A., Yan, P., Hurteau, J. A., Bigsby, R. M., Jung, S. H., Huang, T. & Nephew, K. P. (2001) DNA methylation and ovarian cancer. I: Analysis of CpG island hypermethylation in human ovarian cancer using differential methylation hybridization. Gynecol. Oncol. 82: 261-268. Campan, M., Weisenberger, D. J., Trinh, B. & Laird, P. W. (2009) MethyLight. Methods Mol. Biol. 507: 325-337. El-Maarri, O., Herbiniaux, U., Walter, J. & Oldenburg, J. (2002) A rapid, quantitative, non-radioactive bisulfite-SNuPE- IP RP HPLC assay for methylation analysis at specific CpG sites. Nucleic Acids Res. 30(6): e25. Gebhard, C., Schwarzfischer, L., Pham, T. H., Schilling, E., Klug, M., Andreesen, R. & Rehli, M. (2006) Genome-wide profiling of CpG methylation identifies novel targets of aberrant hyper-methylation in myeloid leukemia. Cancer Res. 66(12): 6118-28. Fan, J.-B., Gunderson, K., Bibikova, M., Yeakley, J. M. & Chen, J. (2006) Illumina universal bead arrays. Methods Enzymol. 410: 57-73. Herath, N. I., Leggett, B. A. & MacDonald, G. A. (2006) Review of genetic and epigenetic alterations in hepatocarcinogenesis. J. Gastroenterol Hepatol. 21: 15-21. Dammann, R., Yang, G. & Pfeifer, G.P. (2001) Hypermethylation of the cpG island of Ras association domain family 1A (RASSF1A), a putative tumor su-

111

NICOLS JOUVE

DE LA

BARREDA

51.

52. 53.

54.

55. 56. 57.

ppressor gene from the 3p21.3 locus, occurs in a large percentage of human breast cancers. Cancer Res. 61: 3105-9. Rivenbark, A. G. & Coleman, W. B. (2007) The Use of Epigenetic Biomarkers for Preclinical Detection of Hepatocellular Carcinoma: Potential for Noninvasive Screening of High-Risk Populations. Clinical Cancer Research. 13: 23092312. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-0086. Zhang ,Y.-J., Wu, H.-C. & Hen, J. S. (2007) Predicting hepatocellular carcinoma by detection of aberrant promoter methylation in serum DNA. Clin. Cancer Res. 13: 2378-2384. Perera, F., Tang, W.-J., Herbstman, J., Tang, D., Levi, L., Miller, R. & Ho, S.M. (2009) Relation of DNA Methylation of 5'-CpG Island of ACSL3 to Transplacental Exposure to Airborne Polycyclic Aromatic Hydrocarbons and Childhood Asthma. PLoS ONE. 4(2): e4488. doi: 10.1371/journal.pone. 0004488. Fraga, M. F., Ballestar, E., Villar-Garea, A., Ropero, S., Setien, F., Ballestar, M., Heine-Suer, D. & Esteller, M. (2005). Loss of acetylation at Lys16 and trimethylation at Lys20 of histone H4 is a common hallmark of human cancer. Nature Genet. 37: 391-400. ONeill, L. P., Vermilyea, M. D. & Turner, B. M. (2006) Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nature Genet. 38: 835-841. Richardson, B. (2007) Epigenetics of Autoimmunity. Nature Clinical Practice Rheumatology. 3: 521-527. Jena, S. & Mishra, S. S. (2002) Lupus vulgaris on keloid. Indian J. Dermatol. Venereol. Leprol. 68: 147-148.

112