3. ARN Prin ARN este denumit generic un grup de acizi nucleici care impreuna participa la sinteza de proteine.

Ei au rol in copierea si traducerea informatiei genetice care se concretizeaza in sinteza unei molecule functionale care poate fi o proteina sau o molecula de ARN. Spre deosebire de ADN, ARN este prezent in mai multe forme (ARN m, ARN t, ARN r) cu structuri si functii diferite, participand la procesele de transcriptie si translatie. 3.1 Structura ARN ARN-ii sunt (asemanator) ADN-ului lanturi polinucleotidice formate din ribonucleotide legate intre ele prin legaturi fosfodiesterice. Spre deosebire de ADN, ARN este alcatuit astfel: contine ca baze azotate: A, G, C, U, si o serie de baze azotate neuzuale (pseudouracil, N6,N6 dimetiladenina, 7- metil guanina) contin riboza in loc de deoxiriboza. Riboza prezinta in pozitia 2 o grupare OH. Care imprima functie catalitica ARN, gruparea 2OH poate ataca nucleofil si deci scinda legatura fosfodiesterica. Aceasta actiune este intilnita in procesul de splicing ce are loc la maturarea ARN mesager.

gruparea fostaf

Moleculele de ARN sunt de regula monocatenare. Pe anumite portiuni insa, acolo unde complementaritatea bazelor o permite, ARN-ul poate avea structuri dublu catenare. Portiunile monocatenare sunt expulzate in afara zonelor bicatenare sub forma unor bucle, imprimand moleculei o structura de ac de par.

Exista mai multe tipuri de ARN care functie de localizare se clasifica in: ARN nuclear: hnRNA heterogenous nuclear ARN ARN nucleolar snARN sau snurps sau small nuclear ribonucleoproteins (U1-U6) ARN citoplasmatic: ARNm mesager care provine din hnARN ARNr ribosomal care provine din ARN nucleolar ARNt de transfer Cele trei tipuri majore de ARN sunt : ARNm, ARNt, ARNr

ARN m ARNm mesager este cel care contine informatia copiata din ADN, o transporta in citozol unde va servi drept program pentru sinteza de proteine. Programul pentru sinteza proteinelor este dat de asa-numitii codoni care alcatuiesc ARNm. Un codon este un grup de trei nucleotide care semnifica un singur aminoacid, prin urmare succesiunea de codoni din ARN va indica succesiunea de aminoacizi din proteina ce urmeaza a fi sintetizata. ARNm este monocatenar; la capatul 5-fosfat prezinta o capsula formata din 7-metil guanozina legata prin legatura 5-5 trifosfat de capatul 5 al lantului polinucleotidic, iar la capatul 3-OH o coada formata din mai multe nucleotide adenilice numita coada poli-adenilata.

ARNt ARNt de transfer este o molecula translator care indeplineste doua functii: citeste mesajul genetic si transporta aminoacizii necesari sintezei proteice. Este cel mai mic ARN (dpdv al numarului de nucleotide) si exista in mai multe forme, cel putin cate una pentru fiecare aminoacid. In mod firesc ar trebui sa existe 20 ARNt, in realitate insa exista mai multi ARNt care sa transporte acelasi aminoacid si care sunt numiti ARNt izoacceptori. Aminoacizii sunt atasati la o tripleta CCA prezenta la capatul 3-OH al ARNt. ARNt are o forma de cruce, pe unul din brate este prezenta o secventa de 3 nucleotide numita anticodon. Cu ajutorul anticodonului ARNt recunoaste codonul cu structura complementara prezent pe ARNm. ARNt contine o serie de baze azotate neuzuale (pseudouracil, dimetil adenina).

ARN r ARNr este reprezentat de mai multe fragmente scurte de ARN care se gasesc in ribozomi asociate cu proteine. ARNr are o structura monocatenara dar prezinta si portiuni bicatenare asemanatoare intr-o anumita masura cu ARNt. El are rol structural, catalitic si de fixare/pozitionare a ARNm pentru ca acesta sa poata fi citit de catre ARNt.

3.2. Transcriptia Transcriptia reprezinta copierea unei fragment din informatia genetica (nu a intregii informatii) a ADNului. Transcriptia se realizeaza prin copierea doar a unei portiuni (nu intotdeauna aceeasi) de pe o singura catena a ADN. Rezultatul transcriptiei este sinteza unei molecule de ARN. ADN contine informatia genetica sub forma de gene. Genele sunt portiuni de ADN care contin toata informatia necesara sintezei unei molecule functionale. Daca gena codifica o proteina atunci rezultatul transcriptiei este ARNm, altfel in urma transcriptiei se sintetizeaza ARNt sau ARNr. Transcriptia este un proces ce are loc in afara replicarii (diviziunii celulare), ori de cate ori celula are nevoie de anumite componente. Aceasta sinteza selectiva, angajeaza [Aurora Popescu] doar anumite portiuni ale ADN acelea care codifica proteinele de care celula are nevoie la un moment dat. Catena ce contine portiunea ce urmeaza a fi copiata se numeste matrita (anti sens), catena complementara care nu este copiata poarta numele de catena codificatoare (sens). O catena matrita pentru o anumita gena poate deveni catena codificatoare pentru alta gena; obligatorie ramane doar respectarea directiei de sinteza si anume 5->3. In urma transcriptiei ARN transcript primar va avea aceeasi secventa cu cea din catena codificatoare, doar ca acolo unde pe catena codificatoare este T pe transcript va corespunde U.

Pentru sinteza ARN transcript primar este nevoie de : un model reprezentat de o portiune de pe o catena de ADN pe care se va realiza copia dupa original; aceasta portiune este numita matrita sau portiune antisens ribonucleotide trifosfat (A, G, C, U) ARN polimeraze ADN dependente in care catena matrita devine cofactor al enzimei Spre deosebire de procariote la care o singura ARN polimeraza este responsabila de sinteza tuturor tipurilor de ARN, la eucariote exista ARN polimeraze diferite pentru diferitele tipuri de ARN: ARN P I sintetizeaza precursorii ARN-urilor ribozomale (28S, 18S, 5,8S) ARN P II sintetizeaza precursorul ARNm si snurps (U1-U6) ARN P III sintetizeaza precursorul ARNt si ARNr (5S) Spre deosebire de ADN polimerazele ARN polimerazelor prezinta o serie de trasaturi particulare: nu necesita primer nu au functie de corectare nu au functie ligazica (nu exista ARN ligaze)

Reactia generala catalizata de ARN polimeraze este (asemanatoare celei catalizata de ADN polimeraza). Reactia de formare a legaturii fosfodiesterice [Aurora] consta in atacul nucleofil al gruparii 3OH libere din nucleotidul in crestere asupra gruparii fosfat a nucleotidului trifosfat adus la locul sintezei conform matritei. Reactia devine termodinamic favorabila prin actiunea pirofosfatazei (PPa-> 2 Pa). Ecuatia procesului:

Etapele sintezei ARN (etapele transcriptiei) Sinteza ARN este un proces complex in care pot fi evidentiate mai multe etape: A. initierea transcriptiei B. elongarea lantului poli-ribonucleotidic C. incheierea A. Initierea transcriptiei Transcriptia presupune copierea unei anumite portiuni din ADN numita gena, care trebuie identificata in molecula de ADN. Gena nu este recunoscuta in mod direct ci mai intai este recunoscuta o secventa situata in imediata vecinatate a genei numita promotor. Asadar initierea transcriptiei incepe prin recunosterea promotorului unei gene. Rolul promotorului este acela de a indica cu precizie locul de incepere a transcriptie.

Initierea transcriptiei este un proces foarte complex care presupune un numar mare de evenimentecare pot fi grupate in doua etape: 1. recunoasterea promotorului 2. formarea complexului de transcriptie 1. Recunoasterea promotorului-structura promotorului Data fiind diversitatea genelor ce codifica toate proteinele organismului, rezulta in mod evident ca si promotorii acestora vor fi de o mare varietate fiind alcatuiti din extrem de diferite. Cu toate acestea promotorii prezinta o serie de secvente comune numite casete care au roluri bine definite. Aceste secvente conservate (care difera foarte putin de la gena la gena) numite secvente consens sunt alcatuite din aprox. 10 perechi de baze, au roluri diferite si se numesc dupa continutul lor: caseta TATA situata in jurul pozitiei -30 in amonte de locul transcrierii. La aceasta caseta se ataseaza factorii de transcriptie ce au rol, in principal, in asamblarea echipamentului de transcriptie numit complex bazal de transcriptie caseta GAAT/GC situata in jurul pozitiei -70 in amonte de punctul de start al transcriptiei, la care se leaga o parte din factorii ce au rol in reglarea procesului de transcriptie

A fost stabilita conventional o nomenclatura si o numerotare care sa evite confuziile privind promotorii si locatia genelor: - termenul amonte se refera la regiuni ale ADN situate in stanga locului de incepere a transcriptiei adica spre capatul 5 in timp ce termenul aval se refera la regiunea situata in dreapta genei adica spre capatul 3 - punctul de start al transcriptiei reprezinta prima baza copiata, este considerat pozitia 1 a genei si este notat cu +1 (pozitia 0 nu exista). Pozitia +1 a genei corespunde pozitiei primei baze de la capatul 5 al ARN-ului transcript - secventele ce preced prima baza copiata sunt numerotate cu semnul si se spune ca sunt situate in amonte (upstream) p si sunt pozitionate inspre capatul 5 - secventele ce urmeaza primei baze copiate sunt notate cu semnul +, se spune ca sunt situate in aval(downstream) si sunt pozitionate inspre capatul 3 2. Formarea complexului de transcriptie Complexul de transcriptie este format din : a. ARN polimeraza care nu recunoaste singura promotorul deci nu stie unde sa se fixeze (enzima oarba) b. Factori de transcriptie care sunt un grup de proteine (aproximativ 35 proteine) al caror rol este acela de a dirija si pozitiona ARN polimeraza la gena si de a recruta si asambla toate proteinele necesare copierii c. Factorii de reglare care sunt proteine cu rolul de a promova/inhiba transcriptia si care pot opera singuri sau impreuna cu alte proteine co-reglatoare. Ei au rolul de a imprima un anumit ritm transcriptiei.

a. La eucariote exista trei tipuri diferite de ARN polimeraze(ARN P) responsabile de sinteza ARNm, ARNt respectiv ARNr. ARN polimeraza II este responsabila de sinteza hnARN, precursorul ARNmesager matur (vezi transcriptia).

b. Factorii bazali ai transcriptiei, notati TF II (transcrition factors, notatia II provine de la ARN P II) A, B, C, D, E....H, fiecare cu o anumita functie, vin in contact mai intai cu ADN, apoi vin in contact unii cu altii si cu ARN P II, pe care o fixeaza la promotor. Complexul format din factorii de transcriptie impreuna cu ARN P II formeaza complexul bazal de transcriptie, deoarece acesta poate initia dar cu o viteza mica (bazala). Atasarea factorilor de reglare permite desfasurarea transcriptiei in ritmul si la viteza ceruta de nevoile celulare. Factorii de transcriptie actioneaza in linii mari astfel: Primul factor bazal al transcriptiei TBP (TATA binding protein) se leaga direct de caseta TATA, apoi prin intermediul TFIIB (o ATP-aza) leaga ARN PII dirijand-o spre locul sintezei. Factori suplimentari ataseaza TFIIH (o helicaza) care sa separe dublul helix in fata ARNPII, alti factori asambleaza si stabilizeaza acest complex (fig. A). c. Factorii reglatori sunt proteine care activeaza/blocheaza transcriptia se mai numesc inductori respectiv represori. Ei actioneaza direct cu complexul de transcriptie sau prin intermediul altor factori numiti mediatori sau co-reglatori Secventele de ADN la care se leaga factorii reglatori se numesc: enhanceri, daca factorii care se leaga la secventa determina activarea transcriptiei silancer, daca factorii care se leaga la secventa i determina inhibarea transcriptiei elemente de raspuns notate RE (response element), daca factorii care se leaga la secventa sunt o serie de intermediari ai unor molecule semnal (mesageri secunzi receptori hormonali) Enhancer/silancer sunt secvente scurte formate din 10-20 perechi de baze, situate la distanta mare inainte sau dupa promotor. Cuplarea lor cu activatori/represori, cresc/scad viteza de initiere a transcriptiei (ritmul transcriptiei). Implicarea lor reprezinta etapa limitanta de viteza a procesului. Functia lor se realizeaza ca urmare a interactiunii cu factorii de transcriptiei legati de promotor direct sau prin intermediul mediatorilor si are ca efect inducerea unor modificari conformationale ale moleculei de ADN (indoirea lantului ADN) care poate fi favorabila sau defavorabila transcrierii. De regula enhancerii sunt localizati pe aceeasi molecula a ADN cu gena activata. Elementele de raspuns sunt secvente de nucleotide situate la distanta fata de punctul de start sau de promtor pe care se fixeaza o serie de intermediari ai unor semnale celulare, ca de exemplu hormonii, proteinele de stres = heat-schok proteins. Exp: pe RE se fixeaza de regula receptorii pentru hormonii steroizi.

Dupa realizarea tuturor etapelor de recunoastere, recrutare si asamblare a complexului de transcriptie semnalul final pentru inceperea transcriptiei este dat de multiplele fosforilari a domeniului C-terminal a ARN polimerazei. In forma fosforilata ARN polimeraza se autoelibereaza impreuna cu unele proteine din complexul bazal si incepe sinteza ARN-ului transcript primar (fig.B).

B. Elongarea
ARN polimeraza realizeaza sinteza in directia 5->3 rezultand transcriptul primar care va contine A, U G C (fig. B). In cazul ARN P II transcriptul primar este hnARN precursorul ARN m. C. Terminarea transcriptiei Terminarea transcriptiei presupune doua evenimente: 1. Pentru ca ARN transcript primar sa poate disocia de pe matrita este necesar ca acesta sa fie capabil sa formeze un ac de par, care va incetini inaintarea ARN si in final o va opri. Aparitia acestei structuri este dictata de o secventa specifica numita secventa palindrom care este bogata in baze GC si caracterizata de o simetrie dubla. Dubla simetrie consta in faptul ca secventa de pe o catena citita in directia 5->3 este aceeasi cu o secventa situata pe catena complementara citita in aceeasi directie. Prezenta bazelor G si C, intre care se formeaza 3 legaturi de hidrogen, va stabiliza structura de ac de par a transcriptului primar. 2. Dupa formarea acului de par, ARN polimeraza intilneste pe matrita o regiune bogata in A. Aceasta determina in ARN transcript aparitia unei secvente complementare bogata in U. Legatura formata intre A apartinand matritei si U apartinand transcriptului este slaba si favorizeaza desprinderea transcriptului.

3.3 Modificari postranscriptionale Transcriptul primar reprezinta o copie liniara a genei. Acesta sufera o serie de modificari posttranscriptionale pentru a putea deveni functional. Aceste modificari au loc in timpul procesului de transport din nucleu unde a avut loc transcriptia in citoplasma unde va avea loc translatia. Modificari ale ARN r Molecule de ARNr provin dintr-un precursor comun. Acesta este scindat in fragmente de ARN de diferite dimensiuni 28S, 5,8S, 18S sub actiunea unei endonucleaze. Proteinele destinate a intra in alcatuirea ribozomilor se asociaza cu aceste fragmente inainte, in timpul sau dupa prelucrarea lor postranscriptionala. Modificari ale ARNt Precursorii ARNt sufera urmatoarele modificari pentru a deveni functionali: anumite secvente sunt excizate din precursori la capatul 3 se aditioneaza o secventa CCA de catre o nucleotidil transferaza unele baze, situate in anumite pozitii, sunt modificate rezultand baze azotate neconventionale care permit asocieri neuzuale intre bazele complementare. Modificari ale ARNm Transcriptul primar al ARNP II este hnARN (heterogenous nuclear ARN). Acesta sufera trei modificari posttranscriptionale: la capatul 5, la capatul 3 si in interiorul catenei, devenind ARNm matur functional.

1. Modificarile capatului 5 constrau in adaugarea unui capsule cap care contine 7-metil guanozina legata prin legatura 5-5 trifosfat la capatul 5 al ARN. Gruparea metil din pozitia 7 a guaninei provine de la SAM (sulf adenozil metionina) si este realizata de S adenozil metionin transferaza. Metilarea se pare ca are drept scop stabilizarea ARNm si facilitarea translatiei in sensul ca 7-metil guanozina devine semnalul de recunostere al sensului de citire a ARNm. 2. Modificarile capatului 3 constau in atasare la aceasta pozitie a unei cozi de pana la 200 polinucleotide de tip adenilic, asa-numita coada poli-A. Aceasta secventa nu este transcrisa din ADN ci adaugata dupa transcriptie de o enzima numita poliA-polimeraza. Rolul acestei cozi este de a facilita iesirea ARN din nucleu si de a-l proteja fata de actiunea exonucleazelor. 3. Modificarile efectuate in interiorul transcriptului primar se refera la excizia intronilor. Excizia intronilor hnARN precursorul ARNm este alcatuit din doua tipuri de secvente si anume: secvente care codifica lanturi polipeptidice (proteine) numite exoni (expressed regions) secvente care nu codifica lanturi polipeptidice (proteine) numite introni (intervening regions In procesul de maturare al transcriptului primar al ARN-ului mesager eucariotic sunt indepartati intronii. Secventele codificatoare ramase adica exoni sunt inadite (splicing) spre a forma ARN matur. In operatia de indepartare a intronilor intervin doua elemente importante: gruparea hidroxil de la pozitia 2(si care la ADN nu exista) care are functie catalitica intrinseca. Aceasta grupare poate hidroliza legatura fosfodiesterica dintre doua nucleotide. spliceozomul care este un complex format dintr-o serie de proteine numite snurps (small nuclear proteins) notate U1-U6. Acesta recunoaste limitele dintre exoni si introni la nivelul anumitor secvente continute in hnARN ( intronii prezinta la capatul 5 bazele GU si la capatul 3bazele AG)

Splicingul alternativ Procesul de splicing apare doar la eucariote. Este un proces normal care favorizeaza aparitia marii diversitati a proteinelor. Prin acest proces acelasi ARN transcript primar poate fi prelucrat diferit, in celule diferite si la stimuli diferiti. Iau nastere astfel proteine cu secvente diferite numite proteine izoforme. Desi in genere acest proces este favorabil uneori poate conduce la afectiuni cum sunt cancerele.