Instituto de Biologa, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

CINTICA ENZIMTICA DE LA TIROSINASA

Dairon Andrs Machado Agudelo
Instituto de Biologa, facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Antioquia 12 de julio de 2012

Primer experimento
En primer lugar, se realiz la extraccin de la enzima a partir de fracciones de banano. Hecho el debido procedimiento, se obtuvo 7.5 mL de extracto enzimtico, que fue llevado hasta 9.5 mL con solucin buffer de fosfato 0.1 M (pH = 7.2) en un tubo para centrifuga. Una vez realizada la centrifugacin, se extrae el sobrenadante y se diluye nuevamente en solucin buffer. Esta solucin de extracto enzimtico en colocado en un bao de hielo, para evitar la desnaturalizacin de la protena. Se procede entonces a servirse las distintas concentraciones de extracto enzimtico en 4 tubos de ensayo, con tubo 1 = 1.0 mL, tubo 2 = 1.5 mL, tubo 3 = 2.0 mL, tubo 4 = 2.5 mL de extracto, siendo el volumen de todos los tubos v = 6 mL; se realizaron las respectivas mediciones de absorbancia en el fotocolormetro. Los datos obtenidos se encuentran consignados en la tabla 1.

Tubo Tiempo (min)

1 0.14 0.17 0.23 0.30 0.36 0.42 0.46 0.50 0.52 0.53 0.53

2 Absorbancia 0.07 0.10 0.20 0.28 0.35 0.41 0.46 0.49 0.51 0.51 0.50

3 0.11 0.17 0.27 0.37 0.46 0.54 0.55 0.55 0.56 0.55 0.55

4 0.17 0.24 0.38 0.50 0.58 0.61 0.61 0.61 0.61 0.60 0.60

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Tabla 1: Medida de la absorbancia de distintas concentraciones de extracto enzimtico respecto del tiempo.

Con base en estos datos, se realizaron la grficas de absorbancia vs tiempo para cada uno de los tubos. En principio, los datos deben presentar una tendencia lineal, de acuerdo a la ecuacin de Beer-Lambert; la pendiente de la grfica representar la concentracin [S] del sustrato. En cada grfica aparecer su correspondiente valor de coeficiente de correlacin R2 que nos indicar el grado de confiabilidad de la funcin lineal que representa la serie de datos. 1

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Absorbancia vs tiempo
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 Tiempo (min) Absorbancia y = 0.0952x + 0.1489 R = 0.9695

Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 1: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 1, con 1 mL de extracto enzimtico.

Absorbancia vs tiempo
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 4 5 Tiempo (min) Absorbancia y = 0.1193x + 0.0802 R = 0.9688 Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 2: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 2, con 1.5 mL de extracto enzimtico.

Absorbancia vs tiempo
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 Tiempo (min) 3 4 Absorbancia y = 0.1607x + 0.1118 R = 0.9776 Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 3: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 3, con 2 mL de extracto enzimtico.

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Absorbancia vs tiempo
0.7 0.6 Absorbancia 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 1.5 Tiempo (min) 2 2.5 3 Absorbancia Linear (Absorbancia) y = 0.1909x + 0.1748 R = 0.9698

Ilustracin 4: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 4, con 2.5 mL de extracto enzimtico.

Con estos datos, procedemos a calcular la actividad enzimtica AE multiplicando los factores de dilucin de cada concentracin de extracto enzimtico por la pendiente de la curva correspondiente:

Comparando los distintos valores, podemos notar que son relativamente cercanos, y ni siquiera es posible notar algn tipo de gradacin entre las diferentes concentraciones. En particular AE2 y AE3 son relativamente cercanos uno de otro. Podemos ver que el valor ms lejano de todos es AE1; es preciso considerar que en el tubo 1 obtuvimos un mayor nmero de puntos para la grfica, mientras que en los dems fue preciso descartar algunos para poder obtener la tendencia lineal que ms se ajustaba a los propsitos de este experimento. Al sacar promedio, encontramos que el valor de la actividad enzimtica de la tirosina es 0.82. Despus, procedimos a preparar una solucin de extracto enzimtico de igual composicin a la del tubo 3; dicha solucin fue llevada a calentamiento en bao mara por 5 min, tras lo cual se dej enfriar. Hecho lo anterior, se le agreg 1 mL de L-metildopa y se llev al fotocolormetro, obteniendo los datos consignados en la tabla 2.

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Tiempo (min) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Absorbancia 0.1 0.11 0.11 0.12 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11

Tabla 2: Medida de la absorbancia de una solucin de extracto enzimtico sometida a calentamiento respecto del tiempo.

Estos datos fueron graficados, obteniendo la curva que representa la ilustracin 5.

Absorbancia vs tiempo
0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 1 2 3 Tiempo (min) 4 5 6 Absorbancia

y = 0.0005x + 0.1086 R = 0.0409

Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 5: Grfica de absorbancia vs tiempo de extracto enzimtico sometido a calentamiento.

Podemos observar que la pendiente de la curva es cero, lo que indica que no hubo ningn cambio en la absorbancia y por tanto en la concentracin del sustrato. Podemos concluir que el calentamiento ha inactivado de alguna forma al enzima, posiblemente desnaturalizndola, hacindola de esta suerte incapacitada para catalizar la reaccin. Otro medio que se puede usar para inactivar el enzima es por medio de un inhibidor, como el cianuro, el cual realiza una inhibicin no competitiva de la tirosinasa, es decir, no impide la unin del sustrato al enzima pues se une a un sitio alostrico, que altera la conformacin del sitio activo y de este modo la incapacita para catalizar la reaccin.

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Segundo experimento
Se realiz la extraccin del enzima de modo similar al primer experimento; vale notar que en este caso, tras la centrifugacin, no se pudo observar el precipitado en el tubo, caso contrario a lo sucedido en el primer experimento. En esta ocasin, se prepararon 6 tubos con 1 mL de extracto enzimtico cada uno, y con diferentes cantidades de L-metildopa segn se relaciona a continuacin: tubo 1 = 0.5 mL, tubo 2 = 1.0 mL, tubo 3 = 1.5 mL, tubo 4 = 2.0 mL, tubo 5 = 2.5 mL y tubo 6 = 3.0 mL. El volumen de todos los tubos era v = 5 mL, completndose en cada caso el volumen total con solucin buffer de fosfato 0.1 M (pH = 6.0). Luego, a cada tubo se le realiz la respectiva lectura de absorbancia por espacio de 5 min. Los datos obtenidos en esta experiencia se encuentran registrados en la tabla 3.

Tubo Tiempo (min)

1 0.01 0.05 0.09 0.13 0.15 0.19 0.21 0.24 0.27 0.29 0.32

2 0.04 0.05 0.07 0.13 0.19 0.25 0.30 0.35 0.37 0.40 0.41

5 0.08 0.11 0.19 0.25 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27 0.27

6 0.1 0.11 0.11 0.14 0.19 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22 0.22

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0

Absorbancia 0.04 0.1 0.06 0.12 0.09 0.14 0.16 0.21 0.24 0.25 0.32 0.28 0.34 0.28 0.36 0.28 0.36 0.28 0.36 0.28 0.36 0.28

Tabla 3: Medida de la absorbancia de diferentes cantidades de sustrato respecto del tiempo. La concentracin de extracto enzimtico es contante en todos los tubos.

Es necesario anotar que durante la experimentacin, tuvimos problemas con los tubos 3 y 4 pues la celda del fotocolormetro no fue lavada con agua destilada antes de depositar en ella la muestra dejando trazas de la muestra precedente, por lo que tuvimos lecturas demasiado elevadas de absorbancia, tendientes a una lnea de pendiente cero. Por lo tanto, fue preciso repetir la experiencia. Para los dems casos, no tuvimos mayores inconvenientes. A partir de estos datos se realizaron las correspondientes grficas de absorbancia vs tiempo para cada una de las concentraciones de sustrato. La pendiente que obtengamos de las grficas representar la velocidad inicial Vi de reaccin para cada una de las concentraciones; esto es posible deducirlo considerando las ecuaciones de Beer-Lambert y de Michaelis-Menten. Cada grfica ser presentada con su respectivo coeficiente de correlacin R2.

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Absorbancia vs tiempo
0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 1 2 3 Tiempo (min) 4 5 6 Absorbancia y = 0.0605x + 0.0259 R = 0.992 Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 6: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 1, con 0.5 mL de L-metildopa.

Absorbancia vs tiempo
0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 3 Tiempo (min) 4 5 6 Absorbancia Linear (Absorbancia) y = 0.0855x + 0.0191 R = 0.9738

Ilustracin 7: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 2, con 1.0 mL de L-metildopa.

Absorbancia vs tiempo
0.5 Absorbancia 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 1 2 Tiempo (min) 3 4 y = 0.105x + 0.0175 R = 0.964 Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 8: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 3, con 1.5 mL de L-metildopa.

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Absorbancia vs tiempo
0.3 0.25 Absorbancia 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 Tiempo (min) 2 2.5 3 y = 0.0777x + 0.0862 R = 0.9667 Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 9: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 4, con 2.0 mL de L-metildopa.

Absorbancia vs tiempo
0.3 Absorbancia 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Tiempo (min) y = 0.104x + 0.076 R = 0.9657 Absorbancia Linear (Absorbancia)

Ilustracin 10: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 5, con 2.5 mL de L-metildopa.

Absorbancia vs tiempo
0.25 Absorbancia 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 Tiempo (min) 2 2.5 3 Absorbancia Linear (Absorbancia) y = 0.0497x + 0.0829 R = 0.8899

Ilustracin 11: Grfica de absorbancia vs tiempo del tubo 6, con 3.0 mL de L-metildopa.

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Procedemos entonces a determinar la concentracin de sustrato [S] al final de cada reaccin por medio de la siguiente ecuacin: [ ] [ ]

Donde: [S]f = concentracin final del sustrato [S]i = concentracin inicial del sustrato = 0.03 M v2 = volumen final de la solucin = 5 mL v1 = volumen adicionado de sustrato Todos estos datos quedan consignados en la tabla 4, adems de aquellas relaciones derivadas de las linealizaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten a saber, las de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee. Por medio de las grficas de tales ecuaciones, podremos determinar los valores que describen la cintica enzimtica de la tirosinasa.

Tubo 1 2 3 4 5 6

[S]f 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018

Vi 0.060 0.085 0.105 0.077 0.104 0.049

1/[S] 333.3 166.7 111.1 83.3 66.7 55.6

1/Vi 16.7 11.8 9.5 12.99 9.6 20.4

Vi/[S] 20 14.17 11.67 6.42 6.93 2.72

Tabla 4: Valores derivados del experimento para las ecuaciones de Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee.

A continuacin, presentamos las grficas que relacionan los valores de la tabla 4, que representan la cintica del enzima que estamos analizando.

Vi vs [S]
0.15 0.1 Vi 0.05 0 0 0.005 0.01 [S] 0.015 0.02 Vi

Ilustracin 12: Grfica de la velocidad de reaccin vs la concentracin del sustrato, segn la relacin de MichaelisMenten.

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1/Vi vs 1/[S]
25 20 15 1/Vi 10 5 0 0 50 100 150 1/[S] 200 250 300 350 1/Vi Linear (1/Vi) y = 0.0077x + 12.447 R = 0.0353

Ilustracin 13: Grfica de la relacin de Lineweaver-Burk.

Vi vs Vi/[S]
0.12 0.1 0.08 Vi 0.06 0.04 0.02 0 0 5 10 Vi/[S] 15 20 25 Vi

Ilustracin 14: Grfica de la relacin de Eadie-Hofstee.

Como podemos observar, ninguna de las grficas representa lo esperado, y resulta sencillamente imposible determinar los valores de KM y Vmax en este caso. Entre las distintas causas del fracaso de esta experimentacin puede estar el hecho de la repeticin de los tubos 3 y 4, fallas de precisin en el fotocolormetro, posibles errores de lectura, alguna posible demora en introducir la muestra en la celda y a su vez tardanza en introducir la celda en el fotocolormetro, lo que hara que el enzima ya llevara algo de accin antes de la lectura, lo que afecta la lectura de absorbancia. Esta ltima causa la considero altamente probable, pues las grficas de las absorbancias arrojan todas sendas funciones lineales, que es lo esperado. Pero si se nota que no existe un orden de gradualidad entre las mismas, y no se presenta la tendencia esperada en cuanto a la rapidez para llegar a su punto mximo de absorbancia; tambin existe variacin en la absorbancia de partida, como vemos en los tubos 4, 5 y 6. 9

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Por las anteriores razones, procederemos a omitir los puntos relacionados con los tubos 4, 5 y 6, y a graficar tan solo los tres primeros tubos.

Vi vs [S]
0.12 0.1 0.08 Vi 0.06 Vi 0.04 0.02 0 0 0.002 0.004 [S] 0.006 0.008 0.01

Ilustracin 15: Grfica de la velocidad de reaccin vs la concentracin del sustrato, segn la relacin de MichaelisMenten, omitiendo los tres ltimos puntos de la tabla 4.

1/Vi vs 1/[S]
18 16 14 12 10 1/Vi 8 6 4 2 0 0 50 100 150 1/[S] 200 250 300 350 1/Vi Linear (1/Vi) y = 0.0317x + 6.2066 R = 0.9943

Ilustracin 16: Grfica de la relacin de Lineweaver-Burk, omitiendo los tres ltimos puntos de la tabla 4.

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Vi vs Vi/[S]
0.01 0.009 0.008 0.007 0.006 Vi 0.005 0.004 0.003 0.002 0.001 0 0 5 10 Vi/[S] 15 20 25 Vi Linear (Vi) y = -0.0007x + 0.0164 R = 0.9494

Ilustracin 17: Grfica de la relacin de Eadie-Hofstee, omitiendo los tres ltimos puntos de la tabla 4.

Partiendo de este nuevo planteamiento de grficos, procedimos a determinar los valores de Vmax y KM para cada una de las relaciones representadas. Para la grfica de Vi vs [S] de la ilustracin 15 tenemos que: [ ] [ ] Despejando KM tenemos que: [ ] [ ]

Luego, hicimos lo debido de acuerdo con la relacin de Lineweaver-Burk, representada en la ilustracin 16, tomando los datos de la ecuacin de la recta:

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Donde y es el intercepto y m la pendiente de la recta. Podemos notar que entre los valores de KM obtenidos segn los dos mtodos existe un 26% de diferencia; en cuanto a Vmax tenemos un 34%. En principio, el valor de Vmax obtenido en la ecuacin de Lineweaver-Burk debe ser ms exacto, pues no aproxima el valor, como en Michaelis-Menten, sino que obtiene el valor real en una lnea recta, y algo similar hemos de pensar sobre el valor de KM pues se deriva a partir del anterior. Ahora observemos los valores obtenidos en la grfica de Eadie-Hofstee:

Donde y es el intercepto y x es el punto en cual la recta corta al eje x. Tanto Vmax como KM han disminuido notablemente sus respectivos valores. En todos los tres casos hemos obtenido valores distantes, pero hay que reconocer que los valores entre Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk estn mucho ms cercanos entre s los mismos respecto a Eadie-Hofstee. En general, Lineweaver-Burk es quizs el que ms se acerque, pues relaciona los recprocos de los valores a graficar, sin complicar ms las relaciones entre los datos de concentracin de sustrato y de velocidad.

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