INTRODUCCIN

La industria bananera en nuestro pas produce grandes cantidades de residuos ya que de la planta solamente se aprovecha el fruto que constituye el 12 % en peso siendo desechado el resto (Zuluaga y col., 2007). La produccin de banano en Mxico es de aproximadamente 2 millones de toneladas mtricas por ao, la especie Musa cavendish representa el 75% del total, de ah que existe un gran volumen de residuos de la industria platanera que podran ser aprovechados si se los transforma para darles un valor agregado.

El proceso de produccin de adecuada para el

protena unicelular es una va biotecnolgica de desechos industriales ricos en

aprovechamiento

carbohidratos. De hecho, el principal factor limitante en la generacin de protena unicelular es el alto costo de las fuentes de carbono, por lo que el uso de subproductos es ideal (Durn 1989). El inters por producir protena unicelular fue estimulado por agencias internacionales relacionadas con la salud, alimentacin y agricultura ante la evidencia de una escasez de protena a nivel mundial (Bu-Lock y Kristiansen 1991), es por esto que la bsqueda de fuentes proteicas es vital (Chacn 2004). Para la generacin de biomasa a partir del banano de rechazo tambin es posible el empleo de levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, cuyo crecimiento se logra si el banano de rechazo es hidrolizado previamente en glucosa y otras sales, por medio de preparados que se vierten dentro de un sistema de fermentacin a nivel laboratorio (Mittal.1992). Esta especie de levadura presenta una amplia utilizacin y aceptacin en la industria para la alimentacin animal y humana, lo que podra resultar en una ventaja para su utilizacin (Liti et al. 2001). La biomasa de origen unicelular tiene aplicaciones como suplemento proteico en alimentacin animal, adems, se ha investigado su utilizacin en la fabricacin de ingredientes funcionales, suplementos proteicos, para resaltar el sabor de alimentos procesados, entre otros (Lee 1996). Para su aplicacin en la alimentacin humana, requiere el empleo de mtodos para la reduccin del nivel 1

de cidos nucleicos, ya que si son consumidos en altas proporciones podran causar la formacin de clculos renales u otras enfermedades. A diferencia de los humanos, el ganado tolera altos niveles de cidos nucleicos, por lo que la protena unicelular podra utilizarse inicialmente en alimentacin animal sin requerir ningn tratamiento (Lee 1996). El estado de Tabasco produce una gran cantidad de musceas. Exporta el 80% del total de la produccin. El 20% es utilizado para el consumo interno, consumo animal y la industria, pero existe un significativo volumen de biomasa considerada como desperdicio, con potenciales caractersticas para la obtencin de alcohol. Los componentes del banano de rechazo que tienen mayor importancia para ser utilizados como sustrato son carbohidratos, protenas y minerales (Quintero et al. 2001). Con el fin de lograr una utilizacin eficiente de estas sustancias, fue importante elegir una levadura con adecuadas caractersticas fisiolgicas como lo fue Saccharomyces cerevisiae, adecuando al mosto a un proceso fermentativo realizado en un biorreactor. Se controlaron parmetros en cada corrida como: Potencial de hidrgeno (pH), grados Brix, temperatura y contenido de azcares totales. Se estandarizo el proceso y se efectuaron las pruebas determinando as la efectividad del rechazo de banano con una fuente de carbono importante para el crecimiento de levaduras y la produccin de biomasa, teniendo un significado importante dentro de esta investigacin.

JUSTIFICACIN
El aprovechamiento de los residuos orgnicos, como puede ser el banano de rechazo, que por su grado de madurez o defectos en su apariencia, puede perder su valor comercial, cobran especial importancia en la medida al generarse alternativas de uso, recupera su valor como materia prima a la vez de reducir la generacin de residuos orgnicos que en su caso son fuente de contaminacin de

suelos, aire y agua. Por ello en este proyecto se pretenden aplicar diversas alternativas biotecnolgicas que permitan su bioproceso y la generacin de productos diversos. El uso de la biotecnologa dentro del sistema de fermentaciones estudia el crecimiento de levaduras del genero Saccharomyces cerevisiae, a nivel de matraz y a nivel de fermentador, utilizando como fuente de carbono, la pulpa de banano. El cultivo de las levaduras, tiene importancia comercial, ya que se pueden utilizar en la elaboracin de productos diversos como son: levadura para la elaboracin de pan, vinos, complementos alimenticios, enzimas, alimento para animales, saborizantes, entre otros. Con la utilizacin de este sustrato, se pretende minimizar los costos de produccin a mayor escala y hacer buen uso de subproductos de los procesos de la industria del banano, los cuales son actualmente utilizados nicamente alimenticio sin aprovecharlo en su totalidad. Los estudios de todo proceso de fermentacin, llevan diversas etapas, desde lo que corresponde a la optimizacin de requerimientos nutricionales y condiciones fisicoqumicas a nivel de matraz, para pasar a la etapa a nivel de fermentador, en los que se pueden estudiar adems de los anteriores otros como son el efecto del tipo de impulsor, la velocidad de este y los vvm`s, entre otros. En el laboratorio de microbiologa, se cuenta con un fermentador, sin embargo no haba sido posible dedicar el tiempo necesario para aprovechar el uso potencial de este aparato, por ello se consider en este trabajo permitiendo as su operacin. Partiendo en este proyecto desde, la traduccin del manual, el establecimiento de las condiciones de crecimiento a nivel de matraz y las pruebas a diferentes condiciones de operacin del fermentador, para evaluar las posibilidades que ofrece el equipo. El estudio de la variacin de los componentes del medio, de los factores fisicoqumicos como el pH (con control y sin control de pH) as como de la alimentacin de aire y velocidad del impulsor, son importantes, como etapa previa al escalamiento de un proceso de fermentacin a nivel piloto; estos estudios, solo son posibles cuando se cuenta con un fermentador con las caractersticas 3 para uso

adecuadas que aseguren la esterilidad del medio, as como la medicin y control de otros parmetros. El fermentador que fue adquirido para el laboratorio del ITVH, tiene estas condiciones por lo que es importante su operacin, para que a futuro, se puedan proponer otro tipo de procesos. El equipo cuenta con sistemas de medicin y control, se pretende que de forma complementaria a la parte de uso y operacin del fermentador, se desarrolle un software que permita su automatizacin y control, esta parte ser llevada a cabo por un estudiante de sistemas computaciones, dirigido por un profesor de esa carrera. Como etapa posterior a este proyecto, se pretende que se desarrollen otro tipo de tecnologas, para procesos alternativos que permita la obtencin de otros productos.

OBJETIVOS Objetivo general

Aplicacin de la biotecnologa en el aprovechamiento de banano. Cultivo de levaduras por proceso de fermentacin aerobia a nivel fermentador utilizando banano de rechazo.

Objetivos especficos
Establecer condiciones ptimas a nivel laboratorio para el cultivo de una cepa de levadura y comparativo con los resultados a nivel fermentador. Arranque y puesta en marcha de un fermentador de laboratorio y elaboracin de un instructivo de operacin del fermentador. Determinar el efecto de la variacin de las condiciones de operacin del fermentador sobre el crecimiento de la levadura.

CARACTERIZACIN DEL REA DE TRABAJO

El presente trabajo se llev a cabo en el Laboratorio de Microbiologa del Instituto Tecnolgico de Villahermosa; ubicado en la carretera Villahermosa-Frontera Km. 3.5, Cd. Industrial de la Ciudad de Villahermosa, Tabasco. El Instituto Tecnolgico de Villahermosa junto con otros 78 institutos localizados a lo largo y ancho del territorio nacional constituyen el Sistema Nacional de Institutos Tecnolgicos, que desarrollan actividades de educacin en Ingeniera, Arquitectura, Relaciones Comerciales y Administracin. Actualmente el Instituto Tecnolgico de Villahermosa ofrece 8 carreras a nivel ingeniera como son: Sistemas Computacionales, Qumica, Bioqumica, Industrial, Civil, Ambiental, Gestin empresarial y Tecnologas de la informacin y las comunicaciones y una a nivel licenciatura: Administracin; as como 2 programas de Postgrado entre ellos: la Maestra en Ciencias en Ingeniera Bioqumica y Maestra en Planificacin de empresas y Desarrollo Regional. El Instituto Tecnolgico de Villahermosa se encuentra certificado bajo la Norma ISO 9001:2008 IMNC - RSGC 544 y bajo esta norma su misin es formar profesionistas competitivos, ntegros y con alto sentido de responsabilidad social y

visin es ser una Institucin lder en Educacin Superior Tecnolgica reconocida nacional e internacionalmente. El Laboratorio de Microbiologa donde se llevaron a cabo las actividades de investigacin experimental est ubicado en el edificio H. del Instituto Tecnolgico de Villahermosa. El laboratorio cuenta con mesas de trabajo, todas equipadas con servicio de gas, agua y electricidad, la iluminacin es proporcionada por lmparas de luz blanca, cuenta con ventiladores de techo, clima, refrigeradores, estufas bacteriolgicas, autoclaves, fermentadores, tarjas para el lavado de material, cuenta con centrifugas y material de cristalera. Las instalaciones se mantienen libres de a conglomerado de personas y los horarios para las actividades estn claramente definidos, cuenta adems con los sealamientos adecuados, extintores y botiqun de primeros auxilios.

PROBLEMAS A RESOLVER
El estado de Tabasco es catalogado como uno de los mayores productores de banano a nivel nacional, ya que basndose en las estadsticas el 92 % del banano que se produce en las diferentes regiones se utiliza para el consumo alimenticio, generando un 8% de banano de desecho. La descomposicin de una parte de este ocasiona una contaminacin ambiental debido a los gases generados por la putrefaccin, como el metano (CH4) y otros gases que se emanan directamente a la atmsfera, causando dao al medio ambiente que en la actualidad es una problemtica mundial y de prdidas econmicas (INEGI, 2007). El banano de rechazo tambin se ha sido utilizado como piensos de animales (porcinos, ovinos caprinos entre otros), ya que es rico en almidn y puede ser utilizado como sustrato para procesos fermentativos que permitan el mximo aprovechamiento energtico a travs de la generacin de otros productos que maximicen le economa de nuestro estado y ponga en marcha el uso de la biotecnologa aprovechando los recursos naturales. En el presente trabajo el problema a resolver es determinar el uso de banano de rechazo como medio de cultivo unicelular a travs de la para la produccin de biomasa o protena levadura Saccharomyces cerevisiae utilizando un

biorreactor de tipo tanque agitado, ubicado dentro del laboratorio de microbiologa del Instituto Tecnolgico de Villahermosa, cumpliendo con las especificaciones necesarias requeridas y determinando as que el banano de rechazo puede ser utilizado industrialmente como uso de medio de cultivo.

ALCANCES Y LIMITACIONES
Alcances Con la ejecucin de este proyecto de investigacin se beneficiar a los alumnos de la carrera de Ingeniera bioqumica ya que se pone en marcha el uso de un 7

fermentador que no haba sido utilizado desde su adquisicin, obteniendo un manual traducido al espaol que proporcionara la facilidad de su uso y con el cual se pondrn generar diversas pruebas a nivel laboratorio para la obtencin de algn producto a partir de materiales biolgicos. De igual forma, tambin se conocer y describir el uso y aprovechamiento de residuos orgnicos de un fruto como lo es el rechazo de banano y que es producido en nuestro estado en grandes volmenes y comercializado en beneficios a la diferentes partes de nuestro pas, que puede ser utilizado para otros fines como la produccin a gran escala de protena unicelular, que conlleva sociedad en cuanto a la rama de alimentos. Limitaciones Todo proyecto est sujeto a limitantes u obstculos que se dan ms que todo en la fase de campo, en este caso los recursos financieros fueron las principales limitaciones ya que era necesario requerir de un nuevo sensor de DO2, debido a que el sensor original trae un defecto de fbrica en cuanto a la membrana y que al momento de su calibracin y uso presentaba ciertos errores de medicin, limitando de tal forma su uso.

CAPTULO 1 FUNDAMENTOS TERICOS

1.1 El banano El Banano o Pltano es el nombre comn que se le da a la fruta comestible producida por varios tipos de plantas herbceas grandes con flores del gnero Musa. El fruto es variable en tamao, color y firmeza, pero generalmente alargado y curvado, de carne blanda rica en almidn cubierto con una corteza que puede ser de color amarillo, prpura o rojo cuando est maduro (figura 1).

Figura 1. Fruto de Banano El pltano o banano es considerado como uno de los cultivos ms importantes en la agricultura. En frutas tropicales ocupa el primer lugar y es considerado como una fruta bsica en la alimentacin mexicana, debido a su bajo precio, rico sabor, disponibilidad en todas las pocas del ao y su valor nutritivo en potasio, hierro y vitamina k entre otros. Las especies Musa son nativas de las regiones tropicales del sur y sureste de Asia, su cultivo se ha extendido en por lo menos 107 pases en las regiones de Centroamrica y Sudamrica, as como de frica subtropical; es el cuarto cultivo ms importante del mundo, despus del arroz, el trigo y el maz. Adems de ser considerado un producto bsico y de exportacin, constituyendo una importante fuente de empleo e ingresos en numerosos pases en desarrollo. 1.1.2 Produccin y usos De acuerdo a la informacin de la FAO (Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin), en el ao 2008 la superficie sembrada de pltano y banano a nivel mundial fue de 10.21 millones de hectreas. Mxico ocupa el lugar 23 en cuanto a superficie se refiere, el primer lugar lo ocupa Uganda con el 17.8% de las hectreas totales sembradas, seguido de Tanzania con el 7.7%. En el ao 2008 se produjo un total de 125.05 millones de toneladas de pltano y banano en el mundo ocupando Mxico el 14 lugar como productor con el 1.73%, seguido de Tailandia (1.59%), Costa Rica (1.57%) y Costa de Marfil (1.57%). En el 2009 el pltano represento el 1.41% del valor total del PIB agrcola en el pas con un lugar de produccin 4.514.29 millones de pesos. El rgimen de produccin

nacional es equitativo pues 50% es de temporal y de riego el otro 50% de la superficie cosechada (SIAP, 2009). El nmero de productores a nivel nacional es de 5000 distribuidos en los estados de Tabasco, Chiapas, Veracruz, Colima, Michoacn, Jalisco, Oaxaca, Nayarit, Puebla y Guerrero con 800 mil jornales en produccin y 88 mil jornales en empaque respectivamente. Los principales estados en Mxico por produccin en toneladas de pltano se muestran en la tabla 1 (SAGARPA, 2010). TABLA 1. PRODUCCIN EN TONELADAS DE PLTANO POR ESTADOS EN LA REPBLICA MEXICANA.

Fuente: (SAGARPA, 2010) Desde el ao 2007 el estado de Tabasco ha sido el mayor productor de banano en Mxico y su produccin ha venido creciendo desmesuradamente. El municipio de Teapa en el estado de Tabasco ha sido el principal productor de pltano en el pas en los ltimos siete aos y representa el 95% del valor de la produccin agrcola del municipio. Dicha fruta se comercializa en el centro del pas y el excedente se exporta a pases de Europa y Asia. Los municipios de Centro y Cunduacn, Tabasco son productores en menor proporcin, pero representan un lugar importante dentro de la economa de estado. Del pltano que se produce en el estado de Tabasco, el 60% se destina para procesos en la industrializacin para usos comerciales como son: Las frituras: para la cual se utiliza pltano maduro o pltano verde (Figura 2). Los precocidos: patacn prefrito congelado, los tostones.

 Los semiprocesados: pltano pelado y empacado al vaco, tajada madura congelada y aborrajado. La produccin de harina, jugos entre otros completos en la alimentacin.

Figura 1.2 Pltano frito en rodajas

1.1.3 Principales variedades de banano que se generan en el estado de Tabasco La variedad de pltanos que se cultivan en el estado de Tabasco es amplia, entre las cuales destacan el pltano Tabasco o Roatn, dentro de los clasificados encontramos las variedades como enano gigante, macho y Tabasco, sin clasificar encontramos al criollo, valery, dominico, pera, manzano y morado; aunque slo el Tabasco en mayor medida, as como, el dominico y macho en menor medida, son los que satisfacen el mercado externo, las variedades restantes se destinan exclusivamente a cubrir el consumo interno. El nombre de pltano se ha generalizado en toda la poblacin, sin embargo, de acuerdo a los especialistas, la mayora de las variedades comerciales son bananos, con excepcin del pltano macho. As, las distintas especies y variedades de pltano se diferencian por su tamao, la disposicin y dimensiones de las hojas, la forma y tamao de los conformacin del racimo (SAGARPA, 2009). 1.1.4 Composicin qumica y valor nutricional El pltano maduro es un alimento muy digestivo, pues favorece la secrecin de jugos gstricos, por tanto es empleada en las dietas de personas afectadas por 11 frutos, pero principalmente por la

trastornos intestinales y en la de nios de corta edad. Tiene un elevado valor energtico (1.1-2.7 kcal/100 g), siendo una importante fuente de vitaminas B y C, tanto como el tomate o la naranja. En las tablas siguientes, podemos observar la composicin nutricional del Pltano por cada 100 gramos de producto comestible. Tabla 1.1 Nutrientes

Nutriente Agua Protenas Lpidos Ceniza Hidratos de Carbono

Por cada 100g 6 5. 2 8 g 1.3g 0. 3 7 g 1. 17g 3 1.89g

Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon

Tabla 1.2 Hidratos de Carbono

Nutriente Fibra Azcares

Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon

Por cada 100g 2.3 g 15g

Tabla 1.3 Minerales

Nutriente Calcio Hierro Magnesio Fsforo Potasio Sodio Zinc Cobre Manganeso Selenio
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon

Por cada 100g 3mg 0. 6 m g 37 mg 34 mg 499 m g 4mg 0. 1 4 m g 0. 0 8 1 m g 0mg 0. 0 0 1 5 m g

Tabla 1.4 Vitaminas

Vitamina Vitamina C Vitamina B1 Vitamina B2 Vitamina B3 Vitamina B5 Vitamina B6 Vitamina B12 Vitamina B9 Vitamina B7 Vitamina E Vitamina D Vitamina K
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon

Por cada 100g 1 8.4 m g 0. 0 5 2 m g 0. 0 5 4 m g 0. 6 8 6 m g 0. 2 6 m g 0. 2 9 9 m g 0mg 0. 0 2 2 m g 1 3.5 m g 0. 1 4 m g 0mg 0. 0 0 0 7 m g

Tabla 1.5 Vitamina A (Antioxidantes Carotenoides)

Nutriente Alfa Caroteno Beta Caroteno Beta Criptoxantina Licopeno Luteina y Zeaxantina
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon

Por cada 100g 4 3 8 g 4 5 7 g 0 g 0 g 3 0 g

Tabla 1.6 cidos grasos

Nutriente cidos grasos saturados cidos grasos monoinsaturados cidos grasos poliinsaturados
Fuente: www.siap.sagarpa.gob.mx/siacon

Por cada 100g 0. 1 4 3 g 0. 0 3 2 g 0. 0 6 9 g

1.1.5 Etapas de madurez del banano Los bananos se cosechan en estado verde-maduro (piel completamente verde pero fisiolgicamente maduros) y despus, a su arribo a los mercados de destino, se les aplica el tratamiento para inducir la maduracin de consumo debido a que 13

las frutas maduras en la planta a menudo se abren y resultan de una textura muy pobre. Se conoce como grado ptimo de corta o de cosecha, el estado de madurez fisiolgica de la fruta que permite un mximo aprovechamiento del racimo, sin que exista maduracin durante el transporte o almacenamiento, manteniendo la lozana y calidad, propicias de una fruta fresca para mesa. La madurez fisiolgica se correlaciona con el dimetro interno de los dedos y esta a su vez con la edad de la fruta, por lo que es posible medirla y aplicarla a la cosecha para un buen aprovechamiento de la fruta, la caracterizacin fisicoqumica del banano dependiendo del grado de madurez la podemos observar en la tabla 2. TABLA 1.7 CARACTERIZACIN FISICOQUMICA DEL BANANO SEGN EL GRADO DE MADUREZ.
G ra d o d e m a d u r e z 1 2 3 4 5 6 7 C o lo r d e c s c a ra V e rd eV e rd e tra z Ms s v e rd e s a m a rrillo a rillo c oT o ta lm e n te T o ta lm e n te a M Am n a m a rilloq u e a m a rrillou e v e rd e x tre m o s v e rd msa rilloa m a rillo c o n p e c a s * q e ae s C a ra c te rs tic a s % A lm id n 1 7 .7 3 1 3 .6 8 8 .7 6 4 .9 6 2 .6 5 1 .7 3 0 .8 2 % A z c a re s to ta le s 1 .3 2 3 .2 1 6 .5 7 1 1 .2 6 1 6 .1 8 1 9 .5 1 9 .7 1 % A z c a re s re d u c to re s.5 7 0 1 .5 3 .2 7 5 .8 6 8 .6 1 0 .4 1 0 .3 2 % S lid o s s o lu b le s , B .6 9 4 rix 7 .2 8 1 2 .4 8 1 7 .7 8 2 0 .8 1 2 2 .1 2 2 .6 1 pH 5 .2 4 5 .0 2 4 .8 7 4 .7 7 4 .7 5 4 .7 8 4 .8 8 A c id e z ( % c id o m lic o ) 1 0 .4 0 .5 4 0 .6 3 0 .6 7 0 .6 7 0 .6 2 0 .5 2 R a z n p u lp a / c s c a ra1 .3 7 1 .4 5 1 .5 3 1 .6 1 1 .6 9 1 .7 8 1 .9 6 % H um eda d 72 7 2 .3 2 7 2 .6 4 7 2 .9 7 7 3 .2 8 7 3 .6 1 7 3 .9 2 * P u n to s c f e s

Fuente: Sonia I. Chacn, F. V. (s.f.). Caracterizacin Fisicoqumica del Banano segn el grado de madurez. Costa Rica,Amrica Central: Universidad de Costa Rica.

A medida que los bananos entran a la fase de maduracin de consumo, el almidn se convierte en azcares, aumentando con ello su dulzura. Los cidos orgnicos y los aromas son tambin componentes importantes del sabor. El banano en su etapa 7 de maduracin pocas veces es aprovechado, ms sin embargo en muchos pases ofrece una gran variedad de elaboracin de productos, transformados e industrializados, en forma cremas, pastas, pulpas,

pur, compotas, mermeladas en conserva, harinas, hojuelas, frutas en jarabe, confitadas y congeladas, alimento para ganado y otros animales; Los subproductos o abonos orgnicos procedentes del vstago que incorporan a la plantacin y los residuos que se generan en la cosecha, fibras y papel a base de los pseudotallos, alcohol, aguardiente, vino, cerveza, vinagre de la fermentacin de la fruta. 1.2 Protena Unicelular La protena unicelular est definido como concentrados proteicos obtenidos a partir de algas, bacterias, levaduras y hongos filamentosos, cultivados en condiciones fermentativas apropiadas y controladas que garantizan una adecuada tasa de crecimiento, por medio del aprovechamiento de sustratos econmicos, enriquecidos con carbono, nitrgeno y fsforo (Jaimez, 1996; Molk et al., 2002; FAO, 2003; Bustamante et al., 2003; Israelidis, 2003; Pelizer et al., 2003). La protena unicelular ha sido utilizada como concentrado proteico en la formulacin de alimentos balanceados principalmente aves y cerdos, y como sustituto de leche para becerros. Existe gran cantidad de informacin disponible en relacin con la composicin de clulas microbiana, incluyendo protenas, aminocidos, vitaminas (especialmente de complejo B) y minerales. Puesto que el valor nutricional y la seguridad desde el punto de vista toxicolgico depende factores complejos como tipo de microorganismos empleado, condiciones de cultivo, presencia de contaminantes en las materias primas y otros, la evaluacin final de la calidad de estas protenas debe de establecerse en pruebas de alimentacin animal, para determinar su conversin alimenticia, digestibilidad y valor biolgico (BV). Por sus caractersticas nutricionales, la protena unicelular puede jugar un papel importante en la produccin pecuaria, pero su produccin ha sido limitada; la restriccin para su produccin son de tipo econmico ms que tecnolgico. Por lo que se refiere al empleo de la protena unicelular en la alimentacin humana, los autorizados y extractos de levadura tienen actualmente una aplicacin industrial y un mercado establecido, siendo un mercado potencial 15

activo, debido a la tendencia para sustituir los productos qumicos por productos naturales. La biomasa de levadura se cultiva en una variedad de compuestos energarendimiento de carbono y fosfato y fuentes de nitrgeno en lote aerbico y sistemas continuos de cultivo. Durante el crecimiento de la levadura en el proceso fed-batch, la adicin de azucares que contiene el medio, usualmente son melazas diluidas medibles que incrementan o minimizan la acumulacin de etanol. Esto es un sistema flexible, adecuados para pequeos y grandes fermentadores [arriba de 60,000 galones (225m3)] y permite fcilmente la conmutacin para alternar con los sustratos y cultivos de levadura. La Biomasa por lo tanto es la materia orgnica que puede usarse como una fuente de energa por sus componentes qumicos. 1.2.1 Importancia Los microorganismos tales como algas, bacterias, levaduras y hongos han sido considerados como fuentes de protenas. El cultivo de microorganismos por su valor nutricional se inici a finales de la Primera Guerra Mundial. Los alemanes desarrollaron un cultivo de levaduras para su uso en los animales y las dietas humanas. El trmino "levadura forrajera" fue acuado (Braude, 1942; Weitzel y Winchel, 1932; Schulein, 1937). Despus de la Segunda Guerra Mundial, su produccin con las pentosas en licor de sulfito se desarroll en los EE.UU., y as mismo otros procesos de sustratos de carbono se han venido desarrollando en el Reino Unido y se han venido utilizando en la actualidad, tales como la melaza, pulpa de caf, semilla de la palma y Palmira, entre otros. El inters en la produccin de biomasa microbiana como alimento y forraje se intensific despus de la dcada de 1950 y alcanz su punto mximo hacia 1977. El trmino "protena unicelular (SCP)" fue inventado, y mucha informacin sobre estos procesos se han publicado en un gran nmero de revistas (cf. Bibliografa). Las caractersticas ms importantes resultantes de la investigacin de CPS se han referido a los siguientes temas:

 La diversidad de los sustratos utilizados y de su catabolismo (sustrato renovable, masa fsil); Seleccin y mejora gentica de una gran variedad de microorganismos. Los diversos microorganismos utilizados para la produccin de biomasa y las vas metablicas implicados en el catabolismo de sustrato se han ido describiendo en artculos citados; as como tambin aspectos fisiolgicos, parmetros de crecimiento, requerimientos nutricionales y la influencia de los parmetros fisicoqumicos en diferentes procesos de distintos tipos de cultivo microbiano. 1.2.2 Microorganismos usados para la produccin de biomasa. La biomasa microbiana es el componente ms activo del suelo, forma parte del pool de la materia orgnica y cumple una funcin muy importante en el humus, ya que interviene en los procesos de mineralizacin de nutrientes (Duchaufour, 1984), una vez muertos ponen a disposicin de otros microorganismos y de las plantas los nutrientes contenidos en los restos microbianos (Jenkinson y Ladd, 1981) y, por otro lado, tambin participan en la inmovilizacin. As, los ciclos de algunos nutrientes mayoritarios, como el carbono, demuestran que la biomasa microbiana es clave en la dinmica de los nutrientes esenciales en el sistema edfico; por ello, algunos autores afirman que la biomasa microbiana y su actividad en el suelo puede ser empleada como ndice de comparacin entre sistemas naturales o como indicador de las variaciones sufridas en el equilibrio de un suelo debido a la presencia de agentes nocivos o su manejo productivo (Doran et al., 1994). Los parmetros microbiolgicos, y por lo tanto bioqumicos, sirven para indicar posibles cambios netos en el equilibrio del suelo que no podran detectarse con mtodos tradicionales (Brookes, 1985; Doran et al., 1994; Garca y Hernndez, 2000). Algunos autores (Nannipieri, 1984; Brookes, 1985; Doran et al., 1994) recomiendan indicadores sencillos de medir y de interpretar. Los ms comunes que se utilizan son, entre otros, la biomasa microbiana, la respiracin del suelo y las relaciones con la materia orgnica y el estado fisiolgico del suelo, donde se ve involucrada la energa en los procesos orgnicos. 17

Tabla 1.8 .Contenido de aminocidos esenciales de microorganismos de inters para la produccin de biomasa (Litchfield, 1979; Bose et al, 1992). Algunas fuentes de protenas importantes involucradas por algunos

microorganismos para la produccin de biomasa son las levaduras que utilizan diversos tipos de sustratos para producir altas concentraciones que sirven para producir una serie de materiales orgnicos algunos otros se mencionan en la tabla 1.8 1.3 Levaduras Las levaduras son microorganismos eucariotas clasificados en el reino fungi, con 1,500 especies descritas actualmente, son unicelulares y algunas especies con formas de levadura pueden llegar a ser multicelulares mediante la formacin de una cadena de conexiones de clulas conocidas como pseudohifas, o hifas falsas, como se observa en la mayora de los moldes. consumidos por los seres vivos,

El tamao de una levadura puede variar mucho dependiendo de la especie, tpicamente la medicin es de 3 a 4 micras en dimetro, aunque algunas de ellas pueden alcanzar ms de 40 micras. La mayora de las levaduras se reproducen asexualmente mediante mitosis, y muchos lo hacen por un proceso de divisin asimtrica llamado gemacin. Por fermentacin, la especie de la levadura Saccharomyces cerevisiae convierte los carbohidratos a dixido de carbono y alcoholes. Durante miles de aos el dixido de carbono se ha utilizado en la coccin y el alcohol en las bebidas alcohlicas. Tambin es un organismo modelo centralmente importante en la investigacin moderna de la biologa celular, y es uno de los microorganismos eucariotas ms investigados a fondo. Los investigadores la han utilizado para recopilar informacin sobre la biologa de la clula eucariota y la biologa humana en ltima instancia. Otras especies de levaduras, tales como Candida albicans, son patgenos oportunistas y pueden causar infecciones en seres humanos. Las levaduras se han utilizado recientemente para la produccin de etanol como biocombustible industrial, a pesar de ser utilizadas tambin para la obtencin de otros productos importantes manufacturados en todo el mundo. Las levaduras no forman una sola agrupacin taxonmica o filogentica y su trmino se toma a menudo como sinnimo para Saccharomyces cerevisiae, pero la diversidad filogentica de estas se muestra por su colocacin en dos filos separados: Ascomycota y Basidiomycota. Las levaduras en ciernes o levaduras ("verdaderas") se clasifican en las rdenes Saccharomycetales. 1.3.1 Principales levaduras industriales y su uso De las 349 especies de levaduras descritas por taxonomistas solo un grupo (tabla 1.9) son de importancia econmica (Loder, 1970). En este grupo de levaduras destacan las cepas verstiles de Saccharomyces cerevisiae usados universalmente en alimentos, relacionadas en la produccin de fermentaciones y bebidas. Para la biosntesis de protenas, sin embargo, la produccin de Candida utilis est creciendo relativamente, principalmente proporcionando biomasa seca 19

(no fermentada) como grandes suplementos para la formulacin de alimento de ganado. Tabla 1.9 Especies de levaduras comnmente usadas a nivel industrial

1.4 Gnero Saccharomyces cerevisiae Gnero que fue propuesto por primera vez por Meyen ex E.C. Hansen en el ao 1883. Saccharomyces cerevisiae es una especie de levadura, tal vez la ms til, despus de haber sido fundamental para la vinificacin, coccin y elaboracin de la cerveza desde la antigedad. Se cree que fue aislada originalmente de la piel de la uva (se puede ver la levadura como un componente de la delgada pelcula blanca sobre la piel de algunas frutas de color oscuro tales como ciruelas, sino que existe entre las ceras de la cutcula). Es uno de los organismos eucariotas ms intensamente estudiados como modelo molecular en biologa celular (Figura 1.3), como el modelo de la bacteria de Escherichia coli (Brock T.D., Smith, D.W. y Madigan, 1897).

Figura 1.3 Levadura de la especie Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo detrs del tipo ms comn de fermentacin, sus clulas son de redondas a ovales, de 5-10 micras de dimetro, se reproduce por divisin de un proceso conocido como ciernes, es uno de los modelos ms adecuados para el estudio de problemas biolgicos, es un sistema eucariota, con una complejidad slo ligeramente superior a la de la bacteria pero que comparte con ella muchas de sus ventajas tcnicas. Adems de su rpido crecimiento, la dispersin de las clulas y la facilidad con que se replican cultivos y aslan mutantes, destaca por un sencillo y verstil sistema de transformacin de ADN. Por otro lado, la ausencia de patogenicidad permite su manipulacin con las mnimas precauciones. S. cerevisiae es un sistema gentico que, a diferencia de la mayora de los otros microorganismos, presenta dos fases biolgicas estables: haploide y diploide. La fase haploide permite generar, aislar y caracterizar mutantes con mucha facilidad, mientras que en la diploide se pueden realizar estudios de complementacin. Una ventaja adicional de este microorganismo consiste en que se conoce la secuencia completa de su genoma y se mantiene en constante revisin. Ello ha permitido la manipulacin gentica de los casi 6600 genes que codifica el genoma de levadura, el uso extensivo de micromatrices de ADN para investigar el transcriptoma y estudios a escala genmica de, entre otros muchos aspectos, la expresin gnica, localizacin de protenas y la organizacin funcional del genoma y el proteoma.

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Por estas razones, S. cerevisiae se ha convertido en una importante herramienta a gran escala de anlisis de genmica funcional (Freedman B.A. 1998). Las utilidades industriales ms importantes de esta levadura son la produccin de cerveza, pan y vino, gracias a su capacidad de generar dixido de carbono y etanol durante el proceso de fermentacin. Bsicamente este proceso se lleva a cabo cuando esta levadura se encuentra en un medio muy rico en azcares (como la D-glucosa). En condiciones de escasez de nutrientes, la levadura utiliza otras rutas metablicas que le permiten obtener un mayor rendimiento energtico, y por tanto no realiza la fermentacin. Desde el punto de vista cientfico, este microorganismo se ha empleado como modelo simple de la clula eucariota. Esto se debe a una serie de ventajas como su facilidad de cultivo y su velocidad de divisin celular (Lewin, B. 2001). 1.4.1 Requerimientos nutricionales Todas las cepas de S. cerevisiae puede crecer aerbicamente en glucosa, maltosa y trehalosa y dejan de crecer en lactosa y celobiosa. Sin embargo, el crecimiento en otros azcares es variable. Galactosa y fructosa se demuestra que son dos de los mejores azcares de fermentacin. La capacidad de las levaduras para utilizar diferentes azcares puede diferir dependiendo de si se cultivan aerbicamente o anaerbicamente. Algunas cepas no pueden crecer anaerbicamente en sacarosa y trehalosa. En todas las cepas se pueden utilizar amoniaco y urea como la nica fuente de nitrgeno, pero no se puede utilizar nitrato, ya que carecen de la capacidad para reducir los iones de amonio. Tambin pueden utilizar ms aminocidos, pequeos pptidos, y las bases de nitrgeno como fuente de nitrgeno. La Histidina, glicina, cistina, y lisina son, sin embargo, no utilizadas. S. cerevisiae no excretan proteasas, de manera que la protena extracelular no puede ser metabolizad

Las levaduras tambin tienen un requisito de fsforo, que se asimila como ion dihidrgeno fosfato, y azufre, que puede ser asimilado como un sulfato de iones o como compuestos de azufre orgnicos tales como los aminocidos metionina y cistena. Algunos metales, como el magnesio, hierro, calcio, y zinc, tambin son necesarios para un buen crecimiento de la levadura. 1.4.2 Factores fisicoqumicos La levadura Saccharomyces cerevisiae crece en una serie de fermentadores. Estos fermentadores son operados bajo condiciones aerbicas (en presencia de oxgeno libre o exceso de aire) de 0.6 a 0.9 v.v.m, (puesto que bajo condiciones anaerbicas (limitacin o ausencia de oxgeno) los azcares fermentables son consumidos en la formacin de etanol y dixido de carbono, lo cual resulta en bajos rendimientos de levadura. Este proceso de fermentacin aerbico es exotrmico, lo cual implica que el fermentador debe ser enfriado para mantener la temperatura bajo 30C, mediante agua de refrigeracin, consiguiendo as la temperatura ptima de crecimiento (Fajardo y Sarmiento, 2007) La cantidad y tipo de melaza que se utiliza depende de la disponibilidad de cada tipo de melaza, los costos, y la presencia de inhibidores y toxinas. Generalmente, en la fermentacin se utiliza una mezcla de los dos tipos de melaza. Una vez que se mezclan, se ajusta el pH entre 4.5 y 5.0 porque una mezcla alcalina promueve el crecimiento de bacterias. El crecimiento de bacterias ocurre bajo las mismas condiciones que el crecimiento de la levadura, y esto hace que el monitoreo del pH sea muy importante. La melaza es clarificada, con el fin de eliminar cualquier impureza; luego el mosto (melaza clarificada y diluida con el pH ajustado) se esteriliza con vapor a alta presin. Despus de la esterilizacin, se diluye con agua y se mantiene en un estanque hasta que se necesite en el proceso de fermentacin

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La etapa inicial del crecimiento de la levadura tiene lugar en un laboratorio. Una porcin de cepas de levadura (levadura madre) se mezcla con el mosto de la melaza en frascos esterilizados, y se deja crecer por 2 a 4 das. La fermentacin del cultivo puro se realiza en fermentadores normalmente de tipo batch donde la levadura crece por un perodo de 13 a 24 horas (Campbell M, Shawn O. Farrell, 1986) La etapa final de la fermentacin tiene el grado de aireacin ms alta, y se incrementa la alimentacin de melaza y nutrientes. Esta etapa tiene una duracin que vara entre 11 y 15 horas. Despus que toda la melaza y los nutrientes son adicionados, el lquido es aireado por un perodo adicional de 0.5 a 1 hora para permitir la total maduracin de la levadura, permitiendo as una mayor estabilidad para el almacenamiento refrigerado. 1.5 Cintica de microbiana "El crecimiento de clulas, microorganismos, clulas vegetales y animales, puede mirarse bajo dos aspectos o tipos de crecimiento reproductivo. a) Clulas individuales o poblacin de clulas en crecimiento sincronizado para estudio del ciclo de vida celular. Procesos en laboratorio. b) Divisin estocstica de la poblacin, o divisin al azar. La divisin celular se efecta luego de un aumento en el tamao de la clula, duplicacin del ncleo, divisin celular, divisin citoplasmtica (salva los organismos centicos). De sta manera una clula da nacimiento a dos clulas hijas de tamao idntico y conteniendo los mismos elementos estructurales y potencialidades. En el caso de las levaduras, y otros microorganismos, se presenta una variante que es la gemacin o botn. Se forma una pequea protuberancia que aumenta

progresivamente de tamao, luego se produce la divisin en el ncleo y migra hacia el botn. Finalmente crece hasta un tamao suficiente y posteriormente se separa formando otra clula idntica a la madre. Las clulas hijas, sin importar el procedimiento de divisin celular, deben heredar todo el potencial gentico y son idnticas." (Muoz A, 1997). 1.5.1 Medicin del crecimiento microbiano El clculo del nmero de clulas que existen en una suspensin se puede llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopa, nmero de colonias), masa celular (peso seco, medida del nitrgeno celular, turbidimetra) o actividad celular (grado de actividad bioqumica con relacin al tamao de la poblacin). Todos estos mtodos se clasifican en dos apartados: mtodos directos y mtodos indirectos. Mtodos directos: Recuento del nmero de clulas en una cmara Peso seco celular Determinacin de nitrgeno o de protenas totales Determinacin de DNA Mtodos indirectos: Recuento de colonias en placa Recuento sobre filtro de membrana Consumo de oxgeno Liberacin de dixido de carbono Concentracin de un enzima constitutivo Decoloracin de un colorante Incorporacin de precursores radiactivos Medida de la turbidez 25

No existe necesariamente una relacin proporcional entre la biomasa y el nmero de clulas, esta relacin es ms compleja para los microorganismos que crecen formando agregados o ramificaciones (cultivos miceliales). En el caso de cultivos miceliales (hongos, actinomicetos), los microorganismos pueden desarrollarse en forma difusa en toda la masa de lquido o en forma discreta adoptando la forma esfrica (pellets). La biomasa y el nmero de clulas que interesan determinar son los correspondientes a los microorganismos activos, aquellos que realmente participan en el bioproceso, no todos los microorganismos vivos o medidos como viables estn realmente activos. La actividad microbiana se mide por la velocidad para realizar la transformacin de inters por cantidad de microorganismos presentes en el sistema considerado (velocidades especficas). La biomasa que debiera usarse en las ecuaciones que describen y cuantifican procesos microbianos es la biomasa activa. En la prctica, se mide la masa celular total y paralelamente se hacen de medidas de viabilidad o actividad celular.

1.6 Biorreactores Un biorreactor o fermentador es un dispositivo biotecnolgico que debe proveer internamente un ambiente controlado que garantice y maximice la produccin y el crecimiento de un cultivo vivo; esa es la parte biolgica. Externamente el biorreactor es la frontera que protege ese cultivo del ambiente externo: contaminado y no controlado Es un sistema, tal como una cmara de fermentacin grande, que puede contener organismos en crecimiento, tales como bacterias o levaduras en condiciones controladas. Los biorreactores se utilizan en la produccin biotecnolgica de sustancias tales como productos farmacuticos, anticuerpos, o vacunas, o para la bioconversin de residuos orgnicos (Houghton Mifflin Company, 2010).

El tambin conocido como fermentador o reactor, es un recipiente donde se lleva a cabo el proceso de fermentacin. Su funcin principal es mantener el medio y el microorganismo en las condiciones adecuadas para lograr la mayor produccin de los compuestos de inters. Es deseable que un fermentador cumpla con una serie de requisitos, entre los que se encuentran: Un consumo bajo de energa Capacidad para mantener un mezclado uniforme del medio de cultivo y el microorganismo, con el mnimo de variaciones durante su operacin. Adaptacin fcil a diferentes procesos. Precio de acuerdo con las caractersticas del fermentador. Transferencia de calor buena Sistema de mezclado que mantenga los microorganismos separados entre ellos para evitar un dao mecnico de las clulas. Diseo mecnico simple. Controles de pH, oxgeno disuelto y la temperatura Facilidad en la toma de muestras. Sistema de eliminacin de calor. Diseo que permita mantener condiciones de asepsia durante el proceso. 1.6.1 Tipos de fermentadores Existen muchos tipos de reactores; cada uno se encuentra diseado de manera que pueda adaptarse a las condiciones de operacin necesarias para optimizar la produccin del compuesto de inters. Los ms utilizados son: El matraz erlenmeyer El reactor del tanque agitado El reactor de elevacin con aire, comnmente conocido por su nombre en ingls, airlift. El reactor de disco rotatorio Un ejemplo de ellos se observa en la figura 1.4 y 1.5 27

Figura 1.4 Biorreactor de tipo tanque agitado Figura 1.5 Biorreactor tipo air-lift

1.6.2 Escalamiento de un proceso de fermentacin El escalamiento involucra el estudio de los problemas asociados a transferir la informacin obtenida en el laboratorio (ml) y desde escala de planta piloto (litros) a escala industrial (m3). Las condiciones de produccin a pequea escala no son, por lo general, extrapolables a la escala industrial, debido a que la fluido dinmica del sistema, los procesos de transporte y el comportamiento celular son diferentes. Por ello, se aplica un proceso gradual, manteniendo una velocidad de transferencia de oxgeno constante, as como la potencia consumida por unidad de volumen, al tiempo que el tamao del cultivo se va aumentando en proporcin 1:10 En cada una de las etapas de escalamiento se evalan algunos aspectos del proceso: 1. Escala de laboratorio se llevan a cabo: La seleccin de cepas Estudios bsicos de cinticas de crecimiento Seleccin del medio, etc.

2. Planta piloto se optimizan las condiciones de operacin Forma de operacin flujos, presiones Temperaturas velocidades de agitacin, etc. 3. Escala industrial se lleva a cabo la produccin del producto de inters a niveles rentables. 1.6.3 Criterios de escalamiento Algunas de las correlaciones para el coeficiente de transferencia de masa y las variables de diseo se siguen determinando los criterios de diseo. Cuando una fermentacin se aumenta de escala, es importante que en la escala mayor se utilice el valor de KLa ptimo encontrado en la escala ms baja. El conocer los valores potencia que se le suministra al biorreactor va a perimir mantener y controlar el nivel de agitacin. Al momento de aplicarlo se debe tener cuidado de no sobrepasar los lmites tanto de esfuerzo de corte mximo y nivel de trasferencia de oxgeno mnima. El conocimiento detallado la variable del esfuerzo de corte, permite mantener el nivel de agitacin adecuado y ptimo. Esta variable deber ser simple y evaluada en cualquier momento dado que se puede estar trabajando con microorganismos que no resistan esfuerzos de corte mayores que los establecidos. Debe prevalecer este criterio. El conocer un adecuado nmero de Reynolds, asegura un nivel de agitacin adecuado ya que indica si el rgimen del fluido es turbulento o laminar. La tasa de bombeo F/V (flujo de aire/ volumen del lquido) asegura una adecuada aireacin del sistema, lo cual no asegura una adecuada transferencia de oxgeno, por lo cual se debe verificar en el proceso. Algunas de las ecuaciones basadas en estos enunciados se basan en la tabla 1.10 de criterios de escalamiento.

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Tabla 1.10. Relacin de criterios de escalamiento que se usan generalmente en biorreactores (Biochemical Engineering, 2007). 1.6.4 Geometra Generalmente, los fermentadores se construyen de vidrio o de acero inoxidable generalmente, a base de hierro, nquel y cromo; el ms usado para biorreactores es el 316 L. A escala de laboratorio, su volumen oscila desde uno hasta cincuenta litros y, a escala industrial, pueden llegar hasta los trescientos mil litros, el volumen de trabajo es, aproximadamente el 80% del volumen total. La geometra estndar de un reactor es cilndrica, y se debe tener en cuenta la efectividad de la mezcla y las consideraciones estructurales (Biochemical Engineering, 2007c). A continuacin en la figura 4 se muestra un esquema de las dimensiones utilizadas en diseo del tamao de un fermentador y en la tabla 8 se relacionan las dimensiones que generalmente se caracterizan para varios tipos de biorreactores.

Figura 1.6. Esquema de las dimensiones de un biorreactor (Biochemical Engineering, 2007c). El clculo de las dimensiones de un reactor, dado que la mayora de los reactores tienen forma cilndrica, puede llevarse a cabo aplicando las relaciones mostradas en el figura 1.6 complementadas con la frmula de dimensiones para determinar el volumen del cilindro: V= r^2 h Donde V es el volumen, es la constante Pi, r es el radio del cilindro, y h la altura del cilindro. La tabla 1.11 muestra la relacin de dimensiones que se usan generalmente en biorreactores

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Relacin
Volum de trabajo Vs. en Volum del tanque en

Valores tpicos

O bservaciones

0.7 a 0.8 Ecuacin Depende de la cantidad de espum producida en la a ferm entacin

Altura del lquido en el reactor Vs. Altura del reactor

0.7 a 0.8 Ecuacin

Dim etro Vs. Altura del reactor

1 a 0.3 Ecuacin La turbina Rushton es generalmente 1/3 del dim etro del tanque. Agitadores axiales son ms largos.

Dim etro del agitador Vs Dim etro del tanque.

0.3 a 0.5 Ecuacin

Dim etro de deflectores Vs. Dim etro del tanque Alto de la paleta del agitador Vs. El dimetro del agitador

0.08 a 0.1 Ecuacin 0.2 Ecuacin

Ancho de la paleta del agitador Vs. El dim etro del agitador

0.25 Ecuacin

Tabla 1.11 Relacin de dimensiones que se usan generalmente en biorreactores (Biochemical Engineering, 2007). El clculo de las dimensiones de un reactor, dado que la mayora de los reactores tienen forma cilndrica, puede llevarse a cabo aplicando las relaciones mostradas en el cuadro anterior complementadas con la frmula para determinar el volumen del cilindro: V= r2 h

Donde V es el volumen, es la constante Pi, r es el radio del cilindro, y h la altura del cilindro. 1.6.5 Instrumentacin y Control de un fermentador Para llevar a cabo durante la fermentacin medidas para el anlisis de datos y el control del proceso se han desarrollado sensores especiales para biorreactores que difieren en cierto modo de los de las industrias qumicas: 1) Todos los sensores localizados en el rea estril deben ser esterilizables. 2) Algunos sensores deben estar especficamente adaptados a las necesidades bioqumicas. Los parmetros fsicos y qumicos que se indican en la Tabla 9 pueden ser medidos directamente en muchas plantas piloto o fermentadores de produccin o pueden ser medidos in situ en el laboratorio.

Fuente: (ITESCAM, 2010)

Los parmetros biolgicos que se indican deben ser medidos fuera del fermentador, con la excepcin de la medida del NADH2 que puede ser medido in situ por mtodos fluorescentes. Existen interesantes novedades en el campo de 33

los electrodos enzimticos, los denominados biosensores. Tales sensores, sin embargo, no pueden ser esterilizados. Un procedimiento normal es determinar en el aire que entra y que sale el O 2 y el CO2 por separado mediante las propiedades paramagnticas del O2 y el espectro de absorcin en infrarrojos del CO2. Los sensores para medir estos gases estn bien desarrollados y funcionan con pocas interrupciones. Pero el espectrmetro de masas es ms verstil, ya que puede medir tambin N 2, NH3, metanol y etanol simultneamente, as como dar informacin cuantitativa y cualitativa sobre el intercambio de O2 y CO2. Mediante el uso de membranas permeables a los gases es posible medir los gases disueltos en el medio nutritivo. Se han desarrollado instrumentos que analizan hasta 8 gases simultneamente en la fermentacin. Es fcil encontrar equipos para la medida precisa del pH. Existen combinaciones de electrodos (electrodos de cristal, electrodo de referencia y compensador de temperatura en una sola mitad) capaces de soportar las temperaturas de esterilizacin y las tensiones mecnicas o debidas a la presin. El tiempo de respuestas y la sensibilidad de estos electrodos son satisfactorios para los requerimientos normales de los fermentadores. Los ordenadores pueden facilitar el control y anlisis de un conjunto de funciones en los procesos de fermentacin: 1. Optimizacin mediante ordenador. Los ordenadores se utilizan en el salto de escala y evalan los parmetros de la fermentacin y miden los efectos de parmetros individuales sobre el comportamiento metablico de los cultivos. 2. Control mediante ordenador. Los ordenadores pueden controlar los procesos de fermentacin. El control in situ de la fermentacin se utiliza ampliamente por muchas compaas a escala de produccin. La aplicacin de ordenadores en biotecnologa se utilizan primariamente para la adquisicin de: a. b. Adquisicin de datos Anlisis de datos

c.

Desarrollos de modelos de fermentacin

CAPITULO II
METODOLOGIA

Este trabajo se realiz en el Laboratorio de Microbiologa del Instituto Tecnolgico de Villahermosa (ITVH), forma parte de un proyecto para poner en marcha y operacin un biorreactor que se encuentra ubicado en el mismo laboratorio.

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2.1 Traduccin del Manual La traduccin del manual tuvo como intencin servir de consulta, el cual fue de gran utilidad para el presente trabajo. Esta traduccin se hizo en conjunto con ayuda de alumnos de las carreras de Ingeniera en sistemas computacionales e Ingeniera Bioqumica.

2.2 Etiquetado Una de las formas para poder familiarizarse con este equipo y hacer de una manera ms fcil su uso fue etiquetar cada una de las partes que integran el equipo, desde su base y accesorios as como tambin el panel frontal y trasero de los 5 mdulos que conforman el biorreactor, apoyndome en el manual del biorreactor.

2.3 Ensamblado El ensamblado se realiz en el Laboratorio de Microbiologa del Instituto Tecnolgico de Villahermosa, localizado en la ciudad de Villahermosa, Tabasco siguiendo la gua de operaciones del MANUAL No. M1273-0054 BioFlo 110 Modular Benchtop Fermentor elaborado por la compaa fabricante New Brunswick Scientific Co., Inc. Tomndose en cuenta los siguientes puntos: Preparacin del rea de localizacin Instalacin de los 5 mdulos del biorreactor Colocacin de la base del recipiente Esterilizacin de todos los componentes aadidos a la placa del cabezal Instalacin del recipiente (7.5 litros) Instalacin de la placa cabezal

 Instalacin de la manta de calor Instalacin del deflector Instalacin del impulsor Instalacin del serpentn de enfriamiento Instalacin del aspersor Instalacin del tubo recolector Instalacin del tubo de muestreo Instalacin del termopozo Instalacin de la sonda de espuma Instalacin del tubo escape de espuma Instalacin de la sonda de nivel Instalacin de los tubos de adicin Instalacin de la sonda de pH Instalacin de la sonda de oxgeno disuelto Instalacin del condensador de escape Instalacin del muestreador Instalacin de la trampa de espuma Conexin de los puertos no utilizados Instalacin del motor de agitacin Instalacin del rotmetro Instalacin de la bomba de aire (5 galones) Instalacin del sistema del lquidos de adicin Conexin elctrica y, 37

 Conexin de agua

2.4 Puesta en marcha del biorreactor

1. Se conect el biorreactor a una fuente de energa usando el cable apropiado para la Unidad de Control de Procesos del equipo. 2. Se llen el recipiente del biorreactor a un volumen de 5 litros de agua 3. Se encendi el equipo y se visualiz que las luces de encendido permanecieran activas 4. Se inici la operacin del tablero, seleccionando el idioma en espaol en la pantalla de la Unidad de Control de procesos 5. Se coloc la manta de calor alrededor de la jarra y se program 121C para iniciar la esterilizacin de la jarra y los accesorios colocados en la placa cabezal como son: el deflector, el impulsor, el serpentn de enfriamiento, el aspersor, el tubo recolector, el tubo de muestreo, el termopozo, la sonda de espuma, el tubo de escape de la espuma, las sondas de nivel y el tubo de adicin. 6. Se coloca una bomba de aire de 5 galones, la cual le da oxgeno al medio y que va conectada al rotmetro para poder controlar la entrada de aire. 7. Al sensor del dixido de oxgeno se le aadi el lquido electrolito en el recipiente que cubre la membrana del tubo del sensor, tal como lo indica el manual, manteniendo su monitoreo, este no fue colocado hasta despus de agregar el medio en la siguiente prueba. 8. Se inici la esterilizacin de la jarra y dems accesorios sin los sensores de pH y DO2, dejando un puerto de uno de los recipientes de la placa del cabezal abierto, y un adaptador de rosca fijo por sujecin, envolviendo los filtros con una capa protectora de papel de aluminio al igual que las sondas y los dems adaptadores con sus respectivos rodamientos y empaques.

9. Se calibr el sensor de pH en dos soluciones amortiguadoras desde el biorreactor, monitorendose desde la pantalla, dejndose listo para la siguiente prueba.

2.5. Materiales y Equipos Microorganismo de trabajo: Saccharomyces cerevisiae Matraces Erlenmeyer estriles de 250 ml y 1000 ml Recipientes de licuadoras estriles Licuadora Esptulas estriles Cajas de Petri estriles, de 15 x 100 mm, de vidrio o de plstico desechables Pipetas estriles de 1 ml (con graduaciones de 0.01 ml), de 5 y 10 ml (con graduaciones de 0.1 ml) Micropipetas con puntas (estriles) Asa bacteriolgica Tubos de ensayo con tapn (estriles) de 16 x 150 mm y 20 x 150 mm Gradillas para tubos de ensayo Magnetos para agitacin Algodn Cubre objetos Cmara de Neubauer Probetas estriles de 100 ml Vasos de precipitado de 250 ml

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 Tiras reactivas de pH Papel estraza Papel aluminio Parafilm Cinta testigo y adhesiva Pinzas Guantes Autoclave ( 121 C durante 15 minutos ) Refrigerador de laboratorio, 4 2 C Horno para esterilizar (160C por 2 horas 180 C durante 1 hora) Balanza granataria: 2000 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g Balanza analtica Mecheros Bunsen Microscopio ptico Refractmetro Atago (0-20% o 0-32%) Peachmetro digital Espectrofotmetro Agitador de laboratorio Agitador Vrtex Biorreactor de 7.5 L de capacidad Bomba de aire para peces (5 galones) Embudos

2.6 Medios

2.6.1 Medios para la purificacin de las cepas de levadura

Los criterios de seleccin primaria son los aspectos visibles como morfologa colonial y microscpica, halos de vveres de indicadores de pH, halos de hidrlisis de sustratos y en cualquier alteracin fsica o qumica del medio que implique el crecimiento y actividad microbiana o bien el desarrollo o inhibicin de microorganismos de prueba; en ocasiones solo el crecimiento de los microorganismos en medios altamente restrictivos, constituye el nico criterio de seleccin primaria. El objetivo en este punto fue que a partir de una fuente natural se pudiera realizar el aislamiento y la seleccin primaria de tres Levadura comerciales de panificacin para la produccin de biomasa y/o protena, utilizando los materiales y mtodos adecuados para su preparacin (Tabla 10), en un Medio slido para el crecimiento de levaduras.

Tabla 2. Medios para la preparacin de la cepa de levadura COMPONENTE Infusin de papa dextrosa Agar Bacteriolgico Agua CANTIDAD 200.0 mL 20 g/L 15.0 g/L 1 litro

Mtodo: Se adicionaron 39 g del medio PDA en un litro de agua purificada calentando con agitacin suave hasta su completa disolucin y homogenizacin, la muestra se mantuvo as durante un minuto. Finalmente se esterilizo en una autoclave a 121 C (15 libras de presin) durante 15 minutos para despus enfriar a una temperatura de 45-50 C vacindolo en cajas de Petri estriles logrando as la purificacin de cada una de las cepas. 41

2.6.2 Medios de cultivos para el arranque

Los medios para la elaboracin del inculo que se utilizaron tanto jugo del banano de rechazo.

para las

pruebas de arranque como para el objetivo final fueron: la melaza de caa y el

a. Preparacin de la melaza de caa como sustrato para la produccin de la cepa de Saccharomyces cerevisiae fue proporcionada por el laboratorio de Microbiologa industrial ya que es frecuente su uso para diversas prcticas, utilizndolo como sustrato para el crecimiento de diferentes microorganismos, ya que es una fuente importante de azcares. A continuacin se presenta en la siguiente tabla los componentes y el volumen utilizados durante el desarrollo del presente trabajo con el uso de un biorreactor.

Tabla 2.1. Composicin del medio de melaza de caa utilizada para la fermentacin.

Componentes Melaza de caa Extracto de levadura Sulfato de Magnesio Sulfato de Manganeso Agua destilada (cbp)

Cantidad 1.0204 kg 25 g 3.0 g 0.15 g Completar el litro

La concentracin de melaza de caa seleccionada se pes y se disolvi en agua esterilizada hasta alcanzar un volumen total de 5000 ml, se calent y agit hasta su completa disolucin y homogenizacin. Posteriormente se esteriliz por 20 minutos a 15 libras de presin en una autoclave dejndose enfriar por una hora y finalmente se le adicionaron las sales especificadas en la tabla anterior.

b. Elaboracin de macerado con banano de rechazo a partir de la pulpa de banano de rechazo para la produccin de la cepa Saccharomyces cerevisiae fue obtenido por estrujado y filtrado y ajustado por disolucin con agua destilada utilizando la tcnica descrita por Bonilla & Gonzlez (2000) para la elaboracin de la pulpa de banano utilizada en la fermentacin. A continuacin se presenta en la siguiente tabla los componentes y el volumen utilizados durante el desarrollo del presente trabajo con el uso de un biorreactor.

Tabla 2.3 Composicin del sustrato de banano utilizado como medio de fermentacin. Componentes Pulpa de banano Extracto de levadura Sulfato de Magnesio Sulfato de Manganeso Agua destilada
Fuente: Lpez et al., 2004

Cantidad 1 kg 25 g 3.0 g 0.15 g Completar el litro

Mtodo. Se utiliz banano con grado 7 de maduracin o banano de rechazo por disolucin con agua destilada a 23.5 Brix ajustando el pH a 4.8- 5.2, el banano se lav con agua fra y se escald por 10 min con vapor a una temperatura de 80C. Posteriormente se pel y se realiz una molienda con 43

una malla de 0.125 pulgadas con lo que se obtuvo una pulpa fina, este concentrado se puso a bao mara por 10 min a 80 C dejndose enfriar para luego ser colocado en matraces de 1000 ml los cuales se esterilizaron en un autoclave a 121C/15 lb, para despus verterlos en la jarra del biorreactor.

2.6.3 Tcnicas fisicoqumicas utilizadas 2.6.3.1 Tcnica del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) Es una tcnica de xido-reduccin que se basa en la capacidad de la glucosa para reducir el cido 3,5-dinitrosaliclico bajo determinadas condiciones; esta reduccin produce una coloracin que se hace ms intensa a medida que aumenta la concentracin de azcares reductores. Se evidencia por medio de la lectura de la absorbancia en espectofotmetro, lo que conlleva a la aplicacin de la Ley de Beer- Lambert (Miller, 1959). El fundamento de esta tcnica consiste en la oxidacin de la glucosa, sin embargo, la glucosa en solucin acuosa se encuentra en su forma cclica que es muy estable y por lo tanto, no reacciona. Por esta razn, es necesario calentar la muestra para que el anillo se abra dejando expuesto el aldehdo dando lugar a una reaccin de oxidacin como se observa en la Figura 4 (Routh et al., 1990).

Figura 4. Estructura del anillo antes y despus de ser sometido a un proceso de calentamiento (http://www.infoagro.com/viticultura/vino/analisis_vinos5.asp).

Para que se d la reaccin tambin es necesario proporcionar un medio alcalino; esto es posible gracias a la adicin de NaOH el cual es una base fuerte. En solucin acuosa se ioniza liberando Na+ y OH- al medio, el cual se alcaliniza, permitiendo la oxidacin de la glucosa; en esta oxidacin, el carbono del grupo

aldehdo se convierte en un cido carboxlico por la prdida de hidrgenos y la ganancia de oxgeno, obtenindose de esta forma el cido glucnico; por otro lado, el cido 3,5 dinitrosaliclico es reducido gracias a la accin del tartrato de sodio y potasio y de la oxidacin de la Glucosa. Esta tcnica fue utilizada para hacer la preparacin en base a los siguientes volmenes de reactivos (tabla 13), calculados en base a los fundamentos estipulados por Miller. Tabla 2.4. Tcnica Miller DNS Agregara a la Mezcla: Agua destilada 3,5 Acido Dinitrosaliclico Hidrxido de sodio Disolver sobre, aadir: Sales (tartrato de sodio y potasio) Fenol (a 50 C) Metabisulfito de Sodio
Autor: Miller 1959

Cantidad 1416 mL 10.6 g 19.8 g 306 g 7.6 mL 8.3 g

2.6.3.2 Curva Patrn DNS .A partir de cada una de las soluciones hidrolizadas de sacarosa y en tubos protegidos por la luz, se procede con el siguiente protocolo para la adicin de los siguientes reactivos que se muestran en la tabla 2.5. Nmero de 1 Tubos Glucosa 0 mL Agua Destilada 0.5 mL DNS 1.5 mL 2 0.1 mL 0.4 mL 1.5 mL 3 0.2 mL 0.3 mL 1.5 mL 4 0.3 mL 0.2 mL 1.5 mL 5 0.4 mL 0.1 mL 1.5 mL 6 0.5 mL 0 mL 1.5 mL

Tabla 2.5 Datos obtenidos para realizar la curva patrn de la tcnica DNS Mtodo: 1) En una rejilla se colocaron 6 tubos de ensayo aadindoles los reactivos correspondientes. 2) Se agitaron los tubos en Vrtex. 3) Se llevaron a ebullicin a 92C durante 5 minutos. 4) Se fren la reaccin con agua fra durante 5 minutos. 5) Se adicionaron 8 mL de agua destilada a cada uno de los tubos. 45

6) Posteriormente se realizaron las determinaciones de absorbancia (540nm) ajustando el 0 de absorbancia con el blanco de la prueba. 7) Por ltimo, con los datos obtenidos se realiza una curva patrn, para la determinacin de la concentracin de azucares reductores. 2.7 Obtencin de la cepa Saccharomyces cerevisiae. Se parti del uso de 3 levaduras liofilizadas comerciales para panificacin y se realizaron los siguientes pasos: 1. Activacin de las levaduras comerciales sembrada en PDA 2. Purificacin de S. cerevisiae. 3. Mantenimiento de S. cerevisiae. 4. Inoculacin del medio de cultivo

2.7.1 Activacin de la levadura comercial Las levaduras liofilizadas comerciales para panificacin, S. cerevisiae, se activaron usando agua estril. Se esterilizaron 9 tubos de ensayo (16 x 150 ml) con 10 ml de agua destilada cada uno. A cada tubo se le agreg un inculo de 1.0 g de levadura liofilizada de diferente marca en un rea protegida de contaminacin con mecheros bunsen. Se colocaron en un bao mara a 35C por 30 minutos. Se incubaron en un horno a 28C por 24 horas, despus de los cuales se midi el pH de un tubo de diferente levadura comercial con un potencimetro. Finalmente se tom una muestra por frotis simple y se observ el crecimiento celular en un microscopio ptico. No existi contaminacin microbiolgica en las muestras, y por lo tanto se realiz el aislamiento de la levadura S. cerevisiae como se describe a continuacin.

2.7.2 Purificacin de S. cerevisiae

El aislamiento de la levadura se realiz mediante el empleo de un medio selectivo; PDA (Gutirrez y Gmez, 2008; Yegres et al., 2003; Zapata et al., 2002) en esta etapa se realiz la toma de muestra y siembra en condiciones aspticas. Del producto obtenido en la etapa (I) se tom con un asa de inculo del tubo, se sembr en PDA por estra y se incub en una estufa a 28 C durante 5 das. Se observ el crecimiento obtenido.

2.7.3 Mantenimiento de S. cerevisiae Se tom una asada de la cepa pura obtenida en la etapa anterior y se sembr mediante la tcnica de estriado en cajas Petri y tubos de ensaye en medio de cultivo PDA. Los medios inoculados se incubaron a 28 C durante 5 das. Posteriormente, para descartar la posibilidad de contaminacin microbiolgica, se realiz la observacin del crecimiento obtenido en el microscopio.

2.7.4 Inoculacin del medio de cultivo Se toman las resiembras de tubos inclinados y se procede a pasar 3 asadas a los 10 ml de agua previamente esterilizados. Teniendo ya las suspensiones, se toma lectura de ellas en un espectrofotmetro obteniendo diferentes absorbencias para cada una de las muestras

2.8 Pruebas preliminares de fermentacin con melaza de caa 2.8.1 Experimentos a nivel biorreactor El medio de cultivo utilizado para las dos pruebas preliminares fue la melaza de caa, la cual present algunos resultados precisos y determinados en relacin a la puesta en marcha del biorreactor y a la produccin de levaduras, siendo as como posteriormente se pudo trabajar con el medio de cultivo seleccionado para este trabajo como lo fue el jugo del banano de rechazo.

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La melaza de caa fue tratada y extrapolada a un Biorreactor (Modelo Bioflo 110 New Brunswick Scentific Co., Inc) de 7.5 litros de capacidad de acuerdo a la siguiente metodologa:

2.8.2 Activacin de la cepa. Descrita anteriormente en el punto 2.7.1

2.8.3 Preparacin del inculo. Para obtener una concentracin aproximada de 5 x 105 Levaduras /mL; al cultivo de dos tubos inclinados se le adicionaron 5 mL de agua destilada estril (para remover las levaduras del micelio) y de ambas suspensiones de cada tubo se transfirieron a dos matraces de 200 mL los cuales contenan una dilucin de agua destilada con dextrosa, despus ambos matraces se mantuvieron en un agitador mecnico durante 12 horas a una temperatura de 28C,posteriomente se contaron las levaduras en un hemocitometro hasta obtener un promedio de 50 levaduras entre los cuatro cuadrantes, equivalentes a 5 x 105 Levaduras/mL. Estos matraces fueron el medio de activacin para la melaza de caa que fue utilizada para el crecimiento de biomasa dentro del biorreactor mantenindose de la misma forma un monitoreo constante de su funcionamiento.

2.8.4 Produccin de Levaduras Del cultivo anterior de la solucin dextrosa se depositaron IxlO6 levaduras/mL al Biorreactor de 7.5 litros de capacidad conteniendo 5 litros del medio de cultivo de melaza de caa mantenindose una agitacin rotatoria y un monitoreo constante de los lazos de control. Los experimentos con melaza de caa se fueron realizando sin duplicado.

2.8.5 Condiciones de fermentacin.

Para tratar de encontrar una alta concentracin y una mayor sobrevivencia de las levaduras se utilizaron dos combinaciones de aereacin y agitacin presentados en la tabla de resultados para ambos medios con un tiempo de proceso determinado y una temperatura constante. El tiempo de proceso se consider por 12 horas para obtener una buena concentracin de levaduras. Para controlar la espuma se utiliz el antiespumante tipo "A" de siliconas Dow Corning al 10%, agregndose durante la fermentacin bajo condiciones necesarias. Durante el proceso de fermentacin se colectaron muestras de 10 mL del Biorreactor cada 3 horas para determinar lo siguiente: Brix, concentracin de levaduras /mL, y pH presentadas en la tabla de resultados; tambin se tomaron lecturas del porciento de Oxgeno consumido. Al terminar el proceso se obtuvieron resultados que se fueron analizando a detalle durante el proceso, determinando de esta forma nuevas condiciones de uso con el medio de cultivo de jugo de banano de rechazo.

2.8.6 Brix A las muestras colectadas cada 3 horas se les determino la concentracin de Solidos Totales Disueltos (Brix) con un refractmetro marca Atago HSR-500 ya que esta considerado como un estndar en la industria, siendo utilizados por las universidades y profesionales del sector industrial alimentario

2.8.7 Cuenta de Levaduras. A las muestras colectadas cada 3 horas se les determin la concentracin de Levaduras/mL, por el mtodo de recuento celular en cmara de Neubauer. De cada uno de las muestras obtenidas, se tom 1.0 mL y se diluy con 9.0 mL de agua destilada estril, contenida en tubos de ensaye (dilucin 1:10); posteriormente se efectuaron diluciones de 1:100 y 1:1000. Finalmente se efectu un recuento de las levaduras en el hemocitometro y se reportaron Levaduras/mL. 49

2.8.8 Medicin de pH Se mantuvo monitoreando la medicin con el potencimetro del biorreactor a las muestras colectadas cada 3 horas. En las pruebas con melaza de caa no se consider controlar el pH, nicamente fue monitoreado en todo el transcurso del proceso.

2.8.9 Seguimiento para el control de dO2 La medicin se realiz con el mismo sistema del biorreactor que incluye un sensor de DO2 el cual se iba monitoreando consecutivamente a las muestras colectas cada 3 horas. 2.8.10 Azcares reductores Se determinaron las concentraciones de azcares reductores para todas las muestras colectadas cada 3 horas, diluyndose si en su caso el contenido de azucares reductores fuera mayor a 1mg/mL para que se encontrara el rango de 0 a 1mg/mL de glucosa, despus se tomaba una alcuota de 0.5 mL y se agregaban 1.5 mL de solucin de DNS, se agitaban en el vrtex y despus se calentaban en agua hirviendo por 5 minutos hasta que cambiara la coloracin de mbar claro a oscuro, se aforaban a 10 mL adicionando 8 mL de agua destilada y se volva a homogenizar dejndose enfriar y leyendo la absorbancia en el espectrofotmetro a 540 nm calibrando con el blanco, para cada muestra. Con las lecturas de la curva patrn se haca una regresin lineal de concentracin de glucosa contra absorbancia y se calculaba la ecuacin de la regresin lineal correspondiente por medio del programa Excel. Sustituyendo el valor de absorbancia de la muestra en la ecuacin de regresin se calculaba la concentracin de azcares reductores expresados como glucosa, al dato obtenido se multiplicaba por la dilucin.

2.9 Experimento central de fermentacin con banano de rechazo En esta parte del trabajo el medio de cultivo con el que se trabajo fue con la pulpa de banano de rechazo (etapa 7) al cual de la misma forma que la melaza de caa presenta resultados ptimos segn la literatura en cuanto a la produccin de levaduras , este medio fue seleccionado y extrapolado en un biorreactor de cinco litros de capacidad pero con diferentes concentraciones durante su preparacin y siguiendo diferente metodologa en base a la obtencin de resultados que concretaran el crecimiento de biomasa a travs de este medio de cultivo y a la monitorizacin del proceso en cuanto a las funciones correlacionadas a ello. Durante la experimentacin se emplearon tres reactivos ms, todo grado reactivo. En lo que respecta a la formulacin del jugo del banano se emple fosfato de potasio; peptona, y fosfato potsico (bsico). Para el sistema de biorreaccin se emple la levadura comercial de panificacin que tuvo mejor desarrollo durante su inoculacin.

La metodologa a seguir fue la misma que la melaza de caa, solo que aqu se realizando 4 corridas con muestreo doble:

CAPITULO III RESULTADOS

En ste captulo se analizan los resultados obtenidos del presente trabajo, encontrndose como parte importante la traduccin del manual, el ensamblado y funcionamiento del biorreactor marca Bioflo modelo 110 conteniendo una fermentacin alcohlica con dos medios de cultivo distintos, uno de ellos utilizado para pruebas de arranque (melaza de caa) y el otro como objetivo primordial para el desarrollo del presente trabajo (banano de rechazo),haciendo con ambos medios anlisis del crecimiento de microorganismos, medicin de slidos solubles totales (Brix), azcares reductores totales y la monitorizacin respecto al funcionamiento del sistema de regulacin de pH y DO2 en el Bioflo 110.

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3.1 Resultados obtenidos con la traduccin del manual La traduccin del manual del biorreactor Bioflo 110 facilito la operacin del equipo siguiendo las pautas de funcionamiento, sin provocar daos a este, ni lesiones personales. Se pudo dar marcha al proceso ya que se encontr la ubicacin correcta para poder colocar los mdulos del biorreactor en un lugar especfico centrndose en una de las mesas del laboratorio de microbiologa, ya que es una zona lisa, plana y resistente, con suficiente espacio alrededor de la parte trasera y la parte frontal que nos permiti un buen acceso para su correcto funcionamiento.

3.2 Resultados obtenidos del ensamblado El ensamblado determino los puntos claves para el funcionamiento de todo el proceso tomndose en cuenta desde las conexiones elctricas de todos los mdulos que fueron dirigidos en la parte trasera con un voltaje de electricidad suministrado de 110v as como las conexiones que fueron dirigidas al biorreactor como son la de los sensores requeridos que se situaron en la parte frontal de los mdulos y que fueron monitoreados gracias a un simulador de procesos centrado en el primer mdulo del sistema. En cada ensamble o desensamble de los componentes del recipiente se manej una forma adecuada como el recostar la unidad a la placa frontal y al eje del impulsor de agitacin utilizando la posicin correcta en una superficie solamente plana, protegiendo de esta forma el eje del impulsor del peso como lo muestra la figura 3.

Fig. 3 Manejo correcto del conjunto de la transmisin

Poniendo en prctica el buen uso del manual se puede mencionar de forma secuencial la operacin del ensamblado de la siguiente forma: 1. Ensamblado del recipiente El recipiente se empotro en una base de acero inoxidable la cual tiene cuatro pies de goma que le dio estabilidad, alrededor de ella se coloc una manta de calor que es la que mantuvo el control de la temperatura al contenido del recipiente para el medio y gracias a una ventana localizada en esta, el cultivo permaneci durante todo el proceso visible para su inspeccin. 2. Instalacin del recipiente en la base Se coloc el anillo de bloqueo en la base del recipiente alineando lo agujeros del anillo de bloqueo, con los pilares de soporte y deslizndolos a su lugar para dejar descansar slidamente el hombro de cada capilar. Se colocaron las dos gomas de parachoques alrededor del interior del anillo de bloqueo, presionando las dos gomas al borde interior del anillo, para despus descender el recipiente de vidrio a travs del centro del anillo de bloqueo, hasta que los bordes del recipiente descansaron cmodamente en los parachoques de las gomas, orientando el recipiente a manera que las graduaciones en el vidrio fueran claramente visibles encarando a las personas encargadas del proyecto entre los dos pilares de la base del recipiente. 3. Instalacin del deflector

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Se coloc suavemente la placa deflectora, con la lengeta hacia arriba, alrededor de todos los dems instrumentos que sobresalan de la placa del cabezal, incluyendo el serpentn de enfriamiento. 4. Instalacin del impulsor. Para la fermentacin colocamos las hojas del impulsor de acuerdo a la tabla 3, refirindonos a los 7.5 litros. Tabla 3. Distancia desde el fondo de la placa superior al comienzo de la hoja del impulsor 1.3 L Impulsor inferior 4 1/8 in 105 mm Impulsor superior 2 5/8 in 67 mm 3.0 L 6 11/16 in 170 mm 4 in 102 mm 7.5 L 8 7/8 in 225 mm 6 in 165 mm 14 L 12 in 305 mm 9 in 235mm

Se lubricaron ligeramente todas las juntas tricas, hilos y hebras de todos los adaptadores del puerto con grasa de silicona antes de instalar el equipo en la placa superior. Tambin cada vez que se lavaba y se volva a ensamblar el biorreactor se aseguraba que el anillo de ranura. 5. Instalacin del serpentn de enfriamiento Por debajo de la placa superior, se insertaron ambos extremos del serpentn de enfriamiento, tanto el puerto de entrada como el de salida, en ambos puertos se colocaron adaptadores estriados que asegurndolos con la llave allen. 6. Instalacin del rociador se fueron fijando con la mano la placa superior estuviera bien asentado en su

Por debajo de la placa superior se insert el tubo rociador en el orificio indicado para este y de la misma forma se fijaron los tornillos del adaptador con la llave allen. 7. Instalacin del tubo de cosecha En el ensamblado del tubo de cosecha se insert en la placa superior en el puerto del tubo de la cosecha, fijando un adaptador estriado con la mano y de la misma forma utilizando una llave allen para fijar los tornillos de sujecin. 8. Instalacin del tubo muestreador. Trabajando por debajo de la placa superior, se instal el puerto del tubo muestreador, fijando un adaptador estriado con la mano y de la misma forma utilizando una llave allen para fijar los tornillos de sujecin. 9. Instalacin de la sonda de espuma Se instal la sonda del sensor de espuma por encima de la placa superior en la ranura indicada por el manual, de la misma forma se fij a mano el adaptador estriado utilizando la llave allen para poder asegurarlo. 10. Instalacin del tubo de escape de espuma Por debajo de la placa superior se insert el tubo de escape de espuma en el puerto apropiado dentro de la tuerca de sujecin en la que va montada la trampa de espuma, fijando a mano el adaptador estriado y asegurando los tornillos de sujecin con la llave allen. 11. Instalacin de la sonda de nivel Se utiliz una sonda de nivel como parte del sistema antiespumante para detectar el nivel del medio. Trabajando desde arriba de la placa superior, se inserta la sonda de nivel en el puerto correspondiente, apretando a mano el adaptador estriado. 12. Instalacin de los tubos de adicin

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En la parte de la placa superior, se insert el triport o tubo de adicin de tres puertos, dentro del puerto apropiado de la placa, se insertaron dos mangueras de silicona de que fueron colocadas en dos puertos del tripor o (puertos de tres) que se adecuaron para las adicciones del cido-base y antiespumante, apretando la parte estriada del adaptador del triport con los dedos. 13. Instalacin de la prueba de pH Antes de la instalacin, la sonda de pH que se utilizo fue inspeccionada de daos para reemplazarla si en su caso esta estuviera daada, esta sonda se coloc de una manera que no hubiera interferencia entre las dems sondas, el conjunto de deflectores, palas impulsoras y serpentn de refrigeracin. Se tuvo problemas al momento de fijarla a la placa del cabezal, ya que el adaptador estriado que le corresponda no se encontr dentro de los aditamentos y fue fijada con algodn y cinta tape para proteger al medio de una contaminacin. 14. Instalacin de la prueba de DO2. Antes de la instalacin, la sonda de oxgeno disuelto que se utilizo fue inspeccionada de daos, para reemplazarla si en su caso estuviera daada, esta sonda se coloc de una manera que no hubiera interferencia entre las dems sondas y el conjunto de deflectores, palas impulsoras y serpentn de refrigeracin. La sonda fue cubierta ligeramente con glicerol, esta se deslizo suavemente por la parte superior del adaptador estriado del puerto colocndole unos casquillos blancos de plstico antes de insertarla por completo en el puerto como lo indica el manual. Esta sonda se iba ajustando a la altura deseada. 15. Instalacin del sistema de muestreo. El biorreactor Bioflo 110 tiene un sistema opcional de muestreo que est diseado para eliminar aspticamente los residuos de muestras del lote utilizado .Toda esta instalacin del paquete de muestreo puedo ser desinfectada en un autoclave como se hizo desde el inicio del uso. La instalacin de este sistema se hizo de la siguiente forma:

a. Se retir la tuerca de fijacin que esta adyacente al plato del cabezal y se coloc el brazo de soporte del tubo de la toma de muestras por medio del tornillo de sujecin. b. Se colocaron 8 centmetros de manguera de silicona que van dirigidos a dos extremos, uno al de la toma de muestras y otra a un tubo que sobresale a la parte exterior de la plato del cabezal, asegurndose la manguera con una abrazadera de plstico. c. Se le conect a la jeringa estril un filtro que hace que la muestra quede libre de impurezas d. En otra manguera de silicona que sobresale de otro extremo del brazo de soporte se coloc la jeringa con el embolo cerrado. e. Se retir la tapa de una de las botellas de muestra y se coloc dentro del muestreador, fijndola en forma de rosca alistndolo para su uso. 16. Instalacin de la trampa de espuma 1. Se desenrosco la tuerca de fijacin en la parte de la placa superior (o la tuerca de sujecin de base), donde fue montada la trampa en la base del recipiente que quedo ms cercano al tubo de escape de la espuma. 2. Se coloc una arandela en el tornillo de sujecin antes de montar la trampa de espuma del portabotellas, fijndose tambin el soporte en su lugar con la tuerca de sujecin suficientemente floja como para girar el soporte. 3. Despus se coloc una botella de trampa de espuma de 500 ml en el soporte. 4. Habindose realizado esta instalacin se conect una manguera de silicona de 60 centmetros de largo en el tubo ms largo que contiene el tapn de la botella asegurndose este con una abrazadera de plstico y que fue fijado en la parte superior con el tubo de escape de espuma que va coloca en el plato del cabezal sujetado con una abrazadera y fijndose a mano el adaptador estriado del tubo de escape de espuma.

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17. Instalacin del sistema antiespumante. En este caso se instal un matraz con un tubo de salida de 500 ml que contena el lquido antiespumante. El matraz de adicin del antiespumante se conect con una manguera larga de silicona al tubo de adicin de antiespumante que se encuentra situado en la placa del cabezal pasando anteriormente por la bomba peristltica que automticamente adicionaba el antiespumante cuando el controlador de nivel se activaba. Finalmente como lo indican la figura 3a y 3b, cuando el plato del cabezal estuvo cubierto por los aditamentos que requeramos y que eran necesarios para trabajar con el equipo se fueron cerrando los puertos no utilizados instalando un tapn ciego (sin agujero) en cada puerto de la placa del cabezal, fijando de igual forma las mangueras de silicona con una abrazadera de plstico y manteniendo cerrado cualquier tubo de acceso que no fuera utilizada, de esta manera se pudo iniciar la operacin del equipo comenzando con las primeras pruebas de arranque con el medio de melaza y continuando con lo que finalmente fue el jugo de banano de rechazo.

Figura 3a y 3b Muestran los resultados obtenidos por el ensamblado para su total funcionamiento.

3.3 Resultados de las pruebas preliminares con melaza de caa El Bioflo permite variar las velocidades de agitacin. Para la primera prueba se determin una velocidad de agitacin ptima de 250 r.p.m a 1.5 v.v.m de flujo de aire para efectuar una fermentacin alcohlica en el Biorreactor; con ste fin se configura el sistema de temperatura, regulacin de pH y de oxgeno disuelto, empleando melaza de caa como medio de cultivo para determinar cada 3 horas desde el tiempo de inicio la concentracin de Brix, azucares reductores y conteo de levaduras de igual forma se sigue el monitoreo constante del funcionamiento del sensor de oxgeno disuelto y del pH. Tabla 3.1 Resultados obtenidos de la primera prueba de arranque con melaza de caa como medio de cultivo.

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HORAS 0 3 6 9 12

TIEMPO 0 1 2 3 4

AGITACIN 250 rpm 250 rpm 250 rpm 250 rpm 250 rpm

BRIX 5 4 3.5 2.5 1

pH 5.15 4.36 4 3.18 3

dO2 80 36 -0.34 20 20

CONTEO DE LEVADURAS 10,112,000 10,800,000 15,400,000 26,300,000 35,540,000

A velocidad de agitacin de 250 r.p.m. se presenta turbulencia automtica a las 3 horas, se visualiza que el parmetro de oxgeno disuelto arroja un dato negativo, el sistema de agitacin se desajusta y provoca que la velocidad del impulsor automticamente aumente a 1400 r.p.m provocando la formacin de espuma, lo cual no es deseable que se presente en el proceso de fermentacin y se agrega el antiespumante lo que hace que disminuya el nivel de espuma y se contine con la operacin reiniciando la operacin de agitacin a 250 r.pm. Para la segunda prueba se prev calibrar de nuevo las sondas de pH y de oxgeno disuelto, se realiza la esterilizacin nuevamente de todo el equipo y la melaza es diluida a 10 Brix, aqu se trabajan en diferentes condiciones determinando una velocidad de agitacin ptima de 350 r.p.m a 2.5 v.v.m de flujo de aire, se inicia el proceso obtenindose los siguientes resultados mostrados en la tablas 3.1 y 3.2. Tabla 3.2. Resultados obtenidos de la segunda prueba de arranque con melaza de caa como medio de cultivo.
HORAS 0 3 6 9 12 TIEMPO 0 1 2 3 4 AGITACIN 350 rpm 350 rpm 350 rpm 350 rpm 350 rpm BRIX 6.5 5 4.5 3.5 2 pH 6.15 5.18 4.64 4.12 3.36 dO2 75 70 76 60 20 CONTEO DE LEVADURAS 10,346,000 22,200,000 37,700,000 42,000,000 56,900,000

Las grficas de crecimiento para cada fermentacin se presentan a continuacin con el fin comparativo de las mismas.

3.3.1 Resultados de slidos solubles totales y porcentaje de sacarosa Debido a que todas las muestras tomadas se midieron a 28 C no fue necesario realizar correccin con tablas a los datos obtenidos.

Grfica 3.Curva comparativas de Brix para fermentaciones con melaza de caa

El porcentaje de sacarosa medido a las 12 horas de cada fermentacin fue de 1 y 2 % de sacarosa. 3.3.2 Resultados de crecimiento de microorganismos Para las dos fermentaciones con melaza de caa, se presentan los datos de crecimiento determinados por el conteo cmara Neubauer con los rangos de error de precisin respectivos. Se calcul de acuerdo a la formula enunciada en el procedimiento para conteo de microorganismos. nicamente de manera preliminar se mantuvo el sistema de regulacin de pH sin control del Bioflo, observndose que en el transcurso de la fermentacin se form un precipitado debido a la baja solubilidad del Carbonato de calcio en el medio, presentando problemas para realizar conteo de levaduras. En estas pruebas de arranque no se detectaron diferencias significativas entre ambos tratamientos a pesar de que sensor del oxgeno disuelto presento unas fallas debido a un dao situado en la punta de la membrana. En esta segunda prueba la melaza fue diluida a 10 Brix determinndose de esta manera una mayor produccin de levaduras con los inculos vertidos de la solucin de dextrosa.

61

Grfica

3.1

.Curvas

comparativas

de

crecimiento

de

levaduras

para

fermentaciones con melaza de caa sin control de pH.

3.3.3 Resultados de azcares reductores residuales Los resultados obtenidos de la curva de calibracin para los azcares reductores se presentan en la grfica 3.2, as como tambin se presenta la tabla 3.3 y 3.4 en la cual se localizan las concentraciones de los estndares empleados para la curva de calibracin, presentando en ambas fermentaciones una regresin lineal de 0.9719 y 0.9733, lo cual nos determina que el mtodo es confiable para poder utilizarla y para determinar la concentracin de azcares reductores presentes en el medio de cultivo de melaza de caa en el cual durante el transcurso de la transformacin nos da el azcar residual presente y de esta manera se obtiene informacin concerniente a la formacin de levaduras a partir de los azcares presentes. Tabla 3.5. Concentraciones estndares utilizadas para la curva de calibracin de la 1 fermentacin con melaza de caa. HORAS 0 3 6 9 12 AGITACIN 250 rpm 250 rpm 250 rpm 250 rpm 250 rpm ABSORBANCIA 0.675 0.6 0.523 0.41 0.31 CONCENTRACIN A.R (mg/mL) 0.721 0.654 0.575 0.51 0.367

Tabla 3.6. Concentraciones estndares utilizadas para la curva de calibracin de la 2 fermentacin con melaza de caa. HORAS 0 3 AGITACIN 350 rpm 350 rpm ABSORBANCIA 0.73 0.693 CONCENTRACIN A.R (mg/mL) 0.82 0.76

6 9 12

350 rpm 350 rpm 350 rpm

0.553 0.442 0.332

0.68 0.525 0.41

Grfica 3.2 Curvas comparativas de azcares reductores en los medios de melaza de caa.

3.4 Resultados de las pruebas centrales con banano de rechazo 1 y 2 corrida sin control de pH En ambas corridas se pudo mantener al sistema con un ambiente favorable para la operacin del proceso biolgico deseado, asegurando la mezcla y la aireacin adecuada, no hubo contaminacin del medio debido a que toda la esterilizacin del material fue un xito. El contenido mximo de oxgeno realmente fue bajo El sistema de aspersin se asegur correctamente y fue lo que hizo que las burbujas fueran de tamao muy pequeo, de modo que la disolucin del oxgeno de la burbuja en el seno del lquido puedo efectuarse con facilidad. Tabla 3.6. Resultados obtenidos de la 1 corrida con banano de rechazo como medio de cultivo con agitacin a 250 rpm, sin control de pH.
TIEM P O A G ITA C I NB RIX 0 250 rp m 5.5 3 250 rp m 5 6 250 rp m 4.5 9 250 rp m 4 12 250 rp m 2 pH 6.15 5.45 4.09 3.51 3.15 A BS O RBA N C IA (540 n m )O N TEO D E LEV A D U RA S /1-100 C 0.69 166,000,000 0.61 194,000,000 0.58 285,000,000 0.54 312,000,000 0.48 422,000,000

Tabla 3.7. Resultados obtenidos de la 2 corrida con banano de rechazo como medio de cultivo con agitacin a 350 rpm, sin control de pH

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T IE M P OA G IT A C I B R IX N 0 3 5 0 rp m 5 3 3 5 0 rp m 4 .5 6 3 5 0 rp m 4 9 3 5 0 rp m 3 12 3 5 0 rp m 2

p H A B S O R B A N C IA ( 5 4 0C n m )T E O D E L E V A D U R A S / 1 - 1 0 0 ON 5 .4 5 0 .7 3 120,000,000 5 .1 0 .6 9 3 168,000,000 4 .0 9 0 .5 5 3 724,000,000 3 .5 1 0 .4 4 2 1 ,0 0 0 ,0 0 0 , 0 0 0 3 .1 5 0 .3 3 2 1 ,2 1 2 ,0 0 0 , 0 0 0

Grafico 3.3 Curva comparativas de Brix para fermentaciones con banano de rechazo, sin control de pH

Grafico 3.4 Curva comparativas de pH para fermentaciones con banano de rechazo, sin control de pH

Grafico 3.5 Curva comparativas de Absorbancia para fermentaciones con banano de rechazo, sin control de pH

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Grafico 3.6 Curva comparativas de conteo de levaduras para fermentaciones con banano de rechazo, sin control de pH

3.6 Resultados de las pruebas centrales con banano de rechazo 3 y 4 corrida con control de pH

El Biorreactor Bioflo 110 consta de un sistema de cuatro bombas peristlticas asignables dependiendo la variable a controlar. Cada bomba tiene un modo de funcionamiento y operacin dependiendo del parmetro a controlar en una fermentacin discontinua o continua. Los modos de funcionamiento son los siguientes: Modo Off: En ste modo la bomba no tiene ningn funcionamiento ya que no responde al Feedback Control Loop. La bomba se encuentra apagada. Modo Manual: Este modo funciona cumpliendo ciclos variables de las bombas. Se le asigna un valor especifico entre 0% y 100%, que determina un caudal para un porcentaje de velocidad. Tabla 3.7 Resultados obtenidos de la 3 corrida con banano de rechazo como medio de cultivo con agitacin a 350 rpm, con control de pH

TIE M P O 0 3 6 9 12

A G ITA C I N BR IX 350 rp m 6 350 rp m 5.5 350 rp m 4.5 350 rp m 3 350 rp m 2

p H A B S O R B A N C IA (540 nCm )N TEO D E LE V A D U RA S /1-100 O 6.15 0.824 178,000,000 6.15 0.785 206,000,000 6.15 0.718 259,000,000 6.15 0.629 394,000,000 6.15 0.596 472,000,000

Tabla 3.8 Resultados obtenidos de la 4 corrida con banano de rechazo como medio de cultivo con agitacin a 250 rpm, con control de pH
T IE M P O A G IT A C I N B R IX 0 2 50 rp m 6 3 2 50 rp m 5 6 2 50 rp m 3 .5 9 2 50 rp m 3 12 2 50 rp m 0 p H A B S O R B A N C IA ( 54 0 C O N) T E O D E L E V A D U R A S / 1- 1 00 nm 6 .1 5 0.6 1 8 3 58 ,00 0 ,0 0 0 6 .1 5 0.5 2 9 4 10 ,00 0 ,0 0 0 6 .1 5 0.4 2 2 5 76 ,00 0 ,0 0 0 6 .1 5 0.3 8 9 6 20 ,00 0 ,0 0 0 6 .1 5 0.2 8 5 7 23 ,00 0 ,0 0 0

En las tablas 3.7 y 3.8 se puede apreciar el funcionamiento correcto del sistema Bioflo 110 en el Modo Base y Acido, el sistema de regulacin de pH entr en funcionamiento, el modo cido y base en las bombas peristlticas realizaron la accin de control de pH a un valor especfico de 6.15, de igual forma el Modo On funciono cumpliendo una operacin de velocidad fija en la bomba y su valor fue de 125%, donde la bomba funcion de manera continua. Para calcular la variacin de pH a lo largo de las fermentaciones, se presentan en las tablas 3.7 y 3.8 los porcentajes de variacin de pH. El porcentaje de variacin se calcul comparando dos valores en la fermentacin, uno comparando el valor de pH del da final respecto al inicial y otro comparando el valor de pH mayor durante la fermentacin respecto al pH ms bajo en la misma. Los porcentajes de variacin de pH calculados en la 3 y 4 corrida.

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Grafico 3.7 Curva comparativas de Brix para fermentaciones con banano de rechazo, con control de pH.

El porcentaje de sacarosa medido para todos los medios de la fermentacin de la 3 y 4 corrida fue del 2 %., disminuyendo los STD en el medio.

Grafico 3.8 Curva comparativas de pH para fermentaciones con banano de rechazo, con control de pH.

Grafico 3.9 Curva comparativas de Absorbancia para fermentaciones con banano de rechazo, con control de pH

Grafico 3.10 Curva comparativas de conteo de levaduras para fermentaciones con banano de rechazo, con control de pH 69

CONCLUSIONES

 Se elabor una traduccin completa del manual y funcionamiento del sistema del biorreactor Bioflo 110, dirigiendo el funcionamiento del sistema en cuanto a la regulacin de pH y dO2, para el manejo de flujos de entrada y salida en el biorreactor a diferentes velocidades de flujo. El desarrollo de estos cuatro experimentos de fermentacin bajo regulacin de pH a 6.15, temperatura constante de 28 C, agitacin de 250 rpm en el Biorreactor marca Bioflo 110 present un mayor rendimiento en cuanto a variables tales como crecimiento de levaduras .El control de la variable pH present una incidencia directa en el desarrollo de una fermentacin mejorando el rendimiento de acuerdo a la formacin de producto y crecimiento de la levadura. De acuerdo a los parmetros determinados en una fermentacin con regulacin de pH, el crecimiento de microorganismos y en la produccin de en la biomasa, consumo de sacarosa, variacin de slidos solubles, contenido de azcares reductores residuales son reproducibles en el biorreactor ya que presentan similitud en las dos fermentaciones realizadas El jugo de banano present un alto potencial de uso como sustrato en los procesos fermentativos logrando altos rendimientos con respecto a los valores tericos reportados, lo que lo convierte en un sustrato promisorio para las fermentaciones alcohlicas. Cada uno de los procesos por separado arroj buenos resultados, permitiendo concluir que el jugo de banano es un sustrato promisorio en los procesos de inmovilizacin que permiten incrementar su productividad. Sin embargo en el caso del Biorreactor se requiere considerar otro tipo de sustratos.

Se pudo observar como Saccharomyces cerevisiae una vez adaptada al medio es capaz de incrementar su biomasa a travs del consumo de 71

sustratos, en este caso, la glucosa, al tiempo que incrementa la acidez del medio y disminuye su pH, efecto ejercido por el cido actico producido durante su metabolismo. Su crecimiento es rpido, el corto tiempo de adaptacin al medio as como una amplia fase lag demuestra el porqu de su amplia utilizacin en la industria, as que el monitoreo de la cintica de crecimiento de microorganismos es de gran importancia, ya que nos puede permitir definir el tiempo de reaccin que necesita un sustrato determinado para obtener un producto deseado, o en su defecto se pueden definir las condiciones de un reactor BioFlo 110 con estos parmetros.

RECOMENDACIONES Antes de utilizar el equipo, se recomienda leer todo lo referente al manual de mantenimiento general del equipo, manual de operacin en proceso y recomendaciones generales del uso de equipo.

 De igual manera, es muy importante tener un sustento terico de los fenmenos de las fermentaciones alcohlica y actica, para as realizar una correcta fase experimental llevada de la mano con un correcto conocimiento terico. Se recomienda ser cuidadosos durante el uso y almacenaje del equipo, para evitar daos en la integridad tanto fsica, elctrica y mecnica. Operar correctamente, aplicando las buenas prcticas de manufactura (BPM) en cada proceso. Se recomienda implementar equipos auxiliares o de asistencia en los laboratorios o planta de alimentos en la universidad, tales como: Refractmetros, balanzas, potencimetros, medidor de ppm, alcoholmetros, cubas y recipientes, tamices y equipos de filtracin, agua filtrada, reactivos, etc.

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