CAPITOLUL 4 NOIUNI DE INGINERIE GENETIC

Moto: E adevrat c misterul, nu este comod, te nelinitete. Dar dac misterul ar fi absent, nelinitea metafizic a cunoaterii ar disprea i omul ar deveni mineral. Petre uea

Aprofundarea cunotinelor de genetic molecular, cunoaterea structurii fine a genelor i a cromozomilor, a deschis noi posibiliti de izolare i sintez a genelor, de transfer de la o specie la alta, uneori chiar ndeprtate filogenetic, de cultur in vitro a celulelor i de hibridare a acestora. Ingineria genetic poate fi definit ca un ansamblu de metode i tehnici moderne prin care este posibil manipularea materialului genetic la nivel celular i molecular. La nivel celular, ingineria genetic a nsemnat extinderea hibridrilor celulare n afara granielor determinate de specie, obinndu-se hibrizi celulari ntre diferite specii de procariote i eucariote, ntre celule vegetale i animale. La nivel molecular, ingineria genetic a nsemnat izolarea genei, sinteza artificial a genei, realizarea ADN recombinat i transferul de gene de la o specie la alta. n sens strict, ingineria genetic const n crearea de ADN hibrid sau ADN recombinat, derivat de la dou specii diferite, integrarea i clonarea acestuia ntr-o celul bacterian, unde poate funciona normal, realizndu-se n felul acesta transferul de gene, nu pe cale sexuat, ci pe baza ADN recombinat. n felul acesta se deschide calea transformrii dirijate a ereditii organismelor la nivel molecular, acionndu-se direct asupra bazei moleculare a ereditii. n sens mai larg, tot ingineriei genetice i aparin i tehnicile de modificare a structurii i numrului cromozomilor prin mutaii, putndu-se transfera fie cromozomi ntregi de la o specie la alta, fie segmente de cromozomi, domeniu al ingineriei genetice denumit chirurgie cromozomic. n acest domeniu, de remarcat sunt rezultatele obinute de J. G. O'Mara (1940), care a reuit s combine caracterele a dou specii prin transferul unuia sau a ctorva cromozomi de la diferite specii. S-a reuit transferul unor cromozomi n cadrul unor hibridri intergenerice, gru x secar sau gru x pir, transferndu-se gene ce confer rezistena la rugina galben i neagr de la secar i respectiv pir, la gru. Primul transfer de gene a fost realizat n 1928 de ctre E. Griffith, prin experienele de transformare genetic, urmat de transferul de gene cu ajutorul unui ADN purificat, realizat n 1944 de O. T. Avery i colaboratorii, cu o eficien mult mai mare.
102

Din multitudinea de aspecte ale ingineriei genetice, vor fi prezentate aspecte privind sinteza artificial a genei, hibridarea celular la animale i plante, haploidia prin androgenez, importana cercetrilor de inginerie genetic.

4.1. SINTEZA ARTIFICIAL A GENEI

Sinteza artificial a genelor a fost precedat de o alt mare realizare i anume sinteza artificial a ADN de la virusul x174 de ctre Arthur Kornberg, laureat al premiului Nobel (1959) fiind descris n capitolul anterior. H. G. Khorana, genetician american de origine indian, mpreun cu o echip de cercettori din Massachusetts, a realizat n 1970, prima sintez artificial a unei gene i anume gena ce determin sinteza unui ARNs ce transport aminoacidul alanina la nivelul ribozomilor, la Saccharomyces cerevisiae. Aceast gen este destul de mic, format din 77 nucleotide, iar tehnica folosit a fost urmtoarea: s-au sintetizat pe cale chimic, segmente de ADN formate din 10-14 nucleotide. Cu ajutorul enzimei ligaza s-au asamblat aceste segmente rezultnd segmente bicatenare mai lungi. S-au obinut 3 segmente mai lungi cu ajutorul enzimei polinucleotid-kinaza, care au fost legate ntre ele rezultnd segmentul de ADN, corespunztor genei ARNs ce transport aminoacidul alanina la ribozomi. Aceast gen nu era funcional biologic. n anul 1973, geneticianul D. Agarwal, a sintetizat artificial o gen de la bacteria E.coli, ce determin sinteza ARNs ce transport aminoacidul tirozina la ribozomi. Aceast gen s-a dovedit a fi funcional biologic. n anul 1975 geneticianul A. Efstradiatis i echipa sa de la Universitatea Harvard, au sintetizat artificial genele ce intervin n sinteza hemoglobinei la iepure, fiind prima sintez artificial a unei gene de la mamifere. n anul 1976 H. Kster, a sintetizat gena pentru hormonul angiotensina, care regleaz tensiunea arterial i contracia muscular la om, fiind prima gen uman sintetizat artificial. n ultimii ani s-au sintetizat artificial genele ce determin sinteza hormonului de cretere, somatostatina i a insulinei. n prezent tehnica de sintez artificial a genei utilizeaz ARNm, care cu ajutorul enzimei reverstranscriptaza, determin sinteza de ADN complementar i deci de gene. Sinteza artificial a genelor prezint o importan deosebit. Dac genele sunt inserate n virusuri sau plasmide, acestea le pot transfera n celulele bacteriene. Celulele bacteriene vor putea sintetiza o serie de enzime, hormoni, antibiotice i, deoarece bacteriile se pot crete uor, va fi o cale foarte eficient de producere a acestor substane. Genele sintetizate artificial vor putea fi integrate n cromozomii celulelor, n locul genelor cu defecte, combtndu-se astfel, cauza unor maladii ereditare i nu efectul lor.

103

4.2. IZOLAREA GENEI

A fost efectuat pentru prima dat de J. Beckwith de la Universitatea Harvard din SUA, n anul 1969. Izolarea primei gene s-a realizat la bacteria E.coli, cu ajutorul fenomenelor de transducie specializat i sex-ducie. Mai nti s-a izolat ntregul operon lac. Genele care constituie acest operon sunt: genele structurale (z, a i y), gena reglatoare (i), promotorul (p) i operatorul (o). Prin cartarea acestui operon s-a stabilit c ordinea acestor gene n operon este: a y z o p i. Etapele mai importante ale izolrii genei lac sunt redate n fig.4.1. n prima etap prin transducie specializat fagul s-a detaat de cromozomul bacteriei alturi de gena gal, iar alturi de acesta s-a ataat un factor de fertilitate F ce coninea gene ale operonului lac. n etapa a doua, operonul lac a fost inserat n cromozomul bacteriei, n mijlocul genei gal, iar fagul ntr-o regiune alturat, dar separat printr-un segment din cromozom. n cea de a treia etap s-au separat bacteriile la care s-a pierdut segmentul dintre gena lac i fagul astfel c fagul este plasat adiacent genei lac. Fagul capt mai nti o form circular, avnd inclus i operonul lac (etapa 5), iar n ultima etap prin iradieri cu raze U.V. fagul s-a eliberat de cromozomul bacterian, i-a recptat forma linear avnd inclus n interiorul su operonul lac.

Fig.4.1. Etapele izolrii operonului lac la bacteria Escherichia coli

104

Operaiile descrise mai sus s-au efectuat i cu un alt fag, 80, ce realizeaz transducia specializat. ADN al fiecrui fag are o caten cu o greutate molecular mai mare (caten grea) i o caten cu o greutate molecular mai mic (caten uoar). Prin denaturare, catenele fagilor s-au izolat una de alta, iar prin ultracentrifugare s-au separat catenele grele de cele uoare. Catenele grele s-au pus mpreun i prin procesul de renaturare, ntre ele, se refac legturile de hidrogen, dar numai n zona operonului lac, acolo unde cele dou catene au nucleotide complementare, n rest catenele rmn distanate. Cu ajutorul enzimelor ce hidrolizeaz ADN monocatenar, s-au eliminat catenele libere, rmnnd doar operonul lac, bicatenar. Izolarea genelor a avut o importan deosebit pentru c a deschis calea spre studiul aprofundat al materialului genetic in vitro, dar mai ales spre transferul de gene de la un organism la altul.

4.3.TRANSFERUL DE GENE (TRANSGENEZA)

n natur se realizeaz pe mai multe ci: la organismele superioare, n procesul de fecundare sau prin transducie cu ajutorul virusurilor, iar la organismele inferioare (procariote) transferul de gene se realizeaz prin intermediul fenomenelor de transformare, conjugare, sex-ducie i transducie. Transferul de gene ntre speciile ndeprtate filogenetic are la baz tehnica ADN recombinat, care const n realizarea de hibrizi moleculari ADN, ce provin de la cele dou specii. Perfecionarea tehnicii ADN recombinat nu a fost posibil dect dup descoperirea unor enzime care rup molecula de ADN n anumite puncte, denumite endonucleaze de restricie (restrictaze) i a ADN-ligazelor care resudeaz molecula de ADN, n vederea realizrii de ADN hibrid. Enzimele de restricie se gsesc n numr foarte mare, fiecare fiind specific unei anumite secvene de nucleotide, deci unei gene. Recunoscnd secvena specific, restrictazele determin tieturi la nivelul ambelor catene de ADN, fragmentnd molecula. Restrictazele constituie adevrate bisturie biologice, cu ajutorul crora se poate desprinde din molecula de ADN, o gen ce urmeaz a fi transferat. Genele ce trebuiesc transferate pot fi sintetizate in vitro. n realizarea transferului interspecific al genelor, prima problem ce trebuie rezolvat este izolarea unei gene, prin una din tehnicile descrise i gsirea unui vector sau vehicul. Rolul de vehicul l poate avea att ADN plasmidial, ct i ADN al unor virusuri cum ar fi, , SV40. n general vehiculele sunt molecule de ADN circular. n anul 1973, A. Chang i S. Cohen, au reuit s obin plasmide hibride care conineau genele de la dou bacterii i anume gena pentru rezistena la tetraciclin, de la E. coli i gena pentru rezistena la penicilin de la Staphylococcus aureus.
105

O alt cale prin care se realizeaz transferul de gene este folosirea ca vectori a virusurilor temperate, care la un moment dat se gsesc integrate n cromozomul bacterian, sub form de profagi. La un moment dat, profagii se elibereaz din cromozomul bacterian i produc liza bacteriei. n acest caz, bacteriofagii pot lua o gen din cromozomul bacteriei i la o nou infecie o pot transfera ntr-o alt bacterie. n anul 1971, geneticianul C. Merril a reuit s transfere gena ce rspunde de metabolizarea galactozei de la bacteria E. coli n celulele umane. Pentru realizarea acestui transfer s-a procedat astfel: bacteriile E .coli au fost infectate cu bacteriofagul , care se inser adiacent genei gal din cromozomul bacterian. Se provoac liza bacteriei i se vor elibera fagi care posed gena gal. Aceti fagi recombinai au fost introdui ntr-o cultur de celule umane, ce proveneau de la un individ ce prezenta maladia ereditar galactosemia (lipsa genei ce determin enzima necesar metabolizrii galactozei, n glucoz). Dup un timp s-a constatat c celulele umane au nceput s metabolizeze galactoza. Se poate spune c bacteriofagii se comport n mod similar cu plasmidele, putnd ncorpora n cromozom gene strine, pe care le poate transfera n alte celule pe care le infecteaz. Aceste transferuri de gene deschid mari perspective mai ales n cazul transferului de gene de la plante sau animale n celulele bacteriene, care ar putea s produc pe medii relativ simple, mari cantiti de enzime, hormoni, proteine, de care are nevoie omenirea. n acest sens se poate meniona transferul genei ce determin sinteza ovalbuminei, protein din oul de gin, la E. coli K12 (). S-a izolat mai nti ARNm ce codific ovalbumina din ovocitul ginilor. Folosind fenomenul de complementaritate s-a sintetizat ADN, respectiv gena ovalbuminei care a fost inclus apoi ntr-un plasmid recombinat, care prin fenomenul de conjugare a fost transferat n celula bacterian. n urma acestui transfer, celulele bacteriene au nceput s produc ntre 30000-90000 molecule de ovalbumin, ceea ce reprezint n jur de 0,5-1% din cantitatea total de proteine a bacteriei. A. Riggs (citat de P. Raicu, 1980) a reuit s transfere gena ce determin sinteza insulinei umane n pancreas, la o bacterie care a nceput s sintetizeze insulina. Insulina uman este format din dou catene polipeptidice alctuite din 21 i 30 de aminoacizi. n experiena amintit A. Riggs a folosit o gen sintetizat artificial. n anul 1977 s-a reuit s se transfere gena ce determin sinteza hormonului de cretere somatostatina, produs de hipotalamus, pancreas, stomac i intestine, din celulele umane n celulele bacteriene care au nceput s sintetizeze acest hormon. O alt realizare a ingineriei genetice este transferul genelor ce determin sinteza interferonului din celulele umane n celula bacteriei E.coli. Interferonul este o protein cu rol antiviral i este produs de leucocitele umane din snge. Cercetrile Institutului de Oncologie i Imunogenetic din Villejuif arat c interferonul este capabil s vindece oarecii bolnavi de diferite tipuri de cancer, ce nu preau induse de virusuri, c aceast substan stimuleaz
106

globulele albe, denumite NK (natural killers - celule ucigae), o linie de aprare mpotriva celulelor canceroase. Producerea interferonului prin infectarea leucocitelor cu virusuri, pentru a stimula fabricarea de interferon, era foarte scump i se obineau cantiti infime de substan. La nceputul anului 1980, Charles Weismann de la Institutul de biologie molecular din Zurich, a realizat sinteza interferonului, cu ajutorul bacteriei E. coli. Astzi se tie c interferonul are urmtoarele funcii: inhib creterea celulelor n general, regleaz activitile imunitare, mrete activitatea celulelor albe (ce recunosc i distrug celulele tumorale), stimuleaz celulele macrofage ce distrug virusurile, bacteriile i alte particule. Se poate spune c interferonul este un mediator celular, deoarece acioneaz ca un activator al celulelor specializate n distrugerea virusurilor i a celulelor canceroase i nu un antibiotic antiviral. Transgeneza, transferul de gene sau fragmente de ADN de la un organism (donor) la altul (receptor) se poate realiza fie prin metoda direct (introducerea moleculei de ADN n celule receptor), fie prin metode indirecte (ADN este introdus n receptor printr-un vector). Prin metoda direct, ADN exogen poate fi transferat n celule gazd prin mai multe tehnici: endocitoz, electroporare, microinjecie, macroinjecie i biolistic (Butnaru Gallia, 1999). Endocitoza presupune obinerea mai nti a protoplatilor, celule vegetale crora li s-a ndeprtat peretele celular rigid, pectocelulozic, cu ajutorul enzimelor (pectinaza, celulaza) sau pe cale mecanic. ADN transformant este adsorbit la suprafaa celulelor receptoare, iar apoi este inclus n celule. Aceast metod presupune protejarea moleculei de ADN prin includerea sa n lipozomi, prin tratare cu polietilenglicol i fosfat de calciu i existena a mai multor molecule de ADN transformant pentru ca transferul s se realizeze cu o frecven ct mai mare. Electroporarea const n transferul moleculelor de ADN n protoplati cu ajutorul unor impulsuri electrice de scurt durat sau cu ajutorul razelor laser (porare laser). Se apreciaz c eficiena transformrii genetice este destul de mic fiind dependent de greutatea molecular a ADN, concentraia polietilenglicolului, durata i intensitatea impulsului electric, starea fiziologic a celulei receptor (Butnaru Gallia, 1999). Microinjecia este o metod mult mai precis, deoarece o molecul cunoscut (ADN, ARN, proteine) se introduce cu o microsering din sticl montat pe un micromanipulator, ntr-un receptor (protoplast, celul animal), fixat pe o lam de sticl, n gel de agaroz. Metodele biolistice constau n introducerea unui ADN exogen ntr-un receptor prin intermediul aa numitului tun de particule sau cu ajutorul arcului electric. Cu ajutorul tunului de particule, microparticule de aur sau tungsten asociate cu molecule de ADN donor sunt direcionate ntr-o celul sau grup de
107

celule. Celulele sau esuturile bombardate cu aceste microparticule, crescute pe un mediu de cultur vor regenera plante, transformate genetic. Transgeneza indirect presupune izolarea unui segment de ADN (o gen), clonarea genei respective i transferul ntr-o celul receptor prin intermediul unui vector (Butnaru Gallia, 1999). Gena ce trebuie transferat a primit denumirea de pasager; de obicei pasagerul, ptruns ntr-o celul receptor este degradat de sistemul enzimatic al acesteia. Pentru a evita aceast degradare, gena (pasagerul) se asociaz cu un vector, iar mpreun constituie o macromolecul complex, de ADN recombinant. Izolarea ADN de la diferite organisme procariote sau eucariote se realizeaz prin diferite metode fizico-chimice (centrifugare, tratare cu diferite enzime etc.). Deoarece fragmentul de ADN izolat poate conine mai multe gene este necesar fragmentarea acestuia, pentru izolarea genei (pasagerului) ce trebuie transferat. Pentru izolarea unei gene de interes se folosete ARNm al genei respective, care n prezena reverstranscriptazei se va transforma ntr-o molecul de ADN complementar (ADN-c) monocatenar. n prezena ADN-polimerazei I, ADN-c i va sintetiza catena complementar, devenind ADN bicatenar, care va avea nscris informaia nucleotidic din ARNm. Genele ce urmeaz a fi transferate nu vor fi funcionale dac nu au ataate promotorul, intensificator sau atenuator ai transcripiei informaiei genetice, care intr n structura genelor i regleaz activitatea acestora. n procesul de transgenez sunt absolut necesare enzimele de restricie (endonucleaze de restricie), produse n mod natural de bacterii, cu rol imunitar, respectiv de a distruge moleculele de ADN exogen ce ptrund n acestea. Sunt cunoscute n prezent peste 500 de tipuri de endonucleaze de restricie care acioneaz ca nite bisturie moleculare, secionnd moleculele de ADN, n secvene scurte ntre dou baze azotate adiacente cunoscute (int). Cele mai cunoscute endonucleaze de restricie sunt: EcoR1 (izolat de la Escherichia coli), Hpa I (din Haemophilus parainfluenzae), Alu I (din Arthriobacter luteus) etc. Aceste enzime acioneaz asupra unor secvene de nucleotide constituite din 4, 5 sau 6 nucleotide, fie pe axul de simetrie al acestora sau de o parte i de alta a acestuia. Astfel, EcoR1 secioneaz ADN n secven hexanucleotidic 5GAATTC-3 ntre nucleotidele G i A, pe ambele catene ale moleculei, n timp ce Alu I acioneaz la nivelul tetranucleotidului 5-AGCT-3 ntre nucleotidele A i G (Crlan M., 1996). Fiecare enzim are un mod particular, unic, de aciune, de aceia sunt nelipsite n operaiunile de fragmentare a moleculelor de ADN. Transgeneza necesit folosirea unui alt grup de enzime i anume ADNligazele, care leag fragmentele de ADN ce trebuie transferat, de ADN al unui vector. Trebuie avut n vedere i receptorul n care trebuie transferat ADN exogen, care poate fi o bacterie, o celul vegetal sau animal. ntre receptor i vector trebuie s fie o compatibilitate perfect, aa nct, un vector este funcional numai la un anumit receptor.
108

4.3.1. Principalii vectori utilizai n transgenez

Vectorii sunt molecule mici de ADN ce ncorporeaz genele ce trebuie transferate (pasagerul). Vectorii trebuie s aib capacitatea de a ptrunde ntr-o celul gazd, iar gena ce trebuie transferat s fie marcat genetic cu un marker specific, pentru a putea fi recunoscut. Ingineria genetic folosete un numr mare de vectori, funcie de pasager i de receptor. Plasmidele bacteriene, cromozomi miniaturali, care pot include gene strine sunt utilizate frecvent ca vectori: plasmida pBR322, plasmida pUC, plasmida Ti, plasmida Ri .a. Ca vectori pentru celulele vegetale, n vederea obinerii plantelor transgenice se folosesc plasmidele Ti (tumor inducing) de la Agrobacterium tumefaciens i Ri (root inducing) de la Agrobacterium rhizogenes. Mrimea plasmidelor, exprimat n kilobaze (1000 de perechi de baze) este n jurul a 200 kb i pot include i transfera segmente de ADN de 8-10 kb. Un alt grup de vectori l reprezint bacteriofagii. Fagul , care conine 48500 pb poate transfera secvene de ADN mai mari de 40 kb. Cosmidele sunt vectori hibrizi realizai ntre fagul i plasmide, combinnd nsuirile plasmidelor i a fagului, n sensul c sunt funcionale, exprimndu-se fenotipic, fr s se integreze n cromozomul celulelor gazd. Se folosesc frecvent pentru clonarea i transferul fragmentelor de ADN de la eucariote, fragmente de aproximativ 45 kb, care n mod normal nu pot fi incluse n fagul . Fagii monocatenari au ca material genetic o singur caten de ADN notat convenional cu (+). Aceast caten ptrunde n celula gazd, n momentul infeciei, constituind matricea pentru sinteza unei catene complementare, notat cu (-). mpreun cu catena (+) va forma o molecul bicatenar de ADN, care poate fi izolat i folosit pentru clonarea ADN. Exist i ali vectori, cum ar fi vectorii de expresie, a cror gene pot fi transcrise i translate n proteine, virusul SV 40 (Simian Virus 40), vectorii YAC (Yeast Artificial Chromosome) cromozomi artificiali ai drojdiei de bere, vectorii BAC (Bacterial Artificial Chromosome) etc.

4.3.2. Realizri ale transgenezei la plante

n ultimii ani s-au realizat plante transgenice, denumite i plante modificate genetic. Aa cum s-a specificat anterior, la plantele superioare se folosesc ca vectori ai genelor de interes plasmidele Ti de la Agrobacterium tumefaciens, care n mod natural dau natere la tumori i plasmidele Ri de la Agrobacterium rhizogenes, care dau natere la rdcini filiforme.
109

Plasmidele Ti, datorit regiunii denumite ADN-T funcioneaz ca transpozoni (elemente genetice mobile). Numai aceast regiune se integreaz n cromozomul celulei gazd. Bacteriile din genul Agrobacterium ofer singurul exemplu de inginerie genetic natural, deoarece n urma infeciei, bacteria transfer n nucleul celulei vegetale o mic poriune din ADN al plasmidei, care determin transformarea celulei infectate n celul tumoral. Prin eliminarea genelor tumorale (oncogenelor) i asocierea acestei plasmide dezarmate cu o plasmid ce conine gena de interes, clonat n bacteria Escherichia coli se obine un vector de transformare foarte eficient pentru dicotiledonate (n condiii naturale Agrobacterium nu atac monocotiledonatele). Indiferent de metoda de transfer, frecvena de integrare a genelor n genomul celulei vegetale este destul de redus. Din aceast cauz, genei de interes i este asociat o gen marker, care permite selecia celulelor transformate. Se folosesc frecvent ca gene marker, genele care confer rezisten la un antibiotic sau la un erbicid, care-i va permite celulei transformate s supravieuiasc pe un mediu de cultur ce posed antibioticul sau erbicidul. Cele mai importante plante transgenice aflate deja n cultur sunt soia Roundup Ready, tolerant la erbicidul total Roundup (care are ca principiu activ glifosat) i porumbul Bt, rezistent la atacul sfredelitorului (Ostrinia nubilalis), urmnd a se obine plante tolerante la doi sau mai muli factori (rezisten la un erbicid asociat cu rezistena la o insect, androsterilitate asociat cu rezistena la un erbicid etc.). O alt realizare a ingineriei genetice o constituie tomatele, la care s-a modificat procesul de coacere a fructelor, denumite Flavr Savr, fructele meninndu-i prospeimea timp ndelungat. n acest caz, s-a folosit tehnologia ARN antisens, blocndu-se sinteza uneia din enzimele ce degradeaz pereii celulari ai fructului sau a hormonului etilen (cel care accelereaz procesul de coacere, aceasta fiind ntrziat). O alt direcie a ingineriei genetice este transferul genelor nif de la plantele leguminoase la plantele cerealiere.

4.3.3. Transferul genelor fixatoare de azot

Plantele din familia Leguminoase (mazrea, fasolea, bobul, soia etc.) au capacitatea s fixeze N atmosferic cu ajutorul unor bacterii cu care triesc n simbioz. Bacteriile fixatoare de azot ptrund n esuturile rdcinilor, formnd aa numitele nodoziti, iar din aceast simbioz beneficiaz ambele specii: plantele obin azotul atmosferic iar bacteriile obin de la plante compuii organici de care au nevoie. Exist i alte plante, n afar de cele leguminoase, care triesc n simbioz cu bacterii fixatoare de azot: unele graminee (Digitaria), chiar unii arbori cum ar fi aninul (Alnus).

110

Azotul atmosferic poate fi fixat de unele bacterii din genurile: Rhizobium, Azotobacter, Desulfovibrio, Hydrogenomonas etc. sau de unele alge verzi-albastre. Mecanismul fixrii azotului atmosferic a fost descifrat n 1960, n laboratoarele Du Pont de Nemours (SUA). La bacteria Clostridium pasteurianum s-a izolat enzima nitrogenaza, care catalizeaz fixarea azotului atmosferic. Aceast enzim este format din dou molecule proteice, una cu greutate molecular mare (220.000 daltoni) i cealalt cu greutate molecular mic (55.000 daltoni). Molecula mare conine atomi de fier, sulf i molibden, iar molecula mic doar fier i sulf. Cele dou molecule sunt active mpreun i numai n absena oxigenului atmosferic. Protejarea moleculei de nitrogenaz mpotriva oxigenului atmosferic este asigurat de un pigment denumit leghemoglobin care se combin cu oxigenul i protejeaz astfel enzima. Sinteza enzimei nitrogenaza este determinat de un grup de gene notate cu nif care sunt localizate pe cromozom alturat de gena his, ce determin metabolismul histidinei. Se pare c este vorba de dou gene nif: una ce determin sinteza moleculei mari a nitrogenazei i alta ce determin sinteza moleculei mici. Transferul genelor nif de la bacteriile fixatoare de azot la altele nefixatoare se poate realiza pe cile cunoscute de recombinare la bacterii: transformare, conjugare, sex-ducie i transducie. Geneticianul R. Dixon de la Universitatea din Sussex (Anglia) a transferat genele nif i his de la bacteria F+ de Klebsiella pneumoniae, la bacteria F- de E. coli. Tot Dixon n 1974 a obinut un factor de fertilitate recombinat care includea n el i genele nif, denumite FN 68. Acest factor de fertilitate, introdus n mediul de cultur a unor bacterii incapabile s fixeze azotul atmosferic (ex. E.coli), a produs transformarea acestora n bacterii fixatoare de azot. Pentru transferul genelor nif se pot folosi ca vectori i bacteriofagii n procesul de transducie. S. Stroicher a folosit fagul P1 pentru transferul genelor nif. Transferul genelor nif de la o bacterie la alta a creat premisele realizrii unor simbioze a acestor bacterii nu numai cu leguminoasele, ci i cu alte plante care nu au capacitatea de a fixa azotul atmosferic. n viitor se preconizeaz transferul acestor gene nif n cromozomul plantelor sau n cromozomul cloroplastelor, situaie n care plantele nu ar mai avea nevoie de simbioze cu bacteriile, plantele fixndu-i direct azotul atmosferic.

4.4. HIBRIDAREA CELULAR LA ANIMALE

Hibridarea celular in vitro a fost realizat pentru prima dat n 1960 de cercettorul francez G. Barski. A cultivat pe un mediu artificial celule ce proveneau de la dou specii de oareci i a observat c unele celule au fuzionat rezultnd celule hibride, care nsumeaz cromozomii de la celulele iniiale i au nsuiri morfologice, fiziologice i biochimice diferite de ale celulelor iniiale.
111

Fuzionarea spontan a celulelor se realizeaz cu o frecven foarte mic. Pentru a mri frecvena celulelor hibride s-au cutat o serie de ageni inductori care s favorizeze hibridarea celular. Virusul Sendai inactivat s-a dovedit a fi un bun inductor, capabil s mreasc foarte mult frecvena celulelor hibride. S-au identificat o serie de substane chimice care stimuleaz hibridarea celular: un analog al isoleucinei, polietilenglicolul etc. O alt problem ce a condiionat hibridarea celular a fost modul de separare sau selectare a celulelor hibride de restul celulelor din mediul de cretere. S-au elaborat aa numitele medii selective, n care celulele hibride se nmulesc n timp ce celulele parentale sunt eliminate. Folosind tehnicile prezentate mai sus, s-au reuit hibridri celulare ntre celule de la specii foarte diferite: celule de hamster chinezesc x celule de oarece, celule umane x celule de oarece, celule umane x celule de nar, celule de oarece x celule de gin. Celulele hibride nu pot regenera organisme hibride complet dezvoltate, dar se nmulesc pn la un anumit moment, rezultnd clone celulare hibride. Obinerea acestor clone celulare hibride are un rol foarte important n cercetrile de genetic. Dac ne referim la hibridrile dintre celulele umane x celule de oarece (fig.4.2.), s-a constatat c celulele hibride conin iniial toi cromozomii (46 de la om + 40 de la oarece). n momentul cnd ncep s se divid, celulele hibride pierd cte un cromozom ce aparine unei specii. n cazul hibridrii celule umane x celule de oarece se pierd o parte din cromozomii umani.

Fig.4.2. Hibridarea celular la animale 112

Aceast particularitate a celulelor hibride, a fost folosit n alctuirea hrilor cromozomice, deoarece eliminarea a cte unui cromozom se manifest prin lipsa sau prezena n plus a uneia sau a mai multor enzime, putndu-se localiza unele gene pe cromozomi. Pentru localizarea mai precis a genelor n diferite regiuni ale cromozomului se folosesc pentru hibridare celule umane ce provin de la indivizi ce prezint anumite restructurri cromozomice. S-au realizat hibrizi celulari ntre leucocitele ce produc interferon i celulele tumorale, rezultnd celule de tip hibridoma, ce produc o cantitate mult mai mare de interferon.

4.5. HIBRIDAREA CELULAR LA PLANTE

Hibridarea celular la plante s-a putut realiza numai dup ce s-au obinut aa numiii protoplati, care sunt celule vegetale crora li s-a ndeprtat membrana rigid pecto-celulozic. ndeprtarea membranei pecto-celulozice s-a realizat la nceput pe cale mecanic iar mai trziu, dup anul 1960, prin metode chimice, folosind o serie de enzime cum ar fi: celulaza, pectinaza, macerozima. n anul 1971, francezul J. P. Nitsch a obinut o plant complet dezvoltat, prin regenerarea protoplatilor (fig. 4.3.). n ultimii ani s-au izolat protoplati i s-au regenerat plante ntregi la: soia, morcov, petunia, bob, mazre, gru etc. (Raicu P., 1980).

Fig. 4. 3. Obinerea enzimatic a protoplatilor 113

Fuzionarea protoplatilor ridic aceleai probleme ca i fuzionarea celulelor animale: mrirea frecvenei celulelor hibride i selectarea acestora. Pentru a mri frecvena de fuzionare a protoplatilor se folosesc: polietilenglicolul, nitratul de sodiu, ionii de Ca la un pH ridicat, ser proaspt de iepure etc. Selectarea celulelor fuzionate se realizeaz prin folosirea de medii selective, care elimin celulele nefuzionate pstrndu-le pe cele hibride. La plante s-a constatat c mediile de cultur ce nu posed substane de cretere (citochinin i auxin) elimin celulele parentale, n timp ce celulele hibride se pot dispensa de aceste substane. P. S. Carlson (1972) a obinut plante hibride ntregi, prin fuzionarea protoplatilor de la speciile de tutun, Nicotiana glauca (2n=24) i N. langsdorffii (2n=18). Plantele rezultate erau amfiploizi ce aveau 2n=42 cromozomi, identici cu hibrizii obinui pe cale sexuat (fig.4.4.) Aceast metod de obinere a hibrizilor a permis ns obinerea de hibrizi celulari ntre speciile ndeprtate filogenetic care n mod obinuit nu se pot hibrida sexuat: morcov x tutun, porumb x ovz, porumb x soia, morcov x petunia.

Fig. 4.4. Hibridarea celular la plante 114

Un aspect foarte important este acela c protoplatii pot include molecule de ADN strine, existente n mediu, particule strine(virusuri) i alte molecule. Fenomenul a fost numit transgenoz, iar pe aceast cale se pot transfera gene sau chiar organite citoplasmatice de la un organism la altul. Din punct de vedere genetic, protoplatii prezint o serie de avantaje: - permit nmulirea rapid a unor genotipuri valoroase; - se pot obine hibrizi celulari ntre dou specii ndeprtate din punct de vedere filogenetic, care nu se pot ncrucia sexuat; - se pot obine forme cu grade diferite de poliploidie; - se pot induce mutaii la nivelul protoplatilor haploizi sau diploizi; - se pot transfera gene, cromozomi sau cloroplaste; - protoplatii pot regenera plante libere de viroze. n ultimii ani cercetrile privind hibridarea celular a luat o mare amploare, reuindu-se hibridarea unor celule animale cu celule vegetale. n anul 1976 A. Lima de Faria (Suedia) a reuit fuzionarea unor celule tumorale umane de tip HeLa cu protoplati de morcov, folosind polietilenglicolul ca agent inductor. Aceste hibridri urmresc combinarea unor genotipuri extrem de diferite, depindu-se limitele impuse de reproducerea sexuat.

4.6. HAPLOIDIA PRIN ANDROGENEZ LA PLANTE

Dezvoltarea partenogenetic a unui embrion sau a unei plante dintr-un microspor haploid poart numele de androgenez iar dezvoltarea unui organism haploid dintr-o oosfer sau un nucleu secundar al sacului embrionar se numete ginogenez. n anul 1964 cercettorii indieni S. Guha i S. C. Maheswari au cultivat pe un mediu artificial, antere de Datura innoxia i au obinut numeroi embrioizi. Cu doi ani mai trziu s-au obinut plante haploide complet dezvoltate la tutun (Nicotiana tabacum) (Raicu P., 1980). Androgeneza este de dou tipuri: direct i indirect (fig.4.5.). Androgeneza direct const n faptul c programul normal al microsporului este deviat sub influena unor stimuli externi, avnd loc o evoluie particular a nucleului haploid, care prin diviziuni mitotice devine embrioid i apoi plant matur. n cazul androgenezei indirecte, se formeaz mai nti un esut nedifereniat denumit calus, din care se pot diferenia apoi plante haploide cu diferite grade de poliploidie. Obinerea unor plante haploide prin androgenez este condiionat de numeroi factori, cum ar fi vrsta anterelor, temperatura, lumina, compoziia mediului de cultur, fapt ce a fcut ca numai la unele specii s se poat obine haploizi pe aceast cale. Pentru genetic, haploizii obinui prin androgenez prezint o mare importan. n primul rnd se demonstreaz c n nucleul celulelor vegetale exist toat informaia ereditar a organismului, inclusiv programul embriogenezei, deoarece dintr-o singur celul se regenereaz un organism ntreg.
115

Plantele haploide sunt pure din puncte de vedere genetic, deoarece sunt hemizigote, existnd o coresponden complet ntre genotip i fenotip. Prin dublarea numrului de cromozomi se obin plante diploide, complet homozigote, aa numitele linii izogene, ntr-un timp foarte scurt, de o importan deosebit pentru ameliorare. Dac prin metodele clasice liniile homozigote la plantele alogame se obin n 8-9 generaii de consangvinizare, prin haploidie liniile homozigote se obin ntr-o singur generaie. La plantele haploide se manifest toate genele recesive iar mutaiile se pot detecta foarte uor. Haploizii s-au dovedit utili n studiile de embriogenez experimental, de citologie, citogenetic, de mutagenez, de fiziologie i biochimie, de citodifereniere, datorit faptului c expresivitatea genelor la plantele haploide, care sunt hemizigote, este total, ntr-o singur generaie.

Fig. 4.5. Haploidia prin androgenez direct i indirect

116