UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESIANA CIENCIAS DE LA VIDA INGENIERA EN BIOTECNOLOGA

INTEGRANTES: Jhoselyn Cueva, Christian Jcome. CURSO: 3 B TEMA: TINCIN GRAM. OBJETIVOS: Identificar bacterias Gram + y Gram mediante la tincin de Gram. Aplicar la tcnica aprendida en clase. MARCO TEORICO: TINCIN DE GRAM Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. EXPLICACIN DEL PROCESO:

El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I 2entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).

Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetoscon alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas. TECNICAS DE COLORACIN:

1. Fijar un frotis
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor

excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.

2. Tincin
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.

3. Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo. La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1%.

4. Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 3 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias..

5. Decoloracin (paso critico)

Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul.

6. Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.

7. Tincin de contraste
Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.

8. Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

MATERIALES: Mechero asa cristal violeta de Hucker Safranina Alcohol lugol Aceite de inmersin Portaobjetos Aguan destilada fucsina PROCEDIMIENTO: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) Se coloc una gota de agua destilada a la que, con el asa, previamente esterilizada a la llama, al rojo vivo, se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque. Se puso una gota de cristal violeta de Hucker (colorante inicial), el cual dejamos reposar 1 minuto Se lav con agua destilada Se puso lugol (mordiente) una gota, el cual dejamos reposar por 1 minuto. Se decolor con alcohol de 95 (decolorante) Se lava con agua destilada Se puso una gota de fucsina bsica (colorante de contraste), se dej reposar 1 minuto. Se lava con agua corriente. Se sec suavemente y sin frotar con papel de filtro Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy pequea de aceite de inmersin y se observ al microscopio con el objetivo de inmersin.

CONCLUSIONES: La tincin de Gram es una herramienta muy til en el laboratorio de microbiologa as como en los anlisis clnicos y diagnostico medico siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una correcta interpretacin de los datos que nos otorga la

diferenciacin de Gram positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes celulares tendrn o no propiedades patolgicas diferentes Los resultados sobre la prctica tincin de Gram positiva o negativa es realmente importante para el diagnstico y buen tratamiento de la patologa relacionada microorganismos es necesario saber cmo influyen en las manifestaciones clnicas las diferencias existentes entre la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en su deteccin. La tincin de Gram no es una prueba fiable de tincin de bacterias en medios de cultivo con escasos nutrientes (p. ej., cultivos viejos o en fase estacionaria) o tratados con antibiticos debido a la degradacin del peptidoglicano.

BIBLIOGRAFA:
Aulton Michael E., Ciencia y diseo de formas farmacuticas, 2 edicin, Ed. Elsevier Espaa, 2004. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins.