Acta Farm.

Bonaerense 24 (3): 371-6 (2005)

Recibido el 20 de noviembre de 2004 Aceptado el 10 de abril de 2005

Trabajos originales

Estudo morfo-anatmico das folhas e caule da Calophyllum brasiliense (Clusiaceae), uma contribuio ao estudo farmacognstico da droga vegetal
Arquimedes G. JUNIOR 1, Izabel C. P. FERREIRA 2, Celso V. NAKAMURA 3, Benedito P. D. FILHO 3, Ezilda JACOMASSI 4, Maria C. M. YOUNG 5 e Digenes A. G. CORTEZ 2* Mestrando em Cincias Farmacuticas da Universidade Estadual de Maring. de Farmcia e Farmacologia, 3 Departamento de Anlises Clnicas, Universidade Estadual de Maring, Avenida Colombo 5790, 87020-900, Maring, PR, Brasil. 4 Universidade Paranaense (UNIPAR), Instituto Superior de Cincias Farmacuticas e Bioqumica, Umuarama, PR, Brasil. 5 Instituto de Botnica de So Paulo, So Paulo, SP, Brasil
1 2 Departamento

RESUMO. Calophyllum brasiliense Cambess (Clusiaceae), conhecida como guanandi popularmente utilizada para o tratamento de reumatismo, varicoses, hemorridas e lceras crnicas. Neste estudo, foram determinadas as caractersticas botnicas e fsico-quimica para o C. brasiliense, com o objetivo de auxiliar a sua identificao taxonmica e o controle de qualidade de produtos preparados com esta planta. Para a caracterizao da morfologia, anatomia e histoqumica foram confeccionadas lminas semipermanentes do caule e das folhas do C. brasiliense. Testes histoqumicos realizados mostraram a presena de compostos fenlicos principalmente localizados nos canais secretores do caule, pecolo e limbo. Os dados obtidos determinaram os parmetros para avaliao de qualidade e pureza. SUMMARY. Anatomical study of leaves and stem of Calophyllum brasiliense (Clusiaceae), a contribution to the farmacognostic study of vegetal drug. Calophyllum brasiliense Cambess (Clusiaceae), a folk medicine plant known as guanandi, is popularly used in the treatment of rheumatism, varicosity, hemorrhoids and chronic ulcerations. This study determines botanical and physico-chemical characters of C. brasiliense, with the objective of providing tools for its taxonomical identification and the quality control of derivatives products. For morphological, anatomical and histochemical characterizations semi-permanent slides has been made from C. brasiliense stem and leaves. Histochemical tests demonstrated the presence of phenolic compounds mainly localized on the secretory canals of stem, petiole and leaf blade. These data shown to be useful to the identification and quality parameters and purity.

INTRODUO A famlia Clusiaceae (Lindl.) inclui 50 gneros e 1200 espcies distribudas principalmente nas regies tropicais do globo. Entretanto, alguns gneros se desenvolvem com grande facilidade nas regies norte de zonas temperadas. Esta famlia engloba rvores, arbustos, lianas e ervas de interesse econmico pela produo de frutos comestveis, madeiras, derivados qumicos de interesse farmacutico e tintas. A maioria das espcies est distribuda em trs gneros: Hypericum L. (350 spp), Clusia L. (200 spp) e Garcinia L. (200 spp) 1. No entanto, o gnero Calophyllum L., cuja maioria das espcies so representadas por rvores tropicais, apresenta entre 180 a 200 espcies de grande interesse econmico, devido a produo de madeiras no-

bres 2. Os gneros mais importantes no Brasil so: Kielmeyera Mart. & Zucc. (pau-santo), Caraipa Aubl, Patonia R. Wight (obacuri), Clusia L., Hypericum L., Rheedia L., Calophyllum L., destacando-se quantitativamente o Calophyllum brasiliense Camb 3., espcie conhecida popularmente como guanandi ou jacareba, cuja infuso da casca um remdio popular utilizado para o tratamento de reumatismo, varicoses, hemorridas e lceras crnicas 4. Calophyllum brasiliense Cambess. uma espcie arbrea, com altura variando entre 20 a 30 metros e dimetro de 40 a 60 cm 5, que se desenvolve preferencialmente em florestas semidecdua, ombrfila densa, amaznica e no cerrado constituinte de vrios estados do Brasil 6. As folhas so simples na forma do limbo, a

KEYWORDS: Anatomy, Calophyllum brasiliense, Clusiaceae. PALAVRAS CHAVES: Anatomia, Calophyllum brasiliense, Clusiaceae.
* Autor para correspondncia. E-mail: dagcortez@uem.br

ISSN 0326-2383

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maioria elptica, obtusa no pice e cuneiforme na base 4. O padro de venao do tipo paxilato 7, ou seja, com nervuras secundrias numerosas, paralelas e muito prximas uma das outras. Esse tipo de venao citado por Melville 7, para o C. inophyllum L. No entanto, Mouton 7 denomina este padro de venao como de paraleldromo transverso, e Rizzini 8 de venosa obliquivnia. Segundo Cronquist 1 uma das caractersticas anatmicas marcantes da famlia Clusiaceae a presena de canais e cavidades secretores esquizgenos em todos os tecidos, onde so elaborados e secretados diversos metablitos secundrios. Suas folhas apresentam cavidades secretoras resinferas, sendo algumas delas produtoras de resinas aromticas que, somadas aos canais secretores, promovem o acmulo de diversos tipos de metablitos secundrios, tais como xantonas e cumarinas 9,10, podendo estar na forma isolada ou agrupar-se com cristais de oxalato de clcio. Diversas cumarinas e xantonas isoladas de representantes do gnero Calophyllum apresentaram importantes atividades moluscicida, antitumoral, antiviral e antimicrobiana 11-14. Sartori et al. 15 comprovaram efeito citoprotetor, anti-secretor e antilcera da frao diclorometano obtida da casca do C. brasiliense Cambess. Da Silva et al. 16 comprovaram atividade analgsica e antiinflamatria das fraes obtidas do extrato das folhas do C. brasiliense Cambess. Recentemente, Gasparotto Junior 17 comprovou atividade moluscicida do extrato, fraes e de uma cumarina isolada das folhas do Calophyllum brasiliense Cambess. apresentando a mesma intensa atividade moluscicida frente ao Biomphalaria glabrata, importante vetor da Esquistossomose Mansnica no Brasil. Segundo Oliveira et al. 18, outro fator importante para a diagnose de drogas vegetais, alm da descrio anatmica, corresponde s incluses celulares tanto de natureza orgnica (amido, compostos fenlicos, gotculas de leo, etc) como inorgnicas (cristais de oxalato de clcio, carbonato de clcio, etc), e estas incluses podem ser evidenciadas por meio de reaes histoqumicas adequadas. O presente trabalho tem por objetivo o estudo da anatomia e histoqumica das folhas e caule do Calophyllum brasiliense Cambess., visando estabelecer: 1) caractersticas marcantes para sua identificao; 2) dar subsdio para a anlise farmacognstica permitindo o controle de qualidade da droga vegetal.

MATERIAL E MTODOS O material botnico, folhas e caule do Calophyllum brasiliense Cambess. (Clusiaceae) foram coletados na Ilha do Cardoso, localizada no Estado de So Paulo, pela professora Dra. Maria Claudia Young, em maro de 2001. A exsicata foi depositada no Herbrio do Instituto de Botnica de So Paulo, sob o nmero de registro SP363818. Para a anlise microscpica do material botnico foram realizados cortes transversais, longitudinais e paradrmicos, mo livre, com auxlio de lmina de barbear. Lminas semipermanentes foram preparadas com os cortes descorados em soluo de hipoclorito de sdio 33%, lavados com gua destilada, corados com safranina 1% e soluo de azul de astra 1%, montados em lmina e lamnula, com gelatina glicerinada (soluo 1:1) 18-20 e observados em microscpio tico Nikon (ALPHAPHOT -2) YS2-T. Para os testes histoqumicos, os cortes do material botnico foram submetidos: soluo aquosa de cloreto frrico 10%, para localizao de compostos fenlicos 19; soluo de floroglucinol cido, para evidenciar paredes lignificadas 20; soluo de Sudan IV (soluo saturada do corante em lcool 95% e adicionada igual quantidade de glicerina), para localizar paredes suberificadas, cutinizadas e outros materiais lipdicos 21; ao reagente de Lugol (gua destilada 100,0 ml para 1,0 g de iodeto de potssio), para localizao de amido 22; soluo de azul de metileno (soluo de 0,3 g de azul de metileno em 20,0 ml de lcool 96GL, e completando com gua destilada para 100,0 ml) para evidenciar estruturas celulsicas e mucilaginosas 23; soluo de cido sulfrico diludo de 5-10%, para evidenciar cristais de oxalato de clcio; e soluo de vermelho de rutnio para evidenciar a presena de clulas de contedo mucilaginoso 24. Os aspectos anatmicos das folhas e caule foram observados, descritos e ilustrados ao microscpio ptico. As fotomicrografias e as escalas referentes s ilustraes foram obtidas utilizando-se do programa Image-pro Lite (version 3.0 for windows/98) acoplado ao microscpio tico Leika DMLS type 020-518.5000 e devidamente ajustado por meio de pr-calibrao. RESULTADOS E DISCUSSO Descrio Microscpica Follha Calophyllum brasiliense apresenta pecolo dorsiventral com sistema vascular formado por

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Figuras 1-4: Sees transversais e longitudinal do pecolo de Calophyllum brasiliense Cambess. 1: sistema vascular; 2: evidenciando o crtex; 3: evidenciando as drusas; 4: seco longitudinal evidenciando laticfero (Ce canal esquizgeno, D - drusas, F - fibras perivasculares, Fl - floema, L - laticfero, X - xilema).

nico feixe colateral. Na face dorsal, possui grupos de fibras associados ao floema (Fig. 1). O sistema fundamental composto em sua maior parte por parnquima colenquimatoso, que se caracteriza por apresentar certo espessamento no lignificado na parede celular (Fig. 2). As drusas esto presentes por todo o sistema fundamental, bem como laticferos e canais esquizgenos, sendo estes ltimos tambm localizados no sistema vascular (Figs. 3-4). Metcalfe & Chalk 25 relatam estas estruturas para algumas espcies da famlia Clusiaceae. O tipo de pecolo do C. brasiliense observado se enquadra com o tipo de C. calaba Jacq., descrito por Metcalfe & Chalk 25. Em seco transversal, o limbo se mostra dorsiventral e hipoestomtico com epiderme unisseriada acompanhada de hipoderme (Figs. 5-7), apresentando cutcula espessa em ambas as faces epidrmicas. O mesofilo composto por uma camada de clulas em paliada, uma camada de clulas coletoras cuneiformes e nove a onze camadas de clulas com formatos irregulares, constituindo o parnquima lacunoso. Nes-

ta regio observou-se a presena de cristais de oxalato de clcio, e principalmente as drusas. Especialmente nas regies das nervuras de menor calibre, o parnquima palidico pode ser formado por duas camadas de clulas mais curtas. Metcalfe & Chalk 25 descrevem algumas caractersticas do limbo de representantes da famlia Clusiaceae, tais como: hipoderme com uma a

Figura 5. Seco transversal do mesofilo do Calophyllum brasiliense Cambess evidenciando hipoderme, parnquima palidico, lacunoso e drusas (Pp: parnquima palidico, Hi: hipoderme, Pl: parnquima lacunoso, D: drusa).

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Figuras 6 e 7: Seces paradrmicas da folha do Calophyllum brasiliense Cambess. 6: Face adaxial evidenciando contorno das clulas; 7: Face abaxial evidenciando estmatos.

Figuras 8 e 9: Sees transversais da nervura principal do Calophyllum brasiliense Cambess. 8: evidenciando o sistema vascular; 9: evidenciando canal esquizgeno (Ce: canal esquizgeno, F: fibras perivasculares, Fl: floema, X: xilema).

vrias camadas de clulas em contato com a face adaxial da epiderme em muitos gneros, inclusive Calophyllum; cristais de oxalato de clcio na forma de drusas no mesofilo; folha dorsiventral em muitos gneros e cntrica e subcntrica em outros. A nervura principal na face abaxial convexa com sistema vascular representado por um feixe colateral em forma de arco, circundado por um anel de fibras (Fig. 5); apresenta canais esquizgenos na face abaxial associado ao parnquima colenquimatoso bem como na regio central (Figs. 8 e 9). Em ambas as faces da nervura principal ocorrem idioblastos com monocristais prismticos e drusas. Na regio do bordo, a cutcula mais espessa e a epiderme formada por uma camada de clulas com tamanho menor, quando comparadas as demais clulas epidrmicas. O sistema vascular nesta regio representado por um feixe colateral, associado a um canal esquizgeno envolvido por bainha de esclernquima. Em cortes paradrmicos, observa-se em ambas as faces epidrmicas clulas de formatos variados e contorno das paredes anticlinais ondulados (Figs. 8 e 9). Os estmatos so numerosos, do tipo anomoctico, e esto presentes unicamente na face abaxial (Fig. 9). Metcalfe &

Chalk 25 descrevem para alguns representantes da famlia Clusiaceae estmatos paracticos presentes na face abaxial da epiderme. Caule O caule em desenvolvimento primrio (3 mm de dimetro) apresenta contorno retangular com epiderme unisseriada constituda por clulas retangulares e papiliformes com cutcula espessa. O crtex formado por tecido parenquimtico e o sistema vascular representado por um cilindro contnuo de floema ao redor do xilema, o qual est envolto por grupos de fibras perivasculares; a regio central do caule se mostra constituda por clulas parenquimticas isodiamtricas em processo de lignificao, e os canais esquizgenos so observados na regio cortical e medular (Figs. 10 e 11). Da mesma forma, foram observados a presena de idioblastos com microcristais prismticos e, em maior evidncia, as drusas. Estes resultados esto de acordo com o relatado por Metcalfe & Chalk 25 e Metcalfe 26 referente presena de canais ou cavidades secretoras em espcies da famlia Clusiaceae, que podem seguir o feixe vascular ou correr independente deste no mesofilo, passando pela regio medular e cortical do pecolo.

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Figs. 10-11: Seces transversais do caule em desenvolvimento primrio do Calophyllum brasiliense Cambess. 10: evidenciando sistema vascular e canais esquizgenos centrais e perifricos; 11: evidenciando canais esquizgenos.

Testes Histoqumicos Parte da planta Lugol Sudan IV H2SO4 FeCl3 Azul de Metileno Floroglucinol Vermelho De Rutnio

Caule Primrio Pecolo Limbo + + +++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ +++

Tabela 1. Resultados dos testes histoqumicos para material seco de Calophyllum brasiliense Cambess. + fracamente positivo; ++ moderadamente positivo; +++ fortemente positivo; - negativo.

Testes Histoqumicos Os resultados dos testes histoqumicos com o C. brasiliense (Tabela 1) demonstraram, aps a utilizao do FeCl3, a presena marcante compostos fenlicos, principalmente localizados em canais secretores esquizgenos apresentados pela espcie. Segundo Metcalfe & Chalk 25, a natureza qumica do contedo das estruturas secretoras tem sido afirmada sem a utilizao de testes histoqumicos adequados. No entanto, testes aplicados por diferentes pesquisadores para o mesmo material podem levar a diferentes concluses, j que o material secretado raramente constitudo por substncias puras. Com a utilizao do Sudan IV observou-se a deposio de compostos graxos, notoriamente na espessa cutcula apresentada pela espcie. A utilizao do H2SO4 comprovou a intensa presena de cristais de oxalato de clcio na forma de microcristais prismticos e drusas dispersas tanto na folha quanto no caule primrio. Com a utilizao do Floroglucinol cido, evidenciou-se a presena de paredes lignificadas principalmente no caule primrio, justificando a existncia em maior quantidade de tecidos de sustentao neste lo-

cal. A utilizao do Azul de Metileno e do Vermelho de Rutnio revelou a presena de tecidos no lignificados com contedo mucilaginoso, principalmente localizados no limbo da espcie. CONCLUSO Os dados obtidos com o estudo da anatomia e histoqumica, para a espcie Calophyllum brasiliense Cambess., foram importantes para sua identificao e avaliao do controle de qualidade, sendo teis para comercializao desta espcie como droga vegetal.
Agradecimentos. A CAPES/CNPq pelo apoio financeiro.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Cronquist, A. (1981) An integrated system of classification of flowering plants. Columbia University Press, New York, pgs. 337. 2. Mckee, T.C., Covington, C.D., Fuller, R.W., Bokesch, H.R., Young, S., Cardellina, J.H., Kadushin, M.R., Soejarto, D.D., Stevens, P.F., Cragg, G.M., Boyd, M.R. (1998) J. Nat. Prod. 61: 1252-6.

375

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3. Joly, A.B. (1975) Botnica: introduo a taxonomia vegetal, Ed. Nacional, Ed. da Universidade de So Paulo, So Paulo, 2 ed., pgs. 428. 4. Corra, M.P. (1978) Dicionrio das plantas teis do Brasil e das exticas cultivadas, Imprensa nacional, Rio de Janeiro, Vol. 3, pgs. 388. 5. Lorenzi, H. (1992) rvores Brasileiras: manual de identificao e cultivo de plantas arbreas nativas do Brasil, Plantarum, Nova Odessa, 2 ed, pgs. 352. 6. Carvalho, P.E.R. (1994) Espcies florestais brasileiras. recomendaes silviculturais, potencialidades e uso da madeira , Embrapa Cnpf, Braslia, pgs. 640. 7. Melville, R. (1976) Taxon 25: 549-61. 8. Rizzini, C.T. (1960/1961) Rodrigusia 35: 193211. 9. Cardona, M.L., Fernndes, I., Pedro, J.R. & Serrano, A. (1990) Phytochemistry 29 (9): 3003-6. 10. Cortez, D.A.G., Marston, A., & Hostettmann, K. (1999) Chromatographia 50 (1/2):7-10. 11. Ravelonjato, B.; Libot, F., Ramiandrasoa, F., Kunesch, N., Gayral, P., & Poisson, J. (1992) Planta Med. 58: 51-5. 12. Guilet, D., Hlesbeux, J.J., Sraphin, D., Svenet, T., Richomme, P., & Bruneton, J. (2001) J. Nat. Prod. 64: 563-8. 13. Dharmaratne, H. R. W., Tan, G.T., Marasinghe, G.P.K., & Pezzuto, J.M. (2001) Planta Med. 68: 86-7. 14. Sakagami, Y., Kajimura, K., Wijesinghe, W.M. N.M., & Dharmaratne, H.R.W. (2002) Planta Med. 68: 541-3. 15. Sartori, N.T., Canapelle, D., De Sousa Jr, P.T., & Martins, D.T.O. (1999) J. Ethnopharmacol. 67: 149-56. 16. Da Silva, K.L., Dos Santos, A.R.S., Mattos, P.E.O., Yunes, R.A., Delle-Monache, F., & Cechinel-Filho, V. (2001) Therapie 56: 431-4.

17. Gasparotto Junior, A. (2003) Estudo botnico fitoqumico e avaliao da atividade moluscicida da espcie vegetal Calophyllum brasiliense (Camb.)-Clusiaceae, Departamento de Farmcia e Farmacologia /Universidade Estadual de Maring, Maring, Dissertao de mestrado, pgs. 118. 18. Oliveira, F. de, K. Akisue & M.K. Akisue (1998) Farmacognosia, Ed. Atheneu, pgs. 412. 19. Johansen, D.A. (1940) Plant microtechnique, McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, pgs. 523. 20. Sass, J.E. (1951) Botanical microtechnique, State Coll. Press. Ames, Iwoa, 2 ed., pgs. 228. 21. Rawlins, T.E. & W.N. Takahashi (1952) Technics of plant histochemistry and virology, The National Press, Millbrae, pgs. 238. 22. Berlyn, G.P. & J.P. Miksche (1976) Botanical microtechnique and cytochemistry, The Yowa State University, Ames (Iwoa), pgs. 331. 23. Costa, A.F. (1972) Farmacognosia (Farmacognosia Experimental), Fundao Calouste Gulbenkian, Lisboa, Vol. III, pgs. 823. 24. Jensen, W.A. (1962) Botanical histochemistry: principles and pratics, San Francisco: W.H.Feeman, pgs. 408. 25. Metcalfe, C.R. & L. Chalk (1957) Anatomy of the Dicotyledons - leaves, stem, and wood in relation to taxonomy with notes on economic uses, Clarendon Press, Oxford, Vol. 1, pgs. 724. 26. Metcalfe, C.R. (1983) Secreted mineral substances, In: Metcalfe, C.R. & Chalk, L. Anatomy of the dicotyledons, Clarendon Press, Oxford, Vol. 1, pgs. 82-97.

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