TECNICAS GENERALES EN MICROBIOLOGIA

Mecanismos de la Fermentacin Alcohlica

Jose Mara Xandri Taguea

vinificatum.blogspot.com

Mecanismos de La Fermentacin Alcohlica

La fermentacin alcohlica, observada desde los tiempos bblicos, ha ejercido una natural fascinacin sobre todos los que se han preocupado de los fenmenos naturales, hasta el punto d.: que en ella, en su estudio, se encuentran los verdaderos orgenes de la Microbiologa. Prescindiendo de las ideas confusas y fantsticas de los alquimistas sobre la fermentacin y de los tanteos de los qumicos posteriores, podemos decir que Lavoisier fu el primero que estableci un esquema qumico del fenmeno, haciendo un balance de sus productos. Thenard, Fabroni, Gay Lussac, ~chawan y Cagniard-Latour, entre otros muchos se preocupan de las causas ntimas de la fermentacin, insinuando los dos ltimos la intervencin de corpsculos ( clulas) organizadas. Pero culmina el inters de los numerossimas trabajos sobre la fermentacin con la oposicin de las tesis sostenidas por Liebig y Pasteur, sosteniendo el primero la existencia de una causa qumica, la accin de una sustancia que llamaba fermento, producida por el contacto del aire con los lquidos azcarados, mientras que Pasteur descubra la verdadera causa microbiana, de la fermentacin lctica y aplicaba los mismos mtodos de trabajo al descubrimiento, logrado plenamente, de la levadura alcohlica. Establece tambin Pasteur la ecuacin de la fermentacin alcohlica y determina que, adems de la produccin de alcohol y gas carbnico, a partir del azcar, se origina la del cido succnico, alcoholes superiores ( fusel ) glicerina y cido actico,

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suponiendo a estas sustancias derivadas de la misma fermentacin, hasta el punto deque en algunos trabajos posteriores se ha indicado la ecuacin de la fermentacin incluyendo en ellas stas ltimas sustancias como "productos secundarios". No pretendiendo hacer historia de los estudios sobre la fermentacin (

*)

citaremos solo como transcendental el descubrimiento de la zymasa o diastasa de la fermentacin alcohlica por Buchner ( 1897 ), que logr producir la fermentacin sin intervencin de clulas, con el jugo de levadura, abriendo un nuevo camino a lasinterpretaciones del mecanismo de la fermentacin. No han cesado despus los trabajos para el esclarecimiento de los numerosos e interesantes problemas que la fermentacin suscita y muy modernamente aparecen con menor oscuridad algunos de ellos, tales como el verdadero origen de los pretendidos productos secundarios, mecanismo qumico de la fermentacin, multiplicacin de enzimas contenidos en la llamada zymasa alcohlica, vemos que en la ecuacin de la misma C6H1206 = 2C2HS(Ol-l)

2 . C02, aparecen como produc(Si partimos de disacaridos, por -

tos finales el alcohol etlico, y el gas carbnico.

ejemplo, de la sacarosa, que es invertida por algunas levaduras:

Pero aparte de que en las fermentaciones con presencia de clulas ( levadu-

ras) vivas nunca se realiza de un modo exacto, cuantitativamente, esta ecuacin, exis--

ten muchas razones tericas y prcticas para afirmar que no es posible que la reaccin de la fermentacin sea tan sencilla y que, por el contrario, ella expresa solo los estados inicial y final, debiendo existir productos intermedios entre el azcar y el alcohol y gas carbnico. Efectivamente de la consideracin de la frumula de un monosacarido se deduce que no puede escindirse sencillamente en alcohol y gas carbnico, razn terica a la que se unen muchas otras de caracter experimental; si ponemos a fermentar jugo azucarado y determinamos frecuente y peridicamente el azcar y el alcohol veremos que al principio el rendimiento en alcohol por gramo de azcar desaparecido es muy pequeo, va creciendo a medida que avanza la fermentacin y es al -

( *) Puede encontrarse un interesante resumen de esta historia en "La fermentacin

alcohlica" de Arthur Harden - 1913, por ejemplo.

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final tan grande que supera el rendimiento terico, lo que no es explicable sin formacin de sustancias intermedias, ni an en los casos de fermentaciones en presencia de levadura, viva, en la que parte del azcar al principio desaparecido se emplea como alimento de la clula, pues un riguroso balance de pesos de levadura, azcar y gas carbnico nos demostrara que no se trata solamente de fenmenos nutritivos, y adems, seran de dificil aplicacin los rendimientos mximos del final de la fermentacin: en apoyo de la necesaria formacin de productos intermedios debe citarse el hecho de que las mismas discrepancias en los rendimientos se observan en las fermentaciones sin presencia de clulas vivas, provocadas por jugos de levaduras o productos enzimticos, como demuestra numerosas experiencias, entre ellas las de Lebedeff, reunidas en el grfico de la figura.

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Marcha de la desaparicin del azcar en una fermentacin por jugo de levadura ( B ) segn dosado directo del azcar y ( A ) segn clculo por el C02 formado. As pues, la desaparicin del azcar y la produccin de los productos finales C02 y CH3 - CH20H son fenmenos no correlativos, sin dependencia inmediata y directa y hay que suponer que en los lquidos que fermentan hay algo que no es ya azcar y no es todava alcohol ni gas carbnico. Tampoco puede comprobarse la constancia de la relacin azcar/C02 en el transcurso de la fermentacin, pues sta relacin es al principio mayor, mientras que

al final es menor, lo que constituye otro argumento a favor de la existencia de los productos intermedios.

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Han sido muchas la hiptesis propuestas para explicar el mecanismo de la fermentacin, correspondiendo a la hiptesis de Buchner, fundandose en el hecho de que el cido lctico est presente en todos los lquidos fermentados por levadura viva, que ste cido pudiera ser un trnsito entre las fases incial y final conforme al siguiente esquema:

eH20H
1

eOOH H -

eOOH
I

H - e - OH
H -

eI

OH

H - e - OH = eo 2
I

eH3 . eH20H

OH H -

eI eI eI

OH - - - - . . .
H

eH2 eo

I
I
I

---P. eH3
eOOH
I

OH

H -

eeH3

OH

H - e - OH
I

e02

+ eH3

. eH20H

eHO

eH3 2 cido lctico

cido hipottico cido dioxicetnico

o sea que la glucosa pasa por deshidratacin a un cido ( hipottico) dioxicetnico y ste se escinde en dos molculas de cido lctico, cada una de las cuales, a su vez ,se descompone en alcohol y gas carbnico. Esta hiptesis no tiene ya valor alguno, sino es histrico, pues ninguna levadura fermenta el cido lctico, ni este cido aparece en las fermentaciones con jugos enzimticos ( enzima, jugo de levadura ... etc. ).
Otra~serie de hiptesis, entre ellas las de Kostyschew, Lebedeff, ete., supo-

nen precisa la escisin de la glucosa en cuerpos de tres tomos de carbono, a partir de las cuales y por accin de reductasas ( enzimas reductoras ) y carhoxilasa ( enzimas que separan el e02 del grupo carboxilo ) se forman el e02 y el alcohol, pasando para la formacin de este ltimo por el aldehido actico. Pero ms modernamente, los estudios de Baeyer y Neuberg, entre otros, comprueban el punto de vista anterior, pero completan y rectifican otros de los autores de las anteriores hiptesis, llegando a formular mecanismos de la fermentacin alcohlica que pueden admitirse como casi demostrados en todas sus partes. Una primera forma que pudieramos llamar normal de la fermentacin alcohlica es la siguiente:

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CHO
I

CHO
I

CHOH
i

CHOH
I

CHOH
I

CH
II

CHOH
I

Menos dos melculas de H20

~

C (OH)
I

CHOH
I

C (OH)
11

CH20H

CH2

Glucosa

- - - - - . . metilgliosalaldol

CHO
I I

CHOH CH
I

CHO
= 2.

C (OH), forma enlica del aldehido pirvico CH3-CO - ~

11

/H

C(OH)
!

CH2

llamado metilgliosal.

C(OH)
11

CH2 metilgliosalaldol

3.- Ahora estas dos molculas del metilgliosal sufren con una molcula de agua la reaccin efe xido-reduccin llamada reaccin Cannizzaro. Forma enlica CH2 = C (OH) - C~o
H

Forma no enlica

H2

CH2 = C (OH) -CH20 ----. CH3-CO-CH20H

=

+
CH2 = C (OH) - C~O

acetal CH2 = C (OH) - COOH _ cido pirvico

acetal CH3 - CO - COOH cido pirvico

... H

4.- El aceta! CH2 lizante puede dar glicerina

= C (OH) -

CH20H por la accin de un enzima hidro-

CH20H - CHOH - CH20H glicerina

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SQ.- El cido pirvico por descarboxilacin dar aldehido etlico y gas carbnico CH2

= C(OH) -

COOH

CH3 - CO - COOH aldehido etlico

69.- El aldehido etlico por la accin de una reductasa dar alcohol.

aldehido etlico

alcohol

o bien en mezcla equimolecular con el aldehido pirvico derivado del metilgliosal por simple transmutacin intermolecular.

CH2

= C(OH) -

""'o C ....
H

__ H

= CH3

- CO - C

""O

sufrir una reaccin Ca-

nnizzaro dando alcohol etlico y cido pirvico que entrar en la reaccin [1 ]

__ H
CH3 - CO - C
~O

CH3 - Co - COOH cido pirvico

(for. no enlica) c. pirvico CH3 - C~ aldehido etlico

.... H
alcohol

""'o

2a .- Forma de la fermentacin.- Neuberg demostr que si se impide la reduccin del aldehido ( reaccin [2 ] ) combinndolo con el anhdrido sulfuroso, con formacin del sulfito-aldehido, menos reducible, se aumentaba la proporcin de glicerina, que se obtel\a ( a partir de una solucin de glucosa, adicionada de sulfito sdico en proporcin elevada para que no impida la fermentacin ) en mezcla equimolecubr con el sulfito- aldehido, lo que constituye una demostracin notable de parte de las reacciones apuntadas, adems de ser conocimiento muy util para la industria enolgica en la que se emplea mucho el gas sulfuroso para sulfitar los mostos.

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Forma Enlica.- Forma tautmera de diversos compuestos orgnicos, caracterizada por la existencia de la agrupacin atmica. CH 11

transformable en

CH2 I

C (OH) -

CO -

As, el ter acetacetico se presenta en forma enlica y en forma quetllica. CH - Co .OC2HS

11

CH2 - Co . OC3HS

I
CO - CH3 forma quetnica

C(OH)- CH3 forma enlica

Tautomera.- Forma especial de isomeria relativa a la existencia de ismeros que representan en solucin y en algunas reacciones, mientras que en estado slido solo se conocen en una forma. Estos ismeros se llaman tautmeros.

3 a.- Forma de la fermentacin.- En presencia de sales alcalinas como el fosfato, carbonato o borato de sodio, la fermentacin alcohlica se presenta tambin en forma diferente, con produccin de cido actico ( producto normal en toda fermentacin alcohlica industrial ), a causa del siguiente mecanismo. . ~O CH3 - C

'H

CH3 - CH20H

CH3 -C

-.:::"'0

alcohol etlico CH3 - COOH cido actico

'H

aldehido etlico

En estas fermentaciones en presencia de sales alcalinas aumenta la produccin de glicerina en tales proporciones que la aplicacin del gas sulfuroso y las sales alcalinas han permitido aplicar en Alemania y Austria, durante la la guerra mundial, la fermentacin alcohlica de soluciones de glucosa a la produccin industrial de glicerina para la fabricacin de explosivos. En las fermentaciones industriales predomina la primera forma de fermentacin cuyos estados inicial y final pueden resumirse en el esquema clsico. Glucosa = alcohol

+ gas

carbnico, pero en mnima parte y segn las condiciones -

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de los mostos pueden realizarse las reacciones de la 2 a y 3 a forma. Son numerosas las pruebas experimentales sobre algunas fases del mecanismo de la fermentacin que acabamos de indicar. Se conoce desde hace mucho tiempo el hecho de que en todas las fermentaciones alcohlicas se producen glicerinas y acetaldehidos tambin ha sido demostrado el notable poder reductor de ciertos enzimas producidos por las levaduras. En lquidos sintticos a base de azcar y materias Apenasmin<:r ates se ha podido demostrar la existencia de cido pirvico y finalmente este cido es fcilmente fermentado por las levaduras producentes de alcohol. tilgliosal y esto parece haber sido demostrado recientemente. Con estos hechos experimentales se ha hecho mucha luz sobre el mecanismo de la fermentacin alcohlica, pero, como es lgico, an quedan muchos puntos oscuros. alcohlica. Uno de ellos es la accin catalizadora de los fosfatos sobre la fermentacin En efecto, en las fermentaciones con levadura viva es prcticamente imquedaba por aclararse otro punto que el que se refiere a la formacin previa del me-

posible privar al medio de P20S, pero empleando productos enzimticos ha sido factible el reducir las proporciones de los fosfatos a valores extraordinariamente pequeos, habiendo observado hace ya bastantes aos Harden y Young que en tales condiciones la fermentacin era lentsima, respondiendo con una enorme activacin a la adicin de fosfatos de modo casi proporcional a la cantidad aadida a menos para las dosis pequesimas a partir de las cuales esta actividad no es ya tan sensible. Aislaron tambin estos autores ( ver A. Harden - La fermentacin alcohlica - 1913 ) un compuesto en el que figura la glucosa unida a radicales fosfricos, hechos experimentales que les indujeron a formular la siguiente hiptesis:

+
azcar

2. P04HR2 = 2C02

+ 2C2HS(OH) + 2 f-I2 0 + C6 H 100 4 ( P0 4 R 2) 2

~
. . . . . . J

fosfato bibsico

alcohol

Producto hiptetico que denominamos exosadifosfato

~'------ ~-------./ ............

triosofosfato Formada la exosadifosfato se descompondra en un segundo tiempo del siguiente modo:

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2C6Hl004 (P04R2)2

2H20

C6H1206

2P04R2H.

fosfato bibsico continuando la reaccin primera indefinidamente sin precisar ms que una mnima cantidad de fosfatos, que como se ve, se regenerarn constantemente. Sin prejuzgar la constitucin del compuesto azcar-fosfato, que algunos consideran como triosofosfato C3HS02 (P04R2) podemos decir que no se opone absolutamente la hiptesis de Harden y Y oung a los conocimientos ms recientes, y que quizs sea posible encontrar esquemas que los hagan compatibles. Nos ha parecido util esta explicacin de las ideas actuales sobre la ferme-ntacn alcohlica, por el enorme inters de ella, en la prctica, y porque constituyen un notable ejemplo de la complicacin que entraan todos los fenmenos fermentativos, aunque para ninguno se hayan realizado estudios tan completos. Hiptesis sobre el significado biolgico de la fermentacin alcohlica.- Existen dos hiptesis, energtica y biolgica del significado de finalidad de la fermentacin. Una tercera hiptesis intermedia ha sido propuesta, basndose en que algunos blastomicetos no atacan al alcohol en anaerobiosis, pero en condicones de aerobiosis es en parte oxidado, dando C02 y "20, Y en parte es utilizado como alimento carbonado. Algunos aventuran la suposicin de que la descomposicin de los azcares no se. detienen en el trmino alcohol, sino que avanza hasta el aldehido frmico antes de ser utilizado. Acaso el producto oxidado para ser utilizado no sea el alcohol, sino Tal es la teora energticauno de los intermedios hipotticos en la fermentacin.

-plstica cuyos fundamentos son escassimos, pues si bien es cierto el hecho arriba apuntado, de que algunos blastomicetos pueden tomar su alimento carbonado del alcohol y an del aldehido frmico, la mayora de los microorganismos, entre ellos las levaduras, no poseen tales actividades y aptitudes y no pueden utilizar ni el alcohol ni el aldehido frmico, ni oxidarlos en aerobiosis. Esta hiptesis es solo una suposicin para aproximar las hiptesis de asimilacin del carbono en los blastomicetos y las plantas superiores y no merece ms detenido examen. Unicamente sern interesantes estudios ulteriores acerca de la posible utilizacin por las levaduras de los productos intermedios (hipotticos) de la fermentacin, habiendo autores que aventuran la idea de que un producto comn inter-

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medio de oxidacin respiratorio y de la descomposicin fermentativa de los azcares, pudiendo ser la dioxiacetona. La hiptesis biolgica acerca del significado de la fermentacin tiene en este caso a su favor el hecho del rpido predominio de los sacaromicetos sobre todos los dems microorganismos, numerossimos, existentes en los mostos naturales, desde que se inicia la produccin de alcohol.

Saccharomyces Ellipsoideus, aultivo esporificado. Aumento, aprox. 1.500 ( S. Castelli)

Cultivo esporificado de Saccharomyces Bayanus; aumento 1.500 (S. Castelli).

Jaccharomyces ltalicus: esporificacin. Aumento aprox. 1.500 ( S. Castelli ).

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