Departamento de Ciencias Bsicas

Gua Laboratorios Bioqumica

ltima actualizacin: Julio, 2012

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REGLAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA GENERAL PRIMER SEMESTRE 2012.

Actividades prcticas: Se realizarn un total de 5 actividades por cada seccin de prctico, segn se indica: o Reforzamiento. La primera semana se realizar una actividad que consiste en un reforzamiento de clculos matemticos aplicados a pH, ecuacin de HendersonHasselbach, ecuacin de la recta, grfica de ecuaciones no lineales (hiperblicas) y sus recprocos. La actividad se realizar en sala con todos los alumnos, ser de carcter obligatorio y con evaluacin. o Actividades prcticas. Se realizar un total de 4 actividades prcticas en modalidad de dos mdulos semana por medio.

Asistencia: La asistencia debe ser de un 100%. El estudiante que se ausente a un prctico, tendr la oportunidad de realizar una actividad recuperativa, solo cuando su inasistencia sea plenamente justificada por causales mdicos y previamente autorizado por el coordinador del ramo. En el caso ms de una inasistencia, el alumno queda en situacin de reprobar la asignatura. Los estudiantes NO pueden asistir a un grupo de laboratorio diferente al asignado en su carga acadmica. Evaluaciones:

Se realizarn 5 quizzes y 4 informes de laboratorio. Los promedios de quizzes e informes tendrn la misma ponderacin (50% cada uno). Los alumnos tienen la posibilidad de borrar la peor nota de quiz e informe. Los quizzes se tomarn al comienzo de la actividad prctica y tendrn una duracin aproximada de 10 min. El alumno que llegue tarde no podr rendir el control, deber esperar hasta que se inicien las actividades, y ser evaluado con nota 1,0. Los quizzes contemplarn las materias de la gua y lo que sea deducible de ellas; adems son acumulativos, es decir, se preguntar de prcticos anteriores. Los informes debern ser entregados la semana siguiente al prctico por un alumno del grupo. El plazo de entrega es inamovible. El grupo que no entregue el informe, ser evaluado con nota 1,0.

El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la informacin contenida. Cualquier reproduccin de parte o totalidad de la informacin, por cualquier medio, existir la obligacin de citar que su fuente es "Universidad Santo Toms" con indicacin La Universidad se reserva el derecho a cambiar estos trminos y condiciones de la informacin en cualquier momento.

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Presentacin personal y conducta de laboratorio: El estudiante debe presentarse: 1. Puntualmente a la actividad. En el caso de llegar atrasado, podr ingresar al laboratorio una vez terminado el quiz de entrada, y slo en los cinco minutos siguientes de rendido ste. No se permitir el ingreso de estudiantes a la actividad despus de 15 minutos de iniciada sta. 2. Con delantal, pelo tomado (si corresponde), zapato cerrado (no chalas ni sandalias), pantaln cerrado (no bermudas ni faldas). Asimismo, debe evitarse el uso de accesorios (anillos, pulseras u otros) que puedan enredarse o limitar la manipulacin de los instrumentos y material de laboratorio. Cada estudiante debe ingresar al laboratorio con su Gua del Laboratorio, de modo que pueda desarrollar la actividad sin entorpecer el trabajo de los dems. La falta reiterada de este material puede ser motivo de una evaluacin mnima (1,0). En el laboratorio slo se permitir el uso de cuaderno, lpices, calculadora, guas y libros de apoyo. Las mochilas y bolsos deben guardarse en los casilleros destinados para tal fin. El estudiante debe evitar situaciones de riesgo, como correr y jugar en el laboratorio. Si el estudiante requiere salir del laboratorio, debe informarle al profesor. Una ausencia prolongada y sin informar puede ser considerada como inasistencia. En el transcurso del prctico No est permitido el uso de aparatos de audio, telfonos celulares, ni el consumo de ningn tipo de bebida o comida (incluido chicle). El profesor puede solicitar al estudiante que abandone el laboratorio si no cumple con esta norma, quedando ausente de la actividad. No existe la posibilidad de apelar a esta sancin, pues el estudiante debe aprender las normas mnimas de comportamiento en un laboratorio.

El usuario solo podr utilizar la informacin entregada para su uso personal y no comercial y, en consecuencia, le queda prohibido ceder, comercializar y/o utilizar la informacin para fines NO acadmicos. La Universidad conservar en el ms amplio sentido la propiedad de la informacin contenida. Cualquier reproduccin de parte o totalidad de la informacin, por cualquier medio, existir la obligacin de citar que su fuente es "Universidad Santo Toms" con indicacin La Universidad se reserva el derecho a cambiar estos trminos y condiciones de la informacin en cualquier momento.

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Pauta para la elaboracin de informes de laboratorio Los informes: Debern tener hasta seis pginas (sin incluir la portada), numeradas en la parte inferior a la derecha, tamao carta (21.59 x 27.94cm) y con tipo de margen normal (izquierda y derecha 3cm; arriba y abajo 2.5cm); slo se corregirn las seis primera pginas de los informes. Lo anterior incluye esquemas, grficos, literatura citada y otros, exceptuando la pgina portada. Adems, deben ser escritos a espacio simple con letra arial de tamao 12. Se debe entregar en el plazo previamente fijado, es decir, una semana despus de haber realizado la experiencia. Los atrasos en estas entregas sern considerados con nota 1.0. Deben constituir relatos fluidos, impersonales y objetivos acerca de la actividad realizada. Sern escritos en tiempo pasado y en tercera persona singular, impersonal. Debern ser escritos en correcto castellano, es decir, con la adecuada redaccin, sintaxis, puntuacin y ortografa.

Ejemplo : Durante el desarrollo de este trabajo se utiliz DNA proveniente de tallo de la cactcea Copiapoa cinerea, disuelto (concentracin) en tampn TE (composicin, pH), mantenido a -20C durante 90 das. Las abreviaturas de unidades de medida (volumen, superficie y otras) NO son seguidas por punto; utilice solamente los sistemas convencionales tipo cgs o mKs. Los litros, por ejemplo, se pueden abreviar L o l; las abreviaturas Lt o Lts son incorrectas. En el c aso de los segundos, sern s y no seg ni segs. Si tiene dudas al respecto, pregunte. Los informes debern constar de las siguientes secciones: 1. En la primera pgina o portada: - Ttulo de la experiencia (y NO nmero del informe o trabajo prctico) - Autores, los alumnos, en orden alfabtico de acuerdo a su apellido - Curso, carrera y seccin - Nombre del Profesor(a) de prctico y del ayudante alumno(a) En su contenido: 2. Introduccin (1,0 punto) y objetivos (0,5 puntos) En esa seccin, se har una descripcin del marco terico relacionado con el tema abordado en la experiencia. Otro enfoque interesante dice relacin con sistemas de diagnstico y patologas asociadas al tema. En este curso particularmente, las diversas metodologas que se utilizarn tienen un fundamento que no es trivial a la hora de elegirlas y aplicarlas. Deben explicar, es decir fundamentar, la eleccin de cada una de
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ellas, para cada experiencia; aportar los elementos que permitan comprender en qu consisten las tcnicas utilizadas, en qu se sustentan y cul es su mecanismo bsico de accin. En su parte final, la Introduccin deber contener los objetivos de la experiencia. La introduccin consta bsicamente de una serie de afirmaciones y conceptos escritos de manera fluida, que sustentan o apoyan la realizacin de la experiencia. Toda afirmacin que se plantee deber ser apoyada por las referencias bibliogrficas correspondientes, entre parntesis, utilizando un nmero para cada una, o bien los apellidos de los autores y el ao de la publicacin. La misma referencia debe tener el mismo nmero, que ser repetido tantas veces se utilice dicha referencia. Muchas veces, en la introduccin se presenta la terminologa a utilizar, con sus respectivas abreviaturas, que sern utilizadas en el resto del informe. Se puede utilizar figuras, grficos u otros disponibles en texto, en cuyo caso es necesario indicar la fuente al pie del esquema (ej: tomado de Meneses y Vidal 2005; NO olvidar detallar la referencia en la seccin 6). 3. Materiales y Mtodos (0,5 puntos) Aqu se detallar el procedimiento utilizado, paso a paso, y se har referencia a los materiales y a los fabricantes de los equipos e instrumentos utilizados, su marca y modelo entre parntesis, con excepcin de aquellos de uso rutinario (No se detallar el uso de micropipetas, ni su marca). Se trata de entregar el procedimiento o tcnica realizados, los reactivos, soluciones o elementos utilizados en forma ordenada, precisa y lo ms brevemente posible, de modo que la experiencia se comprenda paso a paso y pueda ser reproducida por otra persona. Recuerde que hay un lmite en la extensin, no repita el protocolo de la gua. Se detallar entre parntesis, la composicin y concentracin de reactivos y tampones utilizados (slo la primera vez que se haga referencia a ellos, luego se mencionar solamente su nombre). La seccin materiales y mtodos NO ES una lista de materiales, instrumentos y reactivos a modo de lista de supermercado. Debe ser fluida de manera que al ir describiendo el procedimiento utilizado durante la experiencia, vayan apareciendo los diversos materiales e instrumentos que en ese momento deben ser caracterizados con su marca y modelo. Como el resto del informe, los Materiales y Mtodos deben ser escritos en pasado y en tercera persona, aunque impersonal. Ejemplo : Se agreg 20 ml de tampn PBS (10 mM Na2HPO4; 1.4 mM KH2PO4, pH = 7,4; 140 mM NaCl; 2,7 mM KCl) y se centrifug durante 10 min a 300 rpm (marca y modelo de la centrfuga); no es necesario decir que centrifug en una centrfuga, por razones obvias... Si una solucin de un reactivo determinado se agreg con una micropipeta de marca X y capacidad Y, eso NO DEBE ser detallado pues es obvio que dicho volumen se tom con el instrumento apropiado. Tampoco es relevante mencionar si el tubo en el que se realiz un determinado ensayo era de plstico, vidrio, tefln, etc, o si su capacidad era tal o cual.
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En caso de haber efectuado experimentos, es fundamental detallar los controles positivos y negativos en esta seccin. La abreviatura de microlitros, l, (106 L o 10-3 mL) lleva la letra griega (= 10-6), la que no debe reemplazarse por la ltima vocal (u). En el procesador word usted encuentra la letra griega en la tabla del men Insertar, Smbolo. 4. Resultados (1,5 puntos) En esta parte del informe se describe los resultados y observaciones obtenidas, apoyndose en: - Dibujos, fotografas, tablas, grficos u otros. Cada uno de ellos debe llevar su TTULO y NMERO respectivo, asignado en forma consecutiva. - Breves descripciones de lo observado. Tablas, con una breve descripcin en texto (con su nmero respectivo), que seale las tendencias observadas Grficos, cuyo ttulo NO DEBE SER A versus B. Los grficos deben estar correctamente construidos, se debe detallar el nombre de las variables independiente y dependiente con sus respectivas unidades entre parntesis.

Cada figura debe llevar una breve leyenda explicativa. Sobre las figuras deber ir indicado con flechas o letras detalles relevantes para su entendimiento Puesto que el espacio es limitado, NO DEBE REPETIRSE la informacin en tablas y grficos; se optar por aquella expresin que sea ms clara y contenga mayor informacin (generalmente ello corresponde a grficos). SLO se debe incluir figuras, tablas y grficos a los cuales se haga alusin en el texto. No se debe incluir figuras, grficos ni tablas, sin hacer referencia a ellas en el texto. 5. Discusin (2,0 puntos) Este es el captulo MS IMPORTANTE del informe. La primera frase de la discusin es la verbalizacin del resultado o conclusin obtenida ms relevante. Luego, se discutir los resultados en detalle, de acuerdo con los antecedentes tericos, fundamentacin de la experiencia, objetivos e hiptesis planteados en la introduccin. Aqu tambin se discutir las eventuales discrepancias respecto de los resultados esperados, en caso que las hubiera. Se propondr las razones, tanto de orden metodolgico como conceptual, que podran dar cuenta de tales discrepancias. Es fundamental utilizar bibliografa para encontrar una explicacin lgica a los resultados observados. Recuerde que la discusin NO consiste en repetir los resultados obtenidos, si no que explicarlos a l luz del conocimiento terico. La discusin puede finalizar con las CONCLUSIONES del prctico, las que son breves y puntuales., y generalmente van asociadas a los objetivos del trabajo.

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6. Referencias o Literatura Citada (0,5 puntos) Aqu se debe transcribir un listado de las referencias utilizadas durante la elaboracin del informe. No deben aparecer textos, pginas web o artculos cientficos que no sean mencionados en el texto del informe. Asimismo, todas aquellas citas que se hagan en el informe debern aparecer referidas en esta seccin. Utilizar DE PREFERENCIA trabajos publicados en Revistas con Comit Editorial. Las pginas web no son utilizadas bajo ningn motivo. Las citas en el texto, pueden hacerse a travs de nmeros consecutivos, de acuerdo al orden en que se vayan utilizando, poniendo los nmeros entre parntesis y, e la seccin referencias y tambin de manera consecutiva, se debe escribir el nmero y la referencia correctamente. Si una misma referencia se utiliza varias veces, debe tener siempre el mismo nmero que se repetir, en el texto, tantas veces se utilice esa referencia. Otra alternativa al respecto, es sin utilizar nmeros sino, luego del texto que sostiene la afirmacin, se coloca entre parntesis el apellido del o los autores (si son hasta dos), seguido del ao de la publicacin. Si son ms de dos autores, se coloca el apellido del primero y luego y cols. (por y colaboradores), seguido del ao de la publicacin. En la seccin referencias o literatura citada, el listado de las referencias se hace en orden consecutivo, de acuerdo a la numeracin que se les ha dado en el texto y dependiendo del orden de su citacin, en caso que se haya utilizado esta alternativa. Si se ha optado por la segunda modalidad, es decir por el apellido de los autores, las referencias se harn en orden alfabtico segn el apellido del primer autor del trabajo. TODOS los autores de cada trabajo, libro o referencia consultada deben aparecer, figurando primero su apellido y luego las iniciales de su(s) nombre(s). Por favor consulte si tiene dudas al respecto, o directamente orintese poniendo atencin en cualquier texto, y sobretodo artculo cientfico, a su disposicin. Hay varias normas para escribir correctamente las referencias, sin embargo si Ud. escoge cualquiera de ellas, debe ser conservador (consistente) a lo largo de todo el texto, es decir, siempre utilizar la misma modalidad. Por ejemplo, el ao de la publicacin puede sealarse inmediatamente despus de los autores, o bien al final de la referencia. La transcripcin de los nombres propios completos de los autores es un error frecuentemente cometido por los estudiantes: trate de no repetirlo y slo escriba las iniciales de estos nombres. Ejemplos : - Para un artculo cientfico: (1) Fagan, T., D. Morse y J.W. Hastings. 1999. Circadian synthesis of a nuclearencoded chloroplast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the dinoflagellate Gonyaulax polyedra is translationally controlled. Biochemistry. 38: 7689-7695. En el texto, se debiera citar, siempre entre parntesis, con un nmero (que sera en 1 si es la primera cita) o si no, como (Fagan y cols., 1999) y en las referencias, de acuerdo al orden alfabtico de los apellidos de los autores, ira en la F y NO tendra nmero. Este artculo, fue publicado en 1999, en el volumen 38 de la revista Biochemistry, entre las pginas 7689 y 7695.
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- Para un captulo de libro: Granli, E. y P. Carlsson. 1998. The ecological significance of phagotrophy in photosyntetic flagellates. En: Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms. D.M. Anderson, A.D. Cembella y G.M. Hallegraef (Eds.). NATO ASI Series. Vol G 41. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Pubs. pp.539-557. Lo anterior quiere decir que el texto que Ud. consult fue escrito por Granli y Carlsson (lo cual se puede citar en el texto de esa misma manera o con el nmero correspondiente), se titula The ecological significance...., aparece en el libro titulado Physiological Ecology of Harmful Algal Blooms, publicado en 1998. Los editores del libro son: D.M. Anderson, A.D. Cembella y G.M. Hallegraef; la publicacin es de la NATO, la editorial es la SpringerVerlag de Berlin, Heidelberg Publicaciones y las pginas en las que aparece este captulo son desde la 539 hasta la 557.

- Para un libro completo: Futuyma, DJ. 1986. Evolutionary Biology. 2 Ed. Sinauer Associates Inc. Publishers (Sunderland, MA). 600 pp. - Para un resumen (abstract) de un trabajo, aparecido en las Actas de algn congreso: Guillou, L., E. Nezan, P. Gentien and G. Barbier. 2000. Molecular study of the toxic algae Dinophysis spp. from the French coast. Resmenes de la 54th Reunin Annual de la Sociedad Ficolgica de Amrica. D.F. Millie y P.Kugrens (Eds.). J. Phycol. 36 (3): 27. Esta referencia, en el texto se citara (si no se hace con nmero) como (Guillou y cols. 2000). Si usted sigue estas simples instrucciones, tendr la nota mxima en sus informes.

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Laboratorio N 1: Reforzamiento pH, ecuaciones lineales y grficas. Propiedades de los logaritmos

, pues , pues

Importante: Antilog -Log Si P = -log X, para despejar X se debe aplicar la funcin antilog (shift log) Por lo tanto p = logX /antilog 10-p = X El pH El pH es una medida de la acidez o basicidad de una solucin. El pH es la concentracin de iones o cationes hidrgeno [H+] presentes en determinada sustancia. Por ejemplo, una concentracin de [H+] = 1 107 M (0,0000001) es simplemente un pH de 7 ya que: pH = log[107] = 7 Puesto que el agua est disociada en una pequea extensin en iones OH y H+, tenemos que: Kw = [H+][OH]=1014 en donde [H+] es la concentracin de iones de hidrgeno, [OH-] la de iones hidrxido, y Kw es una constante conocida como producto inico del agua. Por lo tanto, log Kw = log [H+] + log [OH] 14 = log [H+] + log [OH] 14 = log [H+] log [OH] pH + pOH = 14

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Ecuacin de Henderson-Hasselbalch Mientras un acido fuerte se disocia totalmente en solucin acuosa, un cido dbil lo hace solo parciamente. Si representamos a un cido dbil por AH y su base conjugada por A-, su disociacin ser AH H+ + A-, el grado en que se disocia el cido se representa por su constante de disociacin o de acidez Ka= [H+] x [A-] / [AH] Supngase un cido AH con disociacin parcial. El equilibrio es:

y la constante de disociacin asociada ser:

Despejando [H3O + ] de la constante de disociacin:

Tomando logaritmos a ambos lados y aplicando la propiedad de los logaritmos para un producto se llega a: E invirtiendo el cociente:

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Ejercicios
+ -3

1. En una solucin donde [H ] es 1x 10 M calcule pH, y pOH. La solucin es cida o bsica?

+ -

2. Si el pH de una solucin es por ejemplo 4,5 calcule [H ], [OH ]. La solucin es cida o bsica? 3. Calcular el pH y pOH de una solucin de NaOH 0,001M 4. En una muestra de un lago contaminado, se determin que el pOH del agua era de
-

6,59. Cul es el valor de [OH ] y pH? 5. Determinar el pH 100 mL de buffer lactato, donde la concentracin de cido lctico es 0,050M, y la concentracin del in lactato es 0,32 M 6. En el problema anterior, Cul ser el valor de pH si concentracin de cido lctico y la del lactato son iguales? 7. Calcule la relacin de concentraciones existente entre acetato y cido actico en un sistema amortiguador a pH = 5,3 8. Los logaritmos se utilizan para medir la magnitud de los terremotos. En la escala Richter, la magnitud R de un terremoto est dada por la formula R = log 10 I, donde I representa el nmero de veces que es ms intenso el terremoto respecto a la actividad ssmica ms pequea que se puede medir con un sismgrafo Cuntas veces ms intenso es un terremoto que mide grado 9,1 (terremoto de Japn, 2011) que un terremoto con grado 8,8 (terremoto de concepcin, 2010)?

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Ecuacin principal de una recta.

Se llama ecuacin principal de una recta a una expresin de forma: y = mx + n o bien y = Ax + B OJO: cuando usan la calculadora, sta entrega el resultado como y = Bx + A Donde m representa la pendiente de la recta y n es el coeficiente de posicin y es el nmero donde la recta corta al eje de las ordenadas (Y) Concepto de Recta Una recta es la representacin grfica de una funcin de primer grado. Toda funcin de la forma y = mx + n representa una lnea recta. La x y la y son las variables de la ecuacin, siendo x la variable independiente ya que puede tomar cualquier valor, mientras que y se llama variable dependiente, ya que su valor est determinado por el valor que tome x. Cada punto (x,y) que pertenece a una recta se puede representar en un sistema de coordenadas, siendo x el valor de la abscisa e y el valor de la ordenada. (x,y) = (Abscisa , Ordenada) Ejemplo: El punto (-3,5) tiene por abscisa -3 y por ordenada 5.

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Pendiente de una Recta En la ecuacin principal de la recta y = mx + n, el valor de m corresponde a la pendiente de la recta y n es el coeficiente de posicin. La pendiente permite obtener el grado de inclinacin que tiene una recta, mientras que el coeficiente de posicin seala el punto en que la recta interceptar al eje de las ordenadas. Ejemplo: La ecuacin y = 4x + 7 tiene pendiente 4 y coeficiente de posicin 7, lo que indica que interceptar al eje y en el punto (0,7). Cuando se tienen dos puntos cualesquiera (x1,y1) y (x2,y2), la pendiente queda determinada por el cuociente entre la diferencia de las ordenadas de dos puntos de ella y la diferencia de las abscisas de los mismos puntos, o sea

y2 x2

y1 x1

Una recta que es paralela al eje x, tiene pendiente 0. Como usar la calculadora (modelos Casio fx-82MS/83MS/85MS/270MS/300MS/350MS

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Laboratorio N2: Soluciones Amortiguadoras y Capacidad Amortiguadora OBJETIVOS GENERALES: Conocer el funcionamiento y preparacin de soluciones reguladoras. Determinar la capacidad reguladora de una solucin tampn. Determinar grficamente la curva de titulacin de un aminocido. INTRODUCCIN Una solucin amortiguadora (Buffer o Tampn) es capaz de resistir cambios de pH cuando pequeas cantidades de cido o base son agregadas a la solucin. Por ejemplo, cuando 0,01 moles de cido fuerte y base fuerte son adicionadas a agua destilada, el pH desciende a 2 con el cido y aumenta a 12 con la base. Si la misma cantidad de cido o base son adicionados a una solucin amortiguadora formada por cido actico acetato de sodio, el pH puede variar solamente en una fraccin de unidad. La regulacin del pH es importante en muchas reacciones qumicas, como as tambin en el control de procesos metablicos dentro de nuestro organismo, para la mantencin de la homeostasis. As encontramos que el pH de la sangre de nuestro organismo se encuentra regulado a un valor de 7,4. Pequeas variaciones de dicho valor pueden causar enfermedades e incluso la muerte, debido a que afecta los procesos bioqumicos que ocurren en dicho fluido. Una solucin amortiguadora requiere dos especies. Una es capaz de reaccionar exclusivamente con OH- y la otra con H3O+. Estas soluciones se forman por la combinacin de un cido dbil y una sal derivada de ste (cido actico/acetato de sodio) o por una base dbil y una sal derivada de sta (amoniaco/cloruro de amonio). Debido a que las soluciones amortiguadoras presentan efecto de in comn, es posible aplicar la ecuacin de Henderson Hasselbalch con la finalidad de prepararlas:

pH pKa log

base conjugada( sal) cido dbil

La Capacidad Amortiguadora ( ) es una medida de la resistencia a los cambios de pH de una solucin amortiguadora cuando un cido o una base son agregados a sta. Este parmetro es expresado como los moles de cido o base necesarios para cambiar el pH de un litro de una solucin reguladora en una unidad. Mientras ms grande el valor de , mayor la resistencia de la solucin amortiguadora a cambios de pH.

moles de OH - o H 3O adicionado s cambio de pH volumen de buffer en L

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En este laboratorio, la ecuacin de Henderson Hasselbalch ser usada para determinar la cantidad del par base conjugada cido dbil necesario para producir un una solucin amortiguada a pH fisiolgico. ACTIVIDADES Preparacin de soluciones amortiguadoras. En esta experiencia se estudiar la capacidad amortiguadora del buffer acetato, cuyo comportamiento est dado por el equilibrio:

CH 3 COOH

CH 3 COO

Ka

1,75 x10

1. Mediante la ecuacin de Henderson Hasselbalch, calcular la cantidad de base conjugada necesaria para preparar 50 mL de buffer acetato a pH 5,0, conociendo la concentracin del cido dbil: Grupo I. 0,10 M de cido actico. Grupo II. 0,25 M de cido actico Grupo III. 0,50 M de cido actico 2. Chequear resultados con el profesor. 3. Preparar solucin amortiguadora.

Determinacin de capacidad amortiguadora 1. Calibrar pH-metro. Seguir instrucciones del profesor para calibrar y limpiar pH-metro. 2. Medir pH de solucin amortiguadora preparada. 3. Llenar una bureta de 50 mL con solucin amortiguadora y otra bureta de 50 mL con solucin estandarizada de NaOH (0,1 M) 4. Transferir 50 mL de solucin amortiguadora en un vaso de precipitado de 250 mL. 5. Adicionar alcuotas de solucin de NaOH (5 mL) a la solucin reguladora. Despus de cada adicin, anotar el volumen de NaOH adicionado y el pH de la solucin. 6. Continuar hasta adicionar 100 mL de solucin de NaOH. 7. Completar Tabla I 8. Graficar pH versus moles de NaOH adicionados. 9. Calcular el pH terico de cada solucin empleando la ecuacin de Henderson Hasselbalch, y compararlos con los valores experimentales.

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Tabla I V. Buffer (L) V. NaOH (L) Moles NaOH Cambio de pH (pH final pH Inicial) Capacidad Reguladora,

Determinacin de curva de titulacin de la glicina. La glicina es un aminocido que en solucin funciona como un cido dbil diprtico, siendo las ecuaciones de equilibrio:
+

H 3 N - CH 2 -COOH H 3 N - CH 2 -COO -

H 3 N - CH 2 -COO -

H H

K a1 K a2

1,75 x10 1,75 x10

H 2 N - CH 2 -COO -

1. Transferir 50 mL de solucin de glicina (0,05M) en dos vasos de precipitado de 250 mL. 2. Medir pH de la solucin. 3. Llenar una bureta de 50 mL con solucin estandarizada de NaOH (0,1 M) y otra con 50 mL de HCl (0,1M). 4. Adicionar alcuotas de solucin de NaOH (5 mL) a la solucin de glicina. Despus de cada adicin, anotar el volumen de NaOH adicionado y el pH de la solucin.
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5. Continuar hasta adicionar 100 mL de solucin de NaOH. 6. Repita el procedimiento con el segundo vaso de precipitado con la solucin de glicina, esta vez, adicionando HCl. 7. Completar Tabla II 8. Graficar pH versus moles de OH- o H+ adicionados. 9. Explicar cada punpunto de inflexin de la curva obtenida. Tabla II V. Soln. Glicina (L) V. NaOH (L) Moles OHpH de la Solucin

V. Soln. Glicina (L)

V. HCl (L)

Moles H+

Cambio de pH (pH final pH Inicial)

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Cuestionario

1.-

a.- Defina los conceptos de Ka, Kb y Kw. b.- Demuestre matemticamente (fundamente) cmo se obtiene el valor de Kw.

2.- Cul es el pH que tiene una solucin amortiguadora formada por CH3COOH (0,2 M)/CH3COO-(0,7 M)? Cul es el pH final si a 50 mL de esta solucin se le agregan 10 mL de NaOH 0,1 M? (Ka CH3COOH= 1,8 *10-5). 3.- Suponga que quiere conseguir un tampn de un pH exactamente 7.00 utilizando KH2PO4 y Na2HPO4. Si tiene una solucin de KH2PO4 0.1 M, qu concentracin de Na2PO4 necesitara? 4.- Describa la curva de titulacin caracterstica para los aminocidos alanina e histidina.

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Laboratorio N 3: Reconocimiento y cuantificacin de las protenas INTRODUCCIN Todas las estructuras celulares estn formadas por protenas y prcticamente todas las funciones celulares son realizadas por protenas. Las enzimas, los transportadores, los anticuerpos, los receptores, los elementos del citoesqueleto, etc, son protenas. Aparte de sus funciones especficas, las protenas participan en la regulacin del equilibrio osmtico y tienen capacidad tamponante o reguladora del pH. Existen variados mtodos para reconocer y cuantificar protenas, siendo los mtodos colorimtricos los ms utilizados actualmente. La determinacin colorimtrica cuantitativa de una sustancia se basa en la capacidad de sta para absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz incidente. La cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al espesor del medio y a la concentracin de la sustancia presente. De esta manera, si se mantiene constante el espesor del medio, la absorcin de luz por una sustancia disuelta en un medio transparente (Ej. agua) ser proporcional a su concentracin molar. Estos principios estn contenidos en las leyes de LambertBeer y estn expresadas en la siguiente ecuacin: log Io/ I = E c l o DO = E c l,

donde DO es la Densidad ptica o Absorbancia de la sustancia, E es el coeficiente de extincin molar, c es la concentracin e l es el espesor de la celda, siendo ste ltimo igual a 1 cm. El coeficiente E se expresa en litros/M cm y es numricamente igual a la DO de una solucin 1M (1 Molar) de concentracin. Si la solucin de un analito sigue la ley de Lambert-Beer, presenta una relacin lineal entre DO y concentracin. Por otro lado si la relacin entre DO y concentracin es lineal para dos soluciones de la misma sustancia a igual espesor y longitud de onda, entonces se puede usar una de ellas de concentracin conocida (estndar) para determinar la concentracin de la otra solucin. En la prctica para determinar espectrofotomtricamente la concentracin de una sustancia se requiere: a) una serie estndar de concentracin conocida, en un rango de concentracin que muestre absorcin lineal y que permita expresar la concentracin en DO por unidad de masa o concentracin. b) un blanco que contiene todos los componentes del ensayo con excepcin de la sustancia a medir y c) la muestra con la sustancia problema a una dilucin tal que su lectura de DO este en el rango lineal de la curva de calibracin

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OBJETIVOS Una vez desarrollada esta actividad prctica los alumnos conocern algunos mtodos de reconocimiento y cuantificacin colorimtrica de las protenas y sus fundamentos tericos.

ACTIVIDADES 1. Preparacin una 50 mL de una solucin de NaCl 0,9% p/v. 2. Reconocimiento de protenas plasmticas El plasma sanguneo tiene un contenido de protenas de aproximadamente 7g/100 mL (g/dl), de los cuales aproximadamente 4g corresponden a albmina y el resto est constituido por anticuerpos, factores de coagulacin, apoprotenas de las lipoprotenas, enzimas proteicas, etc. Este contenido de protenas puede variar de acuerdo a las condiciones nutricionales o el estado de salud del individuo. a) Reconocimiento por absorbancia a 280 nm de luz ultravioleta (UV). Las protenas absorben luz ultravioleta a 280 nm, longitud de onda a la que absorben los aminocidos aromticos (triptofano, tirosina y fenilalanina) de las protenas, especialmente el grupo indol de triptofano. Esta propiedad se puede aprovechar para reconocer la presencia de protenas En esta actividad se utilizar plasma (u ovoalbmina) diluido 1: 20 con suero fisiolgico (NaCl 0.9 % p/v), una solucin de seroalbmina de bovino (SAB) 5 mg/mL y una solucin de NaCl 0.9 % p/v, segn el cuadro siguiente Tubos Na Cl 0,9 % p/v SAB 5 mg/mL Plasma diluido 1 3 mL 2 3 mL 3 3 mL -

Leer en el espectrofotmetro a 280 nm (UV) en cubetas de cuarzo. (El plstico detiene la luz UV). Comparar resultados y discutir la utilizacin de tubos con SAB y con la solucin de NaCl. b.- Reconocimiento por absorbancia a 540 nm (reactivo de Biuret) Este mtodo se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el in Cu+2 del reactivo y los nitrgenos amdicos del enlace peptdico. Por lo tanto este reactivo reconoce especficamente la presencia de enlaces peptdicos. Se utiliza como blanco el reactivo de Biuret a la misma concentracin de los tubos muestra y estndar.

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En esta actividad se utilizar plasma diluido 1:20 con NaCl 0.9 % p/v y solucin de SAB 5 mg/mL de acuerdo al siguiente cuadro Tubos NaCl 0.9% p/v SAB 5 mg/mL Plasma diluido Reactivo de Biuret 2 1,8 0,2 2,0 2,0 2,0 1 3 1,5 0,5 2,0 4 1,0 1,0 2,0 5 0,5 1,5 2,0 7 2,0 2,0 2,0 2,0 6

Mezclar bien, sin agitar y leer despus de 30 minutos a 540 nm en cubetas de plstico. Se puede calentar en bao a 50C por 5 minutos y leer despus de enfriar en agua corriente. Calcule la concentracin total de protenas del plasma en mg/dl a partir de la curva estndar Compare y discuta sus resultados. Reactivos y Soluciones 1. 2. 3. 4. Reactivo de Biuret Solucin NaCl 0.9 % p/v Plasma diluido 1 : 20 v/v con NaCl 0.9 % p/v Solucin estndar de seroalbmina de Bovino (SAB) 5 mg/mL en NaCl 0.9 % p/v

Equipo y materiales 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Espectrofotmetro UV- Visible Cubetas de cuarzo y de vidrio Tubos de ensayo de 10 mL y gradillas Matraces Erlermeyer de 100 mL Pipetas de 1, 5 y 10 mL Bao de agua a 50C Balanza analtica Cuestionario 1.- Explique a lo menos tres mtodos de aislamiento y purificacin de protenas. 2.- Existe posibilidad de que otros compuesto sean reconocidos por el reactivo de Biuret?, de ser as, Cmo se alteraran los resultados obtenidos? 3.- Qu sucede si una muestra no puede ser leda por el espectrofotmetro debido a que se sale de escala de medicin del espectrofotmetro? Qu hara en ese caso? 4.- Cmo determinara usted la concentracin de hemoglobina de una muestra de sangre?.
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Laboratorio N 4: Enzimologa I INTRODUCCIN Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos metablicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo adems a su regulacin. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar su estructura molecular, provocando su desnaturalizacin. En general una reaccin qumica aumenta su velocidad de reaccin al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones catalizadas por enzimas (en Humanos), este efecto se observa slo entre 35 y 40 C, ya que a temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces dbiles, principalmente puentes de hidrgeno y la prdida de su conformacin nativa. Existen otros casos, por ejemplo las bacterias termfilas, en las cuales las enzimas pueden funcionar hasta 100 C Debido tambin a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables, los que derivan de los radicales de sus aminocidos constituyentes. Las alteraciones del pH pueden cambiar el grado de ionizacin de los grupos qumicos involucrados en el sitio activo de la enzima, afectando su actividad cataltica. Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad mxima a un valor de pH denominado pH ptimo. Por tal motivo la actividad enzimtica se mide en presencia de tampones o amortiguadores de pH. OBJETIVOS Estas actividades prcticas tienen como objetivo que los alumnos 1. Se familiaricen con los procedimientos de laboratorio para manipular muestras biolgicas. 2. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en muestras biolgicas. 3. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y temperatura. ACTIVIDADES Objetivo: Estudiar el efecto de las variaciones de pH y temperatura sobre la actividad de la amilasa salival. La amilasa salival es una enzima que rompe especficamente los enlaces glicosdicos 1-4 de los polisacridos. La hidrlisis del almidn por amilasa salival da como producto una mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidn es un polisacrido formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta slo enlaces
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1-4 y amilopectina (ramificada), con enlaces 1-4 y 1-6. El almidn se reconoce qumicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo, por lo que la hidrlisis enzimtica del almidn se puede determinar por la prdida del color azul de una mezcla de reaccin. PROCEDIMIENTO A. Calcular la masa necesaria para preparar 500 ml de una solucin de almidn a una concentracin de 1%p/v B. Efecto de la temperatura sobre la hidrlisis enzimtica del almidn Tubos NaCl 0.9% p/v Tampn fosfato pH 7.0 Alimidon 1% p/v Preparacin enzimtica Incubar a : 1 1ml 1ml 2ml 2ml 2 1ml 1ml 2ml 2ml 3 1ml 1ml 2ml 2ml 4 1ml 1ml 2ml 2ml 5 3ml 1ml 2ml -

0C 100C 25C 37C 37C

Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. C. Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival Tubos NaCl 0.9% p/v Tampn fosfato (1ml) Almidn 1% p/v Preparacin enzimtica 1 1ml pH5 2ml 2ml 2 1ml pH7 2ml 2ml 3 1ml pH9 2ml 2ml 4 1ml pH9 2ml -

Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe. Anote y discuta sus resultados. Reactivos y Materiales 1. Preparacin enzimtica: Lavado bucal con agua destilada, filtrado y mantenido en hielo. 2. Tampn fosfato 0.1 M, pH 5.0, pH 7.0 y pH 9 3. Solucin de Cloruro de sodio 0.03 M 4. Solucin de almidn 1% p/v 5. Solucin de lugol 6. Bao termoregulado y de agua hirviendo

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Cuestionario 1.- Almidn y celulosa son dos polmeros de D-Glucosa, indique la razn por la cual la celulosa no puede ser degradada por los humanos durante la digestin y s puede ser degrada por los rumiantes.

2.- A nivel terico, explique el efecto de la temperatura sobre la actividad biolgica de una enzima. 3.- Indique el nombre y modo de accin de 3 agentes qumicos denaturantes de protenas. (fundamente)

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Laboratorio N 5: Enzimologa II Determinacin de las Propiedades Cinticas de la Enzima Fosfatasa Acida de Germen de Trigo INTRODUCCIN Las enzimas son protenas con un gran poder cataltico y un alto grado de especificidad por su sustrato. Estas protenas poseen gran importancia en todos los procesos bioqumicos. Actuando en forma concertada, catalizan cientos de reacciones que llevan, entre otros, al metabolismo de nutrientes, la conservacin o transformacin de energa o la biosntesis de macromolculas. La reaccin ms simple que pueden catalizar las enzimas est representada por la ecuacin:

Donde E, S y P, representan a la enzima, al sustrato y al producto, respectivamente, mientras que ES y EP representan los complejos transitorios enzima-sustrato y enzimaproducto. Para caracterizar el funcionamiento de una enzima, es importante determinar el como las condiciones ambientales, el pH y la temperatura, afectan su capacidad cataltica. En este trabajo prctico se trabajar con la fosfatasa cida de germen de trigo, la cual cataliza la hidrlisis de fosfatos monosteres, con liberacin de fosfato inorgnico, segn la siguiente reaccin:

Dentro de los objetivos a cumplir se encuentra el determinar los parmetros cinticos de esta enzima. En este ensayo, se usar un sustrato artificial, el p-nitrofenil fosfato (NPP). El grado de hidrlisis de ste se determinar espectrofotomtricamente cuantificando el p-nitrofenol liberado, que en solucin alcalina, absorbe fuertemente a 405 nm.

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OBJETIVOS Estas actividades prcticas tienen como objetivo que los alumnos 1. 2. 3. 4. Conozcan algunos procedimientos clsicos para determinar actividad enzimtica. Verifiquen el efecto de inhibidores sobre los parmetros cinticos de una enzima. Apliquen los conceptos de sustrato, inhibidores competitivos, inhibidores no competitivo en la interpretacin de sus resultados. Observen la variacin de la concentracin de sustrato en el tiempo, determinen la constante de velocidad de primer orden de la reaccin catalizada y sean capaces de expresar grficamente sus resultados

PROCEDIMIENTO 1.- Elaboracin de una curva de calibracin de p-nitrofenol. Prepare 6 tubos que contengan: 1 2 3 4 5 6 pNP 60 uM (mL) 0,0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 NaOH 0,05 M (mL) 4,0 3,5 3,0 2,0 1,0 0,0 Para cada uno de los tubos lea la absorbancia a 405 nm. Verifique que su blanco sea el apropiado. Graficar la curva obtenida. 2.- Determinacin de los parmetros cinticos de la fosfatasa cida de germen de trigo y el efecto del fosfato en la reaccin. Prepare un serie de 10 tubos que contengan 1 2 3 4 5 pNPP 2,5 uM (mL) 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 Buffer pH 5 (mL) 2,00 1,75 1,50 1,25 1,00 INCUBAR 5 min. A 37 Enzima 0,5 mg/mL (mL) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 6 7 8 pNPP 2,5 uM (mL) 0,00 0,25 0,50 Buffer pH 5 (mL) 1,50 1,25 1,00 Fosfato 10 mM (mL) 0,50 0,50 0,50 INCUBAR 5 min. A 37 Enzima 0,5 mg/mL (mL) 0,50 0,50 0,50 9 10 0,75 1,00 0,75 0,50 0,50 0,50

0,50 0,50

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Mezcle por inversion e incube 10 minutos a 37. No olvide preparar inmediatamente 10 tubos que contengan 4,5 mL de NaOH 0,05 M. Pasados los 10 minutos de incubacin a 37, retire una alcuota de 0,5 mL adicionndoselas a los respectivos tubos que contengan 4,5 mL de NaOH 0,05 M. Determine la absorbancia a 405 nm de cada uno de los tubos. Confeccione las curvas pertinentes tanto en presencia como en ausencia de fosfato y determine los valores de Km y Vmax. Analizar y discutir los resultados segn los objetivos planteados.

Cuestionario 1.- Se estudia la cintica del estado estacionario de una enzima en ausencia y presencia de un inhibidor (inhibidor A). La velocidad inicial viene dad en funcin de la concentracin de sustrato en la siguiente tabla: V[(mmol/L)min] Sin inhibidor 1.72 2.04 2.63 3.33 4.17

[S] (mmol/L) 1.25 1.67 2.50 5.00 10.00

Inhibidor A 0.98 1.17 1.47 1.96 2.38

a) Qu tipo de inhibicin (competitiva o no competitiva) se produce? b) Determine Vmax y KM en ausencia y en presencia del inhibidor. 2.- El cianuro de potasio (KCN) es un inhibidor de la cadena transportadora de electrones. Cmo podra afectar este compuesto al ciclo de Krebs?. Haga una descripcin detallada. 3.- Considere el destino del piruvato marcado con 14C en cada una de las siguientes posiciones: carbono1 (carboxilo), carbono2 (carbonilo) y carbono 3 (metilo). Prediga el destino de cada carbono marcado durante el ciclo del cido ctrico.

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