Bioquimica Rocha. 2da Edic.

II
INFORMACION SOBRE EL AUTOR
Hctor A. Rocha L. es Profesor Asociado de la Universidad de La Frontera, Temuco. Posee el ttulo de Bioqumico de la Universidad de Chile (1973) y trabaj durante 1974 en el Laboratorio de Reproduccin de la Sede Norte de la Facultad de Medicina, Santiago. Posteriormente obtuvo una beca de perfeccionamiento otorgada por el Medical College of Georgia, USA (Georgias Health Sciences University) donde se desempe como Research Fellow hasta 1979. A continuacin ingres a la Escuela de Graduados en dicha Universidad parta obtener el grado de Ph.D. en 1983. En cuanto a su experiencia cientfica esta comprende aislamiento y caracterizacin de protenas, enzimologa, transporte de aminocidos, tcnicas de ADN recombinante, produccin de anticuerpos monoclonales, junto a la caracterizacin qumica y biolgica de efluentes txicos industriales. A la vez su experiencia docente data desde 1974 y en la actualidad se encuentra participando en los Mdulos de Bioqumica Mdica y Gentica junto a Fundamentos Moleculares de los Procesos Biolgicos, para las carreras de Medicina y Tecnologa Mdica.
III
IV
PREFACIO
La Bioqumica debe reunir los conocimientos de Fsica, Biologa y Qumica para intentar explicar las reacciones qumicas propias de los seres vivos. Por esta razn es de inters para el autor entregar en esta segunda edicin un alcance ms completo de esta ciencia para los estudiantes de las reas biolgicas. En este texto no solo se hace hincapi en el metabolismo del hombre, sino que se le compara al de otras especies para as obtener una idea del contexto molecular donde este se halla inmerso. El libro se encuentra dividido en diecisiete captulos donde se analizan las molculas que darn origen a las protenas y la interaccin de estas con su medio, junto a las funciones y caractersticas que presentan. Posteriormente se contina con el metabolismo intermediario de Hidratos de Carbono, Lpidos y Aminocidos para as terminar con los cidos Nucleicos, el Control de la Expresin de los Genes y dar un vistazo a algunas tcnicas empleadas en el trabajo con los cidos Nucleicos. Tambin se dar un vistazo a la Bioqumica vegetal. En la parte final de este libro se incluye una seccin de ejercicios y otra de Aprendizaje Basado en Problemas. En esta seccin se encuentra una tcnica de aprendizaje centrada en el alumno donde este debe interaccionar con su grupo, formado por noms de diez personas analizando un problema expuesto como un caso clnico. Este se debe analizar desde distintos puntos de vista que incluyen las reas de: Conocimiento, Socio-Econmico y Comportamiento. Esto supone la distribucin de las distintas tareas de bsqueda de informacin de los miembros del grupo en bibliotecas, entrevistas a especialistas y empleo de recursos en INTERNET, para luego complementarlos entre los miembros del grupo y as resolver los objetivos planteados por cada problema.
No es el propsito de este libro el analizar las tcnicas y las experiencias por las cuales se ha llegado al nivel de conocimiento bioqumico actual, sino que explicar como ocurren las distintas reacciones de sntesis y degradacin que mantienen al organismo dentro de un relativo estado estable. Agradezco la participacin del Profesor Eduardo Gutirrez Da'Forno M.Sc. y al Dr. Gabriel Nuez B. por la correccin del manuscrito as como sus comentarios y sugerencias sobre el mismo. Vayan mis agradecimientos al personal acadmico y administrativo del Departamento de Ciencias Bsicas de la Universidad de la Frontera.
Hctor Rocha Lohs, Ph.D. Bioqumico
CONTENIDO
VI
Captulo 1 Captulo 2 Captulo 3 Captulo 4 Captulo 5 Captulo 6 Captulo 7 Captulo 8 Captulo 9 Captulo 10 Captulo 11 Captulo 12 Captulo 13 Captulo 14 Captulo 15 Captulo 16 Captulo 17
El Agua y sus Propiedades Los Aminocidos y sus Caractersticas Las Protenas su Estructura y Funcin Las Enzimas y sus Propiedades Las Vitaminas Bioenergtica Metabolismo de los Hidratos de Carbono Ciclo Tricarboxlico Fotosntesis Metabolismo de los Lpidos Metabolismo de los Aminocidos Cadena de Transporte de Electrones y Apoptsis cidos Nucleicos Ciclo Celular y Control de la Expresin de los Genes Principios de Medicina Molecular Problemas Aprendizaje Basado en Problemas
3 49 61 135 194 328 341 403 431 480 551 605 653 738 797 859 932
VII
VIII
Hctor Rocha L.
Aprendizaje Basado en Problemas
Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades
CONTENIDO DEL CAPITULO 1 1) CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DEL AGUA 5 a) Caractersticas Reactivas del Oxgeno 5 b) La distribucin electrnica de la molcula de agua 7 c) Caractersticas del enlace hidrgeno 10 2) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DEL AGUA 13 a) Cambios de la densidad del agua con la temperatura 13 b) Propiedades fsicas del agua comparada con otros lquidos 14 Temperaturas 24 c) Punto Triple del agua 16 d) El agua como un buen solvente 16 e) El agua como responsable de la interaccin hidrofbica 17 f) El agua es capaz de ionizarse 20 3) IMPORTANCIA BIOLOGICA DEL AGUA 20 a) Compatibilidad del agua con la vida a bajas temperaturas 22
b) Como se adaptan las protenas a las bajas temperaturas 24
c) Adaptacin de las bicapas de fosfolpidos a las bajas temperaturas 25

d) Compatibilidad del agua con la vida a altas temperaturas 28
e) Adaptacin de las protenas a las altas temperaturas 28 f) Adaptacin de las bicapas de fosfolpidos las altas temperaturas 30
4) LA VIDA SIN AGUA O ANHIDROBIOPSIS 30 5) PRODUCTO IONICO DEL AGUA 31 6) AMORTIGUADORES O TAMPONES 32 7) Disociacin y Curva de Titulacin del Aminocido Glutmico 8) ACIDOSIS Y ALKALOSIS
Ecuacin de Henderson Haselbalch
a) Causas de Acidosis b) Causas de Alcalosis
AGUA
1) CARACTERISTICAS ESTRUCTURALES DEL AGUA. El agua es un lquido de excepcionales caractersticas fsico-qumicas y constituye uno de los elementos esenciales para la vida. Es a la vez capaz de participar en las reacciones biolgicas y actuar como un medio de soporte para las distintas transferencias de energa y materia en los organismos vivos. a) CARACTERSTICAS REACTIVAS DEL OXGENO. La molcula de agua esta formada por son elementos de cualidades opuestas dentro del Sistema Peridico. El Oxgeno por un lado se ubica a la derecha en el Grupo VI A y segn la escala emprica de electronegatividad (Pauling: escala de 1 a 4) atrae electrones con un valor de 3,5. Por otro lado el Hidrgeno, se ubica a la izquierda en el Grupo I A y es capaz de donar electrones, ya que su electronegatividad es igual a 1. Las particularidades de Oxgeno con 6 electrones por tomo se deben a la disposicin particular de sus electrones en la capa ms externa 2P (fig. 1-1). Tanto en 2Py como en 2Pz, posee un electrn y ambos se encuentran con el mismo espn y por consiguiente no apareados. Esta propiedad lo convierte en un biradical, que es afortunadamente poco reactivo con aquellas molculas orgnicas que poseen ambos espnes apareados. Sin embargo puede reaccionar fcilmente, con elementos con un solo electrn con espn opuesto (fig. 1-1). Si no ocurriera de esta manera, el Oxgeno sera como el Fluor y reaccionara espontneamente con todo el Hidrgeno posible. En general, las oxidaciones seran mucho ms espontneas de lo que ya lo son.
* Pz Px Py *x *y Py Px Pz
: electrones
no apareados electrones apareados
y * s
.. s
O ..
. .
..
..
O
Orbital Atmico
Orbital Molecular
O2
O
Orbital Atmico
Ambos tomos de Oxgeno comparten un par de electrones y presentan el otro par no apareado. Generan as una molcula Paramagntica
Fig. 1-1. Orbitales atmicos y moleculares del Oxgeno.
En base a lo anterior, para que el Oxgeno reaccione se pueden seguir dos caminos: a) Primero, se necesita elevar su energa para invertir uno de los espines y pasar desde Oxgeno triplete a Oxgeno singlete. Oxgeno triplete es el Oxgeno basal donde en los orbitales Px, Py, Pz, ambos espines pueden presentar tres posibilidades o arreglos: 1) ambos espines en el mismo sentido, 2) ambos espines en sentidos opuestos, 3) ambos espines no apareados y en sentidos opuestos.
Orbitales p en el triplete
1) Px Py Pz
2) Px Py Pz
3) Px Py Pz
Por otro lado, el Oxgeno singlete es aqul oxgeno activado que presenta en su ltima capa Py, un par de electrones apareados con espn opuesto. Esta caracterstica le permite reaccionar con los compuestos orgnicos con pares de electrones tambin apareados.
Orbital p en el singlete
Px
Py
Pz
b) Segundo, mediante activacin por reduccin monovalente, es decir electrn por electrn. El primer electrn entra con un espn opuesto en una reaccin endergnica que lo transforma en Superxido (O2), luego mediante otro electrn y una reaccin exergnica pasa a Perxido de Hidrgeno (HO-OH), que sucesivamente se transforma mediante un tercer electrn en Superhidroxilo o radical Hidroxilo (OH.) y finalmente con la adicin de un cuarto electrn pasa a formar Agua (Fig.2-1).
Energa
+ Electrn
. O O: Superxido + Electrn
.O-O. Triplete O2 basal
H:O-O:H Perxido
+ Electrn H : O. Superhidroxilo + Electrn H:O:H Agua
Fig. 2-1. Reduccin monovalente de electrn por electrn.
Este tipo de reduccin es el que se emplea biolgicamente adicionando un electrn a la vez, para as generar tanto energa como agua metablica en la Mitocondria. Sin embargo, es
necesario evitar que se liberen los intermediarios (Superxido, Radical Hidroxilo y Perxido de Hidrgeno) que son altamente txicos al organismo. En base a lo anterior se puede concluir que el agua se forma a partir de dos molculas biatmicas con propiedades extremas como son el Oxgeno y el Hidrgeno. Uno de estos elementos es considerado como un agente oxidante y el otro como un agente reductor. Ambos a la vez presentan molculas biatmicas (H-H y O-O) de igual electronegatividad, de manera que la energa para romper el enlace es similar (103 y 106 Kcal/mol). La molcula de Hidrgeno, es la ms simple de todas y presenta dos electrones apareados en un orbital molecular 1s2. La energa para romper este enlace covalente H-H es de 103 Kcal/mol, mientras la energa para romper el enlace entre ambos oxgenos atmicos (que no es doble ni simple) es de 58 Kcal/mol por enlace, dando un promedio de 116 Kcal/mol. A su vez en la reaccin para formar 2 molculas de agua se forman 4 moles de enlaces O-H, que tienen alta diferencia en electronegatividad y 110 Kcal/mol en cada uno con un total de 440 Kcal/mol, mientras que el total de la energa para romper las molculas biatmicas de H2 y O2 ser de 322 Kcal/mol, produciendo una diferencia de 118 Kcal/mol de agua que se liberan mediante una reaccin exergnica: Energa consumida : Energa liberada por ruptura de dos moles de H2O : 2 H2 + O2 = 2 H-O-H + 118 Kcal/mol 2 x 103 + 116 = 322 Kcal/mol 4 x 110 = 440 Kcal/mol 440 322 = 118 Kcal/mol
En el fondo, las caractersticas tan dispares entre Oxgeno e Hidrgeno se conjugan en el agua para formar una molcula con un momento dipolar, que le entrega la capacidad de ser el solvente nico por excelencia. Volver al inicio b) LA DISTRIBUCION ELECTRONICA DE LA MOLECULA DE AGUA LA ASEMEJA UN TETRAEDRO. A
La molcula de agua presenta sus orbitales distribuidos en la forma de un hbrido entre un orbital s y tres orbitales p denominado sp3. Los dos orbitales externos del Oxgeno (2py, 2pz) se encuentran cada uno ocupado por un electrn con espn en un mismo sentido y reciben los electrones de los dos tomos de Hidrgeno. Al mismo tiempo los dos pares de electrones no enlazantes que ocupan los orbitales inferiores (2s2, 2px2) forman orbitales ms anchos y cercanos del Oxgeno por ser este electronegativo. La presencia de estos pares de electrones induce una repulsin de los pares que s forman enlace con el Hidrgeno, induciendo a estos ltimos a presentar una nube larga y angosta (Fig. 3-1). Por lo tanto, los cuatro pares de electrones no se encuentran distribuidos de forma similar y generan un tetraedro imperfecto con una distribucin asimtrica de los electrones (Fig. 3-1). El ngulo entre los Hidrgenos es de 104.5o en comparacin a los 109.5o entre los vrtices de un tetraedro perfecto como el Metano.
Dada las caractersticas anteriores es posible asumir que la nube electrnica alrededor de la molcula de agua posee diferenciales de carga: 2 diferenciales negativos para el Oxgeno y 1 diferencial positivo para cada Hidrgeno. Son estos los que entregan el carcter
PARES SOLITARIOS INTERIORES
H2 O
C H4
H
H + H + Tetraedro imperfecto
104.5
C H
H
H H
109.5
Tetraedro perfecto
Fig. 3 - 1. ngulos de los Tetraedros del Agua y Metano.
dipolo a la molcula de agua (Fig. 3-1). Por lo tanto el agua tiene la capacidad de orientarse en un campo elctrico, lo que se mide por el Momento Dipolar. Los vectores que corresponden a las componentes del Momento Dipolar se pueden observar en las figuras 3-1 y 4-1. Por otro lado, al observar las distancias entre el Oxgeno y el Hidrgeno vemos que es de 0,097 nm y el radio desde donde empieza la interaccin Van der Waal es de 0,120 nm,
Componentes y resultantes de los momentos dipolares
2 O
H
104.5
+
Vector del momento dipolar
Fig. 4 - 1. La densidad electrnica es mayor sobre el tomo de Oxgeno.
mientras que la distancia entre ambos Oxgenos pertenecientes a dos molculas que interaccionan por medio del enlace hidrgeno es de 0,280nm. Una molcula de caractersticas opuestas al agua se encuentra en la molcula de Metano (fig. 5-1). El carbono tiene solo 4 electrones no compartidos en su capa externa y necesita de otros 4 que en este caso sern aportados por el Hidrgeno. La electronegatividad para el Hidrgeno es de 2,1 mientras que para el Carbono es de 2,5. Este hecho indica que son similares y la repulsin entre los pares de electrones que se encuentran formando el enlace covalente es igual en todos, ellos generando una nube electrnica ms larga y delgada dirigida por igual, hacia los vrtices de un tetraedro sp3 perfecto con un ngulo entre los enlaces C-H de 109,5o. A su vez los componentes del momento dipolar en el CH4, se encuentran representados por flechas que se cancelan unas a otras debido a la distribucin simtrica de la nube electrnica. Otra molcula con una estructura intermedia entre el H2O y el CH4, es el amonaco NH3 (fig. 5-1). En ella el Nitrgeno con electronegatividad de 3,1 posee 5 electrones de valencia en su capa externa y necesita tan solo de 3 para completar el octeto. Al unirse los tres Hidrgenos restantes con electronegatividad de 2,1, generan un tetraedro sp3, levemente asimtrico, ya que la molcula de Amonaco solo tiene un par de electrones no enlazantes. Este ltimo par forma una nube electrnica ms ancha y pegada al tomo de Nitrgeno que las otras tres. El ngulo entre los hidrgenos es aqu de 107,3o (fig. 5-1).
METANO CH4 N + H 109,5 AGUA H2O H H + + 107,3 H AMONIO NH3
C H H
O + H + 104,5 H
+ H
F AC. FLUORHDRICO HF
Fig. 5 1. Representacin tetradrica de las molculas de Metano, Amonio, Agua y c. Fluorhdrico. Los momentos dipolares se encuentran representados por flechas y se muestran los diferenciales () de carga.
El c. Fluorhdrico HF (fig. 5 -1), es otra molcula capaz de formar un fuerte dipolo debido a que el Flor es altamente electronegativo 4,1 en la escala de Pauling. El Fluor tiene 7 electrones en su capa externa y requiere de solo un Hidrgeno para completar los 8
electrones. El c. Fluorhdrico forma un tetraedro sp3, altamente distorsionado que cuenta con tres pares de electrones internos, cuya nube repele fuertemente al par de electrones que forma el enlace covalente polar con el Hidrgeno. Debido a esta particularidad, las molculas de HF se pueden adicionar formando largas cadenas de enlaces hidrgeno. Volver al inicio c) CARACTERISTICAS DEL ENLACE HIDROGENO. Debido a la peculiar distribucin de los electrones en la molcula de agua y a su carcter dipolo, la asociacin entre los centros de carga opuestos entre distintas molculas de agua, recibe el nombre de enlace o puente hidrgeno. Esta interaccin, es en realidad puramente electrosttica y ocurre entre el tomo de hidrgeno pobre de electrones perteneciente a una molcula de agua con aquellos dos pares de electrones no compartidos situados en el Oxgeno de otra molcula. De esta manera una molcula puede interactuar con otras 4 vecinas, (fig. 6-1). Esta propiedad le confiere al agua un alto grado de cohesin interna que se refleja en su punto de fusin, pto. de ebullicin, calor de vaporizacin, calor de fusin (Tabla 21) y tensin superficial, comparada con otras m0olculas como el Sulfuro de Hidrgeno o el Amonio. Las uniones por enlace hidrgeno son de baja energa: se necesita de 3 a 7 Kcal/mol para romperlas y este tipo de interaccin responde a las fluctuaciones trmicas ambientales, formndose o rompindose a distinta velocidad contrastando con las interacciones por enlaces covalentes que son muy estables y se rompen solo al aplicar energa por sobre las 110 Kcal/mol. Si consideramos que la mxima intensidad del enlace hidrgeno entre dos molculas de agua ocurre cuando los tres tomos O-H---->O estn alineados en un ngulo de 180,
Fig. 6 - 1. Interaccin de una molcula de agua con otras 4.
sucede que en el c. HF se encuentran 3 pares de electrones libres que no participan en el enlace covalente con el Hidrgeno y tan solo un par de electrones uno del hidrgeno y otro
10
del Flor, se encuentran involucrados en este enlace. En base a esta distribucin es posible pensar que se formaran 4 enlaces hidrgenos, pero en la realidad en 100 molculas tan solo 100 enlaces hidrgenos sern aqu posibles, sera algo as como un collar de 100 molculas de HF. En el caso del NH3, se tienen 3 Hidrgenos unidos mediante tres enlaces con electrones compartidos y se tiene solo 1 par de electrones libre pertenecientes al Nitrgeno solamente. En este caso con 100 molculas, tambin se formarn solo 100 enlaces hidrgenos en un collar. Tanto el NH3 como el HF son casos opuestos, en el primero se tienen tres diferenciales de carga positivos y uno negativo, mientras que en el segundo se encuentran tres diferenciales de carga negativos y uno positivo, por eso en ambos casos con 100 molculas, se tiene un promedio de 100 enlaces hidrgeno. Este efecto tambin se traduce en la formacin de cadenas o anillos de molculas unidas por enlace hidrgeno. Al continuar con el mismo razonamiento, ocurre que el agua tiene dos Hidrgenos con dos pares de electrones compartidos y dos pares de electrones libres propios del Oxgeno, por lo tanto es ms probable que forme un promedio de solo 2 enlaces hidrgeno por molcula de H2O. Esto es parcialmente vlido, ya que el agua fluida est constantemente formando y rompiendo enlaces hidrgenos, mientras que congelada debido a su falta de agitacin trmica interacciona al mximo, es decir una molcula de agua con otras cuatro vecinas. Compuestos HF H2O NH3 CH4 Pares de Compartidos 1 2 3 4 Pares de Libres 3 2 1 0
Entre las molculas que forman tetraedros el Metano (CH4) es la excepcin, no posee pares de electrones libres y tiene un momento dipolar nulo, por lo tanto no forma este tipo de enlace (figs. 3-1 y 5-1). Por otro lado, el enlace Hidrgeno se manifiesta en otras molculas como protenas, cidos nucleicos, hidratos de carbono, etc. Siempre que en una estructura exista un dador y un aceptor de Hidrgenos con las siguientes caractersticas: 1) Un enlace covalente con un momento dipolar en la estructura. 2) Al menos un par de electrones libres que no estn involucrados en el enlace covalente de la estructura. 3) Un tomo de Hidrgeno proveniente de otra molcula que se pueda aproximar al par anterior sin que sea rechazado.
En la Tabla 1-1 se observan los posibles dadores y aceptores de Hidrgeno que se encuentran presentes en molculas o estructuras distintas al agua, como pueden ser protenas y cidos nucleicos.
11
Tabla 1 Dador de Hidrgeno Aceptor de Hidrgeno
N O O
H H H
O O N
C C
H H
N O
Volver al inicio
2) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DEL AGUA.
12
La molcula de agua en estado slido o hielo interacta con otras cuatro molculas y estas a su vez con otras tantas hasta formar una red tridimensional en que el ngulo O-H---->O, es de 180o. En esta estructura se alternarn las formas silla y bote dejando grandes espacios
Estructura Tridimensional del Hielo
X
O H O
O H H
Silla
O H H
Silla
O H O
H
H
H O H
Bote
O
H
H H
H
H O
O H
H
H
H
Silla
O H
H H O
180
H O H
Silla
H O
Y
Fig. 7 - 1. Representacin 3D de la Estructura del Hielo. En ella se observan estructuras silla y bote.
vacos a 0oC (fig. 7-1). De esta manera se obtiene un gran volumen con pocas molculas, lo que se traduce en una menor densidad. Posteriormente al subir la temperatura, el ngulo entre O-H---->O es menor de 180o y las molculas se acercan entre s. La distancia entre los Oxgenos de las distintas molculas se hace menor y se produce una compactacin de las molculas por lo que aumenta la densidad. En otras palabras, el lquido se contrae de 0 a 4oC aumentando su densidad y luego de los 4 a los 100oC se expande aumentando la distancia O-H<---->O y disminuyendo esta vez su densidad (fig. 8-1).
a) CAMBIOS DE LA DENSIDAD CON LA TEMPERATURA. El agua es un elemento fluido y posee dos tipos de movimiento: los de agitacin trmica, influidos por el medio externo y los vibratorios, que son propios de los enlaces internos entre los tomos de la molcula. A baja temperatura la agitacin trmica no es muy violenta y esto permite orientar los ngulos O-H---->O a 180o, lo que es ptimo para que se forme un cristal de hielo o su centro de nucleacin.
13
Densidad 1 gr/cc
100 Temperatura
Fig. 8 - 1. Curva Densidad versus Temperatura.
Posteriormente, a la temperatura de 4oC (Fig. 8 -1), ambos movimientos tanto el de agitacin trmica como el vibratorio se encuentran en la misma fase y se cancelan el uno al otro. Este hecho permite una mayor aproximacin entre las molculas con el consiguiente aumento de la densidad del agua. De esta manera sobre los 4oC ambos movimientos se encuentran fuera de fase por lo que se suman algebraicamente ambas ondas y se producen agrupaciones oscilantes con una vida media de 10-12 segundos. As las interacciones se forman y se destruyen rpidamente dando origen a las agrupaciones oscilantes. Esto permite que en el agua fluida la interaccin sea en promedio de 1 molcula con otras 3,7. Volver al inicio b) PROPIEDADES FISICAS DEL AGUA COMPARADAS CON OTROS LIQUIDOS COMUNES. Los sucesivos cambios de estado slido a lquido y de lquido a vapor en cada unas de las molculas de la Tabla 2-1, dependern del grado de cohesin que existe entre ellas al ser comparadas con el agua. El Calor de Vaporizacin es la cantidad de caloras necesarias para evaporar 1 gr de agua lquida, siendo mayor la del agua al ser comparada a otros lquidos. Este efecto indica que el agua acta como un buen reservorio de energa, ya que puede absorber unas cuantas caloras antes de evaporarse. Por otro lado, se puede disipar una gran cantidad de calor por la vaporizacin del agua. Este efecto, es empleado para mantener la temperatura del cuerpo constante por medio de la perspiracin insensible en el reposo y la transpiracin como consecuencia de la actividad fsica. La Capacidad Calrica del agua, es la cantidad de caloras necesarias para aumentar la temperatura de un gramo de agua de 15 a 16oC y corresponde al valor de 1. El agua en comparacin con las otras molculas tiene una de las mayores capacidades siendo sobrepasada solo por el Amonaco. Este ndice es una medida de la capacidad del agua para amortiguar bruscos cambios de temperatura, ya que puede absorber calor sin cambiar
14
de temperatura. Es decir, un tejido puede desprender una tremenda cantidad de energa calrica debido a su metabolismo, sin embargo su temperatura no sube al absorber el agua de la circulacin ms los lquidos intra y extracelulares esta energa. Tabla 2- 1 Punto de Fusin AGUA METANOL ETANOL ACETONA CLOROFORMO AMONIACO ACIDO FLUORHIDRICO BENCENO HEXANO METANO C 0 - 98 -114 - 95 - 83 - 78 - 92 ------------- 183 Punto de Ebullici n C 100 65 78 56 61 - 33 19 --------------- 162 Calor de Vaporizacin Cal/Mol 540 263 204 125 59 327 360 94 -------------Capacidad Calrica Cal/gr C 1.000 0.600 0.581 0.528 0.226 1.120 ------------------------Calor de Fusin Constante Dielctrica
(adimensio Cal/mol nal) 80 80 22 33 24.9 24 23 21.4 -------5.1 84 -------54.7 -------------------------4.6 1.9 --------
El Calor de Fusin, significa que al congelarse un mol de agua se liberan 80 Kcal, las que representan la resistencia del agua para cambiar de la fase lquida a la fase slida. Esta propiedad contribuye a la estabilizacin biolgica de los organismos y es empleada en aquellos casos extremos en que se congela parcialmente una parte del agua extracelular, para as extraer caloras y poder mantener a la clula an fluida y funcional. En la Tabla 2-1, aparece el Amonaco como una excepcin y se asemeja en parte al agua en su Calor de Vaporizacin, Capacidad Calrica y Calor de Fusin. Esto se debe a su capacidad de formar enlace Hidrgeno, ya que es una molcula asimtrica similar a la del agua. A diferencia de ella, cuenta con un solo par de electrones sobre el Nitrgeno, siendo capaz de formar en promedio un enlace hidrgeno por molcula y no dos como es el caso del agua. La elevada Tensin Superficial del agua favorece la formacin de gotas y capas protectoras de la humedad. En este caso la interaccin H2O-H2O es mayor que la interaccin H2O-aire, evitando as su rpida evaporacin. Esta caracterstica se asocia a la Capilaridad, que es la capacidad del agua para ascender, al interaccionar electrostticamente con las paredes de los vasos capilares. Esta propiedad se emplea en la naturaleza para subir agua desde las races hasta la copa de los rboles con 30 o ms metros de altura. A la vez la evaporacin del agua en las hojas superiores expuestas al sol provoca la concentracin de las sales, produciendo un gradiente osmtico el cual es suficiente para tirar de las molculas de agua hacia arriba como los eslabones de una cadena.
15
El valor de la Constante Dielctrica (D), hace del agua uno de los solventes ms polares, ya que puede aminorar las fuerzas atractivas o repulsivas de los iones de una sal al interponerse entre las cargas. Esta propiedad contribuye al plegamiento de las protenas solubles contribuyendo a que alcancen una conformacin determinada. Volver al inicio c) PUNTO TRIPLE DEL AGUA (fig. 9-1). El agua presenta un punto de triple coexistencia para el estado slido, lquido y gaseoso.
Presin ( Atm ) 1.000 100 10 1.0 0,1 0,01
1 atm
evaporacin Lquido condensacin A Lquido fusin congelacin Hielo Vapor sublimacin
C Lquido Vapor
Hielo
0,00603 atm
B Temperatura ( C ) 80 100 120
0,001
0,0098 C
- 20
20
40
60
Fig. 9 1. Grfico presin versus temperatura del agua.
A 0,0098 C y 0,00603 atm se encuentra el punto triple del agua, donde puede coexistir como slido (hielo), gas (vapor) y lquido. En la curva A coexisten Hielo y Lquido, mientras que en la B Hielo y Vapor, finalmente en la C coexisten Lquido y Vapor. En el punto triple el hielo se puede fundir, evaporar y sublimar ( paso de slido a vapor ) al mismo tiempo. Volver al inicio
d) EL AGUA COMO UN BUEN SOLVENTE.
16
La disolucin en el agua de cualquier molcula depender del delicado equilibrio entre la energa entrpica del agua (tendencia a la disolucin) y la energa de formacin y ruptura del enlace hidrgeno mismo. De esta manera las substancias POLARES, con o sin carga o solo diferenciales de carga, se disuelven en el agua al tratar de igualar su concentracin en el volumen total de solvente en que se encuentran. Este efecto se logra por medio de su interaccin con el agua, lo que significa que estas molculas son ms estables termodinmicamente cuando se encuentran disueltas, que cuando ambos iones de una sal interaccionan consigo mismo. De esta manera las fuerzas electrostticas en la molcula de sal al interponerse el agua se hacen menores que las interacciones Catin-Agua y Anin-Agua. La constante D es una medida de lo que se interpone entre dos cargas que se atraen o repelen y se encuentra considerada en la Ley de Coulomb, como un factor inversamente proporcional a la fuerza de atraccin o repulsin entre las cargas de la ecuacin 1-1: 1 F= D ------Q1 x Q2 --------------------r2 ECUACION 1-1
F: Fuerza con que se atraen o repelen cargas de distinto o igual signo Q1 y Q2 : Cargas de igual o distinto signo r2: El cuadrado de la distancia entre las cargas D: Constante Dielctrica
AGUA + H 2
SAL
Fig. 10 - 1. El agua se interpone entre las cargas positivas y negativas de una sal.
Cuando D = 1, las cargas estn en el vaco y nada se interpone entre ellas. Sin embargo al adicionar molculas de agua la fuerza de atraccin o repulsin entre las cargas de una sal disminuir, ya que cada ion estar solvatado o hidratado con una o varias capas de molculas de agua interpuestas entre las cargas. El Oxgeno del agua estar ms prximo al ion de carga + y los Hidrgenos estarn ms cerca al ion de carga - (fig. 10 -1). Volver al inicio
e) EL AGUA ES RESPONSABLE DE LAS INTERACCIONES HIDROFOBICAS. Las molculas hidrofbicas no presentan interaccin de ningn tipo con el agua, pues no poseen diferenciales de carga, ni cargas puntuales. Al entrar en contacto con las
17
molculas de agua, restringen el movimiento de estas e impiden su libertad de agitacin, rotacin, traslacin, etc. En presencia de varias molculas hidrofbicas, se intensifica este efecto y el agua no puede continuar con sus agrupaciones de carcter oscilante que persiguen la mxima entropa u desorden. Como la capacidad para dispersarse o desordenarse de las molculas de agua fluida disminuye, lo que es termodinmicamente anormal. La nica manera de volver al desorden anterior, es mediante una nueva agrupacin o distribucin de menor energa. De esta manera se logra la estabilizacin entre las molculas de agua y las molculas hidrofbicas amfipticas (molculas con una parte
Acido Graso _
O O
C C C C C
H H H H H H H H
Acido Graso _
O O
C C C C C
H H H H H H H H
Parte polar del Acido Graso _ _

O O O O
C C C C C
H H H H H H H H C
C C
H H H H
H H
H H
H H
H H
H H
C C
C C C
H H H
C C C
H H H
C H C C
H H
H H
C C C
H H H
Fig. 11 - 1. Al agruparse las molculas de cido graso permiten que las molculas de agua ganen en libertad.
hidrofbica y otra polar). Se agrupan estas ltimas escondiendo la parte hidrofbica, que no interacta con el agua y dejan expuesta solo la parte polar (fig. 11-1). Esta nueva agrupacin, es la solucin a la bsqueda del equilibrio y permite ganar en libertad a las molculas de agua, para as aumentar el nmero de molculas en desorden, ya que la superficie expuesta por una agrupacin de molculas hidrofbicas es menor que la suma de las superficies individuales (fig. 11-1). Por ello el trmino de interaccin hidrofbica es ms preciso, que hablar de enlace hidrofbico. Este ltimo en realidad no existe, debido a que la agrupacin de molculas hidrofbicas se produce solo por incremento de la entropa del agua y no por enlace entre las molculas. En las estructuras correspondientes a bicapas de fosfolpidos se produce un acoplamiento entre la interaccin hidrofbica del cido graso y el enlace hidrgeno del agua. La primera de ellas tiene una entalpa positiva (Tabla 3-1), es decir toma energa del medio para estabilizarse y la segunda como lo es el enlace hidrgeno, entrega energa hacia el medio para ganar estabilidad. De esta manera ambas interacciones alcanzan el equilibrio termodinmico acoplndose entre s (fig. 11-1). Un a vez en contacto los Lpidos se produce la interaccin Van der Waals que examinaremos a continuacin. Tabla 3-1. ENTALPIA DE LAS INTERACCIONES DEBILES
18
INTERACCIONES
VAN DER WAALS ENLACE HIDROGENO ENLACE ELECTROSTATICO INTERACCION HIDROFOBICA
Entalpa de formacin Kcal / mol

-1 -3 a -7 -5 +1 a +3
Entre las interacciones que tienen importancia biolgica (Tabla 3-1), existe una con aproximadamente diez veces menor energa que el enlace hidrgeno y de muy corto radio de accin, esta interaccin es la llamada fuerza de Van der Waals (fig. 12-1).
Energa Repulsin
Atraccin
Radio Van der W aals

Fig. 12 - 1. La Interaccin Van der Waals ocurre entre ambas nubes electrnicas y su radio indica cuanto se pueden aproximar ambos tomos antes de que se repelan. Mientras ms abajo se prolonaga el pozo de energa, la interaccin ser ms estable y mientras ms ancho sea este, la distancia entre uno y otro tomo ser mayor.
Su existencia se debe a las fluctuaciones de carga que ocurren entre las nubes electrnicas de las molculas de Fosfolpido en estrecha proximidad. As las variaciones que ocurren en la densidad electrnica de la nube producen pequeas variaciones en la carga. Por esta razn el sitio ms probable en que se encuentran los electrones tendr una densidad de carga negativa y el sitio menos probable tendr una densidad de carga positiva A temperatura ambiente este tipo de interaccin electrosttica es muy dbil para mantener una estructura, a menos que se trate de polmeros de gran tamao. Esto sucede en aquellas estructuras denominadas bicapas y micelas. Por ejemplo en una bicapa cerrada las molculas hidrofbicas se ordenan primero de acuerdo a la contribucin del agua y posteriormente se refuerza esta estructura por la interaccin Van der Waals (Fig. 13 -1 ).
19
Volver al inicio f) EL AGUA ES CAPAZ DE IONIZARSE. La molcula de agua se encuentra en equilibrio con uno de sus hidrgenos, es decir este puede unirse o soltarse de la molcula en una proporcin muy baja. Sin embargo, esta es suficiente para permitir la transferencia de carga o conduccin no solo por el movimiento de difusin de los iones H+ y OH-, sino que tambin por efecto tnel. Este ltimo efecto se detect debido a que las cargas se desplazan por el agua ms rpido de lo que difunden sus iones. Es decir, el hidrgeno unido covalentemente al Oxgeno puede dejar su electrn con este ltimo y saltar al siguiente tomo de Oxgeno unindose por enlace Hidrgeno. De esta manera se produce una molcula negativa que posee el electrn y que se llama ion Hidroxilo y otra molcula positiva que le falta el electrn llamado ion Hidrgeno, que cuando esta hidratado se llama ion Hidrnio (fig. 14 -1).
+
H - O + H - O H H H - O H H - O H
Io n e s =
_
+ H -O
H - O H H
H id ro n io e
H id ro x ilo
Fig. 14 - 1. Ionizacin del agua.
La transferencia de protones en el agua ocurre entonces por efecto tnel (fig. 14-1), el cual es de suma importancia dentro de los mecanismos celulares, ya que permite la generacin de gradientes quimiosmticos a travs de membranas tanto en la Mitocondria como en el Cloroplasto y a la vez es un factor que contribuye a bajar la barrera de energa en el caso de las reacciones catalizadas enzimticamente. Volver al inicio 3) IMPORTANCIA BIOLOGICA DEL AGUA.
Fig. 13 - 1. Fosfolpidos en contacto con el agua se agrupan en bicapas, micelas y liposomas.
Bicapa
Micela
Liposoma
20
En esta seccin se observarn los distintos mecanismos por los cuales algunas macromolculas han evolucionado qumicamente en contacto con el agua y a la vez han llegado a adaptarse para ser biolgicamente funcionales a temperaturas extremas. El agua contribuy al desarrollo de la vida a nivel macromolecular, ya que en los mares tanto primitivos como actuales sirvi de reservorio y amortiguador de la energa calrica evitando los cambios bruscos de clima. Por otro lado, contribuy a nivel microscpico donde mediante su interaccin mantuvo la integridad funcional y estructural de las macromolculas biolgicas permitiendo la evolucin qumica de estas. La debilidad del enlace hidrgeno entre las mismas molculas de agua y entre ellas y los grupos funcionales de las macromolculas, la hace responsable de la actividad dinmica. Esta ltima les permite cambiar de conformaciones ajustndose a sus distintas actividades biolgicas. Por lo tanto grupos con uniones lbiles como: -C=O---H-N- , -O-H---O=C- , -S-H----O=Cson bastante comunes tanto entre protenas como cidos nucleicos. Contrario a lo anterior es la total rigidez estructural hallada en los cristales de grafito y diamante debido al enlace covalente del carbono. Estas formas son incapaces de cambiar de conformacin y por lo tanto incompatible con la vida. En resumen podemos concluir que el agua es:
H H
+ O
H H O H
H O H H
+ H O H
O H
H H O
O H
H 0.8 A 2.8 A o o
Fig. 15 1. Efecto de transferencia de carga en el agua.
1) Un Dipolo.
21
2) Interacciona con otras molculas y consigo misma por medio del enlace Hidrgeno. 3) Es un buen solvente ya que se interpone entre las interacciones polares. 4) Es responsable de las interacciones hidrofbicas. 5) Es capaz de ionizarse transfiriendo cargas positivas y negativas al formar los iones Hidronios(+) e Hidroxilo(-). 6) Presenta efecto tnel mediante el cual las cargas se mueven ms rpido que los iones (fig. 15-1). 7) Todas las molculas que son parte de los organismos han evolucionado qumicamente en contacto con el agua o apartndose de ella. Las interacciones entre el agua y las macromolculas son necesarias para la funcin de estas ltimas. 8) Sin la presencia de agua no existe la formacin de estructuras dinmicas complejas, aunque se puede mantener latente estructuras an viables que han sido formadas previamente en contacto con el agua, como sucede en la anhidrobiosis. Volver al inicio a) COMPATIBILIDAD DEL AGUA CON LA VIDA A BAJAS TEMPERATURAS. La aparicin de la vida en el planeta Tierra se desarroll sobre la base de las propiedades del agua. Esta molcula permite la vida a las temperaturas que consideramos normales y tambin a aquellas temperaturas consideradas extremas, como son bajo los 0oC y por sobre los 90oC. De esta manera tenemos como ejemplo los mares rticos, donde en vez de restringirse la vida por una esperada baja flexibilidad molecular, junto a una prdida de fluidez experimentada tanto por protenas y membranas biolgicas respectivamente, se encuentra la mayor proliferacin de especies, entre ellas el Plancton. Esto se debe a que tanto protenas como membranas han evolucionado en estos organismos para ser tan flexibles a una menor temperatura tan como a una temperada. Otra de las propiedades que permite la vida en estas condiciones es que el hielo flota debido a su baja densidad, junto al hecho de que los gases como el Oxgeno, son ms solubles en los mares fros que en los tropicales, permitiendo una rica oxigenacin bajo su superficie. Al bajar la temperatura a 0oC el equilibrio entre las distintas agrupaciones de molculas de agua, que alternan en las proporciones 1/1,1/2,1/3, 1/4, se desplazan hacia la , que es la ms rgida. De esta forma por ausencia de agitacin trmica, las molculas generan un cristal de agua pura, que se propaga y crece con una densidad 10% menor que la del agua lquida. Solamente a -1.9 oC se forma hielo en el mar, debido a la presencia de las sales que se interponen entre las molculas de agua. La interaccin agua-sal retarda la interaccin progresiva agua-agua, que lleva a la formacin del cristal de hielo. Por otro lado, en los Polos y sus cercanas, las temperaturas pueden alcanzar los -20oC y an ser compatibles con la vida, como se ha demostrado en aquellos organismos que no poseen sangre caliente. En estos especimenes la vida se desarroll o se adapt a las
22
caractersticas del agua, mediante mecanismos que retardan o disminuyen la cristalizacin de esta. En algunos casos se ha observado que los lquidos corporales de algunos insectos en Alaska o Siberia, soportan hasta 55C sin formar hielo. El origen de esta propiedad se atribuye a la presencia de ciertas molculas especiales, que actan como inhibidores de la formacin de cristales y que no se hallan presentes en los organismos de zonas temperadas. Al analizar algunos de los mecanismos que mantienen la viabilidad de los sistemas biolgicos a bajas temperaturas nos encontramos con varias sorpresas. Entre ellos se encuentra como una primera barrera las Propiedades Coligativas, que dependen de la cantidad de soluto que se encuentra en una disolucin y permiten bajar la temperatura hasta los -1,9oC sin formar hielo. A mayor concentracin de soluto en los lquidos biolgicos menor ser el punto de congelacin alcanzado, debido a que el agua como dipolo prefiere interaccionar mucho ms con un soluto con carga que consigo misma. Sin embargo existe el inconveniente de que si se aumenta la concentracin de sal para permitir una temperatura an menor a los -1,9oC, las sales pueden contribuir a precipitar a las protenas retirando el agua de la superficie de estas. Sin embargo, es posible sortear esta barrera con otros mecanismos como se ver ms adelante. Para analizar el primer mecanismo involucrado se debe considerar la distribucin del agua en tres fracciones (fig. 16 -1):
Los solutos polares capturan molculas de agua y disminuyen el % de agua estructurada () por lo que bajan el punto de congelacin como sucede en el agua de mar Distribucin al azar
Cl
-
Na
Na
La distribucin del agua en las distintas proporciones de 1/1,1/2, 1/3 y 1/4 ocurre en el agua fluida
Cl
1/2 1/1 1/3
Na
Na
1/4
Cl
Cl
Agua de solvatacin
La propagacin del agua estructurada (1/4) o formacin de hielo en el mar ocurre a -1,9 C a causa del NaCl en la conc. de 32 gr/lt
Fig. 16 - 1. El agua se distribuye en distintas fracciones. El equilibrio entre las fracciones depender de la temperatura y concentracin del soluto, en este caso NaCl.
1) el agua que forma parte del hielo como agua pura. 2) el agua fluida que forma agrupaciones alternantes.
23
3) el agua que solubiliza o interacciona con los iones o protenas en su superficie, llamada tambin agua de solvatacin. Las molculas de agua se encuentran distribuidas entre estas tres fracciones y sucede que al bajar la temperatura, se incrementa el agua estructurada o la agrupacin correspondiente al hielo. Sin embargo, cuando una sal se encuentra disuelta en el medio lo hace con menos facilidad, debido a la competencia que ocurre entre las molculas de agua por agruparse con los cationes y aniones de la sal (fig. 16 -1). Volver al inicio b) COMO SE ADAPTAN LAS PROTEINAS A LAS BAJAS TEMPERATURAS.
Gran nmero de molculas de agua retenidas por protena altamente polar
Distribucin al azar en el agua fluida
+ + + _
+ _
Agua 1/4
Distintas fracciones que forman el agua fluida
_ _
Las molculas de agua retenidas por la protena polar adoptan fcilmente la proporcin de formando hielo y denaturando a la protena polar por compresin mecnica
Protena parcialmente hidrofbica que retiene menos molculas de agua y no favorece la formacin de cristales
20C DISMINUCIN DE LA TEMPERATURA

Fig. 17 - 1. El agua interacciona con la carga superficial de una protena.
0C
Al continuar extendiendo el punto de congelacin por debajo de lo permitido por las propiedades Coligativas, debemos considerar como sera el comportamiento de una protena normal y otra adaptada a este ambiente. En el primer caso tenemos una protena soluble en agua cuya temperatura ptima es de 37oC, en ella se encontrar una capa de hidratacin externa especialmente en los sitios donde se asoman los residuos de los aminocidos con carga y mientras ms polar sea mayor es su interaccin con el agua y a la vez ser ms soluble. Por lo tanto al bajar la temperatura, se producir una mayor interaccin entre las molculas de agua ya que
24
permanecern inmovilizadas en su superficie. Estas molculas participarn en la formacin de centros de nucleacin o estructuras donde la interaccin entre las molculas es de . Este centro de nucleacin contribuye a la formacin y crecimiento del cristal de hielo (fig. 17 1). Posteriormente la expansin de estos cristales comprimir a la protena denaturndola. En el caso contrario, cuando una protena logre adaptarse a las bajas temperaturas, deber ser capaz de permitir cambios conformacionales compatibles con su funcin y a la vez buscar una manera de disminuir el exceso de hidratacin "paralizante" en su superficie. Este efecto se puede lograr aumentando levemente su carcter hidrofbico en la superficie, pero no lo suficiente para salir de la solucin y precipitar. Esto se logra con el cambio de un aminocido polar por otro hidrofbico en un lugar crtico de la protena. De esta manera se puede disminuir la capa de hidratacin disminuyendo el nmero de molculas de agua inmovilizadas cerca de las cargas superficiales debido a un vecindario de residuos de carcter hidrofbico. Por otra parte, la protena en su interior debe disminuir la interaccin interna entre los residuos de los aminocidos, as se hace ms flexible para experimentar cambios conformacionales frente a un medio menos dinmico, como lo es el agua a baja temperatura que disminuye los choques contra la macromolcula. En resumen, cuando una protena se adapta para ser funcional a bajas temperaturas disminuye el grado de interaccin interna y aumenta su hidrofobicidad superficial. Volver al inicio c) ADAPTACION TEMPERATURAS. DE LAS BICAPAS DE FOSFOLIPIDOS A LAS BAJAS
Adaptaciones moleculares de los fosfolpidos

R CH2 CO O CH O O O CH2 CO P O O
Fosfato Glicerol
CH2 CO O CH O
O CH2 CO
O O
R O
R O
Eteres de
Acido Graso
glicerol
Unin Eter Las ramificaciones de los cidos grasos permiten aumentar la fluidez
AcidoGraso insaturadoCIS
Se gana rigidez por la unin de las colas de los cidos grasos
CO O O O P
O CH
CO CH2 O O P
CO O CH OH C 2 O R
CO O CH2 O
2HC
O O R
BICAPA MESOFILOS
O R
MONOCAPA
CRIOPFILOS
TERMOFILOS
Fig. 18 - 1. Los Fosfolpidos pertenecientes a las bicapas aumentan su tamao y se hacen ms saturados a medida que el organismo al que pertenecen se adapta a mayores temperaturas.
25
De similar modo a las protenas, si una bicapa de fosfolpidos pretende ser fluida a baja temperatura, deber disminuir su interaccin interna disponiendo de cidos grasos poliinsaturados cis y de cadena corta. De esta manera podr disminuir el estrecho empaquetamiento que favorece a la interaccin Van der Waals y que a la vez aumenta el grado de interaccin lateral entre las cadenas de los cidos grasos. Por otro lado, aquellos cidos grasos de cadena corta e incluso con insaturaciones tipo Cis, presentan una menor contribucin del agua a la agrupacin estilo bicapa y la superficie de contacto entre las colas de los cidos grasos es menor (baja interaccin Van der Waals). Por ello la estructura se hace ms fluida con una capacidad de cambio conformacional compatible a sus funciones, (fig. 18 -1). En cambio los cidos grasos de cadena larga son ms hidrofbicos, ya que reciben una mayor contribucin del agua para tomar la forma de micela o bicapa y presentan mayor interaccin lateral (Van der Waals) con sus molculas vecinas similares. Todos estos factores harn que a baja temperatura las bicapas de cidos grasos largos y saturados sean rgidas, poco fluidas e incompatibles con la vida. Un segundo mecanismo que permite la vida a bajas temperaturas lo constituyen la presencia de sustancias crioprotectoras. Los polioles, compuestos orgnicos de bajo peso molecular polihidroxilados de formula R-(OH)n, que participan del enlace hidrgeno por su lado OH y bloquean la continuacin o adicin de nuevas molculas de agua al cristal con su lado R. Estas substancias impiden el crecimiento de los cristales de hielo y entre ellas se encuentran el Glicerol, Sorbitol y la Trealosa (fig. 19 -1).
CH OH
CH OH HO
OH
O
OH
C
HC OH HO CH
OH
O
HC OH HO CH
2
CH
OH
CH OH HO
OH
HC OH CH
2
OH OH
GLICEROL
SORBITOL
TREALOSA
Fig. 19 -1. Los Crioprotectores se interponen entre las molculas de agua y reducen la capacidad para formar enlaces hidrgenos. Con ello impiden la formacin de agua estructurada en la forma de hielo.
Algunas de las especies que cuentan con estas defensas viven en el circulo polar rtico como s el caso de algunos peces y moluscos, que poseen un metabolismo celular lento con acumulacin de glucgeno (polmero polihidroxilado de la glucosa) en los tejidos, ya que esta molcula es rica en OH por un lado y grupos R por el otro. El glucgeno es a la vez una fuente de energa que puede fermentar anaerbicamente.
26
Un tercer mecanismo de adaptacin a las temperaturas bajo 0oC aparece en las ranas, tortugas, peces e insectos que hibernan a temperaturas inferiores a los - 10oC. Estos organismos corren un riesgo calculado que consiste en permitir la formacin de hielo, pero de manera controlada y solo en los espacios extracelulares. Se logra este objetivo mediante protenas de pequeo tamao altamente polares que actan como centros de nucleacin (lugar donde se inicia la cadena de unin de las molculas de agua) en los espacios extracelulares. La formacin de los cristales de hielo es controlada en su crecimiento por otras protenas y polipptidos. Estos ltimos cubren la superficie del cristal (fig. 20 -1) e impiden la adicin de nuevas molculas de agua a la estructura cristalina. Por otro lado, el calor de fusin liberado por la cristalizacin controlada o modulada, se puede transmitir al espacio intracelular para mantener a este ltimo de manera fluida y funcional. Cerca del 65% del agua corporal, es capaz de ser congelada por este mecanismo, especialmente en los moluscos que sobreviven a la baja marea y quedan expuestos por horas a temperaturas de - 20oC o inferiores. La disminucin del agua extracelular fluida debido a la formacin de cristales, plantea en este caso un problema extra que se relaciona con el control del volumen interno de la clula. Como existe en el espacio extracelular menos agua para mantener a las distintas sales all presentes en forma soluble. Estas ltimas se concentran y producen un shock osmtico, sacando agua intracelular y permitiendo la entrada de sales a la clula. Para evitar este problema, es importante la cantidad de hielo extracelular permitido por estos organismos. Es necesario que los cristales de hielo sean frenados en su crecimiento y alcancen un tamao determinado antes de que provoquen un shock osmtico.
27
Por otro lado, estos organismos deben ser aptos para sobrevivir sin aporte de oxgeno y a la
LEC
CRIS TA L . . .
Protenas que actan como centros de Nucleacin
. . . .
. . . . . . .
Polioles Capa de Trealosa ( disacrido) que se une a la carga - de los Fosfol'ipidos disminuyendo su interaccin con el agua.
. . . . . . . . . . .
. .
. LIC . .
. .
. . . . . . . . . . .
. .
GLICEROL En el interior impide la congelacin
Protenas que . impiden la propagacin del cristal de hielo
L E C : Lquido extracelular LIC

: Lquido intracelular
Fig. 20 - 1. Algunas protenas actan como centros de nucleacin mientras que otras cubren el cristal para que no crezca demasiado.
vez eliminar los productos txicos formados en sus tejidos. Para suplir esta carencia, algunas de sus vas metablicas anaerbicas se encuentran exacerbadas. Entre las protenas resistentes al fro se ha encontrado que algunas de ellas son capaces de inducir la formacin de cristales en su superficie, debido a que poseen un 40% de su composicin con aminocidos hidroflicos, tal como Glu, Gln y Thr. Por otro lado aquellas protenas que limitan el crecimiento del cristal al cubriendo la superficie de este, an no ha sido determinada. Sin embargo, deben tener un carcter dual. Por un extremo deben unirse a la superficie del cristal mediante enlaces electrostticos como el enlace hidrgeno y por el otro extremo, deben ser capaces de repeler molculas de agua al exhibir grupos hidrofbicos. De esta forma el cristal de agua no puede continuar agregando nuevas molculas para crecer ya que se encuentra bloqueado y se evita el incremento de la osmolaridad del medio.
Volver al inicio d) COMPATIBILIDAD DEL AGUA CON LA VIDA A ALTAS TEMPERATURAS.
28
Parece ser que la temperatura ms alta tolerada por los pluricelulares es de 60oC, donde proliferan algunos protozoos, algas y championes. En cambio los procariontes pueden desarrollarse normalmente a temperaturas de 95oC y en algunos casos como las Archeobacterias a temperaturas superiores a esta. Para predecir como se adaptarn las macromolculas hay que entender el comportamiento del agua a altas temperaturas. Si la agitacin trmica del agua aumenta con la temperatura, la fraccin de molculas que forma agrupaciones alternantes disminuye, hasta que todas las molculas se encuentran agrupadas al azar y finalmente pasan en grupos a la fase vapor, ya que la energa de agitacin es mayor que la energa de los enlaces hidrgenos que retienen a las molculas en la fase lquida. En realidad la vida en el mar a temperaturas superiores a 95oC ocurre a grandes profundidades. En dichos ecosistemas la agitacin molecular del agua a la presin de 265 atmsferas, no tiene la intensidad suficiente como para denaturar una protena o una bicapa lipdica.
Volver al inicio e) ADAPTACION DE LAS PROTEINAS A ALTAS TEMPERATURAS.

Si una protena tiene una actividad ptima entre 37 y 42oC, significa que tiene capacidad para cambiar de conformacin a pesar de la influencia ejercida sobre ella por su capa de hidratacin externa. Existirn diversos espesores en la capa de hidratacin segn el grado de solubilidad que tenga la protena y a la vez esta capa podr variar de un sector a otro de su estructura, segn la distribucin de las cargas presentes en la superficie. Por otro lado, en el interior de la protena existirn tanto interacciones hidrofbicas, como interacciones electrostticas, enlace hidrgeno, puentes disulfuro y probablemente coordinacin con algn metal. Todas estas interacciones son del tipo dbil a excepcin del puente disulfuro (Tabla 3-1). En otras palabras los tirantes que mantienen la estructura de la protena en solucin no son todos iguales y algunos estn sometidos a mayor tensin que otros, existiendo puntos crticos para mantener la conformacin ptima para cumplir con una funcin especfica a una temperatura determinada (fig. 21 -1). Es por esta razn, que las distintas interacciones dbiles contribuyen mucho ms que los enlaces covalentes, durante el proceso que ha permitido la adaptacin de las protenas a distintas temperaturas. El cambio adaptativo experimentado por las distintas especies ha permitido que las interacciones dbiles sean substituidas por otras ms resistentes del mismo tipo (enlace hidrgeno por puente salino). De esta manera algunas mutaciones han seleccionado la existencia de protenas y bicapas que mantienen la capacidad funcional a altas temperaturas. Este anlisis es vlido al comparar la misma protena o enzima en bacterias Crifilas (0 - 4oC), Mesfilas (temperatura ambiente) y Termfilas (90 - 97oC). Resumiendo, el aumento de la capa externa de agua junto a los sutiles reemplazos de aminocidos, como Glutamina (Gln) por Glutmico (Glu) y en otros casos de Treonina (Thr) por Lisina (Lys) en lugares crticos de la estructura, permite que las interacciones por enlace hidrgeno sean sustituidas por interacciones electrostticas. Este efecto confiere mayor rigidez estructural a la protena, para as tolerar la elevada agitacin molecular del agua y a la vez le permite ser una entidad dinmica compatible con la vida. Hasta la fecha no se ha observado en las protenas un aumento de las interacciones fuertes como es el enlace
29
covalente, como mecanismo adaptativo para adquirir mayor tolerancia a las altas temperaturas.
Cam bio de Gln por Glu Aum ento de la Tem peratura
H is G ln G ln Lys
Protena inestable a 70 oC Enlace Hidrgeno Sim ilar protena a la anterior estable a
H is G lu Glu G lu Lys
70 oC
Interaccin Electrosttica
His G ln
G ln Lys
H is G lu
G lu Lys
Fig. 21 - 1. La protena aumenta sus interacciones internas para tolerar el mayor nmero de choques con el agua a mayor temperatura.
Volver al inicio f) ADAPTACION DE LAS BICAPAS DE FOSFOLIPIDOS A LAS ALTAS TEMPERATURAS.

Una bicapa tendr cidos grasos de cadena mucho ms larga y saturada permitiendo una mayor interaccin de tipo Van der Waals, para conservar la estabilidad a altas temperaturas. Los cidos grasos insaturados, cortos de tipo cis son ms libres y no estn en estrecho contacto, por lo que no pueden tolerar un aumento del nmero de choques con la suficiente rigidez estructural y terminan por separarse. Para superar este problema, se favorece la presencia de cidos grasos largos y saturados. En algunos casos se les ha encontrado ramificados y unidos por la cola en una monocapa. (fig. 18 -1) De esta manera la monocapa (antigua bicapa) podr tolerar una mayor temperatura de fusin al estar formada por cidos grasos de tamao doble con dos cabezas polares, debido al aumento de la interaccin Van der Waals entre las superficies de estos. Estas molculas se encuentran agrupadas en estrecho contacto debido a sus ramificaciones laterales. Estos cambios permiten an la fluidez necesaria para llevar a cabo sus funciones a altas
30
temperaturas, considerando el efecto contrario al incremento de rigidez causado por los choques de las molculas de agua sobre la unin en monocapa.
Volver al inicio 4) LA VIDA SIN AGUA O ANHIDROBIOSIS

El agua es extremadamente importante para las Protenas, Lpidos y estructuras anexas. La falta de agua conduce a la prdida de la estabilizacin de ellas, es decir se abren y muestran sus zonas hidrofbicas denaturndose, sin embargo semillas de trigo guardadas por miles de aos en las pirmides, an son frtiles a pesar de que se encontraban totalmente secas. Por otro lado huevos o quistes de Artemia Salina (crustceo que prospera en salares), carecen totalmente de agua, al ser esta evaporada por el Sol y extrada por la osmolaridad de la sal, sin embargo una vez devueltos al agua se hidratan y pasan a ser frtiles. El mecanismo por el cual se preservan las estructuras tanto en las semillas como quistes, se debe a que el agua que rodea las zonas hidroflicas de las estructuras, ha sido reemplazada en estos casos por grupos OHs, provenientes de Trealosa (dos molculas de Glucosa) y Sucrosa (una Glucosa y una Fructosa). Ambos disacridos se encuentran presentes en gran cantidad en aquellos organismos anhidrobiticos latentes junto al Glicerol, el cual es un alcohol polihidroxilado. De esta forma es posible mantener los enlaces hidrgeno y con ello preservar las estructuras para que permanezcan viables. A pesar de que estos organismos desecados, no realizan metabolismo de ningn tipo, son capaces de mantener sus estructuras intactas y se les considera como vivos, aunque latentes gracias al reemplazo de los grupos Hidroxilos del agua por aquellos de los Hidratos de Carbono, que comprenden molculas como almidn, glicgeno y polialcoholes.
Volver al inicio
5) PRODUCTO IONICO DEL AGUA.

Como hemos visto anteriormente, el agua tambin puede disociarse y existe un determinado equilibrio regido por la ley de accin de masas entre el agua como molcula y sus productos de disociacin: H2O <----> H + + OH No ocupamos aqu, la denominacin de ion Hidrnio H3O+ que en la realidad se encuentra tetrahidratado como H9O4 +, sino que emplearemos al ion H + por comodidad. El otro ion del agua es el OH - que tambin se encuentra hidratado. Para calcular la constante de equilibrio de la disociacin del agua debemos considerar primero: a) la concentracin del agua [H2O] en el agua dentro del volumen de un litro, que es 1000gr/18 peso molecular agua = 55,6 moles/litro.
31
b) la concentracin de los iones H+ y OH -, ser la probabilidad de encontrar uno de los dos iones libres del agua en la concentracin molar del agua, este producto entrega un valor de 0,0000001 moles /litro y para cada ion es de 10-7 M. El Equilibrio entonces, ser de: Keq = (0.000000001)x(0.000000001)/55,6 Keq = (10-7 M x 10-7 M)/55,6 M o Keq = 1.8 x 10 - 16 moles/litro
Como 55,6 M es constante se incorpora entonces al valor de Keq, para dar Kw o el producto de solubilidad del agua que es: Kw = Keq x 55,6 = 1,01 x 10 - 14 Kw, expresa la relacin de concentraciones de los iones H+ y OH - en solucin acuosa. El ion hidrgeno puede disminuir y el ion hidroxilo aumentar o viceversa, sin embargo mantendrn siempre la misma proporcin de 1,01 x 10 - 14: Kw = [H+ ] x [OH -] = 1,01 x 10 - 14 La Kw es la base para determinar la concentracin de iones Hidrgenos en una solucin o el factor conocido como pH. Todas las sales al disociarse en el agua liberan o atrapan una cierta cantidad de protones aumentando o disminuyendo la concentracin de estos. En el primer caso las soluciones son consideradas como cidas y en el segundo como bsicas. La concentracin de los iones hidrgenos se ve alterada, desde la neutralidad a 10 - 7 moles/litro [H +] o bien desde pH 7, hasta la concentracin real de los nuevos iones presentes en el agua. El concepto de pH permite evitar la expresin con tantos ceros para la concentracin del ion hidrgeno y emplear solamente el exponente de la potencia que solo representa el valor de la concentracin del ion hidrgeno. De esta manera la concentracin de 0.0001 tiene un pH de 4 y la concentracin de 0.001 tiene un pH de 3 y as sucesivamente. La expresin que relaciona el valor de la concentracin del ion hidrgeno con su exponente esta dada por la ecuacin: [H+] = 10 pH
pH = log 1/[H+] = - log [H+] As tenemos que: [H+]M 10 - 1 10 - 2 10 - 3 10 - 4 10 - 5 [H+]M 0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001 pH 1 2 3 4 5
etc.
32
Volver al inicio 6) AMORTGUADORES O TAMPONES.

Los tampones son sustancias que mantienen el pH o la concentracin de los iones hidrgenos constante en una solucin. Esta funcin es llevada a cabo por medio de un mecanismo que permite liberar protones cuando el medio se pone bsico y atrapar protones cuando el medio se pone cido. Por ejemplo, un aminocido puede ser considerado como un anftero que puede donar o aceptar protones, ms an puede ser considerado como un cido dbil que puede entregar varios protones a medida que el pH del medio sube desde el valor 2 hasta 10. El aminocido Glutmico (Glu) a pH = 7 por ejemplo, puede ser representado en solucin por la siguiente especie qumica: H + ( -Amino) H3N - C() - COO (-Carboxilo) CH2 ( Residuo CH2 Carboxilo) COO A este pH vemos que sus tres grupos estn ionizados siendo un aminocido de carcter polar y su carga es en estas condiciones ser de -1, ya que se anulan la carga positiva con la negativa. El mismo aminocido presenta a pH 1 la siguiente especie qumica: H H3N - C() - COOH CH2 CH2 COOH
Esta especie se encuentra totalmente protonada con una carga de +1. El aminocido Glutmico a su vez posee tres grupos: -COOH, -NH 3 y -COOH que pueden conferirle el carcter de un cido dbil, ya que puede entregar tres protones con distintas constantes de disociacin:
+
K1= 0 , 0 0 5 0 1 (-Carboxilo) - COOH <--------> (-Carboxilo ) COO - + H + K2=0 , 0 0 0 0 6 3 (Residuo--Carboxilo) -COOH <---------> (Residuo-- Carboxilo) -COO - + H+
33
K3 =0 , 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 9 9 (-Amino) - NH+3 <---------> (-Amino) NH 2 + H+

El K1=0,00501 es del -Carboxilo que libera el primer protn por ser ms cido, en seguida sale el segundo del grupo -Carboxilo con una K2=0,000063 y finalmente sale el tercero perteneciente al grupo -Amino con una K=0,00000000199. En general los aminocidos cidos, como Glutmico y Asprtico pueden ionizarse al cambiar la acidez del medio desde pH 1 a 10. El grupo ms cido o de menor pKd (mayor Kd), tender a entregar el ion H+ primero (-COOH), luego vendr el segundo (-COOH) de Kd intermedio y finalmente el menos cido de todos (-NH3+) o de menor Kd (mayor pKd), que entregar el protn cuando el medio sea francamente bsico. Lo anterior significa que cada uno de los grupos ionizables tiene una constante de disociacin distinta: Kd pKd : K1=0.00501 : K2=0.000063 : K3=0.000000000199 = 5.01 x 10-3 = 6.3 x 10-5 = 1.99 x 10-10 = 2,19 = 4,25 = 9,67
-COOH -COOH - NH3
Como es un tanto difcil hablar de cantidades decimales con tantos ceros, es mucho ms ventajoso expresar solo los exponentes de base 10. Con este propsito se emplea el trmino de pK. As tenemos que: 1 pK = log ---- = - log Kd Kd De esta manera una: K1 = 0.00501 o 10 2 ,3 corresponde a un pK de 2.3 y con similar tratamiento: K2 = 0.000063 corresponde al pK de 4.2 y para: K3 = 0.000000000199 el pK corresponde a 9.7
Los residuos de aminocidos con bajo pK sern cidos y los con alto pK sern bsicos.
En las figuras que aparecen en 22-1 a, b y c, podemos apreciar las especies qumicas formadas junto a las curvas de titulacin del aminocido Glutmico, desde pH 1 a pH 10. Al analizar sus tres pKs empleando la ecuacin de HENDERSON-HASSELBALCH, es posible caracterizar cada una de las etapas de disociacin o la salida de cada protn determinada por su pK especfico (fig.22a-1).
34
La titulacin del cido Glutmico se empieza con NaOH ecuacin (2-1): [ Glu o] pH = 2,3 + log----------[ Glu +]
a pH 1 en base a la
(2-1) o su equivalente
[ AH2] pH = 2,3 + log ---------[AH3+]
En la figura 22c -1, se observa en el grfico de [especie qumica] vs pH, la especie de carga + o [Glu +], que es igual a AH3+ . Este disminuye su concentracin inicial, apareciendo al mismo tiempo la especie neutra [Glu o] o AH2, que aumenta de concentracin a medida que la primera entrega su protn. A continuacin se emplea la segunda ecuacin (3-1), para describir el proceso donde la especie neutra en su concentracin mxima de [ Glu o], dona su segundo protn con un pK de 4,2 y disminuye su concentracin aumentando paralelamente la especie de carga negativa - , [Glu -] o AH-. [ Glu - ] pH = 4,2 + log-----------[ Glu 0 ]
(3-1) o
[ AH- ] pH = 4,2 + log ---------[AH2]
Finalmente, en la tercera ecuacin (4-1), que ocurre en medio bsico a pH 9,7 sale el tercer protn de la especie qumica de carga - , [ Glu - ] con un pK de 9,67 y desde la mxima concentracin disminuye al transformarse en la especie de doble carga negativa - - , [Glu - - ] o A - - , la que aumenta hacia el final de la titulacin a pH 10: [ Glu - - ] pH = 9,7 + log -----------[ Glu - ] [ A - -] (4-1) o pH = 9,7 + log ---------[ AH -]
La ecuacin de Henderson Hasselbalch se puede resumir en general por: [especie qumica que ha dado protones] pH = pK + log --------------------------------------------------[especie qumica que entrega protones] Se puede concluir que despus de esta titulacin los aminocidos a bajo pH < 2 tendrn carga +, mientras que a alto pH > 10 tendrn carga - . Mientras que a un pH intermedio alcanzarn su punto isoelctrico o pI, donde la carga neta ser 0. En este punto el nmero de cargas positivas es igual al nmero de cargas negativas. El pI se puede calcular sumando los pKs de los protones que se liberan en la reaccin anterior y en la reaccin posterior a cuando la especie isoelctrica se encuentra en mayor concentracin. En el caso del aminocido Glutmico el pI deber ser de: 2,3 + 4,2 pI = ------------- = 3,25 2 La curva de titulacin y la curva correspondiente a la variacin de la concentracin de las especies qumicas se observan en las figuras 22b -1 y 22c-1 respectivamente. En ellas se aprecian los cambios que ocurren en la carga y las concentraciones del aminocido Glutmico al pasar por cada pK de su titulacin.
35
En el grfico 22b-1, se observa que las regiones tampn estarn dadas por los "plateau" o mesetas de la curva de titulacin. En este lugar la concentracin de la especie qumica que entrega protones y la concentracin de la especie que acepta protones es igual o muy cercana la una a la otra. En las tres mesetas o "plateau" de la curva de titulacin de la figura 22b-1 se observa, que a pesar de la gran cantidad de equivalentes de OH agregados a la solucin, solo ocurre un pequeo cambio en el pH. Este efecto significa que existen tantas zonas tampn como pKs tenga el aminocido.
36
22 ) Disociacin y Curva de Titulacin del Aminocido Glutmico

Volver al inicio
COOH CH 2 CH 2
3
22 b)
pH
Curva de titulacin a)
+
9.7
2.3
+
3
COOH CH2 CH2 HN C COO H
HN
C COOH H
+ H
4.2
AH- = A- -
AH3
AH2 + H
COO CH2 CH2
3HN
+
2.3
AH2 = AH-
COOH CH2 CH2
3HN C COO H
4.2
C COO - + H
AH3+ = AH2 meq de NaOH Especie qumica Curva de titulacin b) 22 c)
AH2
COO CH2 CH2
3HN
AH + H
COO CH2 CH2
2HN
2,3
-
4.2
AHAH2 = AH-
9.7
AAH- = A- -
C COO H
9.7
C COO H
+H
AH3+
AH2
AH
--
AH3+ = AH2
H+
AH3+
AH2
pH
Fig...22a-1. Especies qumicas que se forman durante la titulacin Fig. 22b-1 y 22c-1. Curvas de titulacin
Captulo I El agua y sus propiedades
Al extrapolar este comportamiento a una protena soluble que cuenta con residuos polares en su superficie, se puede deducir que ser titulable y que actuar a la vez como un tampn (fig. 23 -1). En este caso los pKs individuales de cada grupo de la protena variarn un tanto por el entorno polar de los otros residuos vecinos. En esta protena hipottica, solo los residuos que se muestran al exterior sern titulables, aunque al cambiar sus cargas durante la titulacin la protena sufrir tambin de cambios conformacionales, donde podr mostrar u ocultar algunos otros grupos. La temperatura a la cul se lleva a cabo la titulacin ser otro factor que afecte la estructura y la presencia de grupos titulables en la superficie de la protena.
Protena polar soluble en agua.
+ + + _
+ _
+ + + _
+ _
_ + +
_ + + + +
_ +
_ + + +
Fig. 23 - 1. Las protenas solubles en agua presentan carga superficial debido a los residuos de aminocidos. Estas cargas pueden cambiar segn el pH a que se encuentre el medio.
Volver al inicio
37
ACIDOSIS Y ALKALOSIS EJEMPLO DE UN AMORTIGUADOR BIOLGICO EN MEDIO ACUOSO Para mantener un pH normal de 7,4 en la sangre participan distintos rganos como: a) los pulmones, que manejan el CO2 en la sangre mediante la hipo o la hiperventilacin. b) los riones que controlan la remocin del -HCO3 desde la sangre c) el corazn que con su ritmo es capaz de regular el tiempo de intercambio de gases en los pulmones. Durante el ejercicio los msculos emplean el Oxgeno para convertir la energa qumica almacenada en la Glucosa en energa mecnica. Esta ltima se emplea en contraer los msculos y ejecutar movimiento. El O2 empleado con este fin, proviene de la Hemoglobina en la sangre, mientras que el msculo libera los subproductos del metabolismo como son los cidos Lctico y Pirvico, que junto al CO2 contribuyen a bajar el pH. Si el pH es inferior a 7,4 se desarrolla una condicin denominada Acidosis y si es superior a este se produce una Alcalosis. En aquellos casos donde se baja a pH 6,8 o se sube a pH 7,8 se producen graves alteraciones, ya que una serie de procesos catalticos requieren de un determinado pH y fuera de este no se encontrarn con su desempeo ptimo. Por lo tanto, es necesaria la presencia de amortiguadores en la sangre, destacndose entre ellos el Bicarbonato que se describir a continuacin. La reaccin de equilibrio del Bicarbonato es la siguiente: K1 K2 H2CO3 HCO3 CO2 + H2O
H+
Al respirar dentro de una bolsa aumenta la presin parcial de CO2 en los pulmones provocado por la inspiracin y expiracin de aire viciado. Esta condicin se denomina hipoventilacin y el equilibrio de la reaccin se desplaza a la derecha para liberar protones y bajar el pH. Por otro lado, al hiperventilar por un estado de histeria, durante un ejercicio severo o ante un bao muy caliente, se baja la presin parcial de CO2 en los pulmones. En este caso el equilibrio se desplaza a la izquierda, donde la reaccin toma protones del medio subiendo el pH. La ecuacin tampn de Henderson Hasselbalch (H-H) que se deriva de aqu es la siguiente: ( H2CO3 ) K1 =--------------------------( CO2 ) y ( H+) ( HCO3 - ) K2 =--------------------------( H 2CO 3 )
38
Luego: H+ ( H2CO3 ) K2 = ------------------------------------( HCO3 - )
y al reemplazar el ( H2CO3 ), tenemos: H+ ( CO2) K2 K1 = ------------------------------------( HCO3 - )
al invertir y multiplicar por -1: 1 1 ( HCO3 - ) - -------- = - ------------------------------------K1 K2 ( CO2) H+ Se convierte en la ecuacin H-H, donde el Rin maneja el Bicarbonato ( HCO3 - ), el pulmn maneja el anhdrido carbnico (CO2) y como consecuencia se mantiene el pH constante en la sangre: ECUACIN HENDERSON - HASELBALCH SANGRE ( HCO3 - ) p H = pK + Log ------------------------------( CO2) RIN PULMN
Ahora, como el pK del c. Carbnico ( H2CO3 ) es de 6,1 la reaccin se encuentra normalmente desplazada a la derecha en condiciones normales de pH = 7,4 en la sangre. De esta manera, la relacin H2CO3 / -HCO3 se desplaza desde 50/50 % a pH 6,1 hasta la proporcin de 5/95% o de 1/20 a pH 7,4: CO2 + H2O (5%) H2CO3 pK = 6,1
-
(95%) HCO3
H+
Debido a lo anterior se cuenta con una mayor concentracin de Bicarbonato ( -HCO3 ) capaz de tamponar a los protones que se liberen del metabolismo en los tejidos. Cuando ocurre eliminacin del Bicarbonato (HCO3) o el aumento de Anhdrido Carbnico (CO2) en la sangre, se produce una variacin concomitante entre la relacin de c Carbnico es a Bicarbonato en la Ecuacin de H-H:
K1
K2
39
CO2 + H2O
H2CO3
HCO3
H+
Eliminacin
Aumento
Este nuevo reacomodo de la ecuacin en equilibrio conduce a una Acidosis con una baja de pH en la sangre: (- HCO3 ) pH = pK + Log ------------------( CO2) Volver al inicio
a) CAUSAS DE ACIDOSIS
En general la Acidosis, se produce a causa de enfermedades como la Diabetes mellitus, la inanicin o una dieta de alto contenido graso. Todos estos factores estimulan la produccin de los Cuerpos Cetnicos (c. Acetoactico y el -Hidroxibutirato) cuyo pK es alrededor de 3,5 ( ver captulo de Metabolismo de los Lpidos). Por otro lado se puede provocar una Acidosis mediante el ejercicio fsico sostenido o cuando se producen fallas en la circulacin (isquemias). La ingestin de drogas o la produccin de toxinas por alguna bacteria infecciosa son capaces de estimular la produccin de c. Lctico o evitar su remocin y debido a ello se puede acumular en la sangre (Ver Captulo de Hidratos de Carbono) bajando el pH. Existen otros tipos de acidosis atribuidos a defectos congnitos del metabolismo (Ver captulo sobre el metabolismo de los Aminocidos), donde algunos catabolitos de los aminocidos se acumulan en la sangre por fallas enzimticas. La ingestin de Salicilatos, Metanol, Etilen Glicl, Isoniazida, Hierro, Paraldehido, Azufre, Tolueno y Cloruro de Amonio pueden provocar acidosis qumicas. Volver al inicio
b) CAUSAS DE ALCALOSIS
40
Por el otro lado, existe la Alcalosis. Esta se produce cuando el Bicarbonato aumenta forzando al sistema previamente en equilibrio a sacar protones de la sangre causando que el pH suba. En general, puede ser causado por ingerir Bicarbonato como anticido, exceso de vmitos por nauseas mal contenida o por hiperventilacin que disminuye el CO2:
CO2
H2O
H2CO3
HCO3
H+
(- HCO3 ) pH = pK + Log ------------------( CO2) Como una aplicacin de la Ecuacin de H-H en los casos de Alcalosis, es posible hacer que los corredores de maratn aprendan a controlar su respiracin. De esta manera se les ensear a disminuir la hiperventilacin para que no baje tanto el CO2 y se provoque una Acidosis que neutralice a la Alcalosis. En el extremo opuesto se encuentran aquellas personas que practican carreras cortas, pero intensas junto a los nadadores. Ambos tipos de deportes son propensos a producir grandes cantidades de cido en corto tiempo. Este efecto los hace susceptibles de fatiga y calambres, sin embargo se puede retardar este desarrollo mediante la hiperventilacin previa por 30 o 40 segundos. As se introducen condiciones de Alcalosis en la sangre que ayudarn a neutralizar la acidez producida por el cido Lctico.
Aportado por
CO2 + H2O
H2CO3
HCO3 +
H+
TEJIDOS HCO3 + H+
Cuando uno hiperventila, el CO2 y H2O que se elimina suben el pH, sin embargo los protones son reemplazados por bicarbonato y otros protones ms que provienen de los tejidos. Los pulmones y el rin son los encargados de mantener el pH de la sangre constante. El pulmn puede responder hipo o hiperventilando rpidamente, mientras que el rin demora das en llevar el pH a valores normales nuevamente. Cuando el pH sube (Alcalosis) los riones remueven bicarbonato de la sangre y el equilibrio se desplaza a la derecha, aumentando la concentracin de hidrgeno (bajando el pH) hacia valores normales: CO2 + H2O H2CO3
-
HCO3
H+
41
Rin Por otro lado cuando el pH en la sangre baja (Acidosis), el rin no remueve bicarbonato y este es aportado por los tejidos acumulndose, por lo que se une al in Hidrgeno con lo que el equilibrio se desplaza a la izquierda y el pH sube: Aportado por TEJIDOS HCO3
CO2 + H2O
H2CO3
HCO3
H+
Rin no remueve bicarbonato Uno de los factores que se ha obviado hasta ahora es la velocidad con que se bombea la sangre a los pulmones. Durante el ejercicio violento, la velocidad de la sangre que pasa por los pulmones es de tal magnitud que no hay tiempo de intercambio de Oxgeno por CO2 con lo cual se obstaculiza la eliminacin del CO2 y la subida del pH. Este efecto se ve exacerbado por los niveles del c. Lctico y Pirvico producido por el metabolismo. Por lo tanto aquellos deportistas que pueden controlar de alguna manera su ritmo cardaco (meditacin trascendental) estarn en ventaja sobre aquellos que no posean esta cualidad. La reaccin de equilibrio entre el CO2 y el bicarbonato, se puede verificar fcilmente cuando se abre una bebida gaseosa y se controla su pH. Cundo es ms cida?. Cmo respuesta se puede precisar que recin abierta o cuando estuvo cerrada, la concentracin de CO2 disuelto en el lquido es mayor y el equilibrio se desplaza a la derecha liberando protones y bajando el pH. CO2 + H2O H2CO3
-
HCO3
H+
Cundo es menos cida? Despus de un momento de estar abierta, cuando gran parte del gas CO2 disuelto en el lquido se ha volatilizado y el ion hidrgeno se ha unido al Bicarbonato desplazando el equilibrio hacia la izquierda.
CO2 + H2O
H2CO3
HCO3
H+
Existen otros tampones en la sangre, pero tienen menor relevancia y uno de ellos es el c. Fosfrico, cuyo pK le permite funcionar ms cerca del pH de 7,4: pK = 6,8 H3PO4
-
H2PO4
H+
Otro de ellos es la Hemoglobina con su efecto Bohr (Ver Captulo de Protenas):
42
Hb (O2)4 + 4H+
Hb H4 + 4O2
donde se observa que la Hb es capaz de tomar y liberar protones segn las condiciones del medio.
Volver al inicio
REFERENCIAS.
Qumica Orgnica de los Compuestos Biolgicos. R. Barker., Espaa, Ed. Alhambra, 1975.
43
La Liason Hydrogene. Y. Marechat., La Recherche, Vol 20,480-488,1989. Cmo Sobreviven los Animales a la Congelacin. K.B. Storey y J.M., Mundo Cientfico, Vol 9,482-489, 1989. La Vie a Haute Temperature. T.D. Brock, La Recherche, Vol 19, 476-485, 1988. Role of Water in some Biological Proceses. P.M. Wiggins, Microbiol. Rev., Vol 54, 432-449, 1990 The Hydrophobic Effect and the Organization of Living Matter. C. Tanford, Science,Vol 200, 1012-1018, 1978. Water, a wonder molecule. The Hindu, Thursday , Febraury 12, 1988 SECTION :Science & Tech. http://www.webpage.com/hindu/daily/980212/08/08120001.htm
44
45
Hctor Rocha L. Los Aminocidos y sus Caractersticas
48
INICIO:
1) LOS AMINOACIDOS 51 2) EXISTENCIA DE LOS AMINOACIDOS 52 a) Primera Hiptesis 52 b) Segunda Hiptesis 53 c) Tercera Hiptesis 54 d) El RNA como molcula precursora de DNA y protenas 55 3) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS 56 a) Solo L - Aminocidos participan en la formacin de las protenas 57 b) Clasificacin de los Aminocidos segn su grupo R 59 c) Absorcin de luz ultravioleta 61 d) Ionizacin de los aminocidos 61 e) Influencia de los grupos vecinos sobre la Ionizacin de los Aminocidos en las Protenas 63 4 ) SEPARACIPN DE AMINOCIDOS 63 a) Cromatografa de Intercambio inico 63 b) Electroforesis 66 c) HPLC 66
49
50
1) LOS AMINOACIDOS. En la estructura de los aminocidos se encuentran los principales componentes de la vida, como son Carbono, Hidrgeno, Oxgeno, Azufre y Nitrgeno. Su estructura se caracteriza por un Carbono- central con una estructura tetradrica de hibridacin sp3. A este carbono central, se le unen un grupo Amino, un grupo Carboxilo, un tomo de Hidrgeno y un residuo o grupo R, cuya naturaleza entrega la individualidad a cada aminocido. De los 20 aminocidos que se encuentran en las protenas, solo la Glicina no es quiral ya que posee como grupo R, un hidrgeno similar a su otro Hidrgeno . Por otro lado el aminocido Prolina, posee un grupo R formado por una cadena alqulica, cuyo Carbono- interacciona con su grupo - Amino, formando un anillo y produciendo un aminocido extremadamente rgido para la torsin. (Tabla. 1 - 3). En general los grupos R por Residuo, se encuentran
R-
: Residuo del aminocido que confiere la individualidad
Residuo
HN
3
- Amino
COOH
- Carboxilo
Los grupos funcionales y el tomo de H que se encuentran en el rectngulo son iguales para los 20 aminocidos exceptuando a la Prolina.
Fig. 1 - 2. El carbono es asimtrico.
formados por grupos funcionales como Aminos, Carboxilos, Tioles, Hidroxilos e Imidazoles. Por otro lado, aquellos aminocidos en que los grupos Amino y los residuos R estn en los carbonos o , no forman parte de las protenas. El Carbono central es asimtrico o quiral cuando presenta cuatro sustituyentes diferentes y por lo tanto da origen a enantimeros o ismeros pticos (imgenes especulares no superponibles). El proceso por el cual los gases primitivos se combinaron para generar algunos Aminocidos, Bases Nitrogenadas y precursores de los Hidratos de Carbono, es an un tanto oscuro, sin embargo se puede seguir la pista de como pudo haber ocurrido la reaccin que les dio origen (Ver Captulo de Bioenergtica). Para entender mejor este paso, podemos analizar la siguiente analoga. Si disponemos de un juego con dados y una de las caras pesa ms que las otras, al ser lanzados al aire darn en alta proporcin un valor determinado. Es decir, el nmero que se encuentra opuesto a la cara ms pesada. Esta ltima ser atrada hacia la superficie de la meza un mayor nmero de veces comparadas con las otras caras. No importa la forma en que se lancen, siempre se obtendr un nmero importante de aciertos. De similar manera, una reaccin qumica que cuenta con una disposicin particular de los orbitales en cada uno de los tomos o molculas. Siempre ser capaz de generar productos iguales o similares, a pesar de las distintas
51
condiciones de presin, temperatura y proporcin en que se encuentren. En la actualidad se dice que la vida parti de un conjunto de reacciones qumicas termodinmicamente factibles y que a la vez tenan la capacidad de auto replicarse y evolucionar. En otras palabras eran capaces de reproducirse, hacindose cada vez ms eficientes en su medio (Ver captulo de Bioenergtica). Volver al Inicio
2) EXISTENCIA DE LOS AMINOACIDOS a) PRIMERA HIPOTESIS Hace ya algn tiempo (1920) en un experimento en que se recre la atmsfera primitiva, se combinaron entre s las molculas de NH4, CH4, H2, y H2O. A continuacin mediante una descarga elctrica (Fig. 2 - 3) se produjo la reaccin en que se generaron algunos de los 20 aminocidos, una base nitrogenada y un precursor de los hidratos de carbono.
Sntesis de compuestos orgnicos con actividad biolgica a partir de gases presentes en la atmsfera primitiva LLaves para sacar muestras Gases
Electrodos
Matraz de Reaccin CHISPA
Condensador
Producto condensado de la reaccin
Fig. 2 - 2. El conocido experimento de Miller y Urey en el que se simula la atmsfera primitiva capaz de producir molculas de importancia biolgica por medio de una chispa.
La razn por la cul se formaron estas molculas precisas y no otras al azar se debe fundamentalmente a la disposicin de los orbitales electrnicos de las molculas de gas en la mezcla. Esta disposicin favorecera siempre un determinado tipo de reaccin haciendo la barrera de energa menos costosa para la sntesis de precursores con importancia biolgica y no as la de otros compuestos al azar que no seran parte de la estructura viva. En la actualidad solo se encuentran formando parte de la materia viva las molculas "triunfadoras", sin descontar otras que durante la evolucin qumica, han sido descartadas por ser incompatibles con lo que en la actualidad llamamos vida. Es interesante
52
hacer notar que tambin, aquellos compuestos orgnicos sintetizados por el hombre denominados xenobiticos, no se relacionan con la vida y generan grandes trastornos a los seres vivientes al provocar en ellos cncer u otro tipo de enfermedades. Por lo tanto aquellas reacciones primitivas entre los distintos gases, pudieron haber dado origen a la evolucin qumica de las molculas y a su vez sentar las bases para una posterior evolucin biolgica. Bajo un simple anlisis desde el punto de vista termodinmico, podemos considerar que la reaccin del compuesto A con el compuesto B debe remontar una barrera de energa para formar un compuesto final A--B. Se debe uno preguntar si el compuesto A--B tiene ms o bien menos energa que cada una de las molculas originales A y B por separado. En el evento de que la unin de A con B sea posible, se necesitar aporte de energa desde el medio o entorno para que A y B pasen la barrera. Una vez alcanzada la barrera A y B pueden generar una molcula liberando energa hacia el medio y ganando estabilidad o bien puede suceder que an necesiten de mayor cantidad de energa para unirse entre s. Esta ltima, tambin puede ser tomada o cedida del medio o entorno. Ahora, si la molcula A-B se ha formado, sucede que existen distintos caminos o posos de energa que permitirn ganar mayor o menor estabilidad a la nueva molcula. Esto depender de la forma en que se unan: A-B, B-A, A2B, AB2, A2B2, etc., pero aqu intervendra la naturaleza de sus orbitales y la influencia del medio sobre estos. Por lo tanto al combinarse entre s, favoreceran una acomodacin que permita dar origen a futuras molculas, mucho ms complejas que las originales tomando o cediendo energa hacia el medio. Estas apreciaciones se encuentran de acuerdo con la segunda ley de la termodinmica que "a priori" se puede considerar como: ORDEN = DESORDEN + ENERGIA Esta simple ecuacin, significa que las estructuras complejas pueden descomponerse en sus componentes bsicos, liberando la energa almacenada en ellas. Al mismo tiempo la energa liberada puede emplearse de manera acoplada, para construir otras estructuras an ms complejas y evolucionadas que las anteriores. Por supuesto que esto, siempre ocurre bajo la condicin de que se libere algo de energa extra al entorno o al medio. Volver al Inicio
b) SEGUNDA HIPOTESIS Este nuevo enfoque supone la llegada de meteoritos portadores de aminocidos a la Tierra. La particularidad de estos aminocidos trados de forma tan peculiar, es que en vez de Hidrgeno presentan en sus molculas el istopo Deuterio. Adems, al ser aislados y cristalizados, se encontr que forman una mezcla racmica. Este hecho significa que su sntesis ha sido mediante reacciones qumicas y que no provienen de algn ser vivo como se ver ms adelante. Ms an, el Deuterio, presente en sus estructuras es un istopo del Hidrgeno muy poco reactivo y no es compatible con la vida. Sin embargo, como muchos meteoritos cayeron al mar, se produjo aqu un lento intercambio de Deuterio por Hidrgeno que dur millones de aos, resultando en la existencia de aminocidos funcionales de caractersticas biolgicas. Esta hiptesis ha sido parcialmente comprobada por algunos astrnomos al descubrir en los espectros de luz proveniente de las nubes estelares, algunas bandas de emisin que
53
corresponden a la presencia de molculas orgnicas, entre las cuales se encontraran los aminocidos deuterados. Volver al inicio
c) TERCERA HIPOTESIS En este caso destacamos la importancia de las arcillas formadas por cristales de AlminoSilicato. Estos cristales tienen la capacidad de actuar como ordenadores y catalizadores de su microambiente y se caracterizan por ser polimrficos. Entre sus caractersticas se ha observado que ejercen una cierta influencia sobre su microambiente mediante interacciones dbiles. De esta manera los cristales de Almino-Silicato seran capaces de catalizar, ordenar y facilitar reacciones qumicas entre molculas primitivas (Fig. 3 - 3). Esta propiedad les permitira a las molculas precursoras alcanzar un determinado grado de complejidad y variedad. A la vez, este hecho contribuy a la formacin de algunos precursores de las molculas biolgicas actuales. La existencia de este proto-organismo con un gen inorgnico o cristal de Almino-Silicato, sera a la vez transitoria ya que con el tiempo se generara un nuevo gen con los productos del anterior y esta vez de factura orgnica. Este nuevo gen ordenadorcatalizador, sera capaz de almacenar una mayor cantidad de informacin y tendra una mejor capacidad para influir en su microambiente, desplazando al cristal primitivo de su nicho ecolgico por ser ms eficiente en preservar la informacin.
54
Nuevos genes ms eficientes que generan un fenotipo especfico
Aparicin de nuevo tipo de genes
Genes desnudos o primitivos. Control del medio inmediato por medio de los genes primitivos. Los genes originales desaparecen como habra sucedido con los cristales de almino - silicato Creacin de un fenotipo elaborado
Fig. 3 - 2. Transmutacin gnica. En la parte inferior, se observa como se crea bajo la influencia de un gen primitivo, un nuevo gen que es ms eficaz y desplaza al antiguo hacindolo desaparecer.
Volver al inicio
d) EL RNA COMO MOLECULA PRECURSORA DE DNA Y PROTEINAS. En la actualidad se reconoce al RNA, como a una de las molculas ms primitivas y se le han observado, tanto caractersticas de almacenador de informacin como tambin de catalizador de reacciones. Es decir acta de ambas maneras, tanto como DNA y a la vez como una Enzima proteica. El RNA se encuentra involucrado en el proceso de Transcripcin de la informacin contenida en los genes discontinuos de Eucariontes, especficamente en la maduracin de los transcritos primarios o RNA heteronuclear (RNAhn) de gran tamao que posee tanto exones (codificantes) como intrones (no codificantes). Este RNA heteronuclear debe sufrir un procesamiento donde se descartan los intrones y se forma el RNA mensajero con solo exones. Pues bien, los mismos intrones que posee el transcrito primario (RNAhn) son capaces de catalizar su propio proceso de corte y empalme de los exones formando el RNA mensajero. Adems, son capaces de catalizar aisladamente la formacin de pequeos polmeros de su misma naturaleza en el tubo de ensayo. Por estas razones el RNA aparece en la actualidad como una molcula dual, que acta en ciertos sectores de su secuencia estructural, como enzima y que a la vez guarda la
55
informacin en otros sectores para la sntesis de una protena. macromolcula intermedia entre el DNA y las Protenas.
El RNA sera una
El sistema basado en la molcula de RNA, se cre en sus comienzos desde una serie de bases nitrogenadas que incluyen a la Adenina, Guanina Citosina, Uracilo y Timina. Todas ellas, ms las que aparecen en las vitaminas Riboflavina y Niacina, demostraron que eran capaces de combinarse fcilmente con azucares y fosfato formando mono y binucletidos. Desde aquel momento solo aquellas molculas con solo Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo se seleccionaron y amplificaron, siguiendo la evolucin qumica (azar y competencia) lo que permiti la existencia del RNA y la posterior seleccin molecular actual. La energa para las reacciones anteriores pudo en un principio haber sido obtenida por compuestos denominados Tiosteres (R-CO-S-R). Estas molculas fueron ms comunes antes de que apareciera el Oxgeno en el ambiente y se pasara a emplear energa desde fosfosteres (R-OPO3R) como se hace en la actualidad. El orden seguido para la aparicin de la vida se puede resumir en la siguiente cronologa. La Tierra se solidific cerca de 4.1 x 10 12 aos, mientras que las 12 primeras evidencias de vida son de los 3.5 X 10 aos. En ese tiempo aparecieron las primeras formaciones denominadas Estromalitos. Estas estructuras fueron dejadas por las Cianobacterias, lo que se confirma con el hallazgo de los primeros fsiles bacterianos (3.4 X 10 12 aos). Durante los 0.6 x 1012 aos de diferencia entre la solidificacin de la Tierra y las evidencias de Estromalitos, pudieron haber ocurrido una serie de hechos que se plantean en la hiptesis de la Evolucin Qumica. Esta ltima acepta la generacin abitica de pequeas molculas orgnicas, influenciadas por la temperatura ms la atmsfera reductora (con H2 y sin O2) y en presencia de una elevada radiacin UV. Bajo estas condiciones se formaran algunos monmeros como aminocidos, azcares simples y precursores de bases nitrogenadas. Parte de estos hechos se encuentran confirmados por los experimentos de Oparin y Haldane en 1920 y posteriormente por los experimentos de Urey y Miller en 1953. Al continuar con la evolucin de las molculas, se pas de la qumica inorgnica a la qumica orgnica y posteriormente se generaron mediante estas reacciones molculas precursoras de aquellas involucradas en la vida. De esta forma al agregarse las molculas pertinentes, generaron Proteinoides. Estos ltimos se encuentran constituidos por algunos aminocidos que pudieron reaccionar entre s, lo que se corrobora por los experimentos de Sydney Fox. Este produjo polipptidos al gotear soluciones de aminocidos sobre piedras calientes. Ms an durante la evolucin qumica, ahora con molculas orgnicas agregadas, en especial aquellas que participaran de la vida, produjeron a los Protobiontes o conjunto de molculas de origen abitico capaces de mantener un ambiente interno y exhibir algunas propiedades de la vida, tal como seleccin y evolucin qumica. Entre los protobiontes podramos tener a las Microesferas, formadas por los Proteinoides en contacto con el agua, a los Liposomas o bicapas cerradas de fosfolpidos con agua por ambos lados y a los Coacervados, constituidos por gotas coloidales de proteinoides, cidos nucleicos y polisacridos. La unin entre ciertas propiedades ventajosas que detentaban algunas de estas agrupaciones, necesitaba tambin de un mecanismo que preservara sus
56
caractersticas ptimas, para as tener xito en aquel ambiente. Adems esto les permitira repetir y optimizar sus tareas de sobrevivencia. Por lo tanto, esta ltima capacidad recay en el RNA, molcula capaz de preservar informacin, autoreplicarse y catalizar reacciones. Posteriormente a esto, las diversas funciones del RNA, se delegaron en macromolculas especficas como son DNA y Protenas. Aparte de las anteriores, otra de las hiptesis acerca del origen de la vida la constituye la Panespermia. Esta considera la importacin de los organismos primigenios por meteoritos y cometas. Recientemente se ha observado que la vida pudo haber comenzado en las profundidades del mar, precisamente en los respiraderos marinos o sistemas hidrotermales, donde existe un ecosistema que prospera en la actualidad a 370C. Por ltimo, se ha encontrado en 1998 discutidos restos de microfsiles bacterianos en un meteorito proveniente de Marte, denominado ALH 84001. Sobre la base de este hecho es an posible teorizar, que la vida surgi de ese planeta y fue capaz de colonizar accidentalmente la Tierra. En general, an restan muchas incgnitas en las hiptesis anteriores y estas tienen uno que otro punto dbil.
Volver al inicio
57
3) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DE LOS AMINOACIDOS. a) SOLO L - AMINOACIDOS PARTICIPAN EN LA FORMACION DE LAS PROTEINAS. Como se seal anteriormente a excepcin de la Glicina, todos los aminocidos presentan al menos un carbn asimtrico o quiral Alfa, con Hibridizacin sp3 y que posee 4
C H O C HO C H2 OH
L - G lic e ra ld e h id o
O H C C H H H O 2H C
D - G lic e ra ld e h id o
OH
C O O H C
2H N
H O O C C H H NH2
R
L - A m in o c id o
R
D - A m in o c id o
Fig. 4 - 2. C asimtrico o quiral significa que sus 4 sustituyentes son distintos, solo el aminocido Glicina no es quiral.
sustituyentes diferentes. Esto hace que cada aminocido pueda tener una imagen especular no superponible y por convencin son comparados a una molcula de Gliceraldehdo que posee un carbono 2 asimtrico o carbono central tambin asimtrico (Fig. 4 - 2). El Gliceraldehdo, ser la molcula patrn para designar a los aminocidos L o D. As tenemos, que es posible alinear el grupo OH del Gliceraldehdo con el grupo NH2 del aminocido, a su vez el grupo CHO del gliceraldehdo se alinea con el Carboxilo del aminocido y el grupo CH2OH del Gliceraldehdo con el grupo correspondiente al Residuo R del aminocido. De esta manera el Hidrgeno ocupa la cuarta posicin coincidente en ambos. Ahora, al respetar esta configuracin podemos decir que un aminocido L tiene el grupo Amino al lado izquierdo y un aminocido D al lado derecho. En la actualidad es bien conocido que las estructuras biolgicas ocupan tan solo L-aminocido, basado en la configuracin del L-Gliceraldehdo. Por otro lado, con el fin de observar la pureza de una preparacin de aminocidos se emplea la Rotacin Especfica, que consiste en la rotacin del plano de la luz polarizada. Esta medicin hace incidir sobre una solucin del aminocido luz polarizada, cuya caracterstica principal es que vibra solo en un plano, ya que la luz normal vibra en mltiples planos (Fig. 5b - 2). Al aplicar luz polarizada sobre la solucin del aminocido, la luz emergente tiene el plano de vibracin o polarizacin desplazado. Si sigue las manecillas del reloj se denomina + (dextrorotatorio). En el sentido contrario al reloj es - (levorotatorio). Los prefijos + por dextrorotatorio) y por levorotatorio o d y l minsculas, no se relacionan con D y L en maysculas. Dextrgiro (+) o levgiro (-) se determinan por el plano de rotacin de la luz polarizada y la denominacin L o D, se hace mediante la
58
comparacin con la estructura del Gliceraldehdo (fig.4 - 2). Adems, puede suceder el caso de que una misma configuracin L tenga valores de signo + o -. En aquellos casos donde el plano de luz polarizada emergente que proviene desde el aminocido no se desplaza a ningn lado, se dice que se tiene una mezcla racmica o el mismo nmero de enantimeros o ismeros pticos + y - del aminocido en particular. En este caso coinciden las designaciones L, D con levgiro y dextrgiro, pero no siempre lo que se presta para una confusin. Aquellos aminocidos sintetizados qumicamente producen este tipo de mezcla. En el caso de que un aminocido presenta ms de un carbono asimtrico se emplea el prefijo Alo (Fig. 5a - 2). Todos los aminocidos que provienen de estructuras biolgicas son del tipo L en base a la molcula patrn Gliceraldehdo. No se encuentran aminocidos D en las protenas. Por otro lado los monosacridos de importancia biolgica son del tipo D. La causa por la que se ha favorecido esta determinada configuracin L en los aminocidos y la configuracin D en los monosacridos, puede ser parcialmente explicada de la siguiente manera: En fsica cuntica se describen cuatro tipos de fuerzas, la gravitacional, la electrosttica, la fuerza nuclear fuerte entre protones y neutrones y la fuerza nuclear dbil que aparece entre los electrones. Esta ltima es la que entrega el carcter de quiral, en este caso a los electrones. De esta manera se puede decir que existen electrones dextrgiros y electrones levgiros. Ambos poseeran cargas de tipo opuesto en que los dextro son atrados al ncleo y los levo repelidos por la fuerza nuclear dbil. As, cuando un electrn
5a ) COOH C HN 2 H C CH COOH C H OH H HO C H CH
(+) (-) 1 2 Luz que vibra en todos los planos Luz polarizada que vibra en un solo plano
5b )
NH
3 L - Treonina COOH C C CH
3 D - Treonina COOH H H CH 3 C C NH 2 OH
4 3
HN 2 HO
H H
Desviacin del plano de la luz polarizada despus de pasar por el aminocido
3 L - Alo -Treonina
D - Alo - Treonina
Fig. 5a - 2. La luz polarizada cambia el plano de rotacin con los aminocidos. Fig. 5b - 2. Con ms de un carbono asimtrico se denomina Alo.
esta cerca del ncleo, su direccin de movimiento esta parcialmente alineada con su eje vector de espn, siendo por lo tanto D y cuando esta lejos, se encuentra
59
desalineado con el eje vector de espn y es del tipo L. En base a ello, una molcula tendr diversa quiralidad electrnica, segn la proporcin de electrones que se encuentren cerca o lejos del ncleo. En otras palabras la quiralidad depender de la distribucin de la nube electrnica y se necesitar mayor o menor energa de formacin para uno u otro de los enantimeros. El enantimero que necesite menos energa de formacin, ser el ms favorecido y en este caso corresponde al tipo L para los aminocidos. Se puede concluir finalmente que a causa de la fuerza dbil, se infringe el principio de la paridad y se rompe la simetra ya que favorece la existencia de Levoaminocidos y Dextrosacridos como molculas que constituyen a los seres vivos, por ser menos costosa su sntesis. Volver al inicio
b) CLASIFICACION DE LOS AMINOACIDOS SEGUN SU GRUPO R. Existen cuatro grupos de aminocidos segn la identidad de su grupo R. As tenemos que en primer lugar encontramos a los: HIDROFOBICOS que se caracterizan por tener grupos R de cadenas alifticas y aromticas. En segundo lugar se encuentran los POLARES SIN CARGA con grupos hidroxilos (OH), tioles (SH) y amidas (-CONH2) que son capaces de formar un nmero limitado de enlaces hidrgenos con el agua. En tercer lugar se encuentran los POLARES DE CARGA ( - ) que se caracterizan por poseer un grupo carboxilo R (-COO-) y se disuelven fcilmente en agua. De similar manera tenemos a los POLARES DE CARGA (+) que constituyen el cuarto grupo. Estos ltimos poseen un grupo R representado por un amino (-NH3+), un guanidino (NH-CNH2+-NH2) o un grupo imidazol. En la Tabla 1 - 2, se pueden observar las estructuras de los distintos residuos R de los aminocidos. Los aminocidos pueden an ser sometidos a otras clasificaciones, si tomamos en cuenta algunas otras propiedades. Entre los aminocidos hidrofbicos de cadena aliftica tenemos a la Alanina, Leucina, Valina e Isoleucina y a los aromticos a Fenilalanina, Triptfano y uno polar sin carga, como la Tirosina. Por otro lado existen aminocidos con Azufre, probablemente evolucionaron antes de que apareciera el Oxgeno en la Tierra y son Metionina y Cistena. El primero de ellos es considerado como hidrofbico y el segundo de ellos es considerado como polar sin carga.
60
Tabla 1 - 3.
Hidrofbicos
C H Alanina 3 CH 3 HC Valina CH 3 CH Leucina 3 HC CH CH C H3 2 C H 3 C H C H CH 2 3 C H3 Isoleucina H2 C
R e s i d u o s de a m i n o c i d o s . Polares sin carga

H Glicina
H O CH Serina 2 CH CH Treonina 3 OH H S C H Cistena 2 CH 2
Polares de carga negativa

O O Asprtico C CH 2
Polares de carga positiva Lisina +
HN CH CH CH CH 2 2 2 2 3
O O C CH CH 2 2 Glutmico
HN C NH CH CH CH 2 2 2 2 NH Arginina + 2
HC COO 2 C HC Prolina 2 N H H
HO Tirosina
CH Fenilalanina 2 CH 2 N Triptfano
Asparregina HN 2 C CH 2 O HN 2 O Glutamina C CH 2 CH 2
HC C C H 2 HN NH + C H Histidina
CH S CH CH 3 2 2
Metionina
Volver al inicio
61
c) ABSORCION DE LUZ ULTRAVIOLETA. Existen tres aminocidos que absorben luz Ultravioleta a 280 nm y son Triptfano, Fenilalanina y Tirosina (Fig. 6a - 3). Si la ley de Lambert-Beer establece que A = k c, es decir que la absorcin de luz incidente por una solucin es proporcional a la concentracin de esta. Significa que mientras ms concentrada est una solucin menor ser la luz que pase por ella. Una protena que tenga estos tres aminocidos podr absorber luz UV y podr tener distintas absorciones cuando este a distintas concentraciones. Sin embargo, a una concentracin constante la mayor o menor absorbancia que experimente, ser una medida del despliegue o empaquetamiento que experimente la protena al mostrar o esconder estos aminocidos frente a los cambios de conformacin que experimente ya sea por efecto de la temperatura o el pH del medio (fig. 6b - 2).
a) Abs.
Trp Abs.
b) 40 o C
Tyr 20 o C
Phe 240 260 280 220 240
( nm )
260
280
( nm )
Absorcin de luz por los tres aminocidos
La misma protena a mayor temperatura se encuentra desplegada parcialmente y presenta mayor absorcin al exhibir en mejor forma los residuos de los aminocidos Phe , Tyr y Trp.
Fig. 6a - 2. Los tres aminocidos presentan distinta absorcin a igual concentracin. Fig. 6b - 2. La misma protena se despliega con la temperatura.
Volver al inicio
d) IONIZACION DE LOS AMINOACIDOS Los aminocidos son capaces de ionizarse en solucin, es decir pueden actuar como cidos dbiles donando hidrgenos al medio o como bases dbiles tomando hidrgenos del medio.
62
Mientras mayor sea la capacidad para donar protones, un residuo carboxilo ser ms cido y tendr un pK menor, en cambio un residuo amino mientras menor sea su capacidad para donar un protn, ser ms bsico y su pK mayor (Tabla 2 - 2). De esta manera tenemos que entre los aminocidos hay grupos que difieren en su capacidad para donar o aceptar protones y entre estos grupos se encuentran los -Carboxilos, -Aminos y los residuos -R, que caracterizan a cada aminocido.
Tabla 2 2
Grupos Glicina Alanina Leucina Serina Treonina Glutamina Asprtico Glutmico Histidina Cistena Tirosina Lisina Arginina
pK1 pK2 - COO - NH3 + 2,34 9,60 2,34 9,69 2,36 9,60 2,21 9,15 2,63 10,43 2,17 9,13 2,09 9,82 2,19 9,67 1,82 9,17 1,71 10,78 2,20 9,11 2,18 8,95 2,17 9,04
pK3 -R ------------------------------3,86 4,25 6,0 8,33 10,07 10,53 12,48
Al analizar la Tabla 2-2 se observa que la carga de los aminocidos cambia cuando ceden o toman protones del medio. De esta manera todos los aminocidos son positivos bajo pH 2, ya que todos los -Carboxilos y aquellos otros Carboxilos del residuo R, con un pK entre 2.0 y 4.2 se encuentran protonadados a este pH y sin carga. Por lo tanto, a bajo pH, los aminocidos presentarn solo grupos aminos protonados con carga positiva ( NH3+), ya que tienen un pK igual o por sobre 9. Por otro lado a un pH por sobre 12,5 todos los aminocidos son negativos ya que los grupos -Aminos y los residuos R bsicos, pierden su protn desde pH 9.0 a 12.5 quedando sin carga positiva. En este caso los grupos -Carboxilos, permanecen con carga negativa por haber perdido su protn entre los pHs 2.3 y 4.2. Entre ambos extremos de pH todos los aminocidos presentan una especie qumica, con carga neta 0 y se denominan en este punto como: neutros, isoinicos o isoelctricos. En esta regin de pH, el nmero de cargas positivas es igual al nmero de cargas negativas. El punto isoelctrico se calcula aqu sumando los pKs a ambos lados de la especie isoinica y dividindolos por dos (Fig. 9-2).
Volver al inicio
63
e) INFLUENCIA DE LOS GRUPOS VECINOS SOBRE LA IONIZACION DE LOS AMINOACIDOS. En la figura 7 2, se observa una protena en que los grupos vecinos al grupo carboxilo afectan su pK. El grupo carboxilo se encuentra encuadrado para distinguirlo mejor. Cuando el carboxilo se encuentra junto a un grupo vecino del tipo -NH3+ , aumenta su pK. El grupo vecino atrae electrones y lo hace menos cido. En cambio el carboxilo enmarcado junto a los grupos que donan electrones, como -OH, -SH y -NH2, disminuye su pK y se convierte en ms cido.
A bajo pH el pK del carboxilo sube y le cuesta desprenederse al protn A pH alto el protn se desprende facilmente. El pK se hace menor
+ -+ HN 3 C OH
-+ C OH
.. H N
2
PROTEINA
PROTEINA
C + C OH O O
C O
+ + OH HO
El pK del carboxilo
disminuye frente a las cargas
Si el medio es cido , el pK
del carboxilo se hace mayor
y el protn sale ms fcil
Fig. 7 - 2. El pK de los residuos cambia segn el microambiente que los rodea.
Volver al inicio
SEPARACION DE AMINOACIDOS. Entre las tcnicas clsicas para separar aminocidos se encuentran la Cromatografa de Intercambio Inico y la Electroforesis de alto voltaje, por otro lado entre las tcnicas modernas se destaca la Cromatografa Lquida de Alta Presin (HPLC). a) Cromatografa de intercambio inico La Cromatografa de intercambio inico emplea una fase estacionaria formada por una resina o polmero de cargas negativas o positivas en una columna de elucin. Sobre este polmero se hace pasar una mezcla de aminocidos en un solvente orgnico que se mezcla con un tampn. De esta manera los aminocidos de la fase mvil se separarn por la atraccin o repulsin que experimenten entre la fase estacionaria y la fase mvil .
64
La carga de los aminocidos podr variar segn el pH del medio o fase mvil y se tendr una poblacin de aminocidos positivos, otros negativos y algunos tendrn carga neta 0 (Fig. 8 - 2). Los negativos del mismo signo que la fase estacionaria, eluirn ms rpido que el resto. Mientras que otros con carga positiva sern mayormente retenidos en la columna debido a las cargas opuestas. Aquellos aminocidos que se encuentren en su punto isoelctrico debido al gradiente de pH, sern eludos entre los retenidos y repelidos. En algunos casos es til emplear un gradiente de pH para mejorar la resolucin o separacin de los aminocidos en la columna. En la figura 8 - 2, se aprecian las distintas especies qumicas que se forman entre los aminocidos Glutmico y Lisina al enfrentar distintos pHs. Cada una de las especies qumicas tiene una carga determinada segn el pH. Se emplea aqu una columna llena de resina con carga negativa, donde a pHs inferiores a 2,7 ambos aminocidos son positivos y se unen a la resina. Por otro lado, al emplear una resina de carga + los aminocidos sern repelidos al mismo pH anterior y solo se unirn a ella a pHs superiores a 10. Los pKs del Glutmico son 2,3 para el -Carboxilo y 4,25 para el residuo -Carboxilo,
Abs. Resina de Intercambio catinico Glutmico con Carga desde pH 4,25 a 9,67 Gradiente de pH Lisina con Carga desde pH 9,67 hacia arriba 11 p H
1
_ _ _ _ _
Vol. de elucin
Glutmico p H<2,3
C O OH CH 2 CH C 2 + HN C O OH 3 H
2,3<pH<4,25
COOH CH 2 CH _ + C 2 HN COO 3 H
4,25<pH<9,67
COO
pH>9,67
_
COO CH 2 CH C 2
(p I = 3,30)
CH 2 CH 2 _ C + HN COO 3 H
HN COO 2 H
Carga neta =
+
p H<2,18
+
NH 3 [CH ] 2 4 + C HN COO H 3 H
0
Lisina 2,18<pH<8,95
+
NH 3 [CH ] 2 4 + C _ HN COO 3 H
8,95<pH<10,53
+
NH 3 [CH ] 2 4 _ C HN COO 2 H
-pH>10,53
NH 2 [CH ] 2 4 _ C HN COO 2 H
(p I = 9,74 )
Carga neta =
++
Fig. 8 - 2. Especies qumicas existentes y sus cargas entre distintos rangos de pH. La columna cargada negativamente con la resina separa los aminocidos, segn la carga que estos adquieren en el gradiente de pH. pI indica el punto isoelctrico de cada uno.
mientras que el valor de 9,67 ser para el Amino, mientras que los de la Lisina son de 2,18 para el Carboxilo, 8,95 para el -Amino y 10,53 para el Amino respectivamente.
65
En la figura 9 - 2, se puede apreciar en los grficos de Concentracin de especies qumicas versus pH, como aumenta y disminuye la concentracin de cada una de las formas ionizadas o especies qumicas de los aminocidos junto a su carga. En cada punto de cruce correspondiente a los pKs de los aminocidos, las especies qumicas igualan su concentracin y el pH es igual al pK. Estos grficos permiten escoger el pH para separar mejor las mezclas de aminocidos. Por lo tanto el Glutmico se encuentra 100% con carga negativa entre pHs 4,25 y 9,67, es decir a pH 6,96= (4,65+9,67)/2. A este pH no interacciona con la fase estacionaria y es eluido (sale de la columna). Por otro lado, Lisina a pH 5,6 = (2,18+8,95)/2 tiene 100% de carga positiva y ser retenida. Solo alcanzar un 100% de carga negativa por sobre el pH 10,53 donde solo es 50% negativa. A pH 3,8 segn la ecuacin de HendersonHasselbalch para Lisina tenemos que: 3,8 = 2,18 + log [especie +] / [especie + +]
Especies qumicas vs pH
2,3 4,25
[Glu ]
Especies qumicas del Ac. Glutmi co
_ 9,67 _
3 3,8 4
7,0
9 8,95
10 10,53
11 p H
Con formato: Fuente: Negrita Con formato: Fuente: Negrita
[ Lys
Especies qumicas de Lisina
+ 2,18 +
10
11 p H
Fig. 9 2. Ambos aminocidos presentan distintas especies qumicas y cargas a medida que liberan protones debido al aumento de pH. La zona empleada para la separacin es aquella donde a un mismo pH ambos aminocidos presentan cargas distintas.
[ especie +] + [ especie + +] = 100% El Glutmico a pH 7,0 = (4,25 + 9,67)/2, presenta casi 100% de la especie qumica con una carga negativa y ya no es retenido en el ctodo y migra hacia el nodo. Al mismo tiempo a
66
pH 7,0 la Lisina presenta un 98,9% de la forma positiva (especie +) y 0,1% con carga 0 (especie 0) y permanece an atrada al ctodo. Por lo tanto la separacin se puede llevar a cabo a pH 7,0. Ecuacin Henderson-Hasselbach para Lisina a pH 7,0: 7,0 = 8,95 + log [ (especie 0) ]/ [ (especie +)] [ especie 0 ] + [ especie +] = 100% Volver al inicio b) Electroforsis Otra tcnica de separacin es la Electroforesis. En ella se emplea un campo elctrico para discriminar entre los aminocidos cargados (Fig. 10 - 2). El ctodo es negativo y el nodo positivo, ambos polos se encuentran en los extremos de una matriz slida fibrilar como es la Celulosa empapada con un tampn a un determinado pH. En ella los aminocidos se pueden desplazar bajo la influencia del campo elctrico debido a la carga que presentan a distintos pHs separndose unos de otros (Fig. 10 2 ). A pH 2, el aminocido Glutmico (Glu) tiene una carga Positiva y Lisina dos cargas positivas por lo que este ltimo migra ms rpido hacia el ctodo (-) y a su vez es rechazado por el nodo (+). A pH 7 el aminocido Lisina tiene una carga Positiva y Glutmico una negativa que lo retrasa, separndose ambos.
Migracin
pH 2
+ +
pH 7 + Glu Lys
Glu Lys
+ ++
-
Fig. 10 -2. Durante la Electroforesis a pH 2 el aminocido Glutmico presenta una carga positiva y Lisina dos cargas positivas, mientras que a pH 7 Glutmico presenta una carga negativa y Lisina una positiva.
Volver al inicio
67
c) HPLC Continuando con las tcnicas de separacin encontramos a la Cromatografa Lquida de Alta Presin o tcnica de HPLC. Se puede emplear para separar una mezcla de aminocidos segn el grado de hidrofobicidad de cada uno de ellos. La fase estacionaria en este caso se encuentra formada por partculas de Silicio enlazadas covalentemente a cadenas alifticas o aromticas que pueden tener algn grado de hidroxilacin. Como fase mvil se usa un gradiente de una sustancia polar como el buffer Fosfato y una molcula orgnica soluble como el Acetonitrilo. A medida que se van mezclando gradualmente la fase mvil pasa de 100% polar en Fosfato a 100% hidrofbico en Acetonitrilo puro y se arrastra a los aminocidos que inicialmente se unieron a la fase estacionaria. De esta forma los polares salen primero en el amortiguador o tampn fosfato, luego en la mitad aparecen los polares sin carga y finalmente los aminocidos hidrofbicos que eluyen (salen) en Acetonitrilo puro.
Volver al inicio
68
REFERENCIAS La evolucin qumica y el origen de la vida, R.E. Dickerson, Investigacin y Ciencia, Noviembre, 27,34-53, 1978 Los primeros organismos, AG Cairns-Smith, Investigacin y Ciencia, Agosto, 107, 54-63, 1985. Les premire molcules organiques, F. Robert, La Recherche, Vol. 21, 416-425, 1990. La quiralidad del universo, R.G.Hegstrom y D.K. Kondepudi, Investigacin y Ciencia, 162, 58-66, 1990. The Chemistry of life at the Margins, F. Flam, Science, vol. 265, 471-472, 1994. The Beginnings of Life on Earth by Christian de Duve. American Scientist. Sept.- Oct. 1995, page 1 to 14. American Scientist: Articles http://www.sigmaxi.org/amsci/articles/95articles/CdeDuve.html
69
Hctor Rocha L. Las Protenas y su Estructura
CONTENIDO CAPITULO III
70
1) LAS PROTENAS 74 a) Caractersticas del enlace peptdico 76 b) Niveles de organizacin en las protenas 1) Estructura primaria 80 2) Estructura secundaria 81 a) Est. Alfa- Hlice 81 b) Est. Beta Plegada 83 3) Estructura terciaria 84 4) Estructura cuaternaria 85 5) Estructura pentenaria 86 80
2) LOS DOMINIOS, MOTIVOS Y LA EST. SUPERSECUNDARIA DENTRO DE LA EST. TERCIARIA 86 3) ESTRUCTURA Y FUNCION. PLEGAMIENTO ASISTIDO DE LAS PROTENAS 89 4) DISTINTOS MODELOS PARA EXPLICAR EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTENAS 93 5) REGLAS BSICAS PARA EL PEGAMIENTO DE UNA PROTENA 93 6) SOLUBILIDAD DE LAS PROTENAS 94 a) Efecto del pH 95 b) Efecto de los grupos vecinos sobre la ionizacin de los Aminocidos 97 c) Efecto de la temperatura 99 d) Adaptacin de las Protenas a las altas y bajas temperaturas 101 e) Efecto de la fuerza inica 102 f) Efecto de la constante dielctrica 105 7) EJEMPLO DE PROTEINAS FIBRILARES 106 a) - Keratinas 95 b) - Keratinas 98 8) ALGUNAS CARACTERSTICAS DE LAS ESTRUCTURAS - Y - PLEGADAS 98 9) COLGENO 100
71
CONTENIDO CAPITULO III 10) ANOMALAS EN LA SNTESIS DEL COLGENO a) Escorbuto 103 b) Ehler Danlos 104 c) Osteognesis Imperfecta 106 d) Gangrena Gaseosa 106 e) Resumen de Conceptos sobre el Colgeno 118 9) ELASTINA 118 10) PROTENAS GLOBULARES 119 a) Leghemoglobina 120 b) Mioglobina 121 c) Hemoglobina 122 11) CONTACTOS ENTRE LAS SUBUNIDADES DE LA HEMOGLOBINA 123 12) SUPERXIDO DISMUTASA 124 13) ENVEJECIMIENTO DE LAS PROTENAS 127 a) Sistema Ubiquitina-Proteosoma 130 ++ b) Sistema de las Calpanas y Calpaestatinas regulado por Ca . 131 c) Funcin de los Lisosomas en clulas senescentes 131 14) ENCEFALOPATAS ESPONGIFORMES 133 15) ENFERMEDADES CAUSADAS POR PROTENAS MAL PLEGADAS 136 16) CONCLUSIONES GENERALES SOBRE EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTENAS BASADO EN LAS ENCEFALOPATAS ESPONGIFORMES 140 17) PROTEMICA 142 103
72
1) LAS PROTEINAS.
73
Las protenas son entidades macromoleculares formadas por el enlace peptdico entre los grupos -Carboxilos y -Aminos pertenecientes (Fig. 1a - 4) a los 19 -L-aminocidos y un -Iminocido (Prolina). Las protenas son consideradas como heteropolmeros, cuya estructura tridimensional se genera a partir de la interaccin de los residuos - R con su misma cadena u otra cadena vecina, adems de las interacciones laterales por medio de los grupos carbonilos e iminos presentes en cada enlace peptdico (Fig. 1b - 4). Las protenas se caracterizan por tener las ms variadas funciones. Entre ellas se cuentan la integridad estructural del esqueleto celular, la sntesis de nuevas protenas, el transporte de
a)
En el ENLACE PEPTIDICO participan los grupos - Carboxilo y los Amino de cada aminocido con residuos R1 y R2, liberando una molcula de agua
CARBONO
CARBONO
R C
O O
H H N H
-AMINO
C R 2 H
COOH
HN 2
-CARBOXILO
b) La interaccin intracadena o intercadena entre los grupos R y entre los grupos - Carboxilo y los Amino produce plegamientos en la estructura
R C C H O
H N H C R
O C N H
R C H
C O
H N H C
O C N H
R C H C
H N H C R
O C N
R C H H
Fig. 1a - 4. Los grupos - Carboxilo y - Amino participan en el enlace peptdico. Fig. 1b - 4. La interaccin entre los grupos laterales conduce al plegamiento 3D.
molculas a travs de membranas, la reparacin de daos sufridos por la clula junto a la defensa contra ataques externos, el reconocimiento de ciertas secuencias de los cidos nucleicos y muchas otras ms. Entre sus amplias propiedades se encuentra la capacidad de catalizar y modular reacciones qumicas, junto con transmitir informacin fisiolgica incluyendo el control de los procesos que ocurren en la clula durante el crecimiento y la divisin celular. En la actualidad an se contina pesquisando nuevas funciones a las protenas, sin haberse agotado su versatilidad del todo.
74
Algunas funciones de las Protenas
DNA
GEN H
GEN
GEN
Transcripcin Poliribosomas Traduccin
Hormona
Enzima Enzima
Estructura Estructural l
Protena
Receptor Receptor
Substrato
Producto
Fig. 2 - 4.Las protenas ejercen diversas funciones y son la forma de expresin del DNA.
Las protenas se encuentran codificadas en su totalidad por el material gentico (Fig. 2 - 4), sin embargo no puede decirse lo mismo acerca del control de su expresin, ya que se ha observado que tambin podra depender de mecanismos epigenticos. Otras molculas como los Hidratos de Carbono y Lpidos, no se encuentran codificadas en el DNA, sin embargo el conocimiento intrnseco de estas estructuras moleculares permanece y se expresa por medio de las protenas y en especial por el sitio activo de las enzimas, que intervienen tanto en la sntesis como la degradacin de estos compuestos no codificados. No solo distintos genes con diferentes secuencias permiten la existencia de mltiples protenas diferentes, si no que un mismo gen cuya protena sufre varias modificaciones a nivel de la transcripcin, traduccin, ensamble y vida media, puede generar protenas con distintas actividades en su desempeo. En general, una protena codificada por un solo gen que cuenta con exones e intrones, puede sufrir cambios no solo debido a una distinta combinacin de exones, sino que cambios post-traduccin, desde los ribosomas hasta su punto de llegada donde ejerce su funcin. Durante su vida media, las modificaciones qumicas a las que se ve sometida la envejecen y la conducen a ser marcada para la destruccin por un sistema especializado (Ubiquitina-Proteosoma).Todos estos procesos son estudiados por aquella nueva ciencia denominada como Protemica. En la actualidad, se entiende que las protenas son el idioma por el que se expresa el DNA. Este idioma permite la creacin, continuidad y evolucin en el tiempo de complejas estructuras vivientes. Las letras de este idioma son los aminocidos que pueden unirse entre si generando distintas palabras con distintos significados, as como las estructuras proteicas son capaces de ejercer distintas funciones.
75
El grupo -Carboxilo de un aminocido se encuentra unido al grupo -Amino de otro aminocido por medio de la enzima Peptidil Transferasa (Fig. 3 - 4). Esta reaccin ocurre en la superficie de los ribosomas durante el proceso de sntesis polipeptdica, es decir cuando se dispone de los dos aminocidos anclados con su respectivo RNA de transferencia a los sitios Peptidilo y Aminoacilo. En este lugar se procede a formar una unin qumica entre el grupo Ceto perteneciente al grupo -Carboxilo, que se encuentra formando una unin ster con el grupo 3- OH de la Ribosa perteneciente a su respectivo RNAt. El grupo -NH2 presente en el otro extremo del aminocido adyacente sitio A, dona un par de electrones para romper la unin ster del primero dejando al RNAt unido al sitio P libre. A continuacin se elimina una molcula de agua y se consolida el enlace con el aminocido unido al RNAt del sitio A.
Formacin del enlace Peptdico por la PEPTIDIL TRANSFERASA.

U A C
R N A de transferencia
OH
A AAA
U U U
5'
A AU UG G
U A C
CCC
3'
A AAA
U U U
5'
A AU UG G
CCC
3'
-d O R
O d+ C C
PEPTIDIL TRANSFERASA
C O H R C H 1 2. NH . NH 2 2
C C H H
ENLACE
U A C
R2
N
O H C C NH
PEPTIDICO
H2O
OH
Durante la reaccin se elimina una molcula de agua
Fig. 3 - 4. La formacin del enlace peptdico es catalizada por la PEPTIDIL TRANSFERASA.
La energa necesaria para romper un enlace peptdico es alta, cerca de 110 Kcal /mol y solo se hidroliza mediante incubaciones en presencia de HCl 6N o mediante un lcali fuerte a temperaturas de 110oC por 24 hrs. o ms. Volver al inicio a) CARACTERISTICAS DEL ENLACE PEPTIDICO. 1) Los cuatro tomos que forman el enlace peptdico (C, O, N e H), tienen configuracin trans y son coplanares. El doble enlace C = O cuenta con un enlace y otro del tipo . El electrn deslocalizado de este ltimo, se desplaza hacia el enlace C - N, otorgndole rigidez y carcter de doble enlace al impedir la rotacin de este (Fig. 4 - 4).
76
Centros de rotacin Psi ( ) y Phi ()
R
C
Psi ( )
Phi ( )
O
C
LOS ENLACES O-C-N TIENEN UN ELECTRN DESLOCALIZADO
N
C C
C-
O
Psi ( )
O
Distancias promedio
1,53 A C C O
0 0
R 2
R1 R
R
Phi ( )
O
C
N
1,0 A N
0
N
C C
C-
1,32 A N
0
C C
O
0
1,47 A
1,23 A
R2
Fig. 4 - 4. El enlace peptdico presenta estabilizacin por resonancia del electrn P ().
77
2) Los enlaces Carbono--Imino denominado Phi () y Carbono--Carbonilo denominado Ps () son los nicos capaces de rotar y mantienen a los grupos R lo ms separados posibles en la conformacin antepuesta (Fig. 4 - 4), ya que en caso contrario sus nubes electrnicas entraran en contacto y se repeleran como sucede en la posicin eclipsada.
Psi ( )
R C N
C -
Phi ( )
O C C N
R R R
O N C R C O
N C O R C
C O
Fig. 5 4. Los enlaces Psi ( ) y Phi () se encuentran a ambos lados del Carbono . Ambos enlaces son flexibles y permiten la movilidad de los grupos R, entre las formas eclipsadas y antepuesta La cadena polipeptdica en la figura muestra los grupos por R sobre y bajo el plano.
En un polipptido cualquiera los aminocidos en los extremos de la protena se denominan como Amino terminal (Nt) y Carboxilo terminal (Ct). Una protena empieza por el Amino terminal, siendo este el aminocido numero 1 y finaliza en el Carboxilo terminal o aminocido nmero n. De esta manera ambos grupos terminales se encuentran libres en la mayora de los casos y pueden estar expuestos al medio. En otras protenas el grupo Amino terminal puede estar bloqueado por un grupo formilo o bien glicado o unido a una aldohexosa, mientras que el grupo carboxilo puede estar esterificado. Entre el Nt y Ct se encuentran toda la gama de grupos R (Fig. 5 - 4), perteneciente a los 20 aminocidos, que pueden ser repetidos o no. Los grupos R se caracterizan a su vez por ser hidrofbicos, hidroflicos con cargas netas y an polares, pero sin carga como son los grupos OH (Hidroxilo), -SH (Tiol) y -CONH2 (Amida). Algunos de los grupos R pueden ser voluminosos impidiendo la rotacin de los enlaces Phi ( ) y Ps ( ) o bien de reducido tamao que no presentan impedimento. Los residuos -R, ms los grupos Nt y Ct, al interaccionar entre s o con el medio contribuyen a la conformacin tridimensional de una protena. Por lo tanto la actividad biolgica de una protena depender de su geometra estructural o disposicin espacial y esta a su vez depender de la interaccin entre sus aminocidos a lo largo de la secuencia. Que grupos determinan la estructura tridimensional de una protena? Por ejemplo, si se tiene una protena de 100 aminocidos, en ella existirn 99 enlaces peptdicos y al ser estirada y expuesta al medio se tendr un total de 100 grupos - R, ms los dos grupos terminales.
78
El total de estos grupos expuestos al medio externo acuoso, junto con los grupos carbonilos e iminos pertenecientes a los enlaces peptdicos, generarn por sus caractersticas termodinmicas intrnsecas de contacto, la estructura tridimensional de la protena. Los mecanismos precisos por los que se adquiere la conformacin tridimensional se examinarn ms adelante.
Volver al inicio
b) NIVELES DE ORGANIZACION EN LAS PROTEINAS. Clsicamente las protenas tienen cerca de cinco niveles de organizacin:
79
1) La Estructura primaria esta definida desde 1959 y depende del orden y secuencia de los aminocidos en la cadena lineal. Por ejemplo, Gly, Glu, Ser, Val es una secuencia y Val, Glu, Ser, Gly otra distinta, aunque tengan los mismos aminocidos (Fig. 6 - 4). Sin embargo, se ha observado que la estructura primaria no siempre determina los otros niveles de organizacin en una protena. Por ejemplo, una protena recin sintetizada en los poliribosomas o en el retculo endoplsmico rugoso, puede necesitar de alguna ayuda para alcanzar su estructura funcional. Esta ayuda se encuentra en otras protenas denominadas Chaperonas. Estas se encuentran tanto en el Citoplasma como en el interior del retculo endoplsmico rugoso y vigilan que las interacciones entre los residuos de aminocidos de las cadenas polipetdicas, sean las adecuadas para alcanzar una conformacin funcional. Si no ocurriera de esta forma, las protenas recin sintetizadas podran plegarse en la forma inadecuada o bien interaccionar entre ellas y formar agregados
H H O H C O G ly
Am bos polipptidos tienen los m ism os am inocidos, sin em bargo son estructuralm ente distintos
+
H
O H C CH C H C
2 2
H N H
C H
CH C N H H S er
H N H C CH 3 A la C
O --O
C O
O --- O H O CH H N C O H C CH A la
3
G lu H C N H H C O G ly O
+
H
O C
H N H C CH CH C
2 2
O C --O
H N H
C H S er
G lu
--- O
Fig. 6 - 4.Cuatro aminocidos pueden formar un nmero de 4! = 24 polipptidos distintos.
antes de plegarse en su forma nativa.
Volver inicio
al
2) La estructura secundaria, se encuentra representada por varios tipos de ordenamiento y complejidad espacial. Entre ellos se encuentran los tipos denominados: a) -HLICE b) -PLEGADA
80
a) ESTRUCTURA HLICE La -hlice se encuentra formada por una cadena polipeptdica con 3,6 residuos por vuelta con una torsin hacia la derecha (Fig. 7-4). Su existencia se debe a la interaccin por enlace hidrgeno entre los grupos carbonilos e iminos, pertenecientes a los distintos enlaces peptdicos. La interaccin dominante en este caso es del tipo intracadena. En otras palabras los carbonilos e iminos de la misma cadena polipeptdica forman enlace hidrgeno entre ellos, dejando 3 aminocidos de por medio. Estas interacciones ocurren entre el aminocido n - 1 y n - 5. De esta forma se disponen los enlaces hidrgenos
9 8
C
5 N
C C
H
N C
H
2
1 6 4
H H
4
C
5
N C
O
C
H O
C C
H
N
6 3 7
H H
N
H
C C
1
C
Distribucin de los grupos R , visto desde arriba enlace hidrgeno H 1 1 R O H H 3 R OHH 5 R
Hlice mostrando los planos de los enlaces peptdicos. interaccin enlace hidrgeno
N C C NC C N C C N CC NC C OH H R 2 2 O H H R 4 4 O H
enlace hidrgeno Las interacciones por enlace hidrgeno vistas en la cadena lineal
Fig. 7 - 4.Alfa () -hlice vista desde distintos ngulos.
paralelos a la hlice: H -------------------------- O - N -(CO - CHR - NH)n C n=3 Existe un segundo tipo de hlice que es ms comn en las protenas globulares donde n es igual a 4: O -------------------------------------- H - C -(CHR - NH - CO)n - CHR - Nn=4
81
La -Hlice de preferencia est formada por los aminocidos de pequeo tamao del tipo hidrofbico y algunos polares sin carga. En la Figura 8 - 4, se puede observar tres hlices unidas por puentes disulfuros. La Glicina a pesar de ser pequea no participa de la hlice, ya que el hidrgeno que tiene por grupo R, no favorece estricamente la torsin entre los ngulos (Phi) y (Ps) ,, como se requiere para mantener una hlice. La Prolina al contrario introduce demasiada torsin, la que es incompatible con la hlice. Por otro lado, el aminocido Glutmico tiene carga negativa y con la presencia de dos aminocidos adyacentes puede introducir una repulsin. A pesar de ello se ha encontrado la presencia del aminocido Glutmico en algunas hlices, sin embargo a pH inferior a 3.
O II -C-NI H
S S
O II -C-NI H
O II -C-NI H
O II -C-NI H
O II -C-NI H
S S
O II -C-NI H
Fig. 8 4. Tres Alfa- hlices unidas por puente disulfuro La estructura - Hlice, es muy frecuente entre las protenas, sin embargo los aminocidos con carga no forman parte de este tipo de estructura a pHs normales. Aquellos otros aminocidos voluminosos como Fenilalanina, Triptfano e Isoleucina, tampoco permiten la formacin de la - Hlice, cuando se encuentran juntos en una secuencia debido al impedimento estrico (tamao, abultamiento). Otro factor a considerar aqu, es la polarizacin de la hlice debido a la existencia de dipolos individuales que se forman por cada grupo carbonilo que participa en el enlace hidrgeno. Por esta razn, se favorecen los aminocidos de carga negativa en el extremo Nt y los aminocidos positivos en el extremo Ct de la hlice. Volver al inicio b) ESTRUCTURAS -PLEGADAS
O II -C-NI H
S S
O II -C-NI H
O II -C-NI H
82
Otra estructura del tipo secundario es la llamada (Beta) - Plegada (Fig. 9a - 4), que se forma por la interaccin enlace hidrgeno intercadena que ocurre entre los grupos carbonilos e iminos pertenecientes al enlace peptdico en cada una de las cadenas
a)
Sobre el plano
b)
R R R
C C C H O C N H N C C O C H O N C H N C C O
R
C H N C O ( ) ( ) ( )
RR O
C C N H O
R
C
RO
H C H
N C C
N O
R
Bajo el plano
Fig. 9a - 4. La -Plegada se encuentra en la seda y las telas de araa. Fig. 9b - 4. Las protenas y plegadas forman entre s las estructuras Supersecundarias.
polipeptdicas. De esta manera una cadena polipeptdica puede interaccionar en forma paralela (Nt----->Ct) o antiparalela (Ct<-----Nt) con otra cadena o consigo misma al plegarse. Los plegamientos que ocurren entre las estructuras secundarias se llaman supersecundarios y dan origen a estructuras del tipo - antiparalelas, - antiparalelas y --, donde ambas estn paralelas entre s (fig. 9b - 4). Algunas de estas estructuras supersecundarias son parte de motivos estructurales e incluso dominios de una protena. Ambos son trminos que identifican el grado de organizacin de las protenas y presentan una actividad o funcin caracterstica que suele repetirse en distintas protenas, como se ver ms adelante. De esta manera, es posible concluir por ahora que las distintas agrupaciones espaciales que se alcanzan, no son ms que la bsqueda de la estabilidad energtica con el medio o el solvente, por medio del empaquetamiento de las estructuras en un conjunto. Otros tipos de estructuras secundarias se observarn mas adelante. Volver al inicio
83
3) Estructura terciaria, se le denomina al ordenamiento tridimensional alcanzado por la interaccin de los residuos laterales de los aminocidos o grupos - R. Una protena debe tener sobre los 40 aminocidos para que los residuos laterales tengan un cierto grado de cooperatividad, que les permita alcanzar la estructura terciaria. Esta estructura representa una ordenacin tridimensional en el espacio y la alcanzan aquellas protenas solubles en agua. Este tipo de protenas se caracteriza por ser hidrofbicas por dentro e hidroflicas por fuera (Fig. 10 - 4).
+
Ovillo al Azar
+
CH
Int. hidrofobica
CH C 2 H 3 CH CH 3 H C 3 CH CH 2 3
CH 2
O C _ O
CH
H O
Enlace Hidrogeno
CH
HC 3 3
CH3
NH 3
Int.Ionica
_ NH O C CH2 C H2
+
3
Me
2
O O
Puuente disulfuro
S S CH
Coordinacion por un Metal
Fig. 10 - 4. El plegamiento en tres dimensiones depende de los grupos R, ms los Carbonilos e Iminos.
Volver al inicio 4) Estructura cuaternaria, es producida por la interaccin entre varias cadenas polipeptdicas ya plegadas en tres dimensiones, mediante los grupos laterales alfa R y/o terminales (Fig. 11 - 4), que se extienden al exterior de cada glbulo o subunidad. Varias subunidades con estructura terciaria pueden agruparse entre s por medio de estas interacciones dbiles y en algunos casos se encuentran puentes disulfuro para formar una protena de mayor resistencia.
84
El propsito de tener una protena formada por varias subunidades o protmeros es de importancia econmica para la clula. Una protena gigante de un solo polipptido puede tener un error en la secuencia. Este error es capaz de provocar en la protena la prdida total de su funcionalidad. Sin embargo, si el error aparece en una subunidad pequea o protmero, este ltimo podr ser descartado durante el proceso de ensamble. Por otro lado una protena con varias subunidades puede presentar la capacidad de
+ +
COO NH3
+ + +
------ S ---- S -C H CH3 CH3 HC 3 CH3 C H
--
-- + + +
---
NH3 COO
-+ -+
-- S ---- S ----
-+
-- +
+ + + --
Fig. 11 - 4. La estructura cuaternaria es mantenida por interacciones dbiles, como aquellas denominadas electrostticas e hidrofbica, con la excepcin que la constituye el puente disulfuro.
experimentar cambios conformacionales, al variar el grado de interaccin entre una y otra subunidad mediante interacciones dbiles susceptibles de graduar o cambiar el grado en que se encuentran comprometidas con la estructura general. Existen agrupaciones de protenas en que repiten muchas veces una subunidad que interacciona con sus similares y son rgidas como la cpsula de un virus o bien son flexibles entre dos grados extremos como la Hemoglobina Oxigenada y Desoxigenada.
Volver al inicio
5) Estructura pentenaria, se le considera a la interaccin de una protena cuaternaria con otras molculas no proteicas, como son cidos nucleicos, lpidos, etc. Estas interacciones son mediadas por enlaces del tipo dbil y tambin por enlaces covalentes. En la Figura 12 - 4, se puede apreciar una estructura pentenaria representada por un virus o fago. Aqu existe una interaccin entre protenas, cidos nucleicos e hidratos de carbono.
85
VIRUS BACTERIANO
T
DNA
4
CAPSIDA
COLLAR
COLA FIBRAS DE LA COLA
PLACA TERMINAL
Fig. 12 - 4. Interaccin entre distintas protenas con los cidos nucleicos.
Volver al inicio 2) LOS DOMINIOS, MOTIVOS Y LA ESTRUCTURA SUPERSECUNDARIA DENTRO DE LA ESTRUCTURA TERCIARIA. Se ha reconocido en la actualidad que las protenas tienen dentro de su estructura terciara varios dominios, entendindose por ello a una secuencia discreta de aminocidos que puede ser reconocida en distintas protenas. Estos dominios se justifican al considerar que provienen de uno o ms Exones. A su vez los Dominios pueden estar constituidos por uno o ms Motivos (motifs), que pueden ser del tipo estructural, funcional y secuencial. Adems, aquellos motivos pueden llegar a formar estructuras supersecundarias o combinaciones de -Hlices y Plegadas, que se agrupan entre s con un fin determinado, como es la unin a un sitio especfico del DNA u otra protena. Los Exones son los elementos transcritos y traducidos dentro de los genes discontinuos pertenecientes a los Eucariontes y los Intrones son los elementos que separan o flanquean a los Exones y que tambin son transcritos, pero no traducidos. De esta manera, tenemos que un gen Eucarionte no es ms que un sistema alterno de Exones e Intrones, donde los primeros son las secciones codificantes para los distintos dominios o parte de estos dominios denominados motivos y que posteriormente se integran para formar la secuencia aminoacdica continua de una protena. Mientras que los segundos o Intrones son los espaciadores entre los Exones. Al continuar con el anlisis, vemos que los Dominios pueden a su vez estar formados por uno o ms Motivos (motifs). Estos ltimos se caracterizan por ser una estructura, una funcin o una secuencia particular de aminocidos, que es tpica de una determinada actividad proteica. Por ejemplo, aquel plegamiento de las -Hlices destinada a acoger al grupo Heme en un sitio hidrofbico y que se encuentra en la Hemoglobina, Mioglobina y Legmioglobina, puede ser considerada como un motivo estructural. Ms an, encontramos que los Motivos pueden ser del tipo funcional, al representar una estructura que siempre se
86
le encuentra asociada a la misma funcin bioqumica, por ejemplo la hlice-vuelta hlice que se encuentra en las protenas que se unen a una regin determinada del DNA. Al continuar profundizando el anlisis se observa que el Motivo puede ser tambin un grupo de aminocidos en distintas partes de la secuencia, pero que integrados tridimensionalmente tienen una funcin especfica. As tenemos a las enzimas denominadas Proteasas dependientes de Serina. A pesar que son distintas, todas ellas coinciden en tener Asprtico, Histidina y Serina en sus sitios activos como aminocidos catalticos destinados a romper o hidrolizar enlaces peptdicos en otras protenas. La secuencia entre estos tres aminocidos es distinta en cada uno de los integrantes de la familia, pero se pliegan en el espacio para coincidir los tres aminocidos en el sitio activo. Este es un ejemplo de evolucin convergente. En el siguiente esquema se puede aclarar parte de lo enunciado anteriormente: DNA: -----------------GENXXX---------------------------EXON1--Intron--EXON2--Intron--EXON3------Protena XXX: Dominios formados por: Motivos : Plegamiento en tres dimensiones: Propiedad otorgada por cada dominio : - EXON1-----EXON2-EXON3--- DOMINIO A------DOMINIO B-Exn 1 Exn 2 y 3 --- Motivo a ---- Motivo (b + x )------ Motivo (a + x) ---------- Motivo b------
-- Catlisis sobre------ Solubilidad-------Unin a -un sustrato en agua membrana especfico
En este esquema se aprecia que los Exones dan origen a los Dominios y estos a su vez estn formados por uno o ms Motivos. As tenemos que el Exn 1 codifica para el dominio A, mientras que los exones 2 y 3 codifican para el dominio B de una protena . A su vez los dominios pueden formar motivos directamente en la secuencia uno a continuacin del otro o cuando se pliegan en tres dimensiones (motivo a con motivo x) para entregar propiedades como catlisis sobre un sustrato especfico, solubilidad en agua, unin a una membrana, interaccin con otra estructura proteica, etc. En resumen los dominios o mdulos pueden ser precisamente definidos como una estructura discreta que depende del orden y secuencia lineal de un conjunto definido de aminocidos. Estos aminocidos se pliegan de una manera espontnea (de acuerdo a las interacciones termodinmicas), formando estructuras persistentes y a la vez reconocibles en motivos que contribuyen al plegamiento general de la protena en el espacio.
87
Las unidades modulares o dominios pueden aparecer una o varias veces en una misma protena o en algunos casos en diferentes protenas con algunas modificaciones que les permiten ser an reconocibles. El conjunto de propiedades atribuidas a los dominios permiten deducir que los genes codificadores han evolucionado por medio de la: a) Duplicacin Gnica, (Fig. 13 - 4) donde se forman varios dominios por mutacin a partir de un gen primordial e inmutable. De esta manera se originan protenas con dominios similares y pseudosimetra. b) Fusin Gnica, por este mecanismo se producen dominios con similar funcin y estructura en distintas protenas. Es decir, un solo dominio se encuentra repartido en
INTRON : Secuencia de interrupcion no codificadora. E X O N : region que codifica para un dominio o solo parte de este .
DOMINIOS : Nmero discreto de aminocidos con una funcin especfica y que contribuyen a la actividad general de la protena
Proteina formada por tres dominios
MECANISMOS PARA LA FORMACION DE LOS DOMINIOS
1)
Duplicacion y mutacion de un gen
Duplicacion y modificacion
Duplicacion y mutacion de un gen
DNA duplicado en TANDEM
DNA duplicado en TANDEM
Intron
Intron
2)
Recombinacion
Formacion de nueva proteina con 3 dominios o modulos.
Fig. 13 - 4. Los Dominios son porciones discretas de aminocidos que forman estructuras
distintas protenas (Fig. 13 - 4). En la misma Figura 13 4, se puede observar como se forma una nueva protena mediante la duplicacin gnica seguida por modificacin y recombinacin. La nueva protena tiene un dominio original y otros dos dominios X e Y modificados. Volver al inicio 3) ESTRUCTURA Y FUNCION. PLEGAMIENTO ASISTIDO DE LAS PROTENAS.
88
Se dice que una protena se encuentra en su estado NATIVO cuando ha adquirido la conformacin ptima para llevar a cabo una funcin. Su estructura tridimensional se ajusta al rol biolgico que debe desempear. En cambio se dice que una protena se encuentra DENATURADA, cuando ha perdido su estructura terciaria y no lleva a cabo su funcin o bien se hace insoluble. Es claro que de lo anterior se deduce la importancia de la estructura espacial de una protena. Esta depende esencialmente de las interacciones dbiles entre los aminocidos a lo largo de la secuencia en la cadena polipeptdica. Es interesante hacer notar que a pesar de que una protena se pliegue de distintas maneras solo una de ellas ser la funcional, las otras formas sern de escasa actividad biolgica aunque no hallan alcanzado el estado de denaturacin. Para ilustrar la importancia de como la estructura terciaria est basada en la estructura primaria de una protena, se puede analizar como ejemplo el caso de una PRE-PRO Protena. Esta protena posee una o ms secuencias extras (Pre Pro) en el lado Nt de la cadena polipeptdica, las que se emplean para sealizar: a) ubicacin de la protena en uno de los compartimientos de la clula. b) desarrollo de la actividad biolgica en un lugar y tiempo determinados. As tenemos que en el caso a) si los primeros aminocidos de la secuencia desde el amino terminal son de carcter hidrofbico, esta ser una seal para que la protena atraviese la membrana de un compartimiento y una vez que lo halla logrado el polipptido extra PRE es removido. En el caso b), si la protena es una enzima que solo debe ser activada en el interior del compartimiento, la remocin de la segunda secuencia extra PRO, que se puede encontrar a continuacin de la secuencia PRE permitir que la enzima o la protena alcance su conformacin activa para catalizar una determinada reaccin. En ambos casos se observa que la ausencia de trozos de la secuencia aminoacdica, provoca cambios conformacionales en la protena que repercuten en su actividad. Si a continuacin procedemos a denaturar esta protena ya no podr alcanzar nuevamente su conformacin nativa, porque le falta la interaccin cooperativa necesaria de aquellos residuos que se encontraban situados en la seccin que se perdi. Por otro lado, si es denaturada cuando se encontraba completa con la seccin PREPRO, es muy probable que alcance la estructura nativa. En este ejemplo se enfatiza la importancia del concepto de Cooperatividad, presentado entre las interacciones dbiles a lo largo de la secuencia aminoacdica de una protena. Si se pierde la informacin para alcanzar la conformacin funcional de una protena o estado NATIVO, esta no se pliega de la manera adecuada para llegar a ser activa. Cada aminocido de la secuencia es importante para la estructura final alcanzada por la protena. Sin embargo, algunos de los aminocidos son ms importantes que otros. La estructura proteica es tan delicada que cuando ocurre la modificacin de tan solo un residuo se produce en ella un cambio de conformacin, que es transmitido a toda su estructura por medio de las interacciones dbiles. Este cambio podr afinar o desajustar la estructura terciaria adecuada para llevar a cabo una determinada funcin. Se ha notado que en algunos experimentos dedicados a la transferencia de genes desde eucariotes a bacteria mediante el uso de plsmidos (vectores), a pesar de tener en el gen transferido la secuencia total de los aminocidos de una determinada protena. Esta no se pliega para dar una estructura funcional.
89
Para intentar resolver este problema, podemos suponer que cada conformacin posible que alcanza una protena, est separada de la otra por una barrera de energa (Fig. 14 - 4). Desde el punto de vista termodinmico las barreras pueden ser crecientes o decrecientes, mientras que la conformacin ptima se encuentra en una zona de baja energa. De esta manera cuando una protena se pliega espontneamente se puede deducir que las distintas barreras de energa son cada vez menores o ms fciles de remontar.
Energa
Las chaperonas aumentan y disminuyen las barreras de energa para impedir conformaciones no activas y facilitar activas
B C D X
Distintas Conformaciones posibles Coordenada de reaccin

Fig. 14 - 4. Perfil de energa de una protena que se pliega para alcanzar su conformacin ptima.
A la inversa, cuando una protena no se pliega espontneamente encontrar cada vez barreras ms altas, de tal manera que la energa que extrae del medio no es la suficiente para adquirir una conformacin estable. Cuando existen varias copias de una misma protena en el medio y la concentracin total de las diversas protenas en el citoplasma alcanza a los 352gr/lt. Se hace un tanto cuesta arriba el pensar que un polipptido en vas de plegarse, muestre las interacciones adecuadas con sus propios residuos para constituir sus dominios y que posteriormente los dominios se plieguen entre s para formar la estructura final. Es muy probable que otro polipptido vecino similar interaccione por su lado hidrofbico con el primero antes de que este se pueda plegar sobre s mismo. Sobre esta suposicin se puede explicar la causa del porqu algunas veces una protena de peso molecular por sobre los 15kD no adquiere la conformacin nativa al ser transferido su gen (obtenido a partir de su RNA mensajero), desde un Eucarionte a un Procarionte. Sucede que se necesita la transferencia de un factor extra que disminuya las barreras de energa hacia la conformacin ptima de la protena transferida y que a la vez aumenta las barreras de energa hacia las conformaciones no funcionales (Fig. 14 - 4). Este factor corresponde a una familia de protenas denominadas Chaperones o Chaperonas. Se encuentran presentes tanto en clulas Eucariontes como Procariontes, pero no son del mismo tipo. Las Chaperonas de Procarionte son especficas para su especie y fueron descubiertas debido a que su concentracin aumentaba despus de que las clulas sufran de un estrs trmico.
90
Para evitar la formacin de un agregado proteico anmalo e inactivo que puede precipitar formando depsitos se necesita una molcula chapern HSP 70 (Heat Shock Protein de peso molecular 70 kD (Fig. 15 4). Esta se une a cada uno de los polipptidos ocultando el lado hidrofbico y disminuyendo la posibilidad de la agregacin entre s. Posteriormente alcanzan su total plegamiento individual, por medio del paso a travs del complejo cilndrico TCP 1 (Complejo proteico de interior hidrofbico), convirtindose ahora cada uno de los polipptidos en estructuras funcionales en estado nativo. Las molculas Chaperonas impiden las interacciones incorrectas que llevan a las estructuras a conformaciones no funcionales y a la vez favorecen las interacciones correctas (Ver el plegamiento de las protenas al final del Captulo). No todas las protenas requieren de este sistema de
Las Chaperonas tipo H S P 70 se unen a los centros hidrofbicos de la protena recin sintetizada para que no interaccione con otras copias de si misma. Agregado por interacciones indebidas
H S P 70
Primero se protegen las interacciones correctas del polipptido mismo

TCP-1
El polipptido es llevado a una estructura intermedia entre secundaria y terciaria por la HSP 70 para luego pasar al complejo TCP - 1 donde alcanza la estructura terciaria y es liberado por hidrolisis de ATP
Fig. 15 - 4. Las Chaperoninas impiden las interacciones inadecuadas de la protena recin sintetizada o bien durante su sntesis.
accin ya que algunas se pueden plegar por s mismas. En la Figura 16 - 4 se puede observar el mecanismo de plegamiento asistido que sigue un polipptido en Procariontes, Mitocondrias y Cloroplastos comparado al de un Eucarionte. Este mecanismo consta de las siguientes protenas y factores: Procariontes TF : Factor desencadenador de la unin de las Chaperoninas al extremo Nt del polipptido. Pesa 48 kD, tiene afinidad por el Ribosoma y es una prolil hidroxilasa. DNA k: Es el homlogo de la protena Hsp 70 (Heat Shock Protein, PM 70kD), es una Chaperonina con actividad de ATPasa y emplea como cofactores a las protenas DNAj y Grp E. Complejo groel/groes: Complejo proteico de alto peso molecular y de forma cilndrica con dominio hidrofbico interno. El mecanismo que ocurre en bacterias es el siguiente. Al polipptido naciente se une primero por su lado Nt el factor desencadenador cuando an
91
est en el Ribosoma. Este factor permite la unin de la Chaperonina DNAk junto a su cofactor DNAj. Posteriormente se suelta el factor desencadenador y el polipptido una vez terminado se pliega junto a las Chaperoninas y sus cofactores. Este plegamiento previo favorece la interaccin con el Complejo cilndrico GroEL/Gro/ES que libera por abajo los polipptidos plegados de la forma correcta. En Eucariontes podemos distinguir a las siguientes protenas que siguen los mismos pasos que en Procariontes: NAC : (Nascent Chain-Associated Complex) equivalente al TF de los Eucariontes se une al lado Nt del polipptido y facilita la entrada de las otras protenas efectoras. Hsp 70: Una de las primeras Chaperoninas que se encontr, tiene PM 70 kD y se produca en las clulas estresadas por calor para mantener el plegamiento adecuado de los polipptidos. Impide que los polipptidos interacciones entre s por su lado hidrofbico antes de que se plieguen. Tiene actividad ATPsica. Hsp 40: Cofactor de la protena Hsp 40. TRIC : Chaperonina cilndrica equivalente a GroEL/GroES 4) DISTINTOS MODELOS PARA EXPLICAR EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTENAS. En cuanto al plegamiento mismo, se han elaborado varios modelos a travs del tiempo: a) Modelo del Entramado o andamio: En este modelo la estructura secundaria se forma en
PROCARIONTE EUCARIONTE
TF
DNA
NAC Hsp 70 TRIC Hsp 40 Hsp 70 Hsp 40
DNA
k
TF
Gro EL TRIC Gro ES
Protena Nativa
Protena Nativa
Fig. 16 - 4. Comparacin de los mecanismos de plegamiento asistido de un polipptido entre un Procarionte y un Eucarionte
base a la secuencia primaria, mientras que la estructura terciaria es independiente de las
92
oras dos anteriores, es decir primaria y secundaria. Se prueban paso a paso distintas conformaciones. b) Modelo del Centro de Nucleacin: Se dice aqu que la estructura terciaria es una consecuencia de la estructura secundaria. El proceso de NUCLEACIN ocurre solo en ciertas partes de la estructura primaria, dando origen con ello a la estructura secundaria y que su efecto se propaga posteriormente a la estructura terciaria. c) Modelo del colapso hidrofbico: la estructura terciaria es una consecuencia de la estructura compacta formada por la repulsin hacia el interior de los residuos hidrofbicos formando de esta manera lo que se llama glbulo fundido d) Modelo del Glbulo fundido. Se produce primero una gran cantidad de de estructura secundaria en regiones cerradas o compactas de la Protena en ausencia de la estructura terciaria que an esta por venir., mientras que el centro hidrofbico se encuentra parcialmente delimitado. e) Modelo en conjunto de Nucleacin y Condensacin: Se forma primero un ncleo de plegamiento difuso que posteriormente se consolida pasando por distintos estados de transicin hasta alcanzar la estructura terciaria. El Modelo ms actualizado es una mezcla de los anteriores, ya que cada uno de ellos tiene una pequea contribucin a la realidad de lo que ocurre y consiste en un perfil de energa tridimensional parecido al lado ancho de un embudo (Modelo del Embudo), donde mltiples formas estructurales de una protena coexisten a un mismo nivel de energa. A este nivel concurren mltiples formas entrpicas de una protena que se encuentra en el borde superior del embudo. A medida que se desplazan las distintas formas hacia el fondo disminuye la componente entrpica o el nmero de estructuras posibles y despus de pasar por unos u otros descansos del embudo, lo que significa una determinada estabilidad pasajera de una determinada conformacin, se alcanza la estructura de mayor estabilidad y mnima energa. Volver al inicio 5) REGLAS BSICAS PARA EL PLEGAMIENTO DE UNA PROTENA. 1) Dos aminocidos no pueden ocupar el mismo espacio al mismo tiempo 2) Los Aminocidos hidrofbicos escapan del agua, mientras que los hidroflicos aceptan agua en su superficie 3) Los aminocidos se contactan entre s mediante interacciones electrostticas como puente salino o enlace hidrgeno para formar estructuras cooperativas 4) La interaccin puede ser mediante aquellos grupos R o mediante los mismos enlaces peptdicos con los otros vecinos de la misma cadena o una cadena adyacente 5) El plegamiento de una Protena es un proceso jerrquico. Esto significa que aparecen ciertos centros de nucleacin a lo largo de la secuencia que posteriormente se trasladan al resto de la estructura. 6) La estructura tridimensional de una protena es la que debe ser comparada a otras protenas para encontrar una relacin entre ellas antes que la estructura primaria. Volver al inicio 6) SOLUBILIDAD DE LAS PROTEINAS. La solubilidad de una protena se debe a la interaccin con el agua de las cargas que se encuentran en su superficie. Si el agua es removida de la superficie de las cargas, la protena interaccionar consigo misma denaturndose o con otra molcula adyacente en
93
similares condiciones agregndose y precipitando (Fig. 17 - 4). El contacto con el agua permitir a la protena entrar en solucin siempre que el agua sea capaz de interponerse entre las cargas que se atraen o repelen en la misma protena o bien con otras molculas de protena. As tenemos que mientras ms cargada sea una protena mayor ser su solubilidad, ya que interaccionar de mejor forma con el agua. La interaccin protena - agua en este caso ser mayor que la interaccin protena - protena. Por otro lado las protenas fibrilares no poseen carga en la superficie y por lo tanto no son solubles en agua. Sin embargo, algunas molculas de agua pueden intercalarse en condiciones de alta temperatura entre los enlaces hidrgenos internos con lo cual la estructura general se puede desplegar. Las protenas hidrofbicas solo se intercalan en bicapas lipdicas y se puede decir que son solubles en lpidos ya que interaccionan con ellos de manera hidrofbica y por fuerzas de Van der Waals. En este caso el agua para conseguir que sus molculas ganen en libertad contribuye al empaquetamiento de la protena con los lpidos. Solo las protenas globulares son realmente solubles al rodearse de una o varias capas de agua en su superficie y su solubilidad depender de cuatro variables, como son el pH, la fuerza inica, la temperatura y la constante dielctrica. Estas variables pueden afectar a una solucin proteica y se examinarn a continuacin.
Las molculas de portena dejan de interaccionar entre s para interaccionar con el agua
O C O + H3 N
+ H3 N
PROTEIN A
O O
+ H3 N
PROTEINA
O C O
H OH
PROTEIN A
+ H3 N
C O
C O O
H3 N +
C O
C O O O
+ H3 N
C O O
C O
O O C O
+ H3 N
PROTEINA
De la carga superficial depender el grado de solubilidad de la protena
+ H3 N
C O O
C O
Fig. 17 - 4. Las protenas deshidratadas tardan en entrar en solucin pues predomina en ellas la interaccin protena - protena.
Volver inicio a) EFECTO DEL pH.
al
94
El pH mide la acidez del medio y estar ntimamente involucrado con la conformacin que adopten las protenas. Su efecto se expresa por medio de las cargas que los residuos de aminocidos en una protena asoman al exterior o estn en contacto con el solvente acuoso. Segn el pH del medio los grupos hidroflicos de la superficie sern capaces de tomar o dar protones cambiando con ello sus cargas por lo que sern capaces de formar nuevas interacciones de atraccin o repulsin que acercarn o alejarn a la protena de su conformacin nativa. Si las cargas no son las adecuadas para mantener la conformacin nativa, esta se perder y la protena pasar a denaturarse. Al variar el pH en el medio se observa que cada protena soluble tiene distintos grupos en su superficie de tal manera que el rango de solubilidad de cada una de ellas es distinto. Todas las protenas solubles poseen un punto Isoelctrico (pI), donde el nmero de cargas positivas iguala al nmero de las cargas negativas en su superficie, transformndose de esta manera en dipolos gigantes que se atraen entre s y precipitan. Un claro ejemplo es el efecto del limn sobre una clara de huevo, donde esta ltima tiende a salir de la solucin o hacerse insoluble al bajar el pH, ya sea porque sus protenas precipitan entre s, al quedar expuestas sus zonas hidrofbicas debido al cambio de conformacin inducido por la baja de pH o bien estas protenas alcanzan su punto isoelctrico y se agregan. En general al variar el pH ptimo en que se encuentra una protena, pueden ocurrir los siguientes efectos: a) Cambio de pH----> Cambio de Cargas-----> Cambio de Conformacin en el Medio en la Superficie ------------------------> Agregacin de las Protenas que pasan a mostrar su parte hidrofbica y precipitacin. b) Cambio de pH------> Cambio de cargas----> Precipitacin de en el medio en la superficie Protenas que s atraen como dipolos por haber alcanzado su Pto. Isoelctrico c) Cambio de pH---------> A bajo pH las protenas en el medio permanecen solubles, pero denaturadas por tener solo cargas (+). A alto pH las protenas permanecern solubles, pero denaturadas por tener solo cargas (-). En ambos extremos de pH se repelen unas a otras. Una protena globular soluble en agua, tendr un cierto nmero de aminocidos polares en su superficie. Si un residuo -COOH tiene un pK =2,3 significa que si en el medio existe un pH por sobre este pK, el residuo estar ionizado con carga (-) y en el caso de que cuente con un pH bajo este pK el residuo se encontrar protonado y sin carga. En la situacin opuesta un residuo-NH3+ con un pK de 9,7 que se encuentre a un pH por sobre 10, el residuo estar sin su protn y sin carga. Por otro lado, en el caso de un pH bajo, menor que el pK de 9,7 el residuo se encontrar protonado con carga (+). El pK es en realidad el exponente de la constante de equilibrio con signo positivo y el pH es el exponente de la concentracin de hidrgeno, tambin con signo positivo.
95
Al considerar la ecuacin de Henderson Hasselbalch para cada grupo tenemos que en el caso del carboxilo: pK = 2,3 R - COOH -----------> R-COO- + H+ [R - COO-] pH = 2,3 + log ----------------[R - COOH] y para el caso del amino: pK=9,7 R - NH3+ -----------> R - NH2 + H+ [R - NH2] pH = 9,7 + log -------------[R - NH3+] Al analizar la superficie de la protena soluble encontramos que un grupo funcional puede recibir la influencia de sus vecinos y cualquier cambio en la posicin de estos o de su identidad puede inducir a cambios de pK sobre los grupos que se encuentran en su esfera de influencia. As tenemos que un residuo esencial para la actividad de una protena no tiene siempre un pK similar al del mismo aminocido, sino que es diferente (Fig. 18 - 4).
Con vecino de carga +, el pK del grupo sube y cuesta ms que salga el protn
A pH alto el protn se desprende Facilmente. El pK es menor
O -+ + HN C OH 3
PROTEINA
O -+ C OH
.. H2 N
PROTEINA
Con vecino de carga -, el pK del carboxilo baja y el protn sale ms fcil
C + O OH
C O
O H + Si el medio es cido, el pK
se hace mayor
+ C OH O
Fig. 18 - 4. El pK de los residuos cambia segn el microambiente que los rodea.
Volver al inicio
b) INFLUENCIA DE LOS GRUPOS VECINOS SOBRE LA IONIZACION DE LOS AMINOACIDOS.
96
En la figura 18 - 4, se observa una protena en que el grupo carboxilo encuadrado, es afectado en su pK por los grupos o residuos vecinos en la estructura. El carboxilo junto a un grupo vecino del tipo -NH3+ aumenta su pK, ya que este ltimo grupo atrae electrones y lo hace menos cido. En cambio el carboxilo encuadrado junto a los grupos que donan electrones, como -COO-, -OH, -SH y -NH2, disminuye su pK y se convierte en ms cido.
H N N H 2 C O OH
N NH
HC HC
H N N
+
CH
HC C CH
+
CH
+ HN
3
CH
+H
NH
. .
N H H
p K d e l Im id a z o l 6 ,9 2
p K d e l g r u p o R Im id a z o l 7 -8 p K d e l g r u p o R Im id a z o l 5 -6
p K g r u p o R im id a z o l 6 ,0
Fig. 19 - 4. Comportamiento cido base del grupo Imidazol
Otro ejemplo puede ser el aminocido Histidina (His) (Fig. 19 - 4), que posee un grupo Imidazol que tiene un pK de 6,92 cuando se encuentra solo. Sin embargo, este grupo pasa a tener un pK de 6,0 cuando se encuentra en el aminocido, en otras palabras se hace menos bsico y cuesta menos que salga el protn. Por otro lado cuando se encuentra el aminocido involucrado en un enlace peptdico en la estructura de un polipptido, el pK es de 6,5 con un valor intermedio entre ambos casos anteriores. Este mismo grupo cuando se encuentra en una protena adyacente a otro grupo del tipo -COOH que se caracteriza por entregar un protn, su pK sube a 7 u 8 y en el caso contrario, cuando se encuentra adyacente a un grupo -NH2 que entrega electrones, su pK baja y flucta entre los valores de 5 a 6. En la Figura 20 - 4, se observa una protena globular y su comportamiento en una grfica de Solubilidad vs pH. Bajo pH 2,3 la protena tiene carga positiva y las distintas molculas se repelen entre s permaneciendo soluble aunque denaturada o inactiva. Sobre pH 9,7 las molculas tienen carga negativa, permanecen solubles y tambin pueden estar denaturadas o inactivas. Mientras que en el pH 6,5 se encuentra el punto Isoelctrico (pI) donde la protena precipita, ya que es insoluble al presentar una carga neta de cero. En este punto los residuos con cargas positivas de un lado de la protena, pueden interaccionar con otra molcula similar. Especialmente con el lado que tenga residuos de carga negativa, atrayndose entre s unas a otras y precipitando. Algunas protenas segn su composicin aminoacdica pueden o no denaturarse en su punto isoelctrico. En general se puede decir que el pH del medio afecta al microambiente alrededor de la protena, ya que esta requiere de un cierto nmero de cargas en su superficie para mantener su conformacin nativa. Si la protena no es capaz de tamponar los cambios de pH, tolerando un cierto grado de desaparicin o aparicin de nuevas cargas, es entonces susceptible de entrar en un proceso de denaturacin. La nueva distribucin de cargas provocar en ella cambios conformacionales que distendern su andamiaje sobrepasando el efecto cooperativo de todas las otras interacciones dbiles para mantener su estructura.
97
Protena a bajo pH que presenta solo cargas positivas. Se produce denaturacin y repulsin entre las molculas
Protena en el Punto Isoelctrico (pI), es insoluble por su carga neta igual a 0. Cmo es un dipolo las molculas se atraen y precipitan
Protena a pH ptimo con la conformacin adecuada y soluble
+ --
+ -
Protena a alto p H solo con cargas negativas. Se produce denaturacin y repulsin entre las molculas
+ + +
+ pI 2,3 6,5
Actividad
SOLUBILIDAD mg/ml
7,8
9,7
pH
Fig. 20 - 4. El pH cambia la conformacin y la solubilidad de la protena.
Por ejemplo la enzima digestiva Tripsina es funcional a un pH cercano a 1, para lo cual se ha adaptado presentando en su superficie muchos grupos carboxilos que le permiten atrapar protones y tamponar su microambiente para no denaturarse. Similar cosa sucede con aquellas protenas que son funcionales a altos pHs, lo que se hace posible debido a que poseen muchos grupos aminos que liberan protones, como es el caso de la Lisozima con un pH ptimo de 9.
Volver al inicio
98
c) EFECTO DE LA TEMPERATURA.
La temperatura se puede visualizar como agitacin trmica. Una solucin proteica tendr mayor o menor agitacin segn la temperatura. As una protena normalmente plegada a 37o C sufrir un mayor nmero de choques de parte del agua a medida que aumenta la temperatura, ya que las molculas de agua se agitarn cada vez ms violentamente descubriendo a las cargas superficiales y haciendo que las interacciones internas (interacciones dbiles) de la protena, no puedan mantener la estructura hasta que se denatura desplegndose. En el caso contrario al bajar la temperatura a unos 10oC, el agua se agita cada vez menos y la protena no experimentar un nmero de choques suficientes de parte del agua para tener un grado de flexibilidad compatible a su funcin. Al mismo tiempo sus capas de agua aumentarn y se har ms rgida y poco funcional (Fig. 21 - 4).
A baja temperatura la falta de movimiento del agua facilita la cristalizacin
A temperatura normal el agua interacciona con las cargas y cubre a la protena con una capa
A alta temperatura el agua se agita demasiado para cubrir las cargas
Centro de nucleacin
Fig. 21 - 4. Las protenas se denaturan a las temperaturas donde el agua se agita mucho.
Los cambios conformacionales que provoca la temperatura en las protenas pueden ser visibles por medio de las siguientes tcnicas: a) Titulacin de los residuos expuestos al medio. La primera tcnica dar distintas curvas de titulacin a distintas temperaturas. Mediante esta tcnica se podr demostrar el movimiento de los residuos y su grado de exposicin al medio donde algunos de los residuos se expondrn al medio en la superficie de la protena y otros sern capaces de ocultarse, (Fig. 22-4).
99
C u r v a s h ip o t t ic a s d e t it u la c i n d e u n a p r o t e n a X , la c u a l e s s o lu b le p H A m e d id a q u e s e d e s p lie g a la p r o t e n a a m a yo r te m p e ra tu ra a p a re c e n n u e v o s a m in o c id o s t it u la b le s
25 o C
35
o C
45 o C
e q u iv a le n t e s d e O H
Fig. 22 - 4.Al desplegarse una protena puede presentar un mayor nmero de aminocidos titulables al medio.
b) Espectro Ultravioleta. En este otro caso la absorcin de la luz ultravioleta por una solucin proteica variar segn se exponen los residuos aromticos o no. Este efecto podr emplearse para observar los cambios conformacionales de una protena. Mientras ms se muestren los residuos aromticos, mayor ser la absorcin como se observa en el caso b del grfico Abs. vs Longitud de onda y mientras ms se oculten la absorcin ser menor como en el caso a del mismo grfico (Fig. 23 - 4).
Volver al inicio
100
d) ADAPTACION DE LAS PROTENAS A LAS ALTAS Y BAJAS TEMPERATURAS EN EXTREMFILOS

Las protenas de aquellos organismos que han experimentado cambios de temperatura ambiental durante su evolucin han podido adaptarse a ello a travs de miles de aos, debido a las distintas modificaciones estructurales que han experimentado como resultado del proceso evolutivo y adaptativo. En ellas se han cambiando aminocidos de su superficie o su interior para regular as el grado de interaccin interna entre sus residuos o la interaccin entre los residuos de la superficie con el medio externo o el solvente que las rodea. Cuando han sido expuestas a un aumento de la temperatura, han respondido con un aumento del nmero de cargas superficiales, logrando con ello un incremento en el nmero de capas de hidratacin, que protegen como un escudo frente al creciente nmero de choques o aumento de entropa S del agua. Al mismo tiempo, es posible que la protena aumente el grado de interaccin interna o H (Entalpa) hacindose ms rgida. Esto se logra al cambiar uno que otro aminocido en posiciones crticas de la estructura. De esta forma, ambos efectos contribuirn a hacer a la protena ms rgida. Sin embargo, el nmero de choques sobre la protena ejercen un efecto fsico tal, que se comporta como una similar a temperatura normal 25 42C. De esta manera su capacidad de efectuar cambios conformacionales o su valor de G, se mantiene dentro del marco adecuado a las condiciones biolgicas necesarias para la vida (fig. 24a - 4). En el caso de que una protena normal experimente una baja de temperatura, el agua que la rodea se mueve cada vez menos (disminuye su S) y tiende a formar centros de nucleacin con los residuos cargados de la superficie. La protena experimenta menos choques de las molculas de agua, ya que se forma una gran capa de hidratacin en su superficie. Esta capa a medida que baja an ms la temperatura facilitar la formacin de cristales que comprimirn a la protena denaturndola. Para evitar este proceso, una protena adaptada a las bajas temperaturas, se libera de las capas de agua durante el proceso evolutivo,
25
oC
Abs
45 o C
nm Io I =I o e L Io = k c I A = kc -kc
La protena en b esta a mayor temperatura por lo tanto esta ms abierta y muestra mejor los residuos que absorven luz U V. En el caso a estos se encuentran escondidos debido al plegamiento de la protena a o 25 C
Fig. 23 - 4.La temperatura o el pH pueden alterar la conformacin de la protena lo que se refleja en un espectro de absorcin distinto.
101
mostrando menos carga en la superficie y se hace a la vez menos rgida al disminuir la interaccin interna o su Entalpa (H) (fig. 24b - 4). La protena asoma ahora algunos grupos hidrofbicos para disminuir su capacidad como centro de nucleacin para las molculas de agua.
C a p a c id a d d e C a m b io C o n fo rm a c io n a l o G
a)
G ra d o d e in te ra c c i n in te rn a o H
S u b e la te m p e ra tu ra
10
20
30
40
50
6 0 T C N de Choques del Agua o S
b)
B a ja l a te m p e ra tu ra
40
30
20
10
T C
Fig. 24a y 24b - 4. Las protenas adaptadas a otras temperaturas fuera de lo normal (25 -42C) mantienen su conformacin nativa o G (energa de la conformacin en equilibrio con el medio).
Volver al inicio
e) EFECTO DE LA FUERZA IONICA.
102
La fuerza inica es una medida de las cargas existentes en solucin. As que a igual concentracin [C] de [NaCl] y de [(NH4)2SO4], la sal con el anin de carga (Z) = -2 (SO4= ) presentar la mayor fuerza inica al elevarse a la potencia de 2: 2 I = 1/2 [(C) (Z)] 2 2 I = 1/2 [(Na+ )(+1) + (Cl_ )(-1)] I = 1/2 [2(NH4+ 2 2 = )(+1) + (SO4 )(-2)]
Los aniones y cationes de una sal interaccionarn con el agua y cada uno de ellos puede tener una mayor o una menor capa de hidratacin, segn la carga que posean. Este efecto conduce a la formacin de complejos moleculares hidratados, los que intercambiarn molculas de agua con cualquiera protena que se encuentre en solucin. Como aplicacin de este fenmeno encontramos que una mezcla de protenas que se encuentre deshidratada y en estado slido, no entrar fcilmente en solucin a menos que el agua se interponga entre las cargas que se atraen entre una y otra superficie de protena. En este caso es sabido que una leve concentracin de sal ayuda a la protena a entrar en solucin. El efecto dipolo del agua se magnifica con la sal al interponerse esta vez los iones hidratados entre las cargas de las protenas y disminuir as su efecto de atraccin. Una vez que la protena se encuentra en solucin, al continuar aumentando la fuerza inica por un incremento en la concentracin de la sal, los cationes y aniones de la sal capturan el agua de hidratacin de la protena para poder solvatarse, entrar en solucin o solubilizarce ellos mismos. De esta manera la protena disminuye el agua en sus capas de hidratacin y se dice que finalmente la protena sale de la solucin (Fig. 25 - 4). En otras palabras la protena precipita por no poder retener las molculas de agua que la mantenan soluble y ahora exhibe sus cargas, por lo que puede interaccionar con otras protenas formando un agregado insoluble. Mientras ms polar sea una protena ms costar que precipite con el aumento de la fuerza inica. Al contrario mientras menos polar sea la protena, perder su agua de hidratacin ms fcilmente a expensas de la sal. Por otro lado mientras ms carga tenga la sal o en otras palabras a menor volumen atmico y mayor radio de hidratacin, atraer un mayor nmero de molculas de agua (Fig. 25 - 4). De esta manera las protenas para mantenerse solubles requieren de un soluto que no sea muy facilitador de la entrada en solucin y a la vez no muy sacador de la solucin en que se encuentra la protena. En general, la sal no debe hacer entrar a la protena en solucin denaturndola, debido a su fuerte interaccin entre la protena y el soluto (sal), ni deber hacerla tan insoluble que precipite al formar esta un agregado de si misma, por remocin casi total de su agua de solvatacin. Las sales que estabilizan protenas promueven la hidratacin de estas y se unen dbilmente a ellas, mientras que aquellas sales que desestabilizan, promueven deshidratacin y se unen fuertemente a ellas. Este balance debe ser mantenido entre los solutos inorgnicos y orgnicos de la clula. En la Tabla 1-3, podemos observar la distribucin entre los solutos inorgnicos estabilizantes como el KCl capaz de precipitar a la protena sin denaturarla y aquellos como el SCN- de carcter destablizante que solubilizan a las protenas denaturndolas.
103
La sal compite por el agua de solubilizacin junto a la protena.
NH
+
4
SO 4
NH
+
4 SO 4
O O
+ H3 N
O C O
+ H3 N
PROTEINA
PROTEINA
H3 N +
C O
C O O O
+ H3 N
C O
C O O O
SO 4
NH
+
4
NH SO 4
+
4
Fig. 25 - 4. La sal competir con la protena para atrapar agua de hidratacin.
Con respecto a los solutos inorgnicos es sabido que una sal neutra como KCl facilita el empaquetamiento de una protena. Facilita el ocultamiento interior de los residuos hidrofbicos haciendo a la protena ms rgida y menos funcional. De esta manera microorganismos que prosperan en lugares de alta salinidad deben disminuir sus interacciones hidrofbicas internas para mantener su capacidad de cambio de conformacin dentro de los lmites tolerables a su funcin activa. Otro hecho de singular importancia biolgica que permite ahora ser explicado, reside en la razn por la cual las clulas prefieren K+ en el interior y Na+ al exterior. El agua de hidratacin del K+ es menor que la que requiere el Na+, de tal manera que este in permitir en el citoplasma un mayor nmero de protenas solubles que el Na+ que se encuentra en el espacio extracelular. En otras palabras a igual concentracin de Na+ y K+, el Na+ retiene ms agua que este ltimo restando de esta manera molculas de agua necesarias para la solubilidad de las protenas. Una de las protenas que ms retiene agua en los capilares es la Albmina del plasma, es una protena muy soluble, interacciona bien con el agua y de ella depende la presin onctica de los tejidos. Compite con el Na +, en el lquido extracelular y captura molculas de agua por difusin hacia el interior. Cuando se pierde esta protena al lquido extracelular, por exceso de presin hidrosttica (hipertensin), trauma (golpe) o presin negativa en el exterior (escaladores de montaa), se ocasiona un edema (hinchazn del tejido) al atraer consigo agua. Por otro lado, entre las molculas orgnicas estabilizadores de protenas tenemos a Prolina, Glicina y Glicerol que estabilizan las estructuras proteicas sin interaccionar directamente con
104
ellas. Este efecto ocurre por el lado de la regulacin osmtica. Los solutos orgnicos determinan o fijan la fraccin de molculas de agua que son libres de interaccionar con las protenas solubles. Aquellos aminocidos como Lys (Lisina) y Arg (Arginina) desestabilizan la estructura proteica. La Arg posee un grupo Guanidino de carga (+) y la Lys un grupo Amino tambin de carga (+). Este ltimo aminocido, cuando se encuentra libre en solucin es conocido por disminuir la capa de hidratacin de las protenas de tal manera que algunos organismos marinos lo transforman en Octopina (Lys + c. pirvico) para evitar el problema.
Tabla 1 - 4
Serie Liotropica. Estabilizante Aniones F salting out PO 4 3 2 SO CH COO 4 3 Cl Br Destabilizante I CNS
+ (CH) N + Cationes (CH) N 3 4 3 2
+ NH 4
Na
Cs
Li
salting in +2 + 2 Ba + 2 Ca Mg
Solutos intracelulares con efecto en la estructura de las protenas Solutos orgnicos no perturbadores o estabilizantes
+ CH O H + CH NH H 2 H N 3 3 O O 3 CH C H+N C H C OH C H C H+N C H C R C C O O 2 2 3 2 3 O O CH C H CH O H H H 3 2 2 +H AMNIACIDO TRIMETILAMINA N SARCOSINA BETAINA SO GLICEROL 2 O 3 N - OXIDO H N C N CH C H C H C H C TAURINA 2 2 2 2N O H OCTOPINA H C CH 3 PERTURBADORES DELA ESTRUCTURA C NH HN + + 2 O O NH + 2 NH 2 HN C C O O 3 2 H N C N C H CH C H C H C HN 2 2 2 2 NH O 2 2 GUANIDINA H ARGININA UREA
CH 3 + CH N O 3 CH 3
Entre los compuestos orgnicos estabilizantes se encuentran las Metil Aminas que incrementan el punto de denaturacin trmica de las protenas mediante la estabilizacin de las capas acuosas de hidratacin en la superficie de la protena. Se necesita mayor temperatura para agitar las molculas de agua que forman la capa de hidratacin de la protena y contribuyen a la estabilidad de su conformacin. Por otro lado entre los compuestos orgnicos destabilizantes de la capa de hidratacin, se encuentra la Urea. Esta molcula es capaz de bajar el punto de denaturacin trmica a las protenas o en otras palabras disminuye su capa de hidratacin hacindolas ms susceptibles a los choques con las molculas de agua libre. De similar manera la Guanidina denatura a las protenas al disminuir la contribucin de la capa de agua que las rodea.
Volver al inicio
105
f) EFECTO DE LA CONSTANTE DIELECTRICA

La constante dielctrica (D) es una medida de lo que se interpone entre dos cargas de distinto signo que se atraen o dos cargas de igual signo que se repelen. La fuerza que se desarrolla entre dichas cargas esta dada por la ecuacin de Coulomb: F = 1/D x [ q(-) x q(+)] / r2 El valor de la constante dielctrica (D) es de 1 en el vaco y aproximadamente 80 en el agua. En el vaco las cargas experimentan su mayor atraccin o repulsin mientras que en el agua se disminuye este efecto, ya que se ordenan las molculas de agua y forman enlace hidrgeno alrededor de las cargas puntuales, por lo que las cubren. Una solucin proteica disminuir su solubilidad al agregar al medio compuestos como Metanol, Etanol o Acetona, ya que estas molculas con su reducida capacidad para formar enlace hidrgeno reemplazarn parcialmente a las molculas de agua que cubren las cargas puntuales de la protena, dejndolas cubiertas por su extremo polar capaz de formar enlace hidrgeno mientras que con su otro extremo hidrofbico dirigido hacia el medio acuoso interaccionarn hidrofbicamente con otras protenas en igual situacin y las podrn precipitar por agregacin (Fig. 26 - 4). Como los solventes orgnicos tienen una baja Constante dielctrica D no cubren bien las cargas de una protena y estas pueden interaccionar con las cargas de otra, atraerse y precipitar.
+
C H 3CH 2 O H
Fig. 26 - 4. La molcula de Etanol se interpone entre las molculas de agua y como no hace enlace hidrgeno por uno de sus lados, deja las cargas al descubierto. Estas se atraen o repelen denaturando y/o precipitando a la protena.
Por otro lado los solventes orgnicos disminuyen la contribucin del agua a la conformacin de la protena "hidroflica por fuera, hidrofbica por dentro". De esta forma la protena no esconder sus residuos hidrofbicos y los pondr en contacto con el solvente orgnico al abrirse y denaturarse. El grado de hidrofobicidad que presentan los solventes orgnicos debido a su cadena aliftica, afecta a las protenas que poseen superficies hidrofbicas aumentando en este
106
caso su solubilidad. Por esta ltima razn se emplean mezclas de solventes orgnicos para extraer protenas de las bicapas lipdicas.
Volver al inicio 7) EJEMPLOS DE PROTEINAS FIBRILARES.

Estas protenas se encuentran formadas solo por estructuras primaria y secundaria, ya que forman largas fibras destinadas al tejido estructural de sostn. En estas agrupaciones la repulsin estrica se minimiza y los enlaces hidrgenos se producen al mximo. Pueden alcanzar las estructuras del tipo - hlice (Fig. 27 - 4) o - plegada que se mantienen por medio del enlace hidrgeno. Las hlices ms comunes son las 3.613 r, lo cual significa que tienen 3,6 residuos de aminocidos por vuelta y 13 tomos involucrados en una vuelta con una torsin hacia la derecha (r por rectum). La distancia del enlace hidrgeno es de 2,8 a 3,0 A0. La hlice del tipo 310 r aparece solo en protenas globulares y al final de una hlice normal.
a) -KERATINAS
Fig. 27 - 4. La estructura - hlice se mantiene por los enlaces hidrgeno intracadena.
Las protenas que poseen las estructuras fibrilares descritas anteriormente, son conocidas como las Alfa-Keratinas (Figs. 28 y 29 -4), mientras que los aminocidos ms comunes entre ellas se observan en la Fig. 30 - 4. Sus principales exponentes son el pelo, las uas, las garras, las plumas, las escamas, los cachos, los cascos y el caparazn de las tortugas. En la protena que forma el pelo, tres alfa hlices interaccionan entre s lateralmente por medio de los puentes disulfuros formando paquetes que se entrelazan con una torsin hacia la izquierda (Figs. 28 - 4 y 29 - 4). De esta manera se forman superhlices capaces de tolerar una mayor tensin con un estrecho empaquetamiento.
107
-S-S-S-
-S-S-S-S-S-S-S-S-S-S-
Fig. 28 4. Estructura molecular del pelo.
Triple Alfa Hlice
Cordon superenrrollado mantenido por puentes disulfuro Protofibrilla
Fig. 29 - 4. Los puentes disulfuro mantienen las Hlices unidas.
La distribucin de los aminocidos que forman las estructuras tanto fibrilares como globulares es algo diferente aunque en algunos casos no es del todo rigurosa. Son elementos disruptores de -Hlice, los residuos de Pro, las cargas y el tamao de los grupos adyacentes. Las interacciones entre los aminocidos espaciados por 3 o 4 residuos
108
-S-S- S - S -- S -S -SS - S --S-
-S-S-
-S-S-
Microfibrilla
aparte o las que ocurren en la vuelta de la hlice junto a la identidad de los aminocidos que se encuentran en la secuencia al final o al inicio de la estructura determinan tambin su estabilidad. En la Fig. 30 - 4 se observa que la -Keratinas presenta en mayor proporcin los aminocidos Glu, Cys y Ser, mientras que los aminocidos His, Met e Ile junto a Lys y Phe
N A m in o a c id o s
L a n a b ru ta 100
50
Ser
G lu
C y s P ro
G ly L e u
A s p A r g T h r A la V a l T y r L y s P h e I le H is M e t
Fig. 30 - 4. En este grfico se puede apreciar la distribucin de los aminocidos que forman una protena fibrilar.
estn en menor cantidad. Por otro lado en las protenas globulares (Fig. 31- 4) solubles en agua como la Seroalbmina de Bovino, los aminocidos que se encuentran en mayor proporcin son Glu, Leu y Lys y en menor proporcin Met, Ile y Gly. Cys y Ser justifican su presencia en las - Hlices por las interacciones laterales por puentes disulfuro y por tener el residuo R de pequeo tamao y sin carga, mientras que Glu y Lys son propios de una protena soluble, ya que ambos poseen carga.
M ol %
K e r a t in a
S e r o a lb u m i n a B o v in a
10
S er
G lu
C y s P ro
G ly
Le u
A sp
A rg
T h r A la
V al T yr Lys P he
I le H i s M e t
Fig. 31 - 4. Se observa una diferencia en la distribucin de los aminocidos de la protena globular soluble en agua y la fibrilar insoluble.
Volver inicio b) - KERATINAS
al
109
La estructura -plegada (fig. 32 - 4), forma filamentos flexibles como la Fibroina de la seda y las telas de araa conocidas por su flexibilidad y capacidad de tolerar la tensin. La distribucin de las cadenas puede ser paralela o antiparalela afectando la direccin de los enlaces hidrgeno intercadena. Las hebras paralelas poseen los enlaces hidrgenos en ngulo mientras que en las antiparalelas son totalmente perpendiculares. En la estructura -plegada el esqueleto polipeptdico se encuentra en forma de Zig-Zag a diferencia de la -Hlice y todos los Carbonilos e Iminos de los enlaces peptdicos participan de los enlaces, mientras que los grupos R se encuentran sobre o bajo el plano. Ala y Gly son muy repetidos en la seda natural ya que poseen un grupo R pequeo.
R
C
N
C C
R C
C
R
C
N
C
C C
CC
R R
C C
R
O
C C
R
C
R
O N
C C
R
N
R
C
Fig. 32 - 4. Estructura - plegada. Los grupos R estn por sobre y bajo el plano plegado
Volver al inicio 8) ALGUNAS CARACTERSTICAS ESTRUCTURALES DE LAS ALFA Y BETA PLEGADAS a) La vuelta , (Fig. 33a - 4) que es una estructura formada por el orden de aminocidos -XGly-Pro-Y- (X e Y son cualquier aminocido). Esta estructura se produce cuando una cadena polipeptdica gira 180o cerca de la superficie de una protena. Se dice que cerca de un tercio de los aminocidos de una protena estn involucrados en vueltas o codos cerca de la superficie. b) Se denomina estructura Supersecundaria, a los plegamientos que pueden ocurrir entre las mismas cadenas que forman las estructuras -plegadas o bien a los plegamientos que ocurren entre las cadenas de las estructuras - Hlice y que incluso agrupan dentro de esta categora a las estructuras mixtas, donde las - Hlices se encuentran intercaladas con las -plegadas. No todas las estructuras -plegadas tienen apariencia normal y pueden ocurrir en ellas ciertas anomalas como se observa en la Figura 33b - 4:
110
Recodos del tipo

Exteror
R H N R C O C C N C H C O H N C R R C O R H N C
a)
R H R C C N C O C O H N C R C O
Estructuras super secundarias b)
Interior
Se producen cuando los elementos de estructura secundaria alcanzan la superficie de las protenas
Elementos de estructura secundaria o o que no alcanzan a completar una estructura terciaria
c)
Anoma las en las estructuras tipo

antiparalela paralela
d)
Torcedura hacia la derecha por tres polipptidos en la estructura plegada
Esteructura antiparalela con un residuo extra que provoca una distorsin
Fig. 33 - 4. Se puede observar en la parte superior algunas particularidades de las estructuras del tipo Beta junto a algunas anomalas que tambin se presentan en la parte inferior de la figura.
c) Distorsin en abanico, (Fig. 33c - 4) esta estructura ocurre cuando las cadenas a pesar de ser plegadas no corren interaccionando de manera horizontal unas con otras y se distorsionan formando una especie de abanico. Esta estructura se debe a una deformacin del Nitrgeno del enlace peptdico que trata de tomar la conformacin tetradrica causando de esta manera una prdida de la planaridad para as optimizar los enlaces hidrgenos. d) Abultamientos o jorobas, (Fig. 33d - 4) a causa de la presencia de un residuo extra intercalado entre las hebras beta plegadas, tambin se les llama bulto o joroba Beta.
Volver inicio 9) COLAGENO.
al
111
El colgeno Tipo I (Tabla 2 4) es la protena ESTRUCTURAL de origen animal QUE SE ENCUENTRA EN MAYOR CANTIDAD EN LA TIERRA. Se le halla en los huesos, tendones, dentina, cartlagos, piel, vasos sanguneos y la crnea. En los animales jvenes el colgeno es muy flexible e incluso soluble, ya que tiene escasa formacin de enlaces cruzados. Sin embargo, a medida que el animal envejece aumentan los enlaces cruzados entre sus fibras y los huesos se hacen menos flexibles llegando a quebrarse fcilmente. La hebra bsica de colgeno es del tipo 3,310s. Tiene 3.3 residuos con diez tomos de la cadena central por vuelta y se enrolla hacia la izquierda (sinister). En ella cada tercer residuo es Glicina y la secuencia es del tipo X - Gly - Pro -, donde X es cualquier aminocido. Uno de sus genes Col1A1 que forma el colgeno Tipo I tiene 52 exones y 18 kilobases (kB). Los polipptidos que forman parte de las hebras y que posteriormente dan origen a las distintas triple hlices se denominan: 1(I), 2(II), 3(III), 4(IV) y 2, ya que difieren algo en su composicin aminoacdica. En la Tabla 2 - 4 se describe la identidad de las hebras individuales de la molcula de Tropocolgeno y su distribucin en los distintos tejidos.
Tabla 2 - 4 ALGUNAS DE LAS HEBRAS QUE CONSTITUYEN EL COLAGENO Tipo I II III IV V Composicin [1(I)]2 2 (dos cadenas 1 y una 2) [1(II)]3 [1(III)]3 [1(IV)22(IV) [1(V)]22(IV) Tejido
Cornea, tendn, hueso, piel Discos intervertebrales, cartlago Sistema cardiovascular, piel fetal, fibras reticulares Membrana basal Placenta
El Colgeno se sintetiza en los Fibroblastos y se le considera una Glicoprotena insoluble que es parte de todos los tejidos conectivos. Existen ms de 20 genes responsables de su sntesis y esta empieza con una molcula de PreProColgeno (1464 aas.), que lleva la informacin Pre para entrar al Retculo Endoplsmico Rugoso de parte de los Ribosomas asociados a la superficie (Fig. 34 - 4). Una vez en el interior se rompe el pptido seal y pasa a ser Procolgeno. Cada una de las hlices se estabiliza individualmente por la repulsin que existe entre los anillos de las Prolinas (Pirrolidinas) que se encuentran dirigidos hacia el exterior. A medida que la vescula viaja al Golgi, ocurren una serie de modificaciones qumicas, consistentes en Hidroxilacin y Glicosilacin. La Hidroxilacin ocurre por medio de las enzimas Prolil y Lisil Hidroxilasa. Los grupos Hidroxilos servirn posteriormente para la interaccin intercadena mediante enlace hidrgeno. A continuacin la enzima Glucosil y Galactosil Transferasa, une monosacridos a las unidades de Lisina hidroxiladas que se encuentran en la cadena. Una vez terminada la modificacin qumica se produce la asociacin de 3 de los Propptidos empezando por el lado Ct por medio de puentes disulfuros, mientras que los
112
extremos Nt interaccionan entre s mediante cargas formando un ovillo al azar, que finalmente ayuda con su accin al ensamblaje triple. Las tres hebras que individualmente se enrollan hacia la izquierda s ensamblan en una triple hlice (Fig. 34 - 4) y sufren una torsin hacia la derecha, al interaccionar por medio de los enlaces hidrgenos intercadena. De esta manera se gana una mayor capacidad para tolerar tensiones y queda formada la unidad de Procolgeno.
Retculo Endoplsmico Rugoso formacin del PREPRO COLAGENO

+ + OH
Accin de la PROLIL HIDROXILASA y Vitamina C

OH
OH
Accin de la LISIL HIDROXILASA OH
+ -
OH OH
S S S
Galactosil OH Transferasa OH OH
O H Glucosil Transferasa
Membrana plasmtica
OH OH OH OH OH OH
OH OH
S S S S OH OH OH S S S S
Triple Hlice ensamblada forma la unidad de PROCOLAGENO
Fig. 34 4. La sntesis de Procolgeno ocurre en el RER y se ensambla en el medio Extracelular.
Una vez que la triple hebra se ha ensamblado se le denomina Procolgeno y es secretada al exterior donde sufre la accin de la enzima Procolgeno Peptidasa. Esta ltima hidroliza los pptidos de 15kD en el Nt y de 30kD en el Ct. Ambos extremos fueron de utilidad para el reconocimiento entre las hebras y su aproximacin. Finalmente queda solo una triple Hlice de 95 kD llamada TROPOCOLAGENO. Su largo es ahora de 3000Ao y su peso molecular es de 285 kD (Fig. 35 - 4) y tiene 338 repeticiones de Gly-X-Y, donde X e Y es a menudo Pro. El efecto de las interacciones dbiles como son los enlaces hidrgenos dentro de su contexto cooperativo confieren una gran resistencia trmica al colgeno. De esta manera el nmero de residuos Pro + HO-Pro presentes en el colgeno sern una funcin de la temperatura corporal a la que el espcimen prospera. Por esta razn el Colgeno presenta una temperatura de fusin determinada, que tambin es conocida como la temperatura a la que se desarma la triple hlice de Tropocolgeno y aumenta con el % de Pro-HO-Pro generando una estructura ms resistente en el animal de sangre caliente que la de un pez. Al retomar nuevamente la sntesis del Colgeno encontramos que la molcula de Tropocolgeno se ensambla de forma escalonada en el exterior, cerca de la superficie de las clulas mediante la presencia de enlaces cruzados. En este sitio la enzima Lisil Oxidasa (que requiere de Cu+2, PALP y es inhibida por Latirgenos) es fundamental para crear la unin Aldlica y tambin la unin Hidroxipiridina entre los residuos de LISINA (Fig. 36 4).
113
Una vez dispuestas las unidades de Tropocolgeno de forma escalada se depositan entre ellas los cristales de hidroxiapatita que contribuirn a dar mayor resistencia a la fibra de colgeno.
Nt Nt Nt OH OH OH S
Ct
S Ct S Ct
La falla de PROCOLAGENO PEPTIDASA en el lquido extracelular, se encuentra caracterizada por el sndrome de EHLER DANLOS En los animales la misma enfermedad se denomina DERMATOSPARAXIS, ambas se caracterizan por la presencia de piel LAXA
Nt
OH OH OH
Ct
Molcula de TROPOCOLAGENO en el LIQUIDO EXTRACELULAR

.
Nt Nt Nt
OH OH OH OH OH OH OH
OH OH
Ct
Ct
Ct
Los enlaces cruzados se producen por residuos de LISINA modificados
Disposicin escalonada de las molculas de Tropocolgeno por medio de enlaces cruzados intermoleculares e intramoleculares para formar una microfibrilla
Fig. 35 - 4. El ensamble del Tropocolgeno en microfibrilas ocurre mediante la formacin de los enlaces cruzados
En los animales la ingesta de las semillas conocidas como "arvejilla" produce el Latirismo, enfermedad caracterizada por la inhibicin de la enzima Lisil Oxidasa a causa de los compuestos qumicos o Latirgenos producidos por la planta del gnero Lathyrus. Adems, estos compuestos son neurotxicos y pueden afectar a las neuronas motoras paralizando las extremidades posteriores.
114
FORM ACION DE UNIONES DENTROY ENTRE LAS M OLECULAS DE TROPOCOLAGENO Accin de la Lisil Oxidasa extracelular en la formacin de enlaces cruzados Consecuencias de la accin de la Lisil Hidroxilasa intracelular en la formacin de enlaces cruzados
- ( CH ) - CH - CH - N H
22 2 2 3
) H N - H C - H C - ( CH 22
3 2 2
- ( CH) - N H3
2 4
) H N - ( CH 2 4
3
LISIL Cu+ 2 OXIDASA PALP EXTRACELU LAR

- ( CH) - C H - C
2 2 2
O H
O H
Residuos de Lisina pertenecientes a los extremos de las Hlices

C - C H - ) CH ( 2 2 2
LISIL HIDRO XILASA INTRACELULAR

- ( CH ) - CH-CH-N H
22 2 3
H N - CH- H C- ( CH ) 3 2 22
OH NH CH
3 2
OH
CONDENSA CION A LDOLICA
Eliminacin del Amonio del carbono Epsilon y oxidacn de este Carbono en un Aldehdo
2 2
CH 2 ( CH )
22
UNIONENTRE DOS OH- LISINAS Y UNA LISINA PARA FO RM AR LA HIDRO XIPIRIDINA
H - ( CH ) - C H - C C - ) CH ( 2
2 2
H O - ( CH) 2 2
+N -CH- HC- ( CH2)

2
Unin Aldol
( CH )
22
OH
Hidroxipiridina
Fig. 36 - 4. Formacin de los enlaces cruzados en el colgeno.
Volver inicio 10) ANOMALAS EN LA SNTESIS DEL COLAGENO
al
Como se ha visto la sntesis de Colgeno es algo compleja y a la vez susceptible de experimentar algunas anomalas entre las cuales se encuentran enfermedades de origen distinto y que pueden ser: a) Falta de enlaces cruzados en el colgeno por algn defecto gentico. b) Represin de la sntesis de algunas de las molculas de colgeno.
115
a) ESCORBUTO
La falta de vitamina C o c. Ascrbico produce la enfermedad denominada Escorbuto (Ver Captulo 6), que ocurre tanto en el hombre como en los Conejillos de Indias. Sus sntomas aparecieron en los navegantes de la antigedad durante las grandes travesas a vela. La enfermedad se caracteriza por hemorragias capilares, articulaciones dolorosas e hinchadas, cada de los dientes, manchas y llagas en la piel, que son de una lenta recuperacin junto a una baja capacidad para combatir infecciones. A pesar de estas terribles manifestaciones se observ posteriormente que una dosis diaria de algn ctrico curaba rpidamente estos sntomas. La vitamina C como se ha determinado en la actualidad es necesaria para el correcto funcionamiento de las enzimas Prolil y Lisil Hidroxilasa. En general el cido ascrbico es requerido para el funcionamiento normal de fibroblastos y osteoblastos durante la formacin de las fibras normales del colgeno y su posterior glicosilacin. La vitamina C es tambin necesaria para la sntesis de mucopolisacridos del tejido conectivo, las protenas que forman la dentina y la elastina de los capilares. Ms an la vitamina C parece estar involucrada en otras hidroxilaciones como ocurre durante el metabolismo de los esteroides, el paso de Fenilalanina a Tirosina, la hidroxilacin del Triptfano en la va destinada a la sntesis del neurotransmisor Serotonina y la de otros compuestos aromticos. Por lo tanto a causa de las razones anteriores, la inactividad de las hidroxilasas impide las interacciones laterales por medio de enlace hidrgeno entre los grupos OH de los residuos de OH-Prolina e OH-Lisinas tanto en las cadenas Alfa o Beta de la macromolcula de colgeno propiciando su inestabilidad.
Volver al inicio b) EHLER-DANLOS

Es un amplio nombre para desrdenes del tejido conectivo que pueden tener muchas causas moleculares, pero siempre relacionadas con la sntesis del Colgeno, ya sea en la secuencia misma del colgeno o en las enzimas que participan en sus modificaciones qumicas. En general Ehler Danlos resulta de fallas en la sntesis de Procolgeno Tipo I y II o fallas en los enlaces cruzados. Tiene 10 diferentes subtipos y se caracterizan por fragilidad de la piel, formacin anormal de cicatrices, excesiva marcas de golpes, articulaciones hipermviles y algunas veces ruptura de vsceras y arterias. Por ejemplo la enfermedad de Ehler-Danlos tipo VI, se caracteriza por deficiencia de la enzima Lisil Hidroxilasa, al producirse hebras con bajo contenido de hidroxi-lisina que posteriormente no formarn enlaces cruzados por medio de los anillos de hidroxipirimidina.
Ehler Danlos, Tipo II Por otro lado, cuando ocurre la deficiencia de la enzima Lisil Oxidasa se produce la Ehler Danlos, Tipo I enfermedad molecular denominada Ehler-Danlos Tipo V caracterizada por piel delgada y 116
vlvulas cardacas defectuosas y presencia de hernias. Ms an, cuando la enzima Procolgeno Peptidasa no est presente o bien no corta los pptidos en los extremos terminales del Procolgeno, a causa de la presencia de una mutacin que impide reconocer el sitio de corte, se desencadena la enfermedad recesiva denominada Dermatosparaxis en los animales y que se caracteriza por la presencia de piel inmadura, frgil y colgante.
TABLA 3 -4 ENZIMAS INVOLUCRADAS EN LA SINTESIS DEL COLAGENO Enzima Prolil Hidroxilasa ubicada al interior de la clula Lisil Hidroxilsa ubicada al interior de la clula Galactosil y Glucosil Transferasas ubicadas al int. de la clula Procolgeno Peptidasas ubicadas fuera de la clula Lisil Oxidasa Cofactores Fe+2, Vitamina C
Vitamina C o Ascrbico en polipptido --------------
Funcin Formacin de la 4 OH-Prolina en el Polipptido c. Formacin de la 5 el OH-Lys en el polipptido Glicosilacin de la cadena naciente en la 5 OH- Lisina
Cortan extremos Nt y Ct de la triple hebra de procolgeno para completar su ensamblaje Elimina el grupo Amino del carbono Epsilon () de la Lisina y oxida a este carbono en un aldehdo
Falla Escorbuto
Escorbuto, Ehler Danlos Tipo VI -
-----------
-------------
Ehler-Danlos Tipo VII En animales Dermatosparaxis
Cu+2, PALP
Latirismo (falla enlace entre colgeno y elastina) En los animales Producido por el inhibidor enzimtico - Amino-propionitrilo, que se encuentra en la planta denominada arvejilla. La enfermedad se desencadena con dietas deficientes en Cu. En humanos se denomina EhlerDanlos Tipo V.
En humanos en cambio, la misma causa molecular produce la enfermedad denominada Ehler-Danlos Tipo VII, que se caracteriza por una piel laxa y apariencia aosa. La enfermedad de Ehler Danlos tipo IV se debe a defectos en la fibra de Procolgeno Tipo III y en este caso las personas presentas riesgos de ruptura de vasos o intestino.
117
Volver al inicio c) OSTEOGNESIS IMPERFECTA

Esta enfermedad del Colgeno se debe a la expresin defectuosa de las cadenas de Procolgeno del Tipo I. Puede ocurrir debido a una mutacin puntual de Transversin (Timina por Guanina) en el Procolgeno que impide la remocin de los pptidos terminales por la enzima Procolgeno Peptidasa: 987 988* 989 Alelo CCT GGT CCT Normal Pro Gly Pro Alelo Mutante CCT TGT CCT Pro Cys Pro
En esta anormalidad ocurre el cambio de una Gly por una Cys en la posicin 988* de la cadena Alfa I de la triple hlice, por esta razn se abre el extremo Ct a una excesiva hidroxilacin y glicosilacin que impide su corte enzimtico y posterior ensamble durante la maduracin del Tropocolgeno, lo que se traduce en la aparicin de fracturas a nivel del hueso. Mutaciones en la Triple hlice son causantes de distintos grados de Osteognesis Imperfecta, ya que forman una joroba por falta de interaccin con sus vecinos de las otras hlices, impidiendo el empacamiento cerrado de las triple hlices.
Osteognesis Imperfecta
Volver al inicio
d) GANGRENA GASEOSA
Entre las otras enfermedades que sufre el colgeno es interesante mencionar la accin del Clostridium Histoliticum. Este microorganismo ataca enzimticamente la secuencia X - Gly Pro - Y durante la infeccin denominada GANGRENA GASEOSA. De esta manera degrada los tejidos y penetra fcilmente en ellos propagando la infeccin. Una enzima similar a esta,
118
pero de origen endgeno es empleada por algunos animales durante la metamorfosis para la reabsorcin de algunos tejidos que sern reemplazados por otros.
e) RESUMEN DE CONCEPTOS SOBRE LA SNTESIS DEL COLGENO: 1) La triple hlice de Colgeno se enrolla a la derecha, mientras que las hebras individuales se enrollan individualmente hacia la izquierda 2) La Hidroxilisina se encuentra solo en el Colgeno 3) La Hidroxilacin de Lisina y Prolina requiere de Vitamina C, O2y Alfa-Cetoglutarato 4) La Vitamina C mantiene al Fierro como +2 5) La inhibicin de la Hidroxilacin de la Prolina resulta en inhibicin de la formacin de la triple hlice y en una molcula no funcional. 6) Las triples hlices se encuentran unidas de forma escalonada por residuos de lisina y enlace cruzado de aldol 7) Todos los tipos de colgeno se encuentran compuestos de cadenas Alfas 8) Desmosina e Isodesmosina se encuentran solo en la Elastina 9) Osteognesis imperfecta resulta a partir de defectos en el colgeno Tipo I 10) El sndrome de Ehler-Danlos resulta de de defectos en Procolgerno Tipo I y Tipo III o los enlaces cruzados 11) El sndrome de Marfan es por falla de la Fibrillina 12) Latirismo resulta de la ruptura del enlace covalente entre colgeno y elastina Volver al inicio 9) ELASTINA
La ELASTINA es otra protena del tejido conjuntivo y al igual que el colgeno es rica en aminocidos hidrofbicos con poqusimos aminocidos polares. Se le encuentra de preferencia en ligamentos y en las paredes de los vasos sanguneos que tienen la facultad de estirarse y volver a su forma original (Fig. 39 - 4). El precursor de esta molcula es la subunidad de Tropoelastina con subunidades de 30 y 100 kD. Adems, posee enlaces cruzados debido a la accin de la enzima Lisil Oxidasa entre los residuos de Lisina, donde cataliza la formacin de radicales como Lisil y Lisil Semialdehidos, que dan origen a los aminocidos derivados Desmosina y Lisina-norleusina (Fig. 40 - 4). Ambos aminocidos se emplean como anillos de unin para anclar las distintas cadenas polipeptdicas.
119
Hctor Rocha L. Las Protenas y su Estructura Fig. 39-4. Estructura de la Elastina. Hlices unidas por Desmosina-
La Elastina contiene cantidades elevadas de Glicina y Prolina, pero carece de Cistena y Triptfano. Sin embargo, contiene pocos aminocidos polares y no contiene OH-Lisina. La cantidad de Hidroxi-Prolina necesaria para la estructura normal de la molcula es tambin afectada por la falta de vitamina C que afecta a la enzima Prolil Hidroxilasa.
H N
H C
O C
(C H ) 2 2 CH CH + N CH (CH C O C H 2 2 ) N H H N H C O C 3 2 CH 2
N C C
H H O
DESMOSINA
H C CH CH 2 2 O C
H C H CH 2
H H O
(C H2 )3
CH 2
(C H2 ) 2
C C
LISONORLEUSINA
Fig. 40 - 4. El aminocido Desmosina acta como anillo de unin para las cadenas de elastina.
Tanto en animales como el hombre la formacin de enlaces cruzados es defectuosa cuando la dieta es pobre en Cu afectando la sntesis enzimtica de los aldehdos necesarios para formar enlaces cruzados o anillos de anclaje como la Desmosina. Por esta razn se produce un ensanchamiento de la aorta debido a la perdida de su elasticidad. En esta arteria se encuentra la mayor cantidad de Elastina (30gr/100gr de peso seco) junto al Colgeno (20 gr/100gr de peso seco). De esta manera frente a una falta de enlaces cruzados a consecuencias de una baja actividad en la enzima Lisil Oxidasa (Amino Oxidasa-Cu dependiente) el tejido se distiende y no vuelve a su forma original. La Elastina es resistente a la hidrlisis por colagenasas del Clostridium Histoliticum. Entre las enfermedades que afectan a esta protena se encuentra tambin la presencia de Latirgenos que provocan una falla en la maduracin de la Tropoelastina en los tejidos al inhibir a la Lisil Oxidasa.
Volver al inicio 10) PROTEINAS GLOBULARES.
120
Se caracterizan por tener un centro hidrofbico en su interior y una superficie hidroflica expuesta al medio acuoso. Pueden estar formadas por una o varias subunidades y a su vez cada una de ellas por varios mdulos o dominios. Las subunidades pueden interaccionar entre ellas por medio del enlace hidrgeno, electrosttico, hidrofbico y puentes disulfuro. Las interacciones entre los residuos laterales mantienen la estructura tridimensional de la protena. Desde el punto de vista termodinmico su conformacin esta dada por la suma algebraica de todas sus interacciones dbiles. En otras palabras, as como hay interacciones que liberan energa para ganar estabilidad, tambin hay otras que toman energa para la misma causa. Si la suma total de la energa tanto liberada como absorbida por las distintas interacciones es cercana a 0, la estructura plegada de la protena se encontrar en equilibrio con el medio y su conformacin puede ser denominada como nativa.
C O O + H N 3
--
Leg hem oglobina vegetal 146 am inoacidos
N H
- Hem oglobina 155 am inoacidos M ioglobina 153 am inoacidos
C O O
--
--
C O O N H
3
--
Fig. 41- 4 Las protenas Leghemoglobina, o hemoglobina y Mioglobina estn emparentadas entre s.
Por supuesto que esta es una definicin simplista, ya que existen protenas muy estables que pueden tomar energa del medio sin denaturarse y otras que pueden liberarla de manera similar. La Mioglobina y la Hemoglobina son dos protenas bastante conocidas desde hace algn tiempo ya que fueron estudiadas por Perutz y Kendrew empleando la tcnica de Difraccin de Rayos X. Ambas protenas intervienen en el transporte de oxgeno. A ellas se agrega otra protena de funcin similar que se denomina Leghemoglobina (Fig. 41 - 4). Esta protena se encuentra en las races de las Leguminosas y presenta una estructura terciaria similar a las otras dos.
a) LEGHEMOGLOBINA.
Es considerada como otra integrante de la familia de las Globinas. Su nombre proviene de la unin de las palabras Leguminosa con Hemoglobina y se caracteriza por tener como grupo
121
prosttico a una Protoporfirina IX (Heme) en su nica cadena polipeptdica con un de PM 16 kD. Se le encuentra en gran concentracin en los ndulos de las races de las Leguminosas como la Soja y el Lupino. En este sitio acta transportando O2 a los microorganismos asociados simbioticamente a la planta, como el RHIZOBIUM y el BRADYRHYZOBIUM, cuya funcin es la fijacin del Nitrgeno. A medida que el Oxgeno compite con el Nitrgeno por el sitio activo del complejo enzimtico de la Nitrogenasa, el papel de la Leghemoglobina no solo sera de enriquecedor de la concentracin de Nitrgeno, sino que tambin como sensor del O2 molecular en las races. El grupo Heme de la protena es sintetizado por la bacteria y la Globina por la clula vegetal infectada. Es indudable que el origen de estas protenas Mioglobina, Hemoglobina y Leghemoglobina es comn y se remonta a cerca de 1500 millones de aos atrs, cuando se produjo la divisin entre el reino animal y el vegetal. El origen comn se atribuye a la presin selectiva causada por la aparicin del Oxgeno en la atmsfera que seleccion a este conjunto de aminocidos, ubicados en la secuencia de una cadena polipeptdica (formada por distintos segmentos de -Hlice), como la mejor forma de atrapar O2 con un grupo Heme. Por lo tanto se ha conservado la estructura terciaria tanto en plantas como animales a pesar de las variaciones experimentadas por la secuencia aminoacdica que dependen del medio interno en que se encuentra la protena.
Volver inicio b) MIOGLOBINA.
al
La Mioglobina se encuentra en el msculo y tiene 8 segmentos de - hlice que se encuentran plegados formando una estructura compacta y globular. Su interior es hidrofbico y su exterior es polar, el Oxgeno mismo se une a un bolsillo hidrofbico donde se encuentra alojado el grupo Heme formado por una Protoporfirina IX y un Fe+2. El grupo Heme interacciona con 16 residuos de aminocidos y el Fe con los cuatro nitrgenos de los anillos de pirrol de la Protoporfirina ms una Histidina proximal (situada en la hlice F con posicin 8) y una distal que no esta ligada al grupo heme. Por lo tanto la sexta posicin de coordinacin esta libre de ser ocupada por el Oxgeno. La protena tiene un gen que cuenta con tres exones (secuencia discreta de aminocidos con una funcin especfica) y dos intrones, donde el exn central interviene en la unin al grupo Heme y al Oxgeno.
Volver al inicio c) HEMOGLOBINA.
122
La Hemoglobina presenta cuatro subunidades, 2 subunidades con 141 aminocidos y 7 segmentos helicoidales cada una ms las dos subunidades (Fig. 42 - 4) con 146 aminocidos y 8 segmentos helicoidales. Las cadenas , son similares a la Mioglobina. El peso molecular total del tetrmero es de 64 kD.
Las interacciones no covalentes estabilizan la unin entre las subunidades
Fig. 42 - 4. Las cuatro cadenas interaccionan entre s formando un tetraedro.
Las 4 subunidades se agrupan en los vrtices de un tetraedro y contienen 4 grupos prostticos Heme (Fig. 42 - 4). Este grupo es una Protoporfirina IX con Fe+2 en su centro y se encuentra ubicada al igual que en las protenas anteriores en un bolsillo hidrofbico de la estructura. El Fe del grupo Heme coordina con cuatro nitrgenos en el plano del anillo de la Protoporfirina IX ms una Histidina proximal que cede electrones estabilizando al Fe. En ausencia de Oxgeno el Fe est a 0,6 Ao sobre el plano de la Protoporfirina y en presencia de Oxgeno, baja y se sita en el mismo plano. Este cambio de posicin arrastra a la His proximal lo que produce un cambio en la estructura terciaria que se transmita a la estructura cuaternaria facilitando la entrada de nuevas molculas de Oxgeno a las otras subunidades de la Hemoglobina. La otra Histidina que se encuentra en la posicin distal conocida como E7 (se encuentra en la hlice E en la posicin 7), no interacciona directamente con el Fe del grupo Heme (Fig. 43 - 4), pero protege de la unin al monxido de carbono (CO) bajando su afinidad en 125 veces a causa del impedimento estrico que crea al oponerse a la ubicacin de la molcula de CO sobre el plano del grupo Heme.
123
En general la estructura de la Hemoglobina es hidrofbica por dentro y polar por fuera. Su estructura cuaternaria permite una modulacin de su actividad por medio de los cambios conformacionales transmitidos de una subunidad a otra, cosa que no ocurre con la Mioglobina que es rgida. De esta manera la afinidad de la Hemoglobina por el Oxgeno se puede variar al pasar la sangre desde los pulmones a los tejidos que efectan trabajo metablico. Esta modulacin es llevada a cabo por efectores como el pH, la presin parcial de CO2 (poco) y el metabolismo 2,3 Difosfo-Glicerato (2,3 DPG). Todos ellos actan afectando la conformacin de las subunidades y la interaccin entre ellas hace cambiar la
a)
C CH N H
b)
1
N
His de la Hlice E 7 DISTAL HC
F H E C B G
B G H A
C E F
1
N N
Fe
N
N His de la Hlice F 8 PROXIMAL N C HC CH
CONTACTOS DE EMPAQUETAMIENTO CONTACTOS DE DESLIZAMIENTO CON
Fig. 43 - 4. El Fe interacciona con los nitrgenos de los pirroles y la His proximal. Fig. 43 - 4. Los sectores de Alfa hlice se ordenan de la A hasta la D.
afinidad. El mecanismo por el que ocurre se examinar en el prximo captulo de Enzimas.
Volver al inicio 11) CONTACTOS ENTRE LAS SUBUNIDADES DE LA HEMOGLOBINA

Las hlices de la Hemoglobina presentan distintos tipos de contacto como son los contactos de empaquetamiento (Fig. 43 - 4), que ocurren entre las hlices 1- 1 y las 2 - 2 implicando a las hlices de los sectores B, G, H y el codo GH. Luego estn los contactos de deslizamiento entre las subunidades 1 - 2 y la 2 - 1 que involucran a las hlices de los sectores C, G y el codo FG. De esta manera el tetrmero se encuentra formado por dos protmeros asimtricos 1 - 1 y 2 - 2. Al unirse el Oxgeno, el dmero 1 - 1 rota 15o sobre el dmero 2 - 2 deslizndose sobre los contactos 1 - 2 y 2 1. Los contactos y movimientos aqu descritos son necesarios para modular la afinidad de esta macromolcula proteica por el Oxgeno bajo las distintas situaciones en que se encuentra el organismo.
124
De la figura 44 - 4, se puede apreciar la disposicin antiparalela entre las cuatro cadenas de las Globinas y sus interacciones por puentes salinos. Las cadenas 1 y 2 interaccionan de forma antiparalela por medio de sus Argininas 141 y Asprtico 126. Mientras que sus Ct y Nt tambin lo hacen en los extremos de cada cadena. La Lisina 40 de las cadenas interacciona a su vez con los Ct de ambas cadenas , cuyos residuos Asprtico e Histidina interaccionan entre s.
Interacciones electrostticas entre las cadenas y de la Hemoglobina .
+ H N 3 +
OOC
Arg 141 Lis 40 His 146 Asp 126
+
Asp 94 His 146
COO
+
Lis 40 Asp 126 Asp 94 Arg 141
+
NH
3
+ H3 N
OOC
COO
+
NH
3
Fig. 44 - 4. Las cuatro cadenas se unen por puentes salinos o interacciones electrostticas.
Estas interacciones son del tipo puente salino, lo que significa que estn mediadas por las cargas presentes, tanto en los distintos residuos de aminocidos cmo en sus extremos terminales. Volver al inicio 12) SUPERXIDO DISMUTASA (SOD).
Esta enzima (Fig. 45 - 4), cataliza la dismutacin de los Superxidos:
O2- + O2- + 2 H+ ------> H2O2 + O2

Es decir, a partir de dos molculas idnticas de Superxido se producen dos compuestos diferentes, una molcula de Perxido de Hidrgeno y otra de Oxigeno. La enzima se encuentra formada por solo una subunidad con 4 cadenas Beta plegadas por el lado anterior y cuatro cadenas Beta plegadas por el lado posterior. Todas sus cadenas se encuentran en
125
la disposicin antiparalela. Los polipptidos que conectan las cadenas - plegadas anterior y posterior solo presentan una conformacin de ovillo al azar. A diferencia del grupo de las Globinas que poseen en su estructura espacial solo -Hlice, esta protena que interacciona con el Oxgeno en la forma de Superxido O2-, tiene una estructura terciaria totalmente distinta a las anteriores.
E nzima formada por estructura -plegada antiparalela y dispuesta en la forma de una capa superior y una inferior
O villo al A zar
O villo
Zn
Cu
N t
al Azar
-S -S -
C t Superxido D ismutasa
Fig. 45 - 4. Estructura terciaria formada por cadenas -plegadas en la Superxido Dismutasa. Zn tiene un papel solo estructural.
El sitio de unin al Superxido es el tomo de Cu que se encuentra ubicado en el centro de la protena donde se coordina por los nitrgenos de cuatro histidinas simulando un grupo Heme distorsionado. Finalmente al analizar algunas de las protenas globulares que interaccionan con el Oxgeno se puede concluir que existen estructuras del tipo y estructuras del tipo . Las primeras como la Leghemoglobina, Hemoglobina, Mioglobina estn formadas exclusivamente por estructura secundaria -Hlice, plegada entre s con grupos Heme. Son como resortes enrollados con distintos segmentos corriendo en una y otra direccin. Por otro lado, las protenas Beta de las que se entrega solo el ejemplo de la Superxido Dismutasa (Fig. 45 - 4), estn formadas por estructuras -plegada que corren de manera antiparalela en dos tandas, una capa anterior de cuatro hebras y una capa posterior tambin de cuatro hebras interaccionando entre s. Ambas capas sirven de marco para la unin de un grupo seudo grupo Heme distorsionado que se forma por distintas Histidinas de la secuencia para unirse al Cu. El Zn solo tiene papel estructural, mientras que el Cu participa en la catlisis. En la tabla 4 4, aparece la secuencia parcial de 4 protenas conocidas por unirse al Oxgeno mediante el grupo Heme. Aquellos aminocidos pertenecientes a estructuras
126
crticas para la funcin permanecen en todas ellas, mientras que el resto es poco conservado. Todas ellas presentan la misma conformacin tridimensional. Solo cambios de aminocidos de un tipo por otros del mismo tipo les permite mantener su estructura terciaria y adaptarse a los distintos medios internos donde llevan a cabo su funcin. Son comunes a todas ellas Val (V) 1 o Amino terminal, Pro (P) 38, Phe (F) 44, His (H) 65 y la His (H) 100, necesarios para la estabilizacin del complejo Protena-Grupo HemeOxgeno.
Tabla 4 - 4 Homologa de las secuencias parciales en cuatro protenas con un ancestro comn
SECUENCIA
10
20
30
40
Leghemoglobi na de Soja Mioglobina de Ballena Hemoglobina Hemoglobina Leghemoglobi na de Soja Mioglobina de Ballena Hemoglobina Hemoglobina Leghemoglobi na de Soja Mioglobina de Ballena Hemoglobina Hemoglobina
VAETEKQDAL VXLSEGEWQL VXLSPADKTN VHLTPEEKSA

50
VSSSFEAFKA VLHVWAKVEA
NIPQYSVVFY DVAGHGQDIL
TS I LEKAPAA I RLFKSH PET ERMFLSPPTT GRLLVVYPWT

80
VKAAWGKVGA HAGEYGAEAL VTALWGKVNX

60
XVDEVGGEAL
70
KD I FSELANX LEK FDRFKHL KTY FPHFXDL QRF FEBFGDL

90
GVDXPXXTNP KTEAEMKASE SHGSAXXXXX STPDAVMGNP

100
KLTGHAEKLF DLKKHGVTVL
ALVRDSAGQL TALGAILKKK
QVKGHGKKVA DALTNAVAHV KVKAHGKKVL

110
GAFSDGLAHL
120
KASGTVVADA GHXXXXXXEA DXXXXXXDMP DXXXXXXNLK
AXXXXLGSVH EXLKPLAQSH NALSALSDLH GTFATLBELH
AQKAVTDPXQ ATKHK I PI KY AHKLRVDPVN CDKLHVDPEN
FVVVKEALLK LEF I BEAI I H FKLLSHCLLV FRLLGNVLVC

Volver al inicio
13) ENVEJECIMIENTO DE LAS PROTEINAS.
127
Las protenas tienen una vida media que se puede caracterizar por un recambio metablico lento o rpido. Entre las primeras tenemos a las protenas que se requieren para la integridad de una estructura, como lo son colgeno y elastina y entre las segundas o rpidas tenemos a las enzimas y hormonas peptdicas, cuyos niveles se pueden ajustar para regular la catlisis de una sola reaccin de una va metablica o el desempeo total de la misma va. Adems, dentro de la poblacin de protenas se deben considerar aquellas protenas anormales,
2
C O -- N H2
+ -1
+ +
4
C O -- N H 2 O OH OH
2
--COO CH 2 O H O
+
--- S H
2HN ----
1 --- S --- S ---
1
H S ---
+
--COO
4
HO ----
OH O --- O -- P -- O ----
Reduccin 3
NAT I VA
2 Deaminacin
+ _
3 Fosforilacin 4 Glicosilacin
---
son N H 3 son C O O
DENAT URADA
Fig. 47 - 4. Las protenas sufren cambios qumicos para los cuales no fueron diseadas alterando su conformacin activa.
tanto por su origen, como aquellas que han sido modificadas por mutaciones o que han adquirido una modificacin qumica a lo largo de su vida media. Ms an, es bien conocido que dentro de una poblacin de protenas de un mismo tipo, deben existir algunas recin sintetizadas y otras envejecidas. Esto ltimo significa que las protenas sufren a lo largo de su vida til distintas modificaciones que afectan su estructura y las aleja paulatinamente de su actividad biolgica normal. A continuacin podremos observar algunas de las condiciones intracelulares que daan a las protenas:
1) Temperaturas por sobre los 37C que faciliten la agitacin trmica 2) Presencia de enzimas que modifican a otras protenas como son las Proteasas y Quinasas 3) Formacin de pequeas molculas reactivas que provocan Metilacin, Deaminacon, Adenilacin, Aminacin, Fosforilacin, Reduccin de Puentes disulfuro, Glicacin o Glicosilacin (unin del grupo aldehdo de la Glucosa al grupo Amino terminal de las protenas) entre otras (Fig. 47 - 4), Nitrosilacin, etc. 4) Concentraciones elevadas de sal que generan un ambiente hostil para las enzimas induciendo su disociacin en algunos casos. 5) Liberacin de cidos grasos desde las bicapas de la membrana, que pueden actuar como detergentes facilitando la apertura del centro hidrofbico de las protenas
128
solubles en agua y a la vez facilitando la salida de las protenas integrales de membrana. 6) Presencia de protenas parcialmente plegadas o subproductos de la hidrlisis, como polipptidos de distintos tamaos y an polipptidos nacientes o mutados que pueden arrastrar a las protenas normales a formar agregados insolubles.
En general el medio interno celular no es lo suficiente apto para que una protena sobreviva por un largo tiempo sin la presencia de algunas molculas protectoras. Es sabido que las protenas sufren ms de 100 modificaciones mayores y menores despus que han sido sintetizadas. Estas modificaciones afectan a protenas en su actividad, estabilidad y especificidad de interaccin, lo que altera a los procesos crticos de la clula como son: sntesis y degradacin de DNA y protenas, traduccin de seales, organizacin del citoesqueleto y componentes de la matriz extracelular, eliminacin de desechos y otros ms. En la actualidad se logrado determinar que existe correlacin entre envejecimiento y acumulacin de protenas anmalas, especialmente aquellas que han sufrido estrs oxidativo, consistente en oxidacin y fragmentacin, mientras que otras sufren modificaciones del tipo fsico como lo es el estrs estructural. Ambos factores hacen notar que dichas protenas no se encontraban evolutivamente diseadas a su mxima capacidad. Cualquier efecto capaz de inhibir los procesos anteriores extiende la vida de los sujetos de experimentacin y viceversa. Adems muchas de las enfermedades neurodegenerativas asociadas con la edad (Alzheimer), se caracterizan por presentar acumulacin de protenas parcialmente oxidadas. Detrs de estos mecanismos, existe un delicado balance entre la sntesis de protenas y su degradacin que se rompe con la edad. Por lo tanto, la extensin de este dao depender de los factores que alteren el balance, como son la presencia de compuestos pro-oxidantes, antioxidantes, la reparacin, el reemplazo y la eliminacin de las protenas daadas. En cuanto a la senescencia celular podemos decir que tanto la velocidad de sntesis como la degradacin se ven afectadas por tales efectos. As tenemos que durante la sntesis, el Factor de Elongacin 2 (EF-2), es susceptible de ser oxidado y sufrir fragmentacin produciendo una declinacin en la aparicin de nuevas protenas. De lo anterior se deduce que con la edad o senescencia celular, puede existir una disminucin progresiva del reemplazo de protenas envejecidas por otras nuevas y que a causa de ello se produzca un aumento en la concentracin de protenas daadas debido a la falta de nuevas molculas de enzimas proteolticas responsables de los mecanismos de degradacin. Durante la vida normal, antes de la senescencia celular el organismo emplea distintas vas para eliminar la carga de las protenas envejecidas y reciclar sus aminocidos. Estos mecanismos se dividen en (Fig. 49-4): a) Sistema Ubiquitina-Proteosoma b) Sistema de las Calpanas reguladas por Calcio c) Degradacin Lisosomal
129
VELOCIDAD DE RECAMBIO
SISTEMA UBIQUITINA/ PROTEOSOMA SISTEMA CALPANA/ CALPAESTATINA ACTIVADO POR ++ Ca
vida media de las protenas
VIAS LISOSOMICAS MULTIPLES

Fig.49 4. La vida media o velocidad de recambio de una protena depende de la velocidad de sntesis y degradacin de esta.
Volver al inicio
a) SISTEMA UBIQUITINA-PROTEOSOMA
130
Esta Va se encuentra mediada por unos pequeos polipptidos denominados Ubiquitinas
POLIRIBOSOMA DNA RNA
PROTENA NATIVA
ATP
COMPLEJO + PROTENAUBIQUITINA
PP E3
HSP 40 HSP 70 HSP 40 HSP 70 PERDIDA DE LA CONFORMACIN NATIVA
UBIQUITINA
E2-UBIQUITINA
E1 + A T P + UBIQUITINA
26 S-PROTEOSOMA
HIDRLISIS
Fig. 50 - 4. Las UBIQUITINAS se asocian a las protenas para que estas ltimas sean hidrolizadas por los complejos de proteasas o proteosomas 26S existente en el citoplasma. E1 : Enzima activadora de la Ubiquitina E2 : Enzima transportadora de la Ubiquitina E3: Enzima necesaria para la unin de la Ubiquitina a las protenas blanco
(Fig. 50 - 4). Estos polipptidos son de bajo peso molecular y cuentan con solo 76 aminocidos. Su activacin ocurre por medio de la enzima E1-SH pasando a formar un tiolester en su carboxilo terminal. A continuacin son transportados por medio de una unin similar por la enzima E2-SH para interactuar con la protena blanco, la cual ha sido previamente activada por la enzima E3. La Ubiquitina se une a la protena blanco y la marca para ser hidrolizada por un Complejo de Proteasas o Proteosoma 26S (Fig. 50 - 4), existente en el citoplasma. Se ha demostrado que con la edad no vara la capacidad hidroltica del Proteosoma, pero s la Ubiquitinizacin o marcacin por lo cual se reduce la capacidad para degradar protenas.
Volver al inicio ++ b) SISTEMA DE LAS CALPANAS Y CALPAESTATINAS REGULADO POR Ca
131
El sistema formado por las Calpanas y Calpaestatinas su inhibidor fisiolgico, consiste en la regulacin de una proteasa citoslica con un grupo tiol, dependiente de la presencia de Calcio (Fig. 51-4). La Calpana activada como proteasa, degrada especialmente protenas de membrana como lo son algunas enzimas y parte estructural del citoesqueleto. Se cree que se encuentran involucradas en la degeneracin neuronal y la protelisis anormal que se observa en la enfermedad de Alzheimer (Ver ms adelante) Algunos de los cambios que se producen con la senescencia de las clulas, se atribuyen a las protenas de las membranas que se hacen ms susceptibles al ataque por proteasas. Estas atraen a una mayor cantidad de Calpanas, mientras que la actividad protsica de la Calpana permanece inclume.
PROTENA DE MEMBRANA
++
CALPASTATINA
Ca
CALPASTATINA
Ca
++
Ca FACTOR DE ACTIVACION
++
CALPANA
CALPANA Ca
++
Fig. 51- 4. Sistema de proteasas regulado por Calcio que degrada protenas de membrana
Volver al inicio c) FUNCIN DE LOS LISOSOMAS EN CLULAS SENESCENTES.

Los Lisosomas son organelos que cuentan con un poderoso arsenal de proteasas, peptidasas e hidrolasas capaces de degradar macromolculas intra y extracelulares. Son responsables del recambio basal de las protenas de vida media larga. Su actividad se ve retardada con la edad y como consecuencia aumentan en nmero y tamao, sin embargo su funcin disminuye y se observa ante ello una serie de cuerpos o agregados de almacenamiento o depsitos insolubles. Los diferentes mecanismos por los cuales las protenas son transportadas al interior de los Lisosomas constituyen (Fig. 52 4): fusin de vesculas por endocitosis cuando se invagina la membrana plasmtica y forma una vescula que posteriormente se funde con un lisosoma y la crinofagia que es cuando se funde un lisosoma con una vescula proveniente del Aparato de Golgi.
132
Otros tipos de procesos son la Macroautofagia y Microautofagia, donde regiones de distinto tamao del citoplasma son envueltos por una doble membrana que posteriormente se funde con un Lisosoma y se degrada. Esta actividad disminuye con la senescencia de la clula.
Endocitosis
Lisosoma
transporte mediado por hsc 73, chaperona citoslica Microautofagia
Endosoma
Crinofagia
Macroautofagia
Aparato de Golgi
Fig. 52 - 4. Distintos mecanismos Lisosomales de degradacin de protenas intra y extracelulares.
Un mecanismo adicional consiste en el transporte directo de ciertas protenas hacia la membrana del Lisosoma para ser vertidas en su interior y posteriormente degradadas (Fig. 20 4). Una protena que se debe degradar posee una cierta secuencia de consenso que es reconocida por una Chaperona Citoslica hsc-73 de 73 k Da. Esta unin dirige el complejo a la membrana donde la glicoprotena de membrana, que acta como receptora y denominada lgp 96 por tener 96 k, forma un complejo Prot. sustrato- hsc 73 - Igp96. Posteriormente la protena sustrato es traslocada al interior del Lisosoma mediante la unin de la Chaperona intralisosomal Lys-hsc73 y la salida del complejo de la Chaperona citoplasmtica hsc73. En el interior la protena sustrato es posteriormente degradada.
Volver al inicio
14) ENCAFALOPATIAS ESPONGIFORMES

En la actualidad se ha observado que algunas de las Encefalopatas (Fig. 53 4), ms comunes han sido provocadas por los Priones (PrP por prion protein o proteinaceous
133
infectious particle), conocidos como agentes infecciosos de naturaleza proteica. Estas partculas no estn constituidas por cidos nucleicos y a la vez no presentan ninguna envoltura como aquellas presentes en las partculas virales. Las encefalopatas son enfermedades neurodegenerativas transmisibles y heredadas, que parecen tener su origen a partir del scrapie o enfermedad neurodegenerativa de las ovejas. Esta ltima se ha transmitido a las vacas por contaminacin de los nutrientes y se le ha llamado enfermedad de la vaca loca, que no es ms que una encefalopata del tipo espongiforme. Este ltimo trmino se debe a que el cerebro adquiere forma de esponja, dejando ciertos vacos debido al ataque de los Lisosomas sobre los depsitos de agregados proteicos.
PrPc Ct Nt
Regin globular con -Hlice
La regin con ovillo al azar hacia el extremo Nt, se pliega para incrementar la estructura -plegada
Encefalopatas Espongiformes: cerebro post mortem con grandes vacuolas en el cortex y cerebelo. Humanos: CJD : enfermedad de Creutzfeld-Jacob GSS : sndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker FFI : Insomnio Familiar Fatal Kuru : parece CJD en Nueva Guinea Sndrome de Alpers: nios Animales: Scrapie : en Ovejas TME : Encefalopata del Mink CWD : Cronic wasting disease o enfermedad crnica debilitante BSE : Bovine Spongiform Encephlopaty en vacas
Fig. 53- 4. Regin Globular y de ovillo al azar de la protena responsable de las encefalopatas espongiformes.
Esta enfermedad se puede transmitir a los humanos por ingestin de vsceras y tejido nervioso de bovino, pasando ahora a llamarse enfermedad de Creutzfeldt-Jacob. Otros de sus nombres en humanos es el Kuru, que se produca en la isla de Papa, Nueva Guinea. El Kuru se produjo debido a la ingestin de cerebros humanos a consecuencias de la lucha entre tribus rivales. Esta enfermedad no afectaba a mujeres y nios que se alimentaban solo del tejido muscular de las victimas.
134
En la actualidad despus de acuciosos estudios se ha logrado determinar que el agente infeccioso es una protena (PrPc) la cual posee normalmente una isoforma que tiene 42% de - Hlice y casi ninguna estructura -plegada (Figs. 53, 54 - 4). Esta protena es capaz de transformarse por algn medio, en una protena anormal (PrPsc), con una isoforma de 30% de - Hlice y 43% de - plegada. Tanto en el cerebro de rata con Alzheimer o con la variedad que aparece en la oveja denominada scrapie, as como en humanos con encefalopata CreutzfeldtJacob, se han encontrado anomalas asociadas a la internalizacin de estas protenas. Esto ocurre por medio de vesculas que forman endosomas y que a la vez se encuentran asociadas a la protena chaperona hsp70. Estas vesculas tienen algn receptor que las hace capaces de reaccionar inmunolgicamente con la enzima -Glucoronidasa de los lisosomas y tambin con los agregados de protena marcada para su destruccin con Ubiquitina.
"KURU" EN HUMANOS
ENFERMEDAD DE KREUTZFELD -JACOB EN HUMANOS
"SCRAPIE" EN OVEJA
ENCEFALOPATA ESPONJIFORME EN
Fig. 47- 4. Preparaciones de tejido nervioso donde se aprecia claramente la formacin de huecos o tejido esponjoso.
Aquellas protenas del citoplasma que tienen la secuencia aminoacdica KFERQ (Lys-PheGlu-Arg-Gln) y que se unen a la hcs 73 (protenas parientes de hsp 70), son internalisadas al sistema endosoma-lisosoma, pero la protena infecciosa PrPsc no tiene esta secuencia y permanecer en la superficie del sistema endosomalisosoma, donde la hsp constitutiva hcs73, puede favorecer su plegamiento errneo con el paso de PRPc a PrPsc. De esta
135
manera, parece ser que el cambio se produce durante el proceso de internalizacin de las PrPc. Por otro lado se ha observado que la estabilidad de las secuencias en la PrP, desde el aminocido 96 al 167 y 215 al 230 son esenciales para la unin a una protena X que propiciara el cambio a PrPsc. En general los endosomas lisosomas, muchas veces se repletan de Priones anormales o PrPsc haciendo colapsar la membrana del lisosoma y provocando a la vez con sus enzimas digestivas la destruccin de las neuronas y clulas gliales, dejando huecos que dan el aspecto de espongiforme.
PrP con estructura hlice PrPc con estructura hlice ms - plegada
Fig. 54 - 4. Diferencias en las conformaciones de la PrP y PrPc
Ciertas enfermedades se caracterizan por extensos depsitos de protena en tejidos determinados, especialmente en el tejido nervioso donde se observan enredos de neurofilamentos y a la vez lminas neurticas, especialmente en el cerebro de pacientes con Alzheimer. Estos agregados se encuentran formados por tan solo una protena determinada. En la bsqueda de una explicacin a este problema se ha notado que no todas las protenas nacientes se pliegan por su cuenta y que en algunos casos requieren de la ayuda de otras protenas denominadas chaperonas, ms an antes de alcanzar su conformacin nativa las protenas nacientes pasan por una serie de estados intermedios de plegamiento que pueden ser afectados por la temperatura y que a consecuencias de ello se dirijan al plegamiento equivocado con la formacin de agregados entre unidades de la misma protena. Una mutacin hara ms estable el plegamiento parcial de la protena seleccionando la conformacin con la que se genera el agregado. De similar manera cuando una protena s denatura, lo hace parcialmente a travs de sucesivas etapas hasta alcanzar el estado de totalmente denaturada, sin embargo uno de
136
sus estados intermediarios es capaz de interaccionar con otra de sus copias en similar proceso y formar a la vez los agregados insolubles (Fig. 54 - 4). En la Tabla 5-4 se observan algunas enfermedades producidas por protenas mal plegadas, ya sea por mutaciones u otras causas que afectan el plegamiento.
Volver al inicio
15)
ENFERMEDADES
CAUSADAS
POR
PROTENAS
MAL
PLEGADAS
TABLA 5 - 4
ENFERMEDAD FIBROSIS CSTICA PROTEINA AFECTADA Protena transmembrana que acta de canal inico
Fibrilina Receptor de Vasopresina o Canal de agua aquaporina Protena infecciosa o Prion Protena -Amiloide Protena Tau Protena anormal con largos trechos de Poliglutamina
SNDROME DE MARFAN DIABETES INSPIDA NEFROGNICA ENF. CREUTZFELDJACOB ENF. DE ALZHEIMER ENF. DE PARKINSON ENF. De HUNTINGTON
DEFECTO MOLECULAR Protena mal plegada POR ERROR GENTICO, que es retenida en el RER para ser degradada Protena mal plegada Protena mal plegada es retenida en el RER para ser degradada Forma agregados insolubles intra y extraneuronales Forma agregados fibrilares o placa amiloide entre las neuronas Agregacin de protenas en citoplasma neuronal dopaminrgico Ncleos neuronales y citoplasma
Algunos de los cambios que sufren las protenas las hacen an ms susceptibles a la degradacin, sin embargo esto no es una regla general y puede ocurrir todo lo contrario, es decir las protenas se hacen ms resistentes a la degradacin por aquellas enzimas proteolticas encargadas de degradarlas, como ocurre con la enfermedad de Alzheimer (Ver ms adelante). La enfermedad de Alzheimer o demencia senil es un desorden neurodegenarativo que destruye paulatinamente la capacidad de la persona para razonar, recordar e imaginar. Esta enfermedad afecta aproximadamente a una persona de cada diez sobre la edad de 65 aos y toma entre 3 y 18 aos en desarrollarse totalmente. Molecularmente se caracteriza por la presencia en el cerebro, de las llamadas placas o lminas seniles (placas amiloideas) en el espacio intercelular junto a enredos o agregados de fragmentos neurofibrilares de una cierta protena Tau (.), que transporta vesculas al interior de las neuronas y es parte del citoesqueleto. La protena responsable de formar estos agregados es un pptido de 4kD denominado Amiloide (-A4) por su estructura -plegada y tiene este nombre por su semblanza a la
137
reaccin del Almidn con el Yodo (Amiloide), que produce un material homogneo y esponjoso de color rosado que se dispone a manchones.
N O RM AL ALZHEIMER AG REG ADO S NEURO FIBRILARES
NEURO NAS
PLACAS AMILO IDEAS
Fig. 54 - 4. Neuronas normales comparadas a aquellas que sufren la enfermedad de Alzheimer, caracterizada por depsitos de protenas amiloideas y agregados neurofibrilares causados por la fosforilacin errnea de la protena Tau.
En este caso el material se encuentra formado por una glicoprotena que se deposita extracelularmente y se tie con rojo Congo, (Fig. 54-4). El material amiloide en general, es comn a los mielomas mltiples, donde se encuentran acumulaciones de las cadenas livianas de los anticuerpos provenientes de clonos de clulas plasmticas cancergenas. En los depsitos de protena Amiloide formando las placas seniles en cerebros de pacientes con Alzheimer y teidos con rojo Congo, se encuentran dos pptidos similares, uno de 40 aminocidos (A40) y otro de 42 aminocidos (A42), siendo de mayor carcter amiloidognico la forma A42 que sirve como centro de nucleacin para los sucesivos agregados que se forman. Por otro lado, la protena de la cual provienen estos pptidos, se deriva de una protena de membrana denominada Protena Precursora Amiloide (APP), cuya funcin es mediar tanto la adhesin celular como la accin de receptor o blanco, para aquellos factores que estimulan el crecimiento de las neuritas. APP (Fig. 55 4), es una glicoprotena transmembrana que tiene varias isoformas con 695, 751 y 770 aminocidos, adems posee varios azcares unidos al Nitrgeno y al Carbono con un peso molecular que vara entre 110 y 130 kD. Su dominio extracelular es de gran tamao y tiene en su lado Nt una regin de 200 aminocidos rica en Cistena, seguida por otra regin rica en residuos de aminocidos cidos (Glu y Asp). Esta ltima regin es a su vez seguida en direccin al extremo Ct, por una secuencia inhibidora de una proteasa en especial denominada proteasa de Kunitz ( proteasa con aminocido Asp en el sitio activo) y/o un dominio con homologa a la protena OX-2 (Glicoprotena de membrana que parece inhibir el estado de inflamacin en el cerebro).
138
La protena A4-Amiloide, es la secuencia del dominio que esta justo por encima de la membrana y que a la vez se encuentra parcialmente embebida en esta en direccin al extremo Ct.
PROTENA APP
A4
Zona rica en Cistenas Regin Acdica Ci
Regin inhibidora de Proteasas tipo Kunitz Regin similar a protena Ox2 Secuencia Amiloidea
BICAPA
Fig. 55 - 4. Diferentes regiones de la protena precursora amiloide con el fragmento A4. Proteasa Kunitz, es una dependiente de Ser en su sitio activo.
La sntesis de la PPA se lleva a cabo en el Retculo Endoplsmico Rugoso (RER) y luego es transportada al Aparato de Golgi (AG). En este lugar se cree que la protena chaperona denominada Presenilina (protena que atraviesa la membrana y que tiene 7 dominios transmembrana localizada dentro del RE y el AG) une la PPA a los microtbulos lo cual ayuda al trfico de la PPA hacia la membrana celular. Se ha logrado determinar que las mutaciones en las variantes de Presenilinas PS1 y PS2, junto a aquellas mutaciones en la APP, son capaces de influenciar por que va se produce la degradacin de esta protena, encausndola en direccin a la formacin de pptidos amiloideos que dan origen a la placa senil. Una vez en la superficie de la clula el PPA, despus de cumplir con su vida media, es internalizada y reciclada producindose varios cortes en ella mediante unas proteasas que se denominan como Secretasas y que son responsables de la formacin de los pptidos amiloideos A4. La forma como ocurren estos cortes pueden ser siguiendo dos tipos de vas de procesamiento, (Fig. 56-4). Una de ellas es la No Amiloidognica y consiste en cortes sucesivos por la - Secretasa (Znmetaloproteinasa) ubicada cerca de la membrana citoplasmtica, seguida de la Secretasa (podran ser las Presenilinas) dando origen a un fragmento PPA soluble y un fragmento de pequeo tamao p3, tambin soluble y que no genera agregados moleculares. Sin embargo, los cortes pueden seguir otra va del tipo Amiloidognica, donde cortes sucesivos por la -Secretasa (Aspartil proteasa) seguida de la -Secretasa (enzima influenciada por las mutaciones en PS1 y PS2) generan un gran fragmento PPA soluble y uno pequeo insoluble o A4 (A) constituido de A40 y/o A42. Este ltimo acta agrupndose entre s y precipita con sus similares para formar la placa amiloidea. A esta protena tambin se le llama A y constituyen una familia de polipptidos que van desde 39 a 43 aminocidos.
139
Procesamiento de la Protena Precursora Amiloide (PPA) PPA -secretasa 90% -A4 -secretasa 10%
P3 PPAs t P3 2 fragmentos en Va No Amiloidognica PPAs
-A4 -secretasa 10% -A4 o A 3 fragmentos en Va Amiloidognica
Fig. 56 4. Dos vas para el procesamiento de la PPA. La de la y Secretasa que producen el fragmento A4 y la va de la y - Secretasas que produce el fragmento A.
Uno de los factores que influencian la aparicin temprana (40 aos) de esta enfermedad son los niveles de la protena Apo E4 y HLA-A2 soluble. Las mutaciones en el gen de la PPA se han relacionado a un pequeo nmero de casos de Alzheimer, sin embargo mutaciones del gen de las APP en conjunto con el de las Senilinas resultan en una mayor produccin de fragmento A42 y formacin de placa. Por otro lado la formacin de agregados neurofibrilares que ocurre dentro de las neuronas parece ser gatillada por fosforilaciones anormales de la protena Tau, la cual se presenta con tres variables patolgica llamadas Tau 55, Tau 64 y Tau 69 de acuerdo a los kD de sus pesos moleculares. La fosforilacin anormal provoca la depolimerizacin de los microtbulos, la degeneracin neurofibrilar y la muerte neuronal. Otra hiptesis sobre esta enfermedad reconoce a la Protena Precursora de Alzheimer (PPA) como parte de un receptor NOTCH, constituido por una protena transmembrana de mayor tamao que es requerida como regulatoria del desarrollo celular (Fig. 57-4). Esta es una protena receptora de la superficie de la clula, que transmite seales desde el exterior al interior. Este receptor es sintetizado en el Retculo Endoplsmico Rugoso y viaja en una vescula que se ubica en la membrana citoplasmtica. Luego, cuando esta entra en contacto con otra clula vecina, la fraccin de la protena receptora que atraviesa la membrana sufre un corte y el fragmento viaja en otra vescula al ncleo de la clula para desencadenar una respuesta. Ahora, como se corta el pptido seal y porqu proteasas se lleva a cabo es an un misterio que parece tener algo en comn con las enzimas del tipo Secretasas y sus distintas vas, tales como la Amiloidognica y no Amiloidognica.
140
-SECRETASA VIA TIPO 1 Receptor NOTCH
VESICULAS
NUCLEO APARATO DE GOLGI
MEMB. CELULAR
PROTENA PRECURSORA SOLUBLE
RETICULO ENDOPLASMICO Y LOCALIZACIN DE LAS PRESENILINAS
-SECRETASA
ENDOSOMAS
-SECRETASA PLACA AMILOIDE Fig.- 57 4. Sntesis, transporte y procesamiento del receptor NOTCH que produce la PPA y subsecuente formacin del polipptido A que se agrega en la placa amiloide
Los resultados obtenidos por inmunizacin contra el fragmento A y los frmacos que inhiben las vas Amiloidognicas a nivel de las Secretasas, han tenido a nivel humano un cauto resultado debido a algunas complicaciones teraputicas.
Volver al inicio 16) CONCLUSIONES GENERALES SOBRE EL PLEGAMIENTO DE LAS PROTENAS BASADO EN LAS ENCEFALOPATAS ESPONGIFORMES. 1) Las protenas alcanzan rpidamente su conformacin nativa a expensas de adquirir otras conformaciones anmalas. 2) Una de las conformaciones anmalas es tambin patolgica y se conoce como la placa Amiloide 3) La placa Amiloide se encuentra constituida por agregados estructurales de la forma -plegada 4) La placa amiloide contiene fibras proteicas que se adhieren entre s
141
Agregado desordenado
Agregado desordenado
Ensamble anormal de Oligmeros como ocurre en Anemia Falsiforme y Cataratas
Fibra
Sntesis del polipptido
Forma intermedia Cadena desplegada con secuencia pro fibra amiloide en su centro
Forma nativa por ensamblaje biolgico
Especies Prefibrilares con centros de nucleacin Agregado desordenado Fragmentos degradados. La protena no aparecer en su sitio de accin (Marfan, Fibrosis cstica) Cristal de estructura ordenada
Fibrilla o Placa Amiloide

formado por una serie de hojas beta que se disponen perpendiculares al eje del filamento.
Fig. 54 4. La seccin que da origen a la fibra Amiloide se encuentra en la protena globular al centro de ella y no en el exterior, por lo tanto durante un plegamiento anmalo puede que se muestre a otra de sus similares en otra molcula arrastrando al conjunto a asociarse unas con otras para formar pequeos agregados o centro de nucleacin insolubles que se ensamblan en especies prefibrilares que posteriormente darn origen a fibras maduras o fibrilla amiloide insoluble
5) Al observar las estructuras de la placa amiloide se determin que eran las responsables de las Encefalopatas espongiformes. 6) Aquellas protenas que no se pliegan de la manera correcta no aparecen en su lugar de accin (son degradadas) y son capaces de provocar otras enfermedades 7) Entre estas ltimas tenemos a la Fibrosis Cstica (falta el regulador de la conductancia intermembrana o canal de cloro y el Sndrome de Marfan, donde falta la Fibrilina lo que deja a la Elastina sin un lugar de anclaje. Volver al inicio
142
17) PROTEOMICA.
Una de las ltimas iniciativas dentro del estudio de las protenas lo constituye la Protemica. Se pretende bajo esta palabra explicar el porqu los cerca de 30.000 genes que se expresan en un ser humano cuentan una contrapartida de cerca de 1.000.000 de protenas. El estudio de las siguientes etapas puede arrojar alguna luz sobre el tema: a) Registrar todas las secuencias humanas conocidas hasta ahora b) Registrar todas las protenas similares a las humanas, pero encontradas en animales, principalmente en animales de laboratorio como el ratn y la rata. c) Conocer todos los polimorfismos posibles de las protenas humanas a nivel de sus secuencias como son aquellos polimorfismos de un solo nucletido y los polimorfismos de un solo aminocido que aparecen en las protenas. d) Lo que es ms importante en una protena es saber todos los cambios post- traduccin que sufren, tales como eliminacin de secuencias seales, la presencia de secuencias de transito que indican a la protena a que organelo dirigirse o la existencia de prosecuencias que condicionan su eliminacin a la actividad de la protena. Saber en que condiciones se elimina la Metionina del lado Amino terminal de una protena y aquellas modificaciones qumicas, que sufren como son las metilaciones, adenilaciones, fosforilaciones, etc. Al mismo tiempo se debe conocer como se adicionan otras molculas complejas constituidas por Hidratos de Carbono o Lpidos para formar Glicoprotenas o Lipoprotenas. Por otro lado, ser tambin necesario aprender las modificaciones que resultan mediante la aparicin de enlaces cruzados entre subunidades de protena como son los puentes disulfuro, condensaciones aldlicas, bases de Shiff, etc. En general se conocen cerca de 100 modificaciones post-traduccin que pueden sufrir las protenas y cada da aparecen unas cuantas ms. Todo esto se complica an ms al considerar aquellos cambios post-transcripcionales que ocurren en los transcritos primarios del RNA de gran peso molecular. Este se corta y empalma de formas distintas combinando exones de distintas caractersticas. As como la Genmica buscaba estudiar la naturaleza de todos los genes se creo esta nueva ciencia con el fin de justificar la diferencia entre el nmero total de protenas y los genes correspondientes, as como la funcin de todas las protenas encontradas y por encontrar. Un organismo puede tener una composicin de genes constante, sin embargo genera distintas protenas segn su desarrollo o etapas de diferenciacin, por lo tanto la Protemica es bastante ms dinmica que la genmica. En general durante el ciclo de vida de un organismo existen muchas protenas que aparecen y desaparecen y deben ser estudiadas durante estas etapas para poder pesquisarlas. en la forma adecuada.
Volver al inicio
143
REFERENCIAS
Principles that Determine the Structure of Proteins. C. Chotia, Ann. Rev. Biochem. 53,537572, 1984. Cross-Linking in Collagen and Elastin, R.D. Eyre., M.A.Paz and P.M. Gallop Ann. Rev. Biochem. 53,717-748,1984. Estabilidad de las protenas, M. Cortijo, J.L. Lpez Lacomba, F.G. Blanco y J.M. RuizCabello., Investigacin y Ciencia, Diciembre 1991, 82-89 Le repliement des protines, T.E. Creighton, La Recherche Vol 230, 314-323, 1991.
144
Mdulos mviles en la evolucin de las protenas R. F. Doolittle and P. Bork., Investigacin y Ciencia, Diciembre, 22 - 29, 1993. Hemoglobinas vegetales M. Becana., Investigacin y Ciencia, Febrero 1995, 16-23. The Dynamics of Proteins. M. Karplus, y J.M. McCammon. , Sci. Amer. 254, 42-51, Molecular Chaperons R.J. Ellis and Van der Vies., Ann. Rew. Biochem., Vol 60, 321-347, 1991 The Ubiquitin System for Protein Degradation., A. Hershko and A. Crechanova., Ann. Rew. Biochem., 761-807,1992 Molecular chaperons in cellular protein folding., F. Ulrich Harti, Nature, Vol 381, 571-580, 1996 Nature Insight: Protein misfolding 884-905 Nature 18/25 December 2003
145
146
134
Hctor Rocha L. Las Enzimas y sus Propiedades
ENZIMAS 1) INTRODUCCION A LAS ENZIMAS 137 2)CARACTERISTICAS DE LAS REACCIONES QUE SE ENCUENTRAN BIOLOGICAMENTE CATALIZADAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO 139 3) CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES 144 4) MECANISMOS PARA DISMINUIR LA BARRERA DE ENERGIA 145 5) CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA 147 6) RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCION 154 7) EFECTO DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LA SOLUBILIDAD Y ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS 156 a) Efecto del pH 156 b) Efecto de la Temperatura 158 8) MECANISMOS ENZIMATICOS 159 9) CINETICA ENZIMATICA 161 10) INHIBICION COMPETITIVA 166 11) INHIBICION NO COMPETITIVA 169 12) INHIBICION ACOMPETITIVA 171 13) EMPLEO DE LAS ENZIMAS EN EL DIAGNOSTICO CLINICO 175 14) ENZIMAS ALOSTERICAS 178 15) COMPORTAMIENTO DE LA HEMOGLOBINA 179 16) EXPRESION DE HILL 181 17) MODULACION DE ENZIMAS ALOSTERICAS 185 18) PURIFICACION DE ENZIMAS 186
135
1) INTRODUCCION A LAS ENZIMAS.
136
Las enzimas son protenas que actan como catalizadores de las reacciones qumicas pertenecientes al metabolismo intermediario. Para ello cuentan con una o varias estructuras del tipo terciario, que mantienen el despliegue de uno o ms sitios activos. El sustrato a su vez, debe aproximarse a la enzima en una posicin espacial complementaria al sitio activo, para que mediante el contacto con este en al menos tres puntos sea reconocida su isomera. Posteriormente, una vez aceptado el sustrato este es modificado qumicamente por los residuos catalticos del sitio activo y transformado en producto. Este ltimo abandona el sitio activo. Entre las enzimas, en su mayora de naturaleza proteica se encuentran algunas excepciones como aquellas denominadas por el nombre de Ribozimas. Estas son molculas de RNA, conocido heteropolmero lineal que acta generalmente como portador de informacin. A pesar de ello se le ha encontrado una nueva facultad, al ser posible su plegamiento en una estructura tridimensional, capaz de catalizar la unin o polimerizacin de varios otros nucletidos. El mecanismo de las reacciones enzimticas se puede explicar en parte, al compararlo con aqul que ocurre en las reacciones qumicas ms simples. En ellas la velocidad de reaccin puede ser aumentada con la temperatura. Esta ltima, incrementa el movimiento, la vibracin o la energa cintica de las molculas de sustrato. Se aumenta el nmero de choques entre ellas y en este estado, son capaces de superar la barrera de energa produciendo las interacciones necesarias consistentes en formar nuevos enlaces o romper los antiguos para formar producto (Fig. 1a - 4). A diferencia de la temperatura, un catalizador biolgico no aumenta la excitacin de las molculas de sustrato, sino que se limita a reducir la barrera de energa. De esta forma a una misma temperatura, una fraccin mayor de molculas de sustrato logra pasar por el estado de transicin y se transforma en producto (Fig. 1b - 4). El incremento de la energa cintica inducido por la temperatura provocara en este caso, tanto la agitacin del sustrato como de la enzima, dificultando la interaccin entre ambos. Se hara ms difcil la formacin de un complejo enzima-sustrato entre ambos, aunque a una determinada temperatura denominada temperatura ptima, se favorezca cinticamente la conformacin de la enzima para lograr el encuentro con el sustrato. Al analizar lo que ocurre en el estado de transicin, se puede decir que este depender de la concentracin del intermediario de transicin X* (Fig. 1b - 4). Este ser capaz de pasar por la barrera de energa. Este compuesto es el ms inestable de todos entre sustratos y productos. La diferencia de energa entre el sustrato S y este intermediario inestable X*, formado en el complejo enzima-sustrato, constituye la energa del estado de transicin. Mientras ms alta la barrera de energa para el estado de transicin ms lenta ser la reaccin. Para entender este planteamiento, se puede hacer una aproximacin considerando que la reaccin entre sustrato S e intermediario X* es inestable o reversible. La constante de equilibrio de esta reaccin, debe estar dada por la ecuacin: K*= X* / S y al proceder a despejar X* tendremos que X* = K* S. Por otro lado, debemos asumir que la formacin del producto P depender de la velocidad con que se descompone el intermediario inestable X* o v = k X* y desde aqu sustituyendo en X* tenemos que finalmente v = k K* S (1). Por otro lado, al aplicar la antigua relacin termodinmica entre G* y la K* de equilibrio de esta reaccin parcial, tenemos que: G* es igual a - RT Ln K*. Lo que al reordenar con el exponente del logaritmo de base e y sustituir en la ecuacin (1), nos entrega la siguiente ecuacin de velocidad de reaccin:
137

- G* / RT
v = k (e
)S
De esta ecuacin se deduce que las enzimas, aumentan la velocidad de una reaccin si disminuyen G*. Adems, si la reaccin no se dirige nuevamente hacia el sustrato y se estabiliza en el complejo, la energa del estado de transicin disminuye. Por ello, la energa eliminada al unirse el sustrato a la enzima se puede emplear para aumentar la velocidad de reaccin. Esta aproximacin energtica permite explicar que el aumento de la velocidad de reaccin no se relaciona con el otro componente, denominado G(reaccin). = G(sustratos) G(productos) = - RT Ln Keq(reaccin) (Fig. 1b 4). Este depende de la reaccin misma, es decir de la energa entre sustratos y productos por separado y no unidos a la enzima.
a ) Sin Enzima
BARRERA DE ENERGIA
b ) Reaccin con enzima

Energa G* del estado de transicin E N E R G I A
Reaccin no catalizada
X*:intermedia
rio inestable
N DE M O L E C U L A S
T1
T2
T2 > T1 temperatura
G* S
X*
Reaccin catalizada
G(S) :
Energa del Sustrato S
G(P) :
Energia del Producto P
BAJA
ALTA
ENERGIA ENERGIA
ENERGIA
COORDENADA DE REACCIN
Los niveles de energa del sustrato G(S) y del producto G(P) se mantienen igual con o sin enzima
Fraccin de molculas que pueden reaccionar a mayor temperatura
G reaccin = G(S) - G(P) G reaccin = - RT Ln Keq reaccin exergnica
Fig. 1a - 4. Aumento de la velocidad de reaccin por la Temperatura. Fig. 1b - 4. Aumento de la velocidad de reaccin por disminucin de la barrera de energa a temperatura constante .
Se observa un poco de confusin cuando se emplea la misma ecuacin G= RTLn Keq para explicar tanto la barrera de energa como la naturaleza de la reaccin misma. Esta puede ser exergnica o endergnica, basndose en la energa que poseen sustratos y productos. En general, las Enzimas no hacen posible las reacciones qumicas. Tampoco convierten reacciones que toman energa en otras que liberan energa. Las enzimas no cambian los niveles energticos de las molculas de sustrato o producto. Las Enzimas solo se limitan a bajar la barrera de energa para aumentar la velocidad de reaccin en uno u otro sentido, que ha sido determinado previamente por la energa que poseen sustratos y productos. En sntesis, las enzimas
138
no cambian la constante de equilibrio de una reaccin qumica. Esta llega al equilibrio en un ao sin la enzima o en un milisegundo con la enzima, pero siempre alcanzan la misma proporcin entre sustratos y productos. Volver inicio 2) CARACTERISTICAS DE LAS REACCIONES QUE SE ENCUENTRAN BIOLOGICAMENTE CATALIZADAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO. al
Algunos de las expresiones anteriores se detallan a continuacin al caracterizar algunas de las reacciones enzimticas pertenecientes al metabolismo intermediario: a) LA ENZIMA NO CAMBIA LA Keq DE UNA REACCION: Una reaccin qumica no enzimtica puede proceder hasta alcanzar el equilibrio sea este > 1, igual a 1 o < de 1. Esto no significa, que el equilibrio es necesariamente 50 % de Producto (P) y 50% de Sustrato (S), sino que puede ser 10% (S) / 90% (P), 30% (S) / 70% (P) u 80% (S) / 20% (P), etc. Es decir, cualquiera proporcin final entre sustrato S y producto P, despus que estos han tomado o liberado energa del medio. La constante de equilibrio de una reaccin no se altera por la presencia de un catalizador. La reaccin en presencia de la enzima debe alcanzar el mismo equilibrio, pero en mucho menos tiempo. Por ejemplo en una reaccin qumica: Concentracin de Sustrato [S] y Producto [P] Tiempo de la reaccin: t0 inicio " " " " tx trmino [S] -------------> [P] 100 mM 0 mM 80 20 60 40 40 60 20 mM 80 mM
Se puede partir de 100 mM de sustrato [S] y 0 mM de producto [P] o viceversa y se llega siempre a la misma constante de equilibrio: Keq = 4, ya sea con o sin enzima. La reaccin en este ltimo caso se har mucho ms rpida, ya que solo aumenta la velocidad con que se llega al equilibrio.
b) LA ENZIMA NO CAMBIA LA ENERGIA DE FORMACION DEL SUSTRATO NI DEL PRODUCTO: Cuando el contenido energtico del sustrato es superior al del producto (Fig. 2a - 4), la reaccin procede hacia el equilibrio qumico con o sin enzima. La nica diferencia como se
139
dijo anteriormente, ser el tiempo que le tome alcanzar el equilibrio qumico. Este es mucho menor en presencia de un biocatalizador. Cuando el contenido energtico del sustrato es menor que el del producto (Fig. 2b - 4), la reaccin no ocurre con enzima o sin enzima. No importa si se le agrega ms enzima a esta reaccin, nunca ser posible a menos que otra fuente externa entregue la energa que le falta al sustrato para proceder a transformarse en producto. En este ltimo caso se demorar ms sin enzima que con enzima.
a)
REACCIONES INDIVIDUALES Proceso exergnico Reaccin Posible
E n e r g a E n e r g a
Representacin Grfica de las Reacciones K eq > 1
4
Coordenada de Reaccin
b)
3
c)
Proceso endergnico Reaccin Imposible
K eq < 1 3
REACCION ACOPLADA Exergnica Endergnica E n e r g a
EXERGONICA
SUMA ALGEBRAICA DE AMBAS ENERGIAS
+ +
Existe un intermediario en comn para ambas reacciones
ENDERGONICA
Fig. 2a - 4. Reaccin que libera energa. Fig. 2b - 4. Reaccin que necesita energa del medio. Fig. 2c - 4. Reaccin acoplada.
c) EL APORTE DE SUSTRATO Y REMOCION DE PRODUCTO IMPULSA A LAS REACCIONES TANTO ENZIMATICAS COMO NO ENZIMATICAS:
140
Si la reaccin que ocurre de S a P es reversible, ya que cuenta con una Keq cercana a 1. El desplazamiento de la reaccin de izquierda a derecha se ver facilitado por el aporte de sustrato S, desde el precursor R y la remocin del producto P, a medida que este se transforme en Q. E R ----------> S <-----> P ------> Q Este efecto ocurrir en presencia o en ausencia de la enzima E y si el producto P se acumula por no pasar a Q, la reaccin se desplazar en reversa de P hacia S. De esta manera es posible explicar aquellas vas metablicas que son reversibles. Degradan sustratos de reserva en ayunas y lo reponen o sintetizan despus que el individuo se ha alimentado. La enzima no hace posible la reaccin en ambos sentidos, solo aumenta la velocidad en que ocurre. d) EL ACOPLAMIENTO CON OTRA REACCION QUE LIBERA ENERGIA Y PRESENTA UN SUSTRATO EN COMUN, IMPULSA A LAS REACCIONES ENZIMATICAS Y NO ENZIMATICAS. Aquellas reacciones endergnicas que necesitan energa para proceder de izquierda a derecha (fig. 2c - 5), sern capaces de proceder en ese sentido solo cuando estn acopladas con una reaccin exergnica, cuyo producto sea uno de los sustratos de la reaccin endergnica. Este fenmeno de acoplamiento tambin ocurrir con o sin enzima en la reaccin. e) LAS REACCIONES QUE LIBERAN DEMASIADA ENERGIA EN UN SOLO SENTIDO NECESITARAN DE VARIOS PASOS ENZIMATICOS PARA INVERTIR LA REACCION EN EL SENTIDO OPUESTO. Cuando una reaccin es demasiado exergnica en un sentido, ya no es reversible y puede emplear varias etapas catalizadas por otras enzimas para ganar en energa e invertir esta reaccin La reaccin principal catalizada por la enzima E s (fig. 3 4), es muy exergnica y requiere de tres reacciones, ms la energa de un ATP para volver a su estado inicial. Por otro lado en aquellas reacciones que no son demasiado exergnicas, encontramos a la misma enzima catalizando la reaccin inversa, dependiendo de los niveles de sustrato y producto que se acumulen en uno u otro sentido.
E a
E s
E p
A
E 3
P
E 1
R
ADP + P E 2 ATP
Fig. 3 4. Se requiere de 4 reacciones y ATP para remontar esta reaccin.
141
f) LA ENZIMA PROPORCIONA AL SUSTRATO TODOS LOS EFECTOS CATALTICOS INDIVIDUALES QUE PUEDEN OCURRIR EN SOLUCIN, CON LA DIFERENCIA QUE LO LLEVA A CABO AL MISMO TIEMPO Y EN EL MISMO LUGAR.
HIDROLISIS DE UN ESTER COMO EJEMPLO DE CATALISIS ENZIMATICA
a)
R1 C
O O CH 2 R2
+ HOH AGUA
R1
+ O H
O C
H O CH 2 R2
E N E R G I A
Reaccin normal sin catlisis
[ H+]
b)
R1 C
R1 O O CH 2 R2 CATLISIS CIDA [O H ] CATLISIS BSICA R1
O H
H O CH 2 R2
COORDENADA DE REACCIN
O C
c)
Residuo Cataltico C O O H+ CH 2
R1
+ C
-
O O
R2 O CH 2 O H SITIO ACTIVO DE UNA ENZIMA ( ESTERASA ) La catlisis ocurre por la presencia de dos residuos del sitio activo de la enzima que se encuentran + posicionados para entregar H y OH al mismo tiempo O R2 R1 C
Reaccin con catlisis qumica BAJA LA BARRERA POR CATLISIS CIDA O BSICA
OH + NH3 Residuo Cataltico
O H
H O CH 2 R2
Fig. 4a - 4. El ster se hidroliza solo con agua. Fig. 4b - 4. Hidrlisis por catlisis cida o bsica. Fig. 4c - 4. Hidrlisis enzimtica. Baja la energa del estado de transicin.
Al observar la figura 4 - 4 y comparar los casos a), b) y c), encontramos que la hidrlisis del ster a) aumenta de velocidad en ambos casos, ya sea por la catlisis cida o la bsica b), mientras que durante la catlisis enzimtica c), el sitio activo aporta un residuo de aminocido que acta entregando un protn, como ocurre en la catlisis cida y a la vez otro residuo de aminocido remueve un protn del agua para dejar libre un hidroxilo en el lugar adecuado, es decir como ocurre durante la catlisis bsica. Por lo tanto ambas catlisis son aplicadas aqu simultneamente y producirn un desmesurado incremento en la velocidad de reaccin. g) Todas las reacciones biolgicas conocidas hasta ahora pueden ser catalizadas por las siguientes enzimas: 1) OXIDOREDUCTASAS :Actan donando o removiendo tomos de Hidrgeno sobre grupos qumicos A -1 + B -----------------A + B -1
142
2) TRANSFERASAS: Transfieren grupos funcionales entre molculas aceptoras o donadoras. AB + C -------------------A + B-C
3) HIDROLASAS: Donan agua a un enlace hidrolizndolo A-B + H2O ------------------------- A - H + B-H
4) LIASAS: Agregan agua, amonio, o dixido de carbono a los dobles enlaces o extraen estos mismos compuestos dejando dobles enlaces X Y I I A - B ------------------------------
A=B
X-Y
5) ISOMERASAS: Cambian grupos qumicos de la Configuracin L a la D o bien cambian grupos de su posicin en una molcula X Y Y X I I I I A - B ------------------------------ A - B 6) LIGASAS: Catalizan reacciones de unin o ligacin entre uno y otro grupo qumico empleando la energa del ATP. A + B -----------------------------A - B
Volver inicio 3) CONSIDERACIONES ESTRUCTURALES.
al
Importancia de la estructura tridimensional de la enzima: a) Todas las enzimas enfrentan al sustrato en el sitio activo desde al menos tres puntos en el espacio al mismo tiempo. De esta manera la enzima, puede distinguir la configuracin L o D del sustrato. (Fig. 5 - 4) . Este efecto primario de posicionamiento del sustrato y su posterior catlisis en el sitio activo, hace necesaria una cadena polipeptdica lo suficientemente larga. Solo de esta manera contar la enzima con los pliegues espaciales suficientes, para formar una estructura terciaria adecuada que le permita entrar en contacto con al menos tres residuos catalticos en las coordenadas espaciales X, Y, Z para interactuar con el sustrato (Fig. 5 - 4).
143
U
SUBSTRATO
C X x Y y
SITIO ACTIVO
Z z
Fig. 5 - 4. Los tres puntos de unin por parte del sitio activo permiten a la enzima distinguir la quiralidad del substrato.
En el caso contrario, si los tres aminocidos catalticos estuvieran, unidos por enlace peptdico uno a continuacin del otro. No se lograra la posicin tridimensional adecuada durante la etapa de reconocimiento junto al posicionamiento adecuado del sustrato. De esta manera unos pocos aminocidos unidos covalentemente o tan solo una estructura secundaria del tipo secundaria o fibrilar no son suficientes para lograr la conformacin espacial necesaria. A consecuencias de los requerimientos espaciales anteriores, al enfrentar al sustrato la estructura primaria de una protena debe tener un largo mnimo para alcanzar a plegarse y enfrentar en tres dimensiones al sustrato. De esta manera, el sitio activo contar con la disposicin espacial adecuada entregando afinidad y especificidad durante la catlisis. Como es lgico suponer, el andamiaje de la enzima no es rgido y es capaz de sufrir ajustes y desajustes, para as controlar la afinidad por el sustrato y por ende la actividad qumica con que se lleva a cabo la reaccin. b) Otro factor que depende del tamao de la estructura terciaria de una enzima radica en la posibilidad de que el sustrato se contacte al azar con la enzima en lugares ajenos al sitio activo. Sin embargo, es posible que desde estos lugares el sustrato sea orientado y guiado hacia el sitio activo por medio de interacciones dbiles. Estas ltimas se encuentran ubicadas en la superficie de la enzima. La estructura enzimtica actuara como un embudo virtual canalizando las molculas de sustrato hacia el sitio activo. c) Los aminocidos de la superficie de la enzima son adems capaces de ayudar a ubicar a la enzima en la clula y se emplean tambin durante la interaccin y reconocimiento con otras enzimas u otras estructuras. d) El tamao promedio de las protenas individuales en E.Coli (Procarionte) es de 25 kD mientras que en la lnea de clulas HeLa (clulas de una lnea cancergena que se cultivan in vitro) es de 31,7 kD. Las protenas pequeas < 20 kD en Eucariontes son
144
hormonas o proteasas extracelulares y las grandes > 80 kD son generalmente protenas estructurales o enzimas multifuncionales. Aquellas enzimas que cuentan con varias subunidades, son generalmente regulatorias del metabolismo intermediario y requieren de un complejo ajuste entre las subunidades del tipo regulatorio y las del tipo cataltico e) Uno de los factores que rige el tamao de las enzimas con varias subunidades, es el rea mnima de interaccin con otra subunidad. Esta rea alcanza a los 1000 A2 (A= Angstrom) cuando se trata de una interaccin inica dbil en la superficie de una protena esfrica . Por otro lado, en el caso de protenas con PM 10 kD, el rea alcanza a los 1500 A2, lo que es an poco. Sin embargo, en una enzima regulatoria el rea no es lo suficiente para transmitir cambios conformacionales de una estructura proteica individual a otra y debe extender su cadena polipeptdica hasta al menos los 50kD obteniendo con ello una superficie de 7500 A2. Esta superficie sera el mnimo necesario para mantener las interacciones incluyendo una coordinacin de las actividades con aquellas otras subunidades adyacentes en el caso de una enzima multimrica (varias subunidades). Otro factor a considerar consiste en que a mayor tamao de la subunidad enzimtica se incrementa la masa respecto a la superficie. Este factor puede limitar el tamao y peso de cada subunidad en una enzima multimrica del tipo regulatorio. Volver inicio 4) MECANISMOS EMPLEADOS POR LAS ENZIMAS PARA DISMINUIR LA BARRERA DE ENERGIA. Como en los sistemas biolgicos no se puede aumentar la presin o la temperatura para catalizar una reaccin, se recurre a bajar la barrera de energa mediante los siguientes mecanismos: Primero, las reacciones ocurren en espacios confinados donde el choque entre las molculas de sustrato y enzima es ms probable. A menor volumen mayor es la concentracin. Segundo, existen muchas copias de una enzima para aumentar la posibilidad de un encuentro con el sustrato. En algunos casos las enzimas se encuentran particuladas, formando parte de membranas. Estas ltimas actan como un embudo canalizador de sustrato, mientras que otras enzimas pertenecen a un complejo multimolecular, donde el producto de una reaccin pasa fcilmente a la enzima siguiente y as sucesivamente. Todos estos mecanismos estn destinados a facilitar la interaccin. Tercero, los residuos de la enzima permiten la orientacin adecuada del sustrato para encajar en los residuos catalticos del sitio activo. Este efecto se conoce como Proximidad y Orientacin. Cuarto, la cercana del sustrato a la enzima puede provocar un cambio conformacional en el sitio activo o bien en el sustrato mismo, para aumentar la superficie de interaccin entre ambos. Quinto, el sitio activo es relativamente hidrofbico lo cual impide que el agua se interponga entre las cargas del sustrato y la enzima. Mientras que otras enzimas con sustratos hidrofbicos emplean la contribucin del agua para atraerlo hacia este. Sexto, la catlisis por los residuos del sitio activo puede ser cida General, donde los residuos de aminocidos cidos como Glutmico y Asprtico entregan protones o Bsica General, donde los residuos de aminocidos bsicos como Lisina e Histidina toman protones del agua dejando iones hidroxilos. al
145
Sptimo, la catlisis por los residuos de aminocidos puede ser Electroflica, donde un metal (Me+2) complejado a la enzima atrapa electrones o Neutroflica, en que los residuos con grupos (-OH, -SH, -NH2) entregan electrones al sustrato. En la actualidad an no se conocen o comprenden bien, todos los mecanismos existentes por los cuales una enzima disminuye la barrera de energa o aquella energa necesaria para alcanzar el estado de transicin.
Volver inicio
al
5) CONTROL DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA. Las enzimas pueden regular su actividad para coordinar el metabolismo sin que existan normalmente acumulaciones de sustratos o productos entre las etapas de sntesis y degradacin. La regulacin de la actividad enzimtica es llevada a cabo por algunos de los mecanismos ilustrados en la Figura 6 - 4: a) Aporte de sustrato y remocin de producto ( Fig. 6a 4). Este tipo de regulacin es el ms comn y se pueden encontrar varios ejemplos a lo largo de cualquiera va metablica. Las reacciones son generalmente reversibles y cuando el flujo de izquierda a derecha se ve alterado por acumulacin del intermediario X, la reaccin se invierte de P a S:
146
E1 E2 E3 A<------>S<------>P<------> [ X ] En este tipo de enzimas, al graficar Velocidad de reaccin versus concentracin de sustrato se observa una curva cintica del tipo Hiperblico, la que ser analizada ms adelante.
b) Retroalimentacin positiva y negativa en enzimas alostricas ( Fig. 6b 4). Las enzimas alostricas, son aquellas que poseen un sitio extra distinto al sito activo y que se denomina sitio alostrico. En este lugar ubicado en la superficie de la enzima, se pueden unir sin sufrir transformacin qumica tanto el sustrato como el producto de la reaccin, as como cualquiera otro intermediario de la va metablica a la cual pertenece la enzima. En este sitio alostrico la unin de la molcula mediante interacciones dbiles, provoca cambios conformacionales que son transmitidos por la estructura y a su vez afectan ajustando o desajustando la posicin espacial de los residuos del sitio activo o su actividad qumica. Es decir, se modifica la actividad cataltica sobre el sustrato.
a) Esta Enzima puede catalizar una reaccin reversible SITIO ACTIVO ENZIMA SUSTRATO SITIO ACTIVO d) A mayor nmero de copias mayor posibilidad de encontrarse con el sustrato c) Enzima modificada covalentemente por la unin de un grupo y que como resultado puede ser activada o inhibida
SITIO MODIFICADO COVALENTEMENTE
ENZIMA
MODIFICADOR QUE SE UNE DE FORMA COVALENTE
b) Enzima presente al inicio de una va metablica ENZIMA
SITIO ACTIVO
S S
SITIO ALOSTERICO
SUSTRATO
Fig. 6a 4. Aporte de sustrato y remocin de producto Fig. 6b 4. Enzima regulada por sitio alostrico Fig. 6c 4. Enzima regulada por modificacin covalente Fig. 6d 4. Enzima regulada por el nmero de copias
Las molculas de sustrato o producto que se unen al sitio alostrico se denominan moduladores. Por lo tanto un modulador es considerado positivo cuando aumenta la actividad de la enzima en el sitio activo. Con ello se incrementa la velocidad con que es
147
transformado el sustrato en producto. En algunos casos la primera enzima de una va metablica es la modulada positivamente, por su mismo sustrato e inhibida o modulada negativamente por el producto final de la va metablica (fig.7 4). De esta manera es posible mantener la concentracin constante de los intermediarios, como se observa en el ejemplo al pi de la pgina. Las enzimas no regulables que se encuentran en el medio de esta va funcionan solo por aporte de sustrato y remocin de producto. En estas enzimas ocurre que si el producto tiene mayor concentracin, catalizan la reaccin inversa de producto a sustrato y por eso es
E4 E1 E2 E3
P Q
D
E5
Fig 7 4. Retroalimentacin negativa y activacin necesario mantener el control del gradiente con el sustrato inicial o bien el producto al final de la va. La enzima final de una va metablica es tambin susceptible de regulacin especialmente cuando el producto final sufre una bifurcacin hacia dos o ms vas distintas. Las enzimas regulatorias cuentan con varias subunidades y algunas pueden ser del tipo cataltica al contener el sitio activo y otras del tipo regulatorio, al contener el sitio alostrico. La cintica de las enzimas alostricas es del estilo Sigmoideo, ya que al graficar 1/Velocidad vs 1/Concentracin (dobles recprocos) no producen una recta, pero s una curva. Esta cintica se explica tanto por los modelos de tipo simtrico como los de conformacin inducida que sern vistos ms adelante. c) Enzimas modificadas covalentemente (Fig. 6c 4). La primera enzima al inicio de una va metablica, puede ser la reguladora de la degradacin de un polmero complejo que se emplea como almacenador de energa. Este puede ser Glicgeno o un depsito de Tracilgliceroles. La enzima encargada de la degradacin debe responder a seales externas a la clula o bien a seales provenientes del metabolismo interno de la clula. As puede aumentar o disminuir su actividad segn sea la necesidad de energa. Por ejemplo, la descarga de epinefrina en la sangre a causa de un estmulo repentino, produce un cambio metablico en la clula sin entrar en ella. Esto se logra mediante una cadena de reacciones desde un receptor celular donde se une la epinefrina, hasta la modificacin covalente de la enzima que regula la degradacin del Glicgeno.
148
El mecanismo ocurre al ser gatillado por la epinefrina que acta sobre un receptor ubicado en la superficie de un miocito. Este ltimo mediante un cambio conformacional activa a un transductor conocido como Protena G. Esta protena navega por la cara interna de la bicapa para entrar en contacto con la enzima Adenil Ciclasa. Esta ltima al ser activada, produce AMP cclico a partir de ATP. Esta molcula conocida como segundo mensajero (AMPc) acta a su vez sobre una enzima denominada Protena Quinasa, que es capaz de fosforilar, activando o inhibiendo a una enzima efectora. De esta manera se regula y amplifica la degradacin de la macromolcula Glicgeno. Bajo este mecanismo se liberan unidades de Glucosa fosforilada, que posteriormente donarn su energa formando el ATP necesario para la contraccin muscular. En este caso fuera de hacer posible esta va por activacin, mediante la modificacin covalente, se procede tambin a amplificar en cascada para liberar muchas molculas de Glucosa desde el Glicgeno a partir de una sola molcula de Epinefrina.
d) Enzimas que regulan su nmero de copias (Fig. 6d 4). Los mecanismos vistos anteriormente tenan respuestas que duraban solo milisegundos, en este nuevo mecanismo que afecta al nmero de copias, la respuesta es en horas.
149
E4
E1
E2
E3
P Q
E1
D
E5 E1 E1
RNA pol
Receptor Inhibidor
PROMOTOR
A +
] A
GEN E1
Fig. 8- 4. Induccin o represin de la expresin de un gen en una enzima
Este caso se puede ilustrar con la administracin de una dieta pobre en un determinado sustrato A. Como consecuencias de ello los niveles de las enzimas que procesan al sustrato A disminuyen, por la falta de expresin de uno o ms genes que codifican a las enzimas necesarias para esta va metablica. Este efecto ocurre debido a la presencia de una protena receptora del sustrato A, ubicada en el ncleo como se puede observar en el ejemplo (Fig. 8 - 4). Cuando este receptor especfico del sustrato A, se encuentra por si solo ejerce un efecto inhibitorio de la expresin del gen. Para ello, desencadena un mecanismo en que se bloquea la unin de la RNA pol a la regin promotora e impide la transcripcin del gen. Por otro lado, al producirse una acumulacin de A, la protena receptora se une al sustrato A y ahora no puede unirse al sitio del promotor compitiendo con la RNA pol. De esta manera se produce la transcripcin del gen y un aumento del nmero de copias de la enzima que procesa a este sustrato. La protena que interacciona con el sustrato A puede ser un factor de transcripcin que interviene en la preparacin de la doble hebra de DNA para la unin de la RNA pol. e) Zimgenos o enzimas que se activan al eliminar parte de su secuencia (Fig. 9 4). Algunas enzimas se activan al eliminar parte de su secuencia y este mecanismo se puede ilustrar ampliamente al observar la accin de las enzimas digestivas tanto en el estmago como en el intestino.
150
Para empezar tenemos que la hormona Gastrina estimula, no solo la salida del HCl desde las clulas parietales en el estmago, sino que tambin la salida de Pepsingeno formado por una cadena polipeptdica de 40kD. Este Zimgeno o proenzima, al ser escindido en un polipptido de 42 aminocidos desde su regin Amino terminal, se activa y pasa a llamarse ahora Pepsina de 33kD. La pepsina hidroliza enlaces peptdicos en las protenas de la dieta donde el aminocido del lado amino terminal es Phe, Tyr o Trp.
Activacin de un ZIMOGENO
-S S-S S245
Quimotripsingeno
S-S -S S-
-S
1 15
S-
Arg
Ile
S-S
Ser - Arg 14 15 y
16 1
-S
S-
245
Quimotripsina activa
-S
S-
Thr - Asn 147 148
-S
1 13
S16
146
-S
S-
149
245
Leu
Ile
Tyr
S-S
Ala
-S S-
Quimotripsina activa
Los polipptidos que forman la enzima activa quedan unidos por puentes disulfuro
Fig. 9 - 4. La Quimotripsina se desprende de dos dipptidos para alcanzar su conformacin activa.
Posteriormente, al pasar el contenido al Duodeno, se neutraliza por la secrecin de bicarbonato desde el pncreas, que ha sido estimulado por la hormona secretina. Esta se encuentra en la sangre y es liberada por el bajo pH proveniente del estmago. Por otra parte, la presencia del contenido estomacal en el duodeno estimula tambin la secrecin de Colecistokinina. Esta hormona, a su vez estimula la secrecin pancretica de Tripsingeno, Quimotripsingeno y Procarboxipeptidasa desde el Pncreas, junto a una secrecin de carcter alcalino, ya que posee Bicarbonato. El Tripsingeno es convertido luego a Tripsina por la Enteropeptidasa de las clulas intestinales (Fig. 9 4). En el caso de la Tripsina, se produce la hidrlisis de pptidos de la dieta cuando los aminocidos del lado Ct (carboxi terminal) son Lys y Arg. El paso de Quimotripsingeno a Quimotripsina y de Procarboxipeptidasa a Carboxipeptidasa es tambin catalizado por la Tripsina. La Quimotripsina a su vez hidroliza enlaces peptdicos cuando el lado Ct de estos, presenta alguno de los aminocidos como son Phe, Tyr o Trp. La Carboxipeptidasa por su lado remueve sucesivamente residuos en el extremo Ct de polipptidos cortos. El mecanismo implicado en los Zimgenos o proenzimas evita la autodestruccin del pncreas durante la sntesis de estas enzimas. De esa manera las enzimas digestivas se hacen activas tan solo en el lugar adecuado que incluye el lumen intestinal y frente a los polipptidos de la dieta.
151
f) Aquellas enzimas que catalizan la misma reaccin, pero con distinta afinidad y velocidad son conocidas por el nombre de Isoenzimas y/o Aloenzimas. Estas enzimas tienen distinta estructura molecular lo que se traduce en una distinta Kaf (afinidad) y Vmx (saturacin). Ambas son las constantes que definen a las enzimas (Fig. 10a 4). En este caso se observa como el metabolismo se adapta a los distintos niveles de sustrato, ya que existirn isoenzimas adaptadas para los perodos de ayuno o de baja concentracin de sustrato. Para ello presentan una alta afinidad, mientras que otras enzimas presentan una baja afinidad para los perodos de exceso de sustrato. Una de las isoenzimas ms conocidas es Lactato Deshidrogenasa, que cataliza el paso de Piruvato a Lactato y que se encuentra presente en grandes cantidades en el msculo esqueltico. Posee 4 subunidades H (Heart), tpicas del corazn y 4 subunidades M (Muscle), tpicas del msculo esqueltico. En el resto del organismo hay combinaciones de H y M como son H3M, H2M2, HM3 ms las originales H4 y M4. El PM aproximado de cada subunidad es de 33,5kD. Los diferentes parmetros de afinidad (Kaf) y grado de saturacin (Vmx) conque se cataliza el paso de piruvato a lactato, se ajustan a las particularidades aerbicas o anaerbicas de cada tejido. Estas isoenzimas aparecen en la sangre en el caso de lesiones musculares. Otra enzima ampliamente conocida es la Creatina Kinasa, que cataliza la formacin de ATP a partir de Creatina-Fosfato. Constituye el medio ms rpido de obtener energa durante la contraccin muscular, an antes de entrar a funcionar el metabolismo anaerbico seguido posteriormente por el aerbico. Esta isoenzima posee subunidades M y B junto a combinaciones de M2, MB, B2.
ISOENZIMAS CON DISTINTA Vmx y Km E1 K m = 10 mM V m = 1 mmol/min a) K m = 1 mM E2 V m = 10 mmol/min Enzimas del complejo multienzimtico
E3 S
K m = 10 mM V m = 10 mmol/min
P
AT
EC
AT MT EC PTA KR DH ER TE
: : : : : : : :
Acetil Transferasa Malonil Transferasa Enz. Condensante Prot. Transport. de Acilo Cetoacil reductasa Deshidrogenasa Enoil reductasa Tio esterasa
MT
DH
E RKR PTA SH
CYS
TE
b)
CYS
HS HS TE
PTAKR
SH
ER
DH
MT
EC
AT
ACIDO GRASO SINTASA
Fig. 10a - 4.De las tres isoenzimas habr mayor formacin de producto en E2 que tiene menor Km o mayor afinidad y a su vez mayor velocidad. E1 y E2 catalizarn solo con mayor concentracin de sustrato. Fig. 10b 4. Complejo de la cido Graso Sintasa
152
Las Aloenzimas se caracterizan por catalizar la misma reaccin, pero con distinta velocidad o afinidad y provienen de alelos distintos por ejemplo uno paterno y otro materno. Pueden variar su afinidad y nivel de saturacin con el sustrato. g) Complejos Multienzimticos. Existen varios complejos multienzimticos como el de la Piruvato Deshidrogenasa, la AlfaCetoglutarato Deshidrogenasa y la cido Graso Sintasa (Fig. 10b - 4). Los dos primeros emplean un cido graso de 8 carbones conocido como c. Lipoico que posee dos grupos SH y sirve para trasladar al sustrato de una enzima a otra en el complejo. El complejo de la cido Graso Sintasa emplea con este mismo fin una coenzima de cerca de 77 aminocidos conocida como Protena Transportadora de Acilos que posee tan solo un grupo SH en su extremo para unirse al sustrato. La ventaja de un complejo multienzimtico es obvia, ya que consiste en tomar al sustrato y pasarlo por las distintas enzimas, hasta que despus de sucesivas modificaciones qumicas se convierte en el producto final que es liberado nuevamente al medio. De esta manera se evitan las perdidas por difusin de los intermediarios. h) Enzimas unidas a membrana. Las enzimas unidas a membrana actan acopladas a algn sistema de transporte que facilita el paso de un sustrato a algn compartimiento en especial. Su funcin en algunos casos es activar al sustrato para su unin al transportador o modificar al sustrato para que no difunda hacia fuera del compartimiento una vez que ha entrado. En otros casos las membranas sirven de embudos para canalizar el sustrato hacia la enzima.
Volver inicio
al
153
6) RELACIONES ENTRE ESTRUCTURA Y FUNCION. La conformacin o forma espacial de una protena esta ntimamente ligada a su funcin. De esta manera, basta un pequeo cambio en el acomodo de los residuos en la estructura, para que los tres puntos de contacto con el sustrato se vean alterados. En este caso no solo el reconocimiento y la eficiencia de la unin sern afectados sino que tambin la eficiencia de la catlisis misma (Fig. 11 - 4). En consecuencia la alteracin de la Conformacin se emplea para regular la actividad
En una enzima los residuos de aminocidos tienen distinta importancia. Algunos estarn destinados a mantener la conformacin. Otros estarn destinados al posicionamiento del sustrato y otros sern necesarios para la actividad cataltica
Residuos necesarios para mantener la conformacin entre ambas subunidades
Residuos que posicionan al sustrato
Residuos destinados a mantener la ubicacin de los residuos catalticos
Fig. 11 - 4. No todos los residuos de una enzima tienen igual importancia para la funcin de esta.
cataltica de las enzimas alostricas y de esta manera controlar a las vas metablicas. Una enzima expuesta a ambos sustratos L y D, elegir aquel que corresponda a una menor barrera de energa durante el proceso de unin, lo que ocurrir en algunos casos con el ismero L o con el ismero D. La estructura tridimensional de la enzima posee ciertos aminocidos crticos para interaccionar con el sustrato y un cierto nmero de otros aminocidos en posiciones espaciales muy determinadas. Estos ltimos sern necesarios para mantener una conformacin destinada a catalizar una reaccin especfica. Aquellos lugares crticos en la estructura hacen el papel de bisagras para amplios sectores de la protena. Cuyo resto puede estar formado por aminocidos susceptibles de ser reemplazados de una especie a otra, sin mayores cambios en la catlisis. Por otro lado, aquellos sitios especficos para la catlisis no experimentan cambios adaptativos, ya que se han agrupado evolutivamente como los mejores aminocidos para llevar a cabo una determinada reaccin qumica y no es necesario cambiarlos posteriormente. Podemos tomar como ejemplo de lo anterior, a la enzima Superxido Dismutasa (Tabla 1 - 4) que tiene un rol crtico al disminuir el riesgo de la presencia de Superxidos durante el metabolismo aerbico. En ella existen ciertos residuos de aminocidos que son imperturbables, a pesar de pertenecer a 6 especies distintas. Los residuos conservados son
154
de preferencia los de carcter cataltico y estn formados por 4 His en el sitio activo, ms 40 residuos en otras posiciones claves de la estructura. Estos ltimos se encuentran destinados a la aproximacin y orientacin del sustrato Superxido sobre el sitio activo. Si este sustrato toca alguna parte extra de la enzima, es capaz de denaturarla por su condicin de fuerte Reductor y Oxidante. Otros residuos de la estructura tienen cierta variacin de especie en especie y son cerca de 100. Entre ellos se puede cambiar de naturaleza sin perder la conformacin original de la enzima y solo ayudan adaptarla a los distintos medios internos de cada especie. TABLA 1 - 4 Regiones de homologa encontradas en las secuencias alineadas de la enzima Superxido Dismutasa perteneciente a 5 especies distintas
HUMANO 140 CABALLO 138 133 PEZ ESPADA 123 116 117 LEVADURA 94 94 98 95 BACTERIA 42 39 42 44 40
BOVINO HUMANO CABALLO PEZ ESPADA LEVADURA
Volver inicio
al
155
7) EFECTO DE LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LA SOLUBILIDAD Y ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS. a) EFECTO DEL pH. Existen enzimas que expresan su actividad fuera del rango normal de pH, como lo es entre 4 y 8. Algunas tienen catlisis ptima a pH 1,8 como en el caso de la Pepsina. esto se debe a que cuentan con un gran nmero de grupos carboxilos hacia el exterior (Fig. 12 - 4). Otras tienen un pH ptimo de 9 (Tripsina) por el predominio de los grupos amino hacia el exterior.
Pepsina A c t i v i d a d 2 4 6
Tripsina
10
pH
Fig.12 - 4.Efecto del pH sobre algunas proteasas.
En general, el pH interviene al controlar en una enzima: a) las interacciones con el sustrato b) las interacciones con sus moduladores c) los pasos catalticos de la secuencia de reacciones destinadas a formar producto d) las transiciones estructurales que acompaan la modulacin de la enzima y su catlisis. Una enzima soluble presenta residuos al exterior con cargas y/o residuos polares sin carga neta. Estos ltimos poseen diferenciales de carga y son capaces de formar enlaces hidrgeno con el agua. Por otro lado, aquellos grupos con carga, son titulables y podrn aceptar o donar protones cambiando la carga neta de la protena y por consecuencia se afectar la conformacin y solubilidad de esta. Tambin los residuos del sitio activo sern capaces de aceptar o donar protones, o de cambiar su disposicin espacial por el mismo efecto. Esto a su vez se traducir en un cambio de Km (la constante de Michaelis), que es aproximadamente el valor recproco de la constante de afinidad y/o un cambio en el nmero total de molculas activas o viables, lo que afectar a la actividad o Velocidad mxima de la reaccin. Por tanto las enzimas tendrn una actividad que depender del pH (Fig. 13 4). La enzima Lctico Deshidrogenasa en el msculo, necesita tener protonado al menos el 50% de su His 159. Esta ltima es necesaria para la unin al sitio activo del Piruvato. Sin embargo, la misma His 159 debe estar sin el protn para unirse al Lactato. En otras palabras debe encontrarse a pH bsico en el msculo, durante la modalidad aerbica y a pH cido o protonada, lista para unirse al Piruvato durante la modalidad anaerbica del metabolismo.
156
Msculo aerbico LDH Lactato + NADH + H+----------->Piruvato + NAD Msculo anaerbico LDH Piruvato + NAD ------------->NADH + H+ Lctico De esta manera se llevar a cabo la catlisis a un pH ptimo donde la enzima se encontrar en la mejor condicin posible para adoptar una conformacin espacial que permita el subsecuente posicionamiento y protonacin (unin de protones). Este efecto entregar la carga correspondiente a los residuos catalticos. Fuera de este pH ptimo, la catlisis no se encontrar con la disposicin espacial adecuada y disminuir la velocidad de reaccin o la afinidad por el sustrato.
SITIO ACTIVO DE LA LACTATO DESHIDROGENASA
Cofactor
NADH
H i s 195
Se requiere de bajo pH para que la His 195 se encuentre siempre protonada. Su grupo Imidazol debe tener carga ( + ), para que se una al Carbono del Pirtuvato
H O
+ H N
N H
Piruvato
H C
3
C C
O H H N
O H
A r g 171
+N
C N H
Para unirse al Lactato se requiere de un pH elevado y que la His 195 se encuentre sin protn
Fig. 13 - 4. La enzima Lctico Deshidrogenasa necesita estar 50% protonada para unir Piruvato y 50% deprotonada para unir Lactato.
Volver inicio b) EFECTO DE LA TEMPERATURA.
al
157
La temperatura ptima de una enzima es aquella que le permite llevar a cabo la catlisis en las mejores condiciones de afinidad y velocidad de reaccin con el sustrato. La temperatura ptima permite a la enzima adquirir su mejor conformacin para desarrollar la actividad mxima. Existen varias curvas cinticas (Fig. 14 - 4), que describen los distintos procesos que tienen lugar al aumentar la temperatura de una reaccin enzimtica. Todas estas curvas se combinan para dar una velocidad nica que se puede explicar de la siguiente manera:
Caso a) Sin considerar la enzima, el aumento de la velocidad de reaccin (Fig. 14 - 4), depender en parte del aumento de energa o agitacin molecular del sustrato mismo, la que se alcanza a una mayor temperatura. Esta energa de activacin le permitir alcanzar el estado de transicin, que se encuentra en la cspide de la barrera de energa. Segn la ecuacin de Arrhenius a mayor temperatura y menor energa del estado de transicin ( G* /RT: energa necesaria para pasar la barrera a temperatura T) mayor ser la velocidad de una reaccin. Ahora, cuando la enzima se encuentra presente se alcanza la conformacin ptima y ms all de esta se denatura por la agitacin trmica. Por otro lado, mientras ms se agite el sustrato por el aumento de temperatura, mayor ser la afinidad que la enzima necesite para unirse a este. Por esta misma razn, no ser posible un mayor incremento en la velocidad de reaccin a causa de que a la enzima le costar a su vez ms energa desprenderse del producto, al final de la catlisis.
Caso b) La cintica de denaturacin trmica de la enzima (Fig. 14 - 4), se manifiesta como

Caso a: Aumento de velocidad sin enzima
V e l o c i d a d
Caso b: Reaccin con Enzima. Cintica de la Denaturacin Trmica de la Enzima
Arrhenius: - G*/RT
V=ke
T
Fig. 14 - 4. La V combinada aumenta hasta que la Enzima se denatura
perdida de la afinidad de la enzima por el sustrato. La estructura enzimtica empieza a sufrir una alteracin de su conformacin a causa de la elevada agitacin del medio en que se encuentra inmersa. De esta manera se provoca una paulatina degradacin de la enzima por el nmero de choques con el medio. En el caso de aquellas enzimas que se adaptan a la baja temperatura, como sucede en los peces rticos. Se ha producido en ellos un aumento del valor de la Km (fig. 15 - 4), es decir ha disminuido su afinidad por el sustrato, ya que este
158
se agita menos. Por otro lado en los animales adaptados al clima tropical, donde el sustrato se agita ms. La Km ha disminuido aumentado la afinidad por el sustrato. A baja temperatura el sustrato se agita poco y la enzima no requiere de una gran interaccin para atraerlo y retenerlo en el sitio activo, al contrario de lo que sucede a alta temperatura. Por otro lado, al liberar el producto costar menos a baja temperatura y bastante ms en alta. En el primer caso se rebaja la barrera de energa y en el segundo se aumenta. En el caso de las iguanas, una vez que han alcanzado su temperatura de actividad corporal, ocurre que el sustrato se agitar ms y deber ser retenido de forma ms intensa por la enzima. A causa de este efecto, la barrera de energa sube y la enzima es menos eficiente (fig. 15 - 4).
Km
peces rticos
mamferos iguanas Disminuyen las K ms
45
TC
Fig. 15 4. Variacin de la Km con la temperatura en distintas especies. Volver inicio 8) MECANISMOS ENZIMATICOS. Uno de los mecanismos enzimticos mejor conocido es la participacin de la enzima Quimotripsina durante la hidrlisis de enlaces peptdicos. Esta es una enzima de 25 kD, que se encuentra formada por tres polipptidos conectados por puentes disulfuro. Se observan en su estructura regiones tipo Beta antiparalela y Alfa-Hlice. Su papel, es hidrolizar enlaces peptdicos en sustratos proteicos, donde el lado Carbonilo del enlace pertenece a un aminocido aromtico como Fenilalanina, Tirosina o Triptfano. En algunos casos tambin puede ser Metionina. Los aminocidos crticos del sitio activo son la Ser 195 y la His 57, como se puede observar en la figura 13 - 4. Cuando el sitio activo esta vaco (fig. 16a - 4), existe un puente hidrgeno entre el Asp 102, la His 57 y la Ser 195. Cuando el sustrato entra al sitio activo se transfiere un protn desde la Ser 195 a la His 57, producindose una interaccin electrosttica entre la His y el Glu (fig. 16b-4). Enseguida se desarrolla el ataque del grupo hidroxilo de la Ser 195 sobre el carbonilo del enlace peptdico y a consecuencias de esto se forma el enlace. Por otro lado, la unin Carbono - Oxgeno queda reducida a solo el enlace Sigma (se pierde el enlace P), quedando el Oxgeno con carga negativa. A continuacin se forma un arreglo al
159
tetradrico de transicin mantenido por los residuos 195 y 193 de la cadena polipeptdica de la enzima. El enlace peptdico se rompe y se forma el intermediario Acil-enzima, como se observa en la figura 16c - 4, quedando el lado Imino unido al hidrgeno de la His 57. En la seccin d) de la Figura 17 - 4, el lado amino del polipptido, empleado como sustrato ha difundido fuera del sitio activo y entra una molcula de agua para deacilar la enzima. La
a)
R O C O H N C CH N CH H 1 H N C O O CH 2 R 2 O C O H
b)
R 1 H
H N C O CH
H O R 2
N 195 cadena de la enzima H N
CH N C N CH
193
Asp 102
Asp 102
Ser 195
His 57
Ser 195
c)
O C O H N C CH H N CH
R N H
O C O CH R 2
Asp 102
His 57
Ser 195
Fig. 16a - 4.Mecanismo de accin de la Quimotripsina con aminocidos Asp 102, His 57 y Ser 195. Fig. 16b - 4.Interaccin con residuos Ser 195 y Glicina 193 Fig. 16c - 4.Ruptura enlace peptdico y formacin del Intermediario Acil-Enzima
d)
O C O H N C H CH N O H O C O R 2 O C O 2
e)
H CH N
195 cadena de la H N
O C O R 2 2
enzima
Asp 102
CH
CH
+ H N
C
H O CH
H N 193
Asp 102
CH
His 57
Ser 195
His 57
Ser 195
f)
H O O C O H N C CH N H C O O R 2
Asp 102
CH
CH
His 57
Ser 195
Fig. 17d - 4. Entrada de molcula de agua y salida de lado amino del polipptido Fig. 17e - 4. La molcula de agua se rompe y el OH es tomado por el acilo Fig. 17f - 4. Salida del extremo carboxilo del polipptido
molcula de agua se rompe y el OH es tomado por el acilo en un nuevo estado de transicin tetradrico de la figura 17e - 4, que es mantenido por otros residuos de la enzima como lo son el 195 y 193. Enseguida se rompe la unin con la Ser 195, quedando el lado acilo del
160
polipptido sustrato libre, para que finalmente la Ser 195 interaccione nuevamente con la His 57 alcanzando el estado de reposo (fig. 17f 4). Volver inicio 9) CINETICA ENZIMATICA. El anlisis de la cintica enzimtica fue llevado a cabo por Leonor Michaelis y Maud Menten. Estas personas relacionaron la concentracin de sustrato con la velocidad de reaccin bajo los siguientes principios: Estado k1 activado k3 E + S <--------------> [ES] --------------> E + P k2 La enzima se une al sustrato para formar un complejo que alcance el estado activado y luego puede descomponerse para formar nuevamente sustrato ms enzima sin cambio alguno o bien puede descomponerse para formar enzima y producto. La enzima queda finalmente inalterada ya que es solo un catalizador. Los principios del anlisis de Michaelis-Menten son los siguientes: 1) La velocidad con que se forma el complejo ES es igual a la velocidad con que se destruye. v1 = v2 + v3 k1 [E]l [S] = k2 [ES] + k3 [ES] (1) al
2) La enzima total [E]t ser igual a la enzima libre [E]l, ms la unida al complejo enzima substrato [ES]. [E]t = [E]l + [ES] (2) 3) La velocidad de la reaccin inicial depender de la concentracin del complejo ES. A medida que este se descompone se formar producto o sustrato nuevamente. v1 = k3 [ES] (3)
4) La velocidad mxima (Vmx) de la reaccin se obtendr cuando la concentracin del complejo [ES] sea igual a la concentracin total de la enzima E. Vmx = k3 [E]t cuando [E]t = [ES] (4)
5) La Constante de Michaelis ser la relacin que exista entre las constantes de la velocidad de la reaccin en uno y otro sentido. k2 + k3 (5)
161
Km = --------k1 Si k3 es muy pequeo, la Km ser inversa a la constante de afinidad (Kaf) por el substrato. A mayor Km entonces menor afinidad por el sustrato. Al reemplazar las ecuaciones 2, 3, 4 y 5 en 1 se obtiene la ecuacin general de MichaelisMenten que relaciona la velocidad de reaccin con la concentracin de substrato: Vmx [S] v = -----------Km + S El significado de Vmx y Km es el siguiente. La Km cuando v = 1/2 Vmx, es la concentracin de substrato para saturar el 50% de los sitios activos presentes (uno por molcula de enzima) y se relaciona como se dijo anteriormente con la afinidad de la enzima por el substrato. A mayor afinidad menor Km y a menor afinidad mayor Km. La Vmx se relaciona con el nmero de molculas de enzima activas o la concentracin total de la enzima viable bajo 100% de saturacin con el sustrato, ya que pueden existir molculas de enzima no activa o inhibidas de actuar. La Vmx depender no solo de la concentracin de enzima, sino que del nmero de recambio conocido como el nmero de molculas de substrato que pasarn por el sitio activo transformndose en producto. Al graficar la ecuacin de Michaelis-Menten, encontramos que la curva formada, es una hiprbole que consta de tres partes. La primera indica que la reaccin es de orden 1 o proporcional a la concentracin de sustrato (Figs. 18a - 4, 18b 4 y 18c - 4), donde la enzima aumentar la velocidad de reaccin a medida que llegue ms substrato al sitio activo: v = k1 [S] o dS/dt = k1 [S] o S = S0 e-kt donde k es la constante de la velocidad, luego: Log S0/S = kt/2.303 Con ello se puede calcular el tiempo medio en que ocurre una reaccin de primer orden, el cual es independiente a la concentracin de substrato: t /2 = 0.693/k
162
El tiempo medio es independiente de la concentracin inicial de sustrato.

a) b)
E
S P
E
S
E
P S
E
P
E
c)
E E E
P P S P d)
E E
S S P P S S
E E
P P
S S
Fig.18 - 4. En a) una molcula de substrato por cuatro de enzima, en b) dos molculas y en c) tres molculas, para estar finalmente saturada con cuatro molculas en d).
v = V max v
v = K (s
) (s )
v = V max v 1 v = Vmax 2
Km
(s )
Fig. 19 - 4.Ambos grficos representan la velocidad respecto a la concentracin de sustrato.
163
La segunda parte est representada por la zona curva y es de orden indeterminado ni 0, ni 1 y la tercera parte se encuentra representada por la recta horizontal que es de orden 0, donde se alcanza la velocidad mxima en forma independiente a la concentracin de substrato y la velocidad en este momento solo depender de la concentracin de Enzima o el nmero de molculas de enzima activas (Fig. 18d - 5): a) v = Vmx si [ES] = [E]t b) Vmx = k3 [ Et ] De la ecuacin b) se puede calcular el Nmero de Recambio que es el nmero de moles de substrato convertidos a producto por minuto por mol de enzima. En este momento la Velocidad solo depender de la concentracin de enzima solamente, la velocidad ser mxima si el substrato est saturante. Por lo tanto la Ecuacin de Michaelis-Menten est formada por dos rectas (Fig. 19 - 4) donde la velocidad es proporcional a la concentracin de substrato y la otra en que la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato durante la saturacin total de la enzima. Debido a que la ecuacin de Michaelis - Menten representa una curva, el clculo de Km y Vm para cada enzima se hace complejo y se necesitan muchos puntos para determinar los valores con exactitud. De esta manera se hizo un arreglo matemtico por la dupla Lineweaver-Burk para convertir la curva en una recta, que solo puede ser definida por al menos 2 puntos (Fig. 20b - 4), comparada a la Michaelis-Menten (Fig. 20a-4) que necesita muchos puntos de definicin. De esta manera se cambi la expresin, pero no el anlisis y se hizo mucho ms fcil la determinacin grfica de Km y Vmx.
a)
v = Km + [S ]
V m. [ S ]
b)
1 v
Km . Vm
1 [S]
1 Vm
Vm
Michaelis-Menten
1 2
1/v
Lineweaver-Burk Km/Vm
Vm
1/V m
Km c)
Vm
- 1/K m
1/[ s ]
v
Eadie Hofstee -Km
- Km
v
[S]
Vm
v / [S ]
Fig. 20 - 4.Tres formas distintas de expresar el mismo planteamiento central de a) MichaelisMenten, b) Lineweaver-Burk y c) Eadie-Hofstee.
164
Expresin de Lineweaver-Burk: 1 Km 1 --- = ---------- + v Vmx [S] 1 -----Vmx
puede ser homologada con la ecuacin de la lnea recta: y=mx+n Al graficar 1/v vs 1/S se obtiene la pendiente m = Km/V y el intercepto en el lado positivo del eje 1/v es n = 1/Vmx, mientras que el intercepto en el lado negativo del eje 1/S es -1/Km (Fig. 20b - 4). Otra forma de expresar el anlisis de Michaelis-Menten en una recta, fue ideado por la dupla Eadie-Hofstee (Fig. 20c - 4) donde: v v = - Km --- + Vmx [S] La ecuacin puede ser homologada a la recta de pendiente negativa: y=-mx+n La grfica corresponde aqu a v versus v/S y se obtiene una recta de pendiente negativa m = - Km y un intercepto n = Vmx en el eje v. La descripcin de Michaelis-Menten es una de las ms simples, pero la interaccin entre una enzima y un sustrato puede presentar algunas otras variantes que se describirn a continuacin. Primero, cuando existen molculas similares, pero no idnticas al substrato que compiten por el sitio activo junto a este. Segundo, cuando existen molculas que se pueden unir a la superficie de la enzima libre y tambin al complejo ES inhibiendo su actividad. Tercero, cuando una molcula que no es el substrato se une exclusivamente al complejo ES. Estos tres casos son sucesivamente conocidos como, inhibicin competitiva, inhibicin no competitiva e inhibicin acompetitiva respectivamente y pueden ocurrir en el metabolismo intermediario. Tambin estos mecanismos se emplean en el dominio de la farmacologa para controlar algunas vas metablicas o la sntesis y secrecin de neurotransmisores. Muchas drogas han sido diseadas para interactuar con receptores o enzimas provocando alteraciones como las aqu sealadas en el transcurso de su accin.
Volver inicio
al
165
10) INHIBICION COMPETITIVA. La inhibicin competitiva puede ocurrir cuando existe una competencia entre una molcula estructuralmente similar al sustrato denominada inhibidor y el sustrato por el sitio activo (Fig. 21 - 4):
I nhibicin Competitiva .
ES
E
S
+ +
I
+
P
E+ +
I
ES
E+ P
EI EI
I
Fig. 21 - 4. El substrato y el inhibidor son similares y pueden entrar al sitio activo.
La constante de disociacin del inhibidor I es la siguiente: Kd = k2/k1 = [E] [I] / [EI] = Ki cte. del inhibidor y 1/Km = Kd, mientras que Km = [E] [S] / [ES] en Km / [S] = [E0] / [ES] - [ES] / [ES] -[EI] / [ES] Km / [S] = [E0] / [ES] - 1 - [E] [I] / Ki Km / [E] [S] donde: [Eo] / [ES] = Km / [S} + 1 + Km[I][E] / [E]Ki[e] Si:
166
[Eo] / [ES] = Vm / v Vm / v = Km / [S] + Km [I] / [S] Ki + 1 Al multiplicar por [S]: Vm[S] / v = Km (1+ [I] / Ki) + [S]) donde: o en la forma Michaelis-Menten: v = Vmx [S] ---------------------Km ( 1 + [I] ) + [S] --Ki v = Vm [S] / Km( 1 + [I] / Ki) + [S]
o en la forma Lineweaver-Burk: 1 --v 1 --v = "Km aparente" ----------Vmx Km ---Vmx 1 --- + [S] 1 --Vmx + 1 --Vmx
[I] 1 (1 + ----) --Ki [S]
La Km que se obtiene en presencia del Inhibidor se denomina "Km aparente" y su valor aumenta con la concentracin del inhibidor. Kmaparente = Km ( 1 + [I] / Ki) Los siguientes puntos son de consideracin: 1) El grado de inhibicin causado por un inhibidor competitivo depender de [S], [I], la Km y la Ki. 2) Cuando la concentracin de sustrato aumenta a [I] constante, la inhibicin disminuye. 3) Cuando la concentracin de inhibidor aumenta a [S] constante, el grado de inhibicin aumenta. 4) A menor concentracin de [S] y a mayor Ki, mayor ser la inhibicin. 5) Cuando la [S] sea mayor o igual a 100 veces la Km aparente, se tendr que v = Vm. En este caso la Km por el sustrato original S, aumenta al incrementar la concentracin del inhibidor I. Por ejemplo si la enzima Flico Reductasa produce la forma activa del c. Flico denominada c. Tetrahidroflico y se la pone en contacto con los compuestos anlogos Aminopterina o Metopterina (Fig. 22 - 4). Ocurre que se produce una inhibicin de tipo competitivo donde la Km por el c. Flico aumenta disminuyendo la afinidad por el sustrato natural a medida que aumenta la concentracin del compuesto anlogo inhibidor, Ejemplo:
167
Km c. Flico c. Flico + Aminopterina c. Flico + 2[Aminopterina] c. Flico + 3[Aminopterina] 10 uM 15 20 30
Vm 50 um/min 50 50 50
Igual cosa sucede con las Sulfonamidas, en los Streptococus Fecalis. Estos se pueden reproducir cada 20 minutos, ya que pueden sintetizar el c. Flico de novo o a partir de 0, sin embargo la enzima que une el c. p-aminobenzoico, puede equivocarse y tomar a las Sulfonamidas que tienen similar estructura para ensamblar el c. Flico, por lo que se producir una inhibicin competitiva.
E structuras Similares Provocan Inhibicin Competitiva .

2-Amino-4-Hidroxi 6 - M e t i l P t e r i n a. Ac.Para-Amino Benzoico Ac.Glutamico.
NICO TINAM IDA
OH N
H N
2
H N CH N 2
H C N C C H2 C H2 C O O H H COOH
N
H N
2
A c. F O L I C O
O C NH 2 N O C
N
H2 N
N N
H N
2
H CH N
2
C N C C H2 C H2 C O O H H COOH
Empleados en Quimioterapia
N N H 2 H
AMINOPTERINA
N
IS ON IA Z IDA
C H3 N N CH 2
H H COOH
N
H N
2
C N C C H2 C H2 C O O H
tratamiento de la tuberculosis
N H
METOPTERINA
H N
O S O NH R
desinfectante
SULFONAMIDA
Fig. 22 - 4. Los anlogos del c. Flico actan inhibiendo la sntesis de cs. Nucleicos en humanos, mientras que las Sulfas inhiben la sntesis de cs. Nucleicos en las bacterias del intestino al igual que los antibiticos y la coenzima NAD.
Volver inicio 11) INHIBICION NO COMPETITIVA.
al
168
Ocurre cuando el Inhibidor se une tanto a la superficie de la Enzima libre como a la Enzima unida al sustrato (Fig. 23 - 4) y las siguientes consideraciones deben ser tomadas en cuenta para este tipo de inhibicin: 1) El grado de inhibicin en presencia de un inhibidor no competitivo depende solamente de [I] y KY. 2) En presencia de un inhibidor no competitivo pareciera existir menos enzima de la que se encuentra presente. 3) La Velocidad aparente es siempre una fraccin constante de la Vmx, independiente de [S] y de Km. De lo anterior se deduce que: E + ES + I = EI + ESI si E + I = EI
Inhibicin No Competitiva . E
ES
+ +
I
+
I
+
P
E + S ES + I EIS E + P
+ I EI + S
EI
EIS +
S S
Fig. 23 - 4. El substrato y el inhibidor no se relacionan estructuralmente. El inh. se une solo a la superficie de la enzima.
simplificando: EI + ESI = EI Luego: Ki = [E] [ I ] / [EI] = ( [E] + [ES] ) [ I ] / [EI] (a) La enzima se encuentra durante esta inhibicin de 3 formas:
169
[Eo] =[E] + [ES]+[EI] sustituyendo: [E] + [ES] en a, tenemos que: Ki [EI] = [E0] [ I ] - [EI] [ I ] Ki [EI] + [EI] [ I ] = [E0] [ I ] Luego, despejando [EI]: [EI] = [E0] [ I ] / Ki + [ I ] Como Vmx = k [E0] y v en presencia de substrato e inhibidor no competitivo es v = k([E0 [EI]) Vmx/v = [E0] / [E0-[EI] Vmx/v = [E0] / [E0-[E0] [ I ] / [E0] - [E0] [ I ] / Ki + [ I ] finalmente: v = Vmx ( Ki / Ki + [I] ) y "Vaparente" = Vmx / (1 +[ I ] / Ki) y la ecuacin final estar dada al estilo Lineweaver-Burk por: 1 Km [I] 1 1 [I] --- = --- ( 1 + --- ) --- + --- ( 1 + --- ) v Vmx Ki [S] Vmx Ki En este caso la Km permanece igual ya que no se afecta el sitio activo, pero la Vmx disminuye, ya que el nmero de molculas totales de enzima activa decrece a causa de la unin con el Inhibidor. Un ejemplo de este tipo de inhibicin son los excesos de metales pesados, como el Cobre, Hierro, Plomo y Mercurio, este ltimo es de reconocida toxicidad y se le emplea en algunas preparaciones desinfectantes. Estos metales se unen a los grupos tioles de las Cistenas que se asoman al exterior en la superficie de las enzimas. La unin a ellos paraliza a la enzima que puede estar libre o unida al sustrato, de esta manera algunas molculas de enzima no catalizarn la reaccin disminuyendo la Vmx. Volver inicio al
12) INHIBICION ACOMPETITIVA (Fig. 25 4).
170
En este caso el Inhibidor se une solo al complejo ES, a diferencia de la inhibicin NO COMPETITIVA donde tambin se une a la enzima libre. Su efecto se puede analizar de la siguiente manera: ES + I === EIS I: Inhibidor Si Consideraciones Generales. 1) En los grficos de Lineweaver-Burk se observan en este caso rectas paralelas a concentraciones crecientes del inhibidor 2) En presencia del inhibidor disminuye Km y Vm 3) La Ki pude ser calculada grficamente. [ES] [ I ] Ki = ----------[EIS]
Inhibicin Acompetitiva .
ES
E
S
+
E
+
P
ES
+ P
+
I I
EIS
EIS
S
Fig. 25 - 4. El inhibidor I se une solo al complejo Enzima-Substrato.
En la Figura 26 - 4, se pueden observar las expresiones de Michaelis-Menten y LineweaverBurk para los tres tipos de inhibiciones. Durante la Inhibicin Competitiva la Km disminuye y la Vmx contina igual, ya que las molculas de inhibidor entran al sitio activo de la enzima desplazando al substrato debido a su similaridad estructural. En la Inhibicin No Competitiva, la Km permanece inalterada y la Vmx disminuye debido a que el inhibidor elimina molculas de enzima libre o unida al substrato durante la reaccin, mientras que en
171
la Inhibicin Acompetitiva ambos parmetros disminuyen Km y Vmx, debido a que el Inhibidor solo se une al complejo Enzima-Substrato. En la figura 27- 4, estn representadas grficamente las inhibiciones en el estilo de Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee. En los tres tipos de grficos la concentracin del inhibidor aumenta desde la letra a hasta la letra c. Los grficos representados por rectas parecen ser los ms precisos para clasificar el tipo de inhibicin y calcular los valores de Km y Vmx, adems cualquier comportamiento anormal de las rectas podr ser interpretado como la presencia de una enzima modificada alostricamente por el inhibidor o el substrato y su cintica deber expresarse mediante otro tratamiento como es la expresin de Hill.
IINHIBICION COMPETITIVA V mx 1+ [I] Ki [S] + [S] 1 = v
SIN
Km
AUMENTA
V mx
CAMBIO
= Km
Km 1+ V mx
[I] Ki
1 + [S]
1 V mx
IINHIBICION NO COMPETITIVA V mx v = 1+ [I] Ki INHIBICION ACOMPETITIVA V mx v = Km + [S] 1+ [S] [I] Ki 1 = v (Km + [ S ] ) [S ] 1 = v V mx Km
Km
SIN CAMBIO
V mx
DISMINUYE
1+
[I] Ki
1 + [S]
1 1+ V mx
[I] Ki
Km
DISMINUYE
V mx
DISMINUYE
Km V mx
1 [S] +
1 1+ V mx
[I] Ki
.
Fig. 26 - 4. En el lado izquierdo aparece la expresin para Michaelis-Menten y en el derecho para Lineweaver-Burk.
172
M i c h a e l i s - M e n t e n L i n e w e a v e r- B u r k e Inhibicin Competitiva
Km Vm CTE
Eadie-Hofste
a = Sin Inhibidor b = Con Inhibidor c = Con 2 x inhibidor
1/v
b a
v a v
b c v/s a v/s
Km ap.
Inhibicin Nocompetitiva
1/s a 1/s c b a 1/s v a b c
v
Km CTE Vm
Km= Km ap.
a b c s
1/v
Inhibicin Acompetitiva
v
Km Vm
Km ap.
a b c s
1/v
v/s
Fig. 27 - 4. Se puede observar aqu los tres tipos de inhibiciones expresadas en los grficos estilo Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk y Eadie-Hofstee.
173
RESUMEN DE LAS CARACTERISTICAS GENERALES DE LAS ENZIMAS 1) Son en su mayora protenas que bajan la barrera de energa actuando como catalizadores. 2) No afectan la constante de equilibrio de una reaccin, solo las velocidades con que estas ocurren. 3) Presentan dependencia de la concentracin ya que en pequeas cantidades producen grandes cambios de velocidad de una reaccin. 4) Forman complejos reversibles con el sustrato. 5) No se consumen o modifican en la reaccin, es decir se pueden emplear varias veces. 6) Muestran especificidad de reaccin esa decir enzimas distintas para distintos sustratos. 7) Son engaadas por los inhibidores, en especial aquellos usados en la quimioterapia. 8) Cada enzima muestra una actividad ptima que depende de temperatura, pH, fuerza inica, etc. 9) Muchas requieren de cofactores como las vitaminas... 10) Existen de 2000 a 3000 diferentes en cada clula y cada clula de un tejido tiene un conjunto distinto de enzimas. 11) Se involucran en los mltiples pasos del metabolismo intermediario. 12) Se pueden regular por retroalimentacin y algunos otros mecanismos. 13) La produccin es controlada por los genes. 14) Las enfermedades genticas son el resultado de la falla de una o ms enzimas de una va metablica. Volver inicio al
174
13) EMPLEO DE LAS ENZIMAS EN EL DIAGNOSTICO CLINICO. Las enzimas Lctico Deshidrogenasa (LDH), Glutamato Piruvato Transaminasa (GTP), Glutamato Oxaloacetato Transaminasa (GOT), Creatina Kinasa (CK), son ampliamente utilizadas en el diagnostico clnico (Fig. 28 - 4). En un suero normal no se encuentran presentes estas enzimas, sin embargo la actividad enzimtica medida aparece como producto de algunas patologas como son las Lesiones musculares, Infarto al miocardio y otras patologas hepticas o musculares. En general las enzimas aparecen en la circulacin como producto de un aumento indiscriminado en su sntesis o una determinada proliferacin celular, un aumento de la permeabilidad de las membranas y por necrosis celular o lisis como se indica en el esquema.
Proliferacin Celular
Aumento de la Sntesis
Activacin Enzimtica
Necrosis celular y Lisis
Actividad enzimtica medida
Aumento de la Permeabilidad de la membrana celular
Excrecin Urinaria
Inactivacin y degradacin
Inhibicin Enzimtica
Remocin metablica o catabolismo
Por otro lado la actividad enzimtica en el plasma, puede ser alterada por factores de activacin como algunos metabolitos o frmacos y de inactivacin, como es su inhibicin o degradacin. Entre las enzimas ms comunes en el plasma tenemos a: LDH CK GOT GPT GOT GPT Lesin Muscular Oclusin Coronaria, primera en aparecer Oclusin Coronaria, a las 12 hrs. Oclusin Coronaria, a las 24 hrs. Lesiones Hepticas, intoxicacin con lquidos orgnicos, Hepatitis, Traumas.
Para su determinacin se emplean sustratos sintticos que producen color al reaccionar a concentraciones saturnales y se determina su actividad mediante grficas de Absorbancia (Densidad ptica) versus tiempo. De la pendiente de estas curvas se obtiene la velocidad de reaccin en DO/t o micromoles de Producto/t. Posteriormente estos datos s grafican versus las alcuotas de enzima o la concentracin de la enzima y el resultado pueden ser
175
expresados en Unidades Enzimticas (UE). Una UE es la cantidad de enzima que forma un micromol de producto en un minuto a 25oC. De esta manera se obtienen las Unidades de actividad enzimtica en la alcuota en que se hizo la determinacin. La isoenzima que se encuentra en el Corazn es la Creatina Kinasa - Msculo, Cerebro o CK-MB, mientras que la que se encuentra en el msculo esqueltico es la CK-MM y la que se encuentra en el cerebro CK-BB. A pesar de que aumenta cerca de un 90% despus de un infarto ( 4 a 6 hrs.) llega a un mximo a las 24 hrs. y vuelve a valores normales a los 3 o 4 das, tambin aumenta ante algn trauma muscular (CK-MM), ejercicio fsico, estado postoperativo, cuando hay convulsiones y delirio. LDH tambin se encuentra en Corazn, pero es menos especfica ya que est presente en msculo esqueltico, hgado, eritrocitos, rin y algunos neoplasmas. Tambin puede aumentar por enfermedades a cualquiera de los rganos mencionados y hemlisis. Aumenta a las 24 hrs despus del infarto, llega a un mximo a los 3 das y baja a niveles normales en 8 a 9 das.
Curso de las enzimas indicadores despus de un infarto
Troponina
N ode veces que aumenta X7 X6 X5 X4 X3 X2 Normal HBDH
CK MB: Creatina Kinasa isoenzima mixta miocardio - cerebro CK: Creatina Kinasa
CK - MB CK
GOT GOT: Glutmico Oxaloactico Transaminasa
HBDH: Deshidrogenasa hidroxibutrica LDH LDH: Lctico Deshidrogenasa
das
Fig. 28 - 4. Variacin de los niveles enzimticos durante un infarto al miocardio.
Isoenzimas: LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5
presente en Corazn, eritrocitos y corteza renal en sistema Retculo Endotelial presente en pulmones presente en placenta, rin y pncreas en msculo esqueltico e hgado
ltimamente se ha recurrido a detectar la presencia de Troponina I, una protena contrctil de la miofibrilla que no es una enzima. La isoforma cardaca es muy especfica
176
Aumenta de 4 a 6 hrs. despus del dao, al mximo en 12 a 16hrs y permanece elevada por al menos 10 das.
Volver inicio
al
14 ) ENZIMAS ALOSTERICAS.
177
Estas enzimas son moduladas mediante el control de su Km o Vmx por medio de algn compuesto que se encuentra al inicio o al final de la va metablica como lo son las molculas efectoras que cambian de concentracin segn el estado del metabolismo (CO2, 2,3 DPG). Al tener varias subunidades la cintica de interaccin con el sustrato es regida por una curva sigmodea que se puede explicar tanto por el modelo Simtrico o el Secuencial que se observa a continuacin. El MODELO SECUENCIAL (Fig. 29 - 4) indica que la enzima de varias subunidades al unirse progresivamente a distintas molculas de substrato, cambia su conformacin paulatinamente haciendo que las nuevas molculas de substrato entren cada vez ms fcilmente hasta saturarla. La primera molcula de sustrato entra lentamente, la segunda ms fcil y as sucesivamente hasta ocupar todos los sitios activos de la enzima. El MODELO SIMETRICO (Fig. 29 - 4) supone la existencia de dos conformaciones en la enzima, una tensa T con poca afinidad por el sustrato y la otra relajada R de alta afinidad por el sustrato. A medida que el sustrato se une a la forma relajada R que se encuentra en baja concentracin, el equilibrio se desplaza hacia esta forma que se une ms fcilmente al sustrato hasta convertir toda la forma T en R.
MODELO SECUENCIAL
+S
+S
S S
+S
S S S
+S
S S
S S
La enzima Oligomrica cambia de conformacin al unir sucesivamente a las molculas de substrato.Cada molcula de substrato que se une a la enzima facilita la entrada de la otra hasta saturarla.
MODELO SIMETRICO CONCERTADO
R +
S S S
+S
S S
S S
S S
La enzima Oligomrica existe en dos formas , una relajada R y la otra tensa T el substrato S desplaza el equilibrio hacia la forma relajada que es a la cual se
unen sucesivas molculas de substrato hasta que toda la enzima esta en la forma R y saturada.
Fig. 29 - 4.Ambos modelos explican la cintica del tipo Sigmoideo.
Volver inicio 15) COMPORTAMIENTO DE LA HEMOGLOBINA
al
178
La Desoxihemoglobina presenta una estructura Tensa debido a los puentes salinos formados por los grupos terminales de sus cuatro cadenas (Ver captulo de protenas). En presencia del Oxgeno la estructura tiende a pasar al estado Relajado, en este momento se presenta el efecto cooperativo que se desencadena por la entrada de la primera molcula de Oxgeno. Este efecto hace bajar al Fierro que se encuentra por sobre el plano del anillo Heme, arrastrando con ello a la His proximal. El movimiento provoca un cambio en la estructura terciaria y luego un deslizamiento en la estructura cuaternaria debido a la ruptura de las interacciones electrostticas entre los grupos terminales de las cuatro cadenas. De esta manera se desplaza el equilibrio del tetrmero hacia la forma Relajada. Este mecanismo aumenta la afinidad de los grupos Heme que se encuentran an vacos, despus de unirse la primera molcula de Oxgeno favoreciendo la entrada de la segunda y luego de la tercera hasta completar las cuatro. La afinidad por el Oxgeno de la Hemoglobina puede ser modulada a la vez por los cambios de pH, la PpCO2 y la concentracin de 2,3 DPG como se dijo en el captulo de las Protenas. En la Figura 30 - 4 s observa el grfico de la fraccin de saturacin (Y = v/Vmx) de la molcula de Hemoglobina versus la presin parcial de Oxgeno (PpO2). Una fraccin Y de 1 significa 100% de saturacin de la molcula de Hemoglobina y una fraccin Y de 0.5 significa 50% de saturacin. La curva de saturacin es del estilo sigmodeo y muestra un desplazamiento a izquierda o derecha cuando varan los niveles de los moduladores. As tenemos que la Hemoglobina desplaza su curva de saturacin a la izquierda aumentando su afinidad por el Oxgeno en condiciones de pH 7.6, baja PpCO2 y a la vez baja concentracin de 2,3 DPG en el pulmn.
PULMON
p H = 7,6 PpCO 2 Sin DPG 2,3 D P G
MUSCULO EN ACTIVIDAD
p H = 7.2 PpCO2 2,3 D P G
Y
1.0
Fraccin de Saturacin
0.5
En ERITROCITO con DPG
20
40
60
Pp O2 torr
Fig. 30 - 4.Curvas de saturacin sigmoideas donde se observa el comportamiento de la Hemoglobina a distintos pHs.
El desplazamiento de la curva de saturacin hacia la derecha en la figura 30 - 4 indica una disminucin de la afinidad por el Oxgeno al liberarse hacia los msculos en condiciones de pH 7.2, a causa de la acumulacin de c. Lctico como producto final del metabolismo anaerbico. La PpCO2 es aqu tambin elevada junto al nivel de 2,3 DPG que es un subproducto del metabolismo de la Glucosa en los tejidos.
179
El modulador 2,3 DPG se une a las tres cargas positivas de los residuos de aminocidos His 2, Lys 82 e His 143 que son aportados por la cadena Beta en la hendidura Beta-Beta o cavidad central del tetrmero. La unin del Oxgeno y el 2,3 DPG son exclusivas, ya que la cavidad central se hace muy pequea en la Oxihemoglobina como para aceptar al 2,3 DPG: Hb(O2)4 + DPG <----> Hb-DPG + 4O2 La PpCO2 en los tejidos durante el metabolismo intenso se encuentra aumentada con lo que se produce una baja de pH por la reaccin: H2O + CO2 <----> HCO3- + H+ DESOXIHEMOGLOBINA OXIHEMOGLOBINA + Hb(H )2 + 4O2 <----------> Hb(O2)4 + 2H+ La Desoxihemoglobina presenta mayor afinidad por los protones ya que tiene en ambas cadenas Beta, la Histidina 146 con un pK elevado a consecuencia de la cercana de un Aspartato. En cambio en la Oxihemoglobina ambas Histidinas en la posicin Beta 146 se encuentran libres y su pK baja soltando un protn. De esta manera al disminuir el pH disminuye la afinidad por el Oxgeno y se suelta este hacia los tejidos. Esta particularidad es conocida como el Efecto Bohr. A pesar de que el CO2 se transporta en la sangre como HCO3- parte de este se combina con la hemoglobina y tambin acta como modulador alostrico. De esta manera el CO2 interacciona con los grupos Amino terminales no ionizados de la Desoxihemoglobina formando Carbamatos. Estos aductos estabilizan la estructura tensa al formar nuevas interacciones electrostticas: Hb-NH2 + CO2 <----> Hb(NHCOO-) + H+ Si por alguna mutacin la Hemoglobina disminuye el grado de interaccin interna se hace ms relajada y se une ms fcilmente al Oxgeno y su curva sigmodea se desplaza a la izquierda y se comprime a hiperblica. Si la unin interna se hace ms rgida por otra mutacin o como lo es cuando se une al 2,3 DPG, la molcula se hace ms tensa y disminuye su afinidad por el Oxgeno y la curva sigmoidea se estira hacia la derecha (Fig. 30 - 4). El comportamiento cintico de la Hemoglobina es claramente mostrado por su efecto Cooperativo que se representa por las diversas curvas sigmodeas y se puede concluir que esta protena se comporta en general como el Modelo Simtrico con una cintica susceptible de ser analizada por medio de la expresin de Hill. Volver inicio 16) EXPRESION DE HILL. La cintica de las enzimas alostricas es del tipo Sigmodeo. Estas enzimas cuentan con varias cadenas polipeptdicas y a la vez varios sitios activos. El comportamiento de las al
180
enzimas alostricas se explica mediante los modelos secuencial o simtrico vistos anteriormente. En este caso se analizar el comportamiento de la Hemoglobina comparado al de la Mioglobina. Ambas no son enzimas, sin embargo se comportan como si lo fueran en su interaccin con el Oxgeno. Una de ellas es todo o nada (Mioglobina) y la otra (Hemoglobina) es del tipo modulado. Especialmente por: a) El incremento de 2,3 DPG (2,3 Di-Fosfo-Glicerato) que se une a un bolsillo central con cargas positivas, b) El aumento de la PpCO2 o CO2 que en la forma de bicarbonato HCO3 se une a los grupos Amino terminales de las cadenas liberando protones para el efecto Bohr y a la vez aumentando la interaccin por puente salino al introducir dos cargas negativas. c) La baja en el pH, que tambin modifica las cargas de los grupos terminales. En general, todos estos efectos hacen a la Hemoglobina ms rgida y con menos afinidad por el Oxgeno. Al comparar la cintica de la Mioglobina (fig. 31 4), de una sola cadena polipeptdica con la de la Hemoglobina, se puede apreciar las ventajas de tener mltiples subunidades. Estas permiten variar la afinidad o la velocidad mxima de reaccin. De esta manera es posible ajustarse a las distintas situaciones que ocurren durante el metabolismo. Las curvas sigmodeas pueden ser reemplazadas por rectas, para que estas requieran menos determinaciones y puedan ser fcilmente graficadas. De esta manera se resumir su comportamiento que se encuentra representado por la accin de los distintos sitios activos y sus sitios alostricos. El Oxgeno se une a la Hemoglobina lentamente al principio para continuar rpidamente hasta alcanzar finalmente en forma lenta la saturacin. Esta cintica es indicadora de un comportamiento modulado y la presencia de varios sitios de unin.
Y
Hemoglobina
Mioglobina
10 20 30 40 50
PpO2
Fig. 31 - 4. Curva hiperblica de la Mioglobina y sigmodea de la Hemoglobina
La expresin para graficar el comportamiento de estas molculas, se obtiene de la ecuacin de Michaelis Menten. En ella la concentracin de sustrato se puede reemplazar por la PpO2, que se puede elevar al nmero n, de sitios activos o de aquellos sitios susceptibles
181
a que se una la molcula de O2. Este exponente se representa por el smbolo n, conocido tambin como factor de interaccin. n n Vmx [S] Vmx [PpO2] v = ----------= -----------------n n Km + [S] PpO250 + [PpO2] La constante Km de Michaelis-Menten se puede homologar por la presin parcial de Oxgeno necesaria para saturar el 50% de la molcula de Hemoglobina con sus cuatro subunidades o PpO250. Al despejar la ecuacin anterior, obtenemos: n n v PpO250 + v [PpO2] = Vmx [PpO2] n n v PpO20 = Vmx [PpO2] - v [PpO2] n v PpO250 = [PpO2] ( Vmx - v ) n v [PpO2] ----------------------- = -----------------------( Vmx - v ) PpO250
En esta ecuacin la relacin entre la velocidad a cualquiera PpO2 y la Velocidad mxima a PpO2 saturante, se conocer como Fraccin de Saturacin, que puede estar representada por Y:
v
Fraccin de Saturacin: Y = ------Vmx
Despus de este cambio nos dar: Y (Oxihemoglobina) -------------------------------------------1 - Y (Desoxihemoglobina) n [PpO2] = -----------------------------PpO250
Cuando n es igual a 1, se obtiene la curva hiperblica de la figura 31-4 y cuando n va de 1 a cerca de 4 se obtiene la curva sigmodea. Despus de estas aproximaciones es posible aplicar logaritmo a toda la ecuacin anterior, empezando por la relacin entre las molculas de Oxihemoglobina (Y) y las molculas de Desoxihemoglobina (1-Y), que tambin pueden considerarse como el equilibrio qumico entre
182
las molculas de Oxgeno que se unen a la Hemoglobina y las que se sueltan. De esta manera se obtiene final mente la ecuacin o expresin de Hill:
Log
Y 1-Y
= n Log PO2 Log P50
La expresin de Hill se encuentra en el grfico de la figura 32 4.
GRAFICO DE HILL
Log Y 1 - Y Mioglobina n=1
n=2.8 Hemoglobina
L o g p O2
Fig. 32 - 4. Grfico para Mioglobina y hemoglobina junto a la expresin de Hill
Esta expresin se encuentra en funcin de n veces el logaritmo de la diferencia entre la presin parcial de Oxgeno (PpO2) y la presin parcial necesaria para saturar el 50% de los sitios de la Hemoglobina (PpO250). Una vez deducida la expresin de Hill se puede aplicar en ambas protenas (Fig. 32 - 4) y se observa que n tiene un valor de 1 para la Mioglobina con un sitio de unin por molcula, mientras que la Hemoglobina en vas de saturacin muestra un exponente de 2,8 a 3 y nunca un valor de 4, ya que se obtiene solo un promedio entre las molculas de Oxgeno que se unen y se sueltan de la Hemoglobina al mismo tiempo. Cuando el valor de Y/1-Y es igual a 1 o cuando se encuentra la Hemoglobina a 50% de saturacin entonces el Log Y/1-Y es igual 0 y se obtiene el valor de la PpO250. Este mismo valor es el que cambia bajo el control de los moduladores pH, PpCO2 y 2,3 DPG. En la Figura 33 - 4 se aprecia la aplicacin prctica de la expresin de Hill en una enzima alostrica cualquiera. En el ejemplo se determin el valor del exponente n denominado coeficiente de interaccin u orden aparente de la reaccin y que es funcin del nmero de sitios de unin presentes en la molcula de enzima (n). Las siguientes consideraciones se deben tener en cuenta frente a la expresin de Hill: a) Si la enzima se une con alta afinidad al sustrato el coeficiente de interaccin deber ser igual al nmero de sitios activos presentes y si la interaccin es dbil o la enzima no es alostrica su valor ser de 1.
183
b) Por otro lado si la enzima tiene varios sitios el coeficiente tendr diversos valores frente a los distintos moduladores que afecten a la enzima. c) Cuando la enzima se encuentra 50% saturada (v = 1/2 Vmx) o cuando v / Vm - v = 1, el logaritmo de v / (Vmx - v) es 0 y n log [S]50 = log K 50 dejando finalmente K50 = [S]50n .
Expresin de Hill para una enzima alostrica

v Log Vm _ v =
n Log
[S] _
L o g K 50
Determinacin de n con una Tabla de Datos obtenida de la interaccin de una enzima alostrica con su sbstrato. V m = 500 [S]
5 10 6 10 8 10 10 1 . 5 10 -3 2 10 -3 -3 -4 -4 -4
Log [S]
- 3.301 -3.222 -3.097 -3.000 - 2.824 - 2.699
v
55 90 170 250 385 445
L o g v/Vm - v
- 0.914 - 0.660 - 0.288 0 0.481 0.903
Log
v/Vm - v
1 n = 3.12 0
-1 - 3,5
S 50
- 2,5
Log [S]
Fig. 33 - 4. Estudio de la cintica de una enzima alostrica con la expresin de Hill.
Volver inicio
al
17) MODULACION DE ENZIMAS ALOSTERICAS (Fig. 34 - 4).
184
Cuando el modulador es el mismo sustrato y activa a la enzima aumentando su afinidad por el mismo en el sitio activo o disminuyendo la Km o K50, el efecto se denomina Cooperativo Homotrpico y si es otro compuesto distinto al substrato y tambin aumenta la afinidad se denomina Cooperativo Heterotrpico. En el caso de que el modulador inhiba a la enzima el efecto es Antagonista y puede ser Homotrpico o Heterotrpico. La modulacin puede tambin afectar a la Vmx donde esta puede aumentar o disminuir.
Aum ento de la c onc entrac in
D isminuci[on de la concen traci n del modulador -
del m odulador +
A um enta la Vm
Aum ento de la c onc entrac in del m odulador +
D isminuci[on de la concentracin del modulador -
D ism inuye la V m
D ism inuye la K m
Aum enta la K m
( s )
( s )
Fig. 34 - 4.Curvas cinticas producidas por los moduladores.
Volver inicio
al
18) PURIFICACION DE ENZIMAS.
185
Al purificar una enzima o una protena se debe tener claramente definida la actividad biolgica que la caracteriza y sus condiciones ptimas de ensayo, tales como pH y temperatura. Si fuera una toxina habra que buscar un ensayo biolgico donde manifestara su toxicidad, como ser la dosis letal 50 (Mortalidad del 50% de los especimenes sometidos al ensayo). Este valor se determinara para evaluar los distintos grados de purificacin de la muestra inicial y por lo tanto debiera disminuir a medida que se purifica. Es decir, con una preparacin ms pura se mata el 50% de los especimenes con menor cantidad de material puro. Por otro lado en el caso de la purificacin de una enzima que se encuentra mezclada con varias otras protenas y enzimas, se puede distinguir del resto siempre que lleve a cabo una reaccin especfica sobre un determinado substrato. De esta manera no se puede descartar la existencia de otras enzimas como las isoenzimas y aloenzimas. Para distinguir la individualidad de la enzima y su grado de purificacin se recurre a los siguientes parmetros: 1) Cuantificacin de la protena en mg/ml. Consiste en emplear un mtodo colorimtrico por el que se determina la cantidad de protena, de tal manera que se conozca el total de mgs e protena en la preparacin y en cada una de las etapas de purificacin. 2) Definicin de la Unidad Enzimtica, como la cantidad de enzima que catalizar la transformacin de una cantidad de sustrato especfico en producto bajo ciertas condiciones definidas de temperatura y pH. Por lo tanto 1 U = 1 micromol de substrato consumido/ mg de protena de la preparacin enzimtica. 3) Definicin de la Actividad Especfica como los micromoles de sustrato consumido en un minuto por un miligramo de enzima [1 micromol de substrato consumido por min. X ml o bien se puede expresar como la Unidad de enzima X mg de protena (1 Unidad = 1 micromol substrato consumido/min). 4) Actividad Total de la enzima expresada como los micromoles de sustrato consumido/min en los mg totales de protena. 5) El Rendimiento se conoce como la relacin entre la actividad enzimtica obtenida por cada uno de los pasos de purificacin y la actividad total obtenida en la primera etapa. Se obtiene al comparar porcentualmente las Actividades Totales del inicio hasta el final de la purificacin. 6) El nmero de veces que la enzima se ha purificado es la relacin entre la actividad especfica de la primera etapa de purificacin con cada uno de los pasos sucesivos.
TABLA DE PURIFICACION DE UNA ENZIMA GENERICA
186
Homogenizado Precipitacin Cromatografa de Intercambio Inico DEAE Cromatografa de Filtracin en Gel Electrofocacin Isoelctrica
Volumen Total (ml) 2000 250 50 10 10
Protena Total (mg) 5000 1000 80 10 5
Actividad Actividad N de Puri- % rendiEspecfica Total ficaciones miento (U*/mg) (U*) 10000 2 1 100 4000 4 2 40 3000 2000 1500 37,5 200 300 18,8 100 150 33,3 20 15
U * = Unidad Enzimtica = 1 micromol/min a 25 0C. La enzima ejemplo fue aislada en una cantidad de 5 mg y con una purificacin de 150 veces y un rendimiento del 15%. El homogenizado inicial se lleva a cabo segn el tipo de tejido, en el caso de que este sea fibroso como el msculo se procede en un homogenizador estilo juguera (fig. 35a - 4) o si es blando como rin se procede en un homogenizador estilo Potter que consiste en un cilindro central que gira dentro de un tubo de vidrio aplastando el tejido contra la pared. En el caso de un tejido blando como hgado, tambin se emplea un homogenizador formado por un mbolo central y un cilindro (estilo Dounce). Por otro lado se puede recurrir a una prensa donde se pasa el tejido impulsado por un mbolo por dos lminas con mltiples perforaciones, pero de distinto tamao para retener el tejido conjuntivo. El homogenizado debe permanecer a 4C en un tampn al pH adecuado a la enzima. En cada una de las subsecuentes etapas se extraen alcuotas para determinar la concentracin de la protena y su actividad especfica. Se debe tener el cuidado de no formar espuma durante la preparacin ya que significa protena denaturada. La precipitacin del homogenizado se efecta mediante una solucin saturada de sulfato de amonio y la enzima puede estar en la fraccin precipitada o sobrenadante. Si la enzima est en el precipitado se procede a dializar para extraer el exceso de sulfato de amonio junto con tomar las alcuotas respectivas y prepararse para la columna de intercambio inico en la siguiente etapa de purificacin. El DEAE -Celulosa (fig. 35b - 4) es una matriz de celulosa con grupos Dietilaminoetilo de carga positiva y por lo tanto se fijarn a la columna todas las protenas de carga negativa a un determinado pH.
187
a)
HOMOGENIZADORES
HOMOGRNIZADORES
Potter
Dounce
Blendor
Prensa
b)
Cromatografa de Intercambio Inico CH Celulosa N +

2 5
c)
Cromatografa de Filtracin en Gel
CH
5
2 5
CH
2
Partcula de Dextrano
DEAE - Celulosa
d)
Electrofocacin Isoelctrica + pH 3 4 5 6 7 8 9
e)
-
Electroforsis -
Fig. 35 - 4. a) Homogenizadores b) Cromatografa de Intercambio Inico c) Cromatografa de Filtracin en gel. d) Electrofocacin Isoelctrica e) Electroforesis.
La elucin se lleva a cabo variando el pH o cambiando la concentracin salina del tampn de elucin de esta manera el cambio de carga en la superficie de la enzima como respuesta al pH o los iones de la sal que se interponen entre las cargas permiten la salida fraccionada de las protenas, entre las cuales estar la enzima. Esta ltima puede ser detectada al analizar los distintos fracciones eludas. Suponiendo que la enzima se ha purificado un cierto nmero de veces, pero que an no est pura del todo se procede a la cromatografa de filtracin en gel (Fig. 35c - 4) donde se produce la separacin de las protenas por su distinto tamao molecular. La fase slida de la columna est formada por partculas de Dextrano o Acrilamida que son polmeros de cadena larga que a su vez se pliegan sobre s mismo, formando huecos de distintos tamaos para que pasen las protenas. Las protenas ms grandes pasarn por fuera y eluirn antes de la columna, mientras que aquellas de menor tamao pasarn por los huecos y tendrn un camino ms largo que recorrer separndose de las anteriores. De esta manera si la enzima sali de la columna de intercambio inico mezclada con otras protenas de igual carga, ahora se podr separar ya que debe tener un tamao distinto al de las protenas contaminantes. Por ltimo se procede con la Electrofocacin Isoelctrica (Fig. 35d - 5) donde se emplea una matriz slida formada por Dextrano la que se encuentra cargada con distintos tampones para obtener un gradiente de pH desde el valor 3 a 9. Se aplica la mezcla de protenas a purificar en el centro a pH 7 y luego se conecta un campo elctrico en ambos extremos del gradiente.
188
Las protenas migrarn de acuerdo al campo elctrico y a la carga que posean detenindose cuando se muevan sobre un pH que las haga alcanzar su punto isoelctrico. De esta manera se producirn distintas bandas, tanto de protenas contaminantes que han alcanzado su punto isoelctrico como de la enzima que se pretende aislar. La enzima se supone purificada cuando a pesar de sucesivas etapas de purificacin la actividad especfica permanece igual. Por otro lado se puede ratificar la pureza mediante la tcnica de Electroforesis (Fig. 35e - 4). Esta ltima consiste en la separacin de protenas a un determinado pH en una matriz slida polimerizada formada por Acrilamida o Agarosa, la que se encuentra embebida en un tampn. Estas matrices son sometidas a un campo elctrico donde se obtiene la separacin de las protenas debido a sus cargas y tamao molecular. Cuando se detecta solo una banda de protena como responsable de la actividad enzimtica se asume como purificada.
Volver inicio
al
189
15) REFERENCIAS Enzimologa, O. Viratelle. Ediciones Omega, Barcelona 1976 Outlines of Biochemistry Conn,E.E. ,Stumpf ,P.K. Bruening,G. and Doi, R. H., John Wiley & Sons , 1987 Problemas e Exerccios em Bioqumica, Emilio y Ottilia Mitidieri, Editorial Interciencia (Brasil). Ro de Janeiro, Brasil, 1978. Energy, Enzymes and Catalysis Problem Set http://www.biology.arizona.edu/biochemistry/problem_sets/energy_enzymescatalysis/energy_enzymes-catalysis.html
190
Hctor Rocha L. Las Vitaminas
AMINAS DE LA VIDA VITAMINAS 195 IMPORTANCIA DE LAS VITAMINAS EN EL CEREBRO 196 CLASIFICACIN DE LAS VITAMINAS 196 VITAMINAS HIDROSOLUBLES 196 1) NIACINA O VITAMINA PP O B3 197 2) RIBOFLAVINA O VITAMINA B2 200 3) TIAMINA O VITAMINA B1 203 4) BIOTINA O VITAMINA H 206 5) COBALAMINA O VITAMINA B12 208 6) AC. FOLICO O VITAMINA Bc O B9 7) PIRIDOXINA O VITAMINA B6 217 219 213
8) AC. ASCORBICO O VITAMINA C VITAMINAS LIPOSOLUBLES 1) VITAMINA A 221 221
2) VITAMINA D 224 3) VITAMINA E 226 a) EL OXIGENO COMO FUENTE DE RADICALES LIBRES 229 230
b) LOS LPIDOS COMO BLANCO DE LOS RADICALES LIBRES 4) VITAMINA K 232
193
VITAMINAS.
194
El metabolismo intermediario de plantas y animales presenta una serie de reacciones de distinta naturaleza durante la degradacin y sntesis de las molculas. Algunas de estas reacciones pueden ser de Carboxilacin, Oxidacin, Fosforilacin, etc. Todas ellas se caracterizan por ser catalizadas enzimticamente, es decir una protena con un sitio activo cataltico se une a un substrato bajando la barrera de energa de la reaccin con lo cual aumenta la velocidad del proceso hacia la formacin de un producto, siempre que la reaccin sea termodinmicamente factible. En algunas de estos casos las reacciones necesitan de molculas que aporten energa y en otros casos de molculas que tomen la energa disipada por la reaccin. A pesar de los principios enunciados anteriormente, an no son posibles algunas reacciones a pesar de ser termodinmicamente factibles y de que cuentan con la enzima adecuada, la concentracin de substrato y las condiciones de pH y temperatura necesarias. Parece ser en estos casos, que el sitio activo de la enzima requiere de una cierta capacidad extra, que no posee el conjunto de aminocidos que lo forma a pesar de su disposicin espacial para enfrentar al substrato. En otras palabras, existe la carencia de una cierta actividad extra requerida por el sitio activo y esta falta es suplida por la presencia de una pequea molcula, denominada COENZIMA. La Coenzima participa de la catlisis en el sitio activo y permanece al final de la reaccin inalterada. Esta molcula no se encuentra estructuralmente relacionada con los aminocidos y solo se asocia al sitio activo por medio de enlaces que pueden ser de tipo covalente, electrosttico o enlace hidrgeno. Sus funciones son bastante variadas y puede participar en la transferencia de protones, tanto en la Oxidacin como la Reduccin del sustrato, as como tambin puede inducir su polarizacin electrnica o transferir un grupo qumico desde un sustrato a otro. Es posible que la coenzima tambin intervenga en la introduccin de nuevos grupos funcionales al sustrato, etc. Las Coenzimas se necesitan a todo nivel metablico y son sintetizadas por bacterias, levaduras y plantas, pero no en los mamferos con la excepcin de los rumiantes, donde la flora bacteriana de sus estmagos segmentados es capaz de sintetizar suficiente vitamina para sus necesidades. En humanos y algunos animales las vas metablicas de la sntesis de estos compuestos no estn representadas por genes ya que estos ltimos se han perdido total o parcialmente, debido a que las vitaminas han estado presentes en la dieta durante gran parte del proceso evolutivo. A su vez las Coenzimas son derivados de las VITAMINAS que se encuentran distribuidas en los alimentos y a la vez se encuentran presentes en el organismo, si es que la dieta es balanceada. Todas las vitaminas al ser empleadas como Coenzimas requieren de algunas modificaciones en su estructura, que comprenden reacciones de fosforilacin, adenilacin, metilacin, etc. El nombre de VITAMINA fue puesto por Kasimer Funk al descubrir que una Amina cuaternaria en la cscara del arroz, era esencial para la vida. Su carencia se produjo a consecuencias de la revolucin industrial a principios del siglo XX, cuando se crearon mquinas que permitan sacar la cscara al arroz. Como la dieta de los Orientales consista mayormente en arroz, se provoc la enfermedad denominada Beri-Beri, que se curaba al beber una infusin de la cscara misma. Otra enfermedad conocida desde tiempos antiguos y que afectaba principalmente a marineros y piratas durante la poca de los barcos a vela, fue el Escorbuto. Esta dolencia se erradic durante el siglo XIX mediante el consumo de jugo de limn por los tripulantes durante sus largas travesas. Volver al inicio IMPORTANCIA DE LAS VITAMINAS EN EL CEREBRO.
195
El cerebro por su metabolismo, es el rgano que hace mayor consumo de vitaminas tanto por sus neuronas como sus clulas gliales. As tenemos que la Tiamina (B1), Riboflavina (B2), la Niacina (PP o B3) junto al cido Pantotnico son necesarias en los procesos bioqumicos relacionados con la degradacin de la Glucosa y produccin de ATP, durante su funcionamiento normal. Por otro lado durante la vida fetal son indispensables el cido Flico (B9) y la Cobalamina (B12), que intervienen en la sntesis de DNA y consecutivamente en el crecimiento del cerebro. Durante la etapa de mielinizacin, las clulas ya no se dividen, pero es necesaria la vitamina B12. Por otro lado el c. Flico interviene continuamente en la transferencia de Metilos durante la sntesis de neurotransmisores como la Dopamina, Serotonina y Epinefrina. De esta manera, la falta de Vitamina B12 y cido Flico (Vitamina B9) acarrea trastornos nerviosos tanto al cerebro del individuo en desarrollo como el adulto, por falta de mielinizacin y carencia de neurotransmisores. La vitamina B1 o Tiamina es necesaria para la sntesis de la Acetil Colina y ocurre que durante la enfermedad denominada Beri-Beri los niveles de este neurotransmisor se encuentran disminuidos, siendo en parte responsable de los trastornos neurolgicos que la acompaan. La vitamina B6 o Piridoxina es la responsable de la sntesis de otros neurotransmisores como Dopamina, Serotonina y GABA (-Amino-Butrico). Su falta provocada por la presencia de anticonceptivos orales que actan como antagonistas de la vitamina, puede provocar convulsiones por dficit de estos neurotransmisores. Ms an se ha detectado que las vitaminas C y E protegen a las estructuras del cerebro de la accin de los Superxidos (O2-) y Superhidroxilos (OH.) conocidos como radicales libres. Estos compuestos son capaces de destruir estructuras celulares especialmente lpidos poliinsaturados, como aquellos que se encuentran en la mielina. Volver inicio CLASIFICACION DE LAS VITAMINAS En la actualidad las Vitaminas han sido identificadas en su totalidad junto a su mecanismo de accin, pero an persisten molculas similares consideradas candidatos a vitaminas como son la Colina, el Inositol, cido Lipoico, etc. Las Vitaminas se dividen en dos grupos: a) Solubles en agua: 1) Niacina 2) Riboflavina 3) Tiamina 4) Biotina 5) Cobalamina 6) c.Flico 7) c. Ascrbico 8) Piridoxina al
b) Insolubles en agua:
196
1) Vitamina A con sus vitmeros o formas similares conocidas como Retinal, Retinol y Retinoico. 2) Vitamina D con sus vitmeros Ergocalciferol, Colecalciferol, 1,25-di-OH-Colecalciferol. 3) Vitamina E o -Tocoferol. 4) Vitamina K con vitmeros como Filoquinona o Menaquinona. Volver inicio VITAMINAS HIDROSOLUBLES 1) NIACINA o B3. En 1912 Funk lanz la hiptesis de que el factor conocido desde 1867 por los qumicos como c. Nicotnico, curaba un mal denominado Pelagra (del italiano pelle agra, que significa piel agria). Esta enfermedad era conocida desde el siglo XVIII en Italia y se caracterizaba por la presencia de las 3 Ds, Dermatitis (lceras cutneas escamosas), Diarrea (inflamacin de la mucosa intestinal) y Demencia (esquizofrenia o falta de procesamiento correcto de la informacin). La Pelagra se difundi, en Europa desde que se llev el trigo del Nuevo Mundo y se le emple como cereal. El problema aparece cuando durante su tratamiento para hacerlo comestible, no se emple el agua de cal como se hace en Mxico haciendo biodisponible al aminocido Triptfano precursor de la Niacina, antes de preparar las tortillas. El c. Nicotnico recibe el nombre actual de NIACINA y su otra forma con un grupo amido es denominada NIACINAMIDA (Fig. 1 - 5). al
H C HC HC C O C OH
H C HC HC C O C N H2
+
N
CH
+
N
CH
Ac. Nicotnico
NIACINA
Fig. 1 - 5. Estructura de la Niacina y la Niacinamida.
Nicotinamida
NIACINAMIDA
En la forma de Coenzima, la Niacinamida (Fig. 2 - 5) se encuentra unida a otras molculas como un Dinucletido: NIACINAMIDA-RIBOSA-FOSFATO-FOSFATO-RIBOSA-ADENINA y se denomina NIACINAMIDA DINUCLEOTIDO o NAD.
197
Otra forma de la Coenzima se encuentra unida a un grupo fosfato en el carbono 2' de la Ribosa del c. Adenlico y se denomina NADP o NIACINAMIDA DINUCLEOTIDO FOSFATO. Ambas molculas NADP y NAD con y sin el grupo 2- Fosfato respectivamente, participan en reacciones de oxido-reduccin y se caracterizan por tomar o donar protones a los substratos en reacciones catalizadas por las siguientes enzimas: ENZIMAS VIAS METABOLICAS 1) Glutmico Deshidrogenasa 2) 3-P-Gliceraldehido Deshidrogenasa 3) Lctico Deshidrogenasa 4) Piruvato Deshidrogenasa 5) Isocitrato Deshidrogenasa 6) -Cetoglutarato Deshidrogenasa 7) Malato Deshidrogenasa 8) L (+) Beta -OH Acil-SCoA Deshidrogenasa 9) -Cetoacil-SCoA Reductasa 10) ,- Acil-SCoA Reductasa 11) Glutmico Deshidrogenasa Metabolismo Aminocidos Gliclisis Gliclisis Entrada al Ciclo Tricarboxlico Ciclo Tricarboxlico Ciclo Tricarboxlico Ciclo Tricarboxlico Beta Oxidacin de cidos Grasos Sntesis de cs. Grasos Sntesis de cs. Grasos Metabolismo de los Aminocidos
BASE NITROGENADA
HC HC O
FOSFATO
H C C O C NH2
+
N
CH
CH O
2 H
O H
BASE NITRO NITROGENADA

NH C C C N N C 2
P O
H HO O CH 2 H H HO O H
RIBOSA
H OH N
NAD
FOSFATO
o
NADP
: Niacinamidadenin dinucletido :
P O
O H
O O P O
Niacinamidadenin dinucletidoFosfato
AL ADICIONAR FOSFATO AL 2' OH
RIBOSA
OH H
Fig. 2 - 5. Estructura de las Coenzimas NAD y NADP.
198
La Coenzima NADP se reduce, tanto en la Va de las PENTOSAS, como en la reaccin catalizada por la enzima Mlica (Pg. 277, Fig. 12 - 9). Posteriormente se oxida, en la sntesis de cidos grasos y colesterol. En cambio la coenzima NADH + H entrega directa o indirectamente protones al Complejo I de la Mitocondria representado por la NADH Deshidrogenasa en la Cadena de Transporte de Electrones. En este lugar debido al elevado potencial de Oxido-Reduccin (-0,32 volt), conque se oxida NADH + H, la reaccin es lo suficientemente exergnica para generar a lo largo de la cadena un gradiente quimiosmtico entre un compartimiento y otro, el que finalmente disipa parte de su energa como calor y el resto la emplea en la sntesis de ATP. El aminocido Triptfano mediante una va que emplea PALP puede ser convertido a Niacina en el hombre, de tal manera que la ingesta repetitiva de alimentos faltos en triptfano, como el maz, empleado en algunas culturas nativas (Mxico), puede acarrear la enfermedad conocida como Pelagra. La falta de Piridoxina y la subsecuente Coenzima PALP tambin puede acarrear pelagra ya que 60 mg de Trp son necesarios para producir tan solo 1 mg de Niacina. En cambio los cereales no refinados, la levadura y las carnes de vaca, cerdo y conejo son ricas en Triptfano y por ende en Niacina. La forma oxidada de la Coenzima en su anillo piridnico tiene carga + y puede aceptar un Hidrro o Hidrgeno con carga negativa, es decir acepta dos electrones. Las posiciones a ocupar pueden ser la 2, 4 o 6 (Fig. 3 - 5), pero durante la estabilizacin por resonancia del compuesto, se prefiere la posicin 4. Mientras que el segundo protn del sustrato queda siempre en solucin.
HIDRURO
H
HC
H O C C HC + C H N C NH 2
H H HC HC N C
H O C CH C NH 2
Fig. 3 - 5. Mecanismo de accin de la Coenzima NAD o NADP.
En el animal la carencia de esta vitamina produce una inflamacin y ulceracin de mucosas del hocico y del esfago con una pigmentacin azul oscura en la punta y borde de la lengua. Se produce tambin una deformacin de los huesos de las patas y una anemia normoctica. En el hombre, la enfermedad de Hartnup por ejemplo se caracteriza por un sarpullido en la piel, que se hace sensible a la luz, adems de hiperqueratosis, ataxia cerebelar, inestabilidad emocional y aminoaciduria. Se observa una disminucin de la absorcin del Triptfano junto a otras -aminocidos, debido a problemas en su abosorcin tanto en el intestino como durante la reabsorcin que se efecta en el rin.
Volver inicio
al
199
2) RIBOFLAVINA o B2 Esta vitamina se identific por la dcada de 1930 y esta formada por un triple anillo nitrogenado de Isoaloxacina denominado Flavina, el que es inestable a la luz UV y se encuentra unido a una Ribosa o Ribitol, que es un alcohol polihidroxlico (Fig. 4 - 5). Ambas molculas al estar unidas forman la Riboflavina. Se le encontr primero en la leche, luego en la cscara de los cereales, carne de vacuno, pescados y huevos. Esta vitamina es sintetizada originalmente por plantas y microorganismos.
H HC 3 C C C HC 3 C H C C N C C C C C H H OH OH OH 2 O O P OH O H N C C N O C N H C O
Isoaloxacina
RIBOFLA VINA
H H H H
Ribitol
Fosfato
Fig. 4 - 5. Coenzima Flavina Mononucletido.
F A D : Flavin Adenina dinucletido

H HC 3 C C C HC 3 C H C C N H OH OH OH 2 O O P OH O O P OH O C H N C C N O N C C N O C N H C O
Isoaloxacina
RIBOFLA VIN A
H H H H
C C C C C H
Ribitol
N H2 C N
Fosfatos
H HO OH
Adenina
Ribosa Ac. Adenlico
Fig. 5 - 5. Estructura de la Coenzima FAD
200
La forma molecular de la Vitamina puede ser fosforilada, (Fig. 4 - 5) para formar a la Coenzima denominada Flavina Mono Nucletido (FMN). Esta ltima puede ser tambin adenilada para constituir una nueva Coenzima de nombre Flavinadeninadinucletido (FAD) (Fig. 5 - 5). Ambas Coenzimas participan en el metabolismo intermediario en reacciones de Oxido-Reduccin, capturando dos protones y dos electrones de los sustratos, los que se guardan en el anillo de Isoaloxacina, (Fig. 6 - 6).
La parte activa de la molcula se encuentra en el recuadro oscuro

H HC 3 C C C HC 3 C H C C N N C C N O C NH C HC 3 C C HC 3 C H H H C C C N N O C C C N H NH C O
+ + 2H + 2e
O
R OXIDA DAES COLORA M A RILLO
R REDUCIDAES INCOLORA
Fig. 6 - 5. El anillo de la Coenzima acepta reversiblemente dos protones y dos electrones.
Tanto FMN como FAD son agentes oxidantes superiores a NAD y NADP+ . Pueden participar en reacciones con Radicales Libres, con metales e incluso directamente con el Oxgeno a nivel de los Peroxisomas, durante la Oxidacin de cidos grasos (Ver Cap. Metabolismo de Lpidos). Algunas de las enzimas en que interviene la Coenzima FAD son: ENZIMAS 1) Succinato Deshidrogenasa 2) cido graso Deshidrogenasa 3) Piruvato Deshidrogenasa 4) Glucosa Oxidasa VIAS METABOLICAS Oxidacin , de cs Dicarboxlcos en el Ciclo Tricarboxlico 1 Etapa de la -Oxidacin de cs. Grasos Oxidacin a la entrada del Ciclo Tricarboxlico De Hemiacetal a Lactona o desde -D-Glucosa ms O2 a D- Glucono-1,5 Lactona ms H2O2 Desde un Alcohol a un Aldehdo Desde un D-Amino a -Iminocido y posteriormente a - Cetocido Desde NADH o NADPH a NAD o NADP respectivamente
5) Glicolato Oxidasa 6) Aminocido Oxidasa
7 ) Diaforasa
201
Las coenzimas FMN y FAD se encuentran tambin como grupos prostticos de los transportadores denominados Flavoprotenas, que despus de tomar los protones de una reaccin de oxidacin los pasan al Complejo III de la Cadena de Transporte de Electrones en la Mitocondria. Parece ser que el Potencial Redox (E) (Ver Cap. Cadena de Transporte de Electrones) o la capacidad de donar u aceptar protones y electrones por la Coenzima FAD, no es fija y vara segn est unida a una enzima o se encuentre libre. Esta propiedad depende a su vez de la resonancia de los electrones pertenecientes al triple anillo (fig. 6 - 6). Al estar reducida la capacidad de resonancia se pierde. Su E depende entonces, de la cantidad de resonancia que perdure despus de la unin a una enzima. Si la forma oxidada (FAD) se une dbilmente y la reducida (FADH2) fuertemente, tiende a permanecer reducida en comparacin con la Coenzima FAD libre y el Potencial Redox (E) ser menos negativo o con menos capacidad de donar electrones. Si la forma Oxidada (FAD) se une fuertemente y la reducida (FADH2) dbilmente a una enzima, la Coenzima tiende a permanecer oxidada o con ms capacidad de donar electrones al compararse con la coenzima libre. Esto ocurre en la reaccin del complejo de la Piruvato Deshidrogena. En este caso dona protones y electrones al NAD, en vez de recibirlos de este (Ver ms adelante en la Vitamina Tiamina). En el hombre la carencia de Riboflavina se debe a la falta de consumo de productos animales y se asocia a trastornos cutaneomucosos con lesiones en las zonas de unin entre la piel y mucosas. En la cara aparece una dermatitis seborreica y en los labios se forma una costra exudativa acompaada de una lengua color rojo magenta. Sin embargo, estos signos no son especficos y pueden encontrarse en otros tipos de avitaminosis. En el animal tambin aparecen lesiones cutneo mucosas, inhibicin del crecimiento, hipersalivacin y lagrimeo acompaado de sensibilidad a la luz, conjuntivitis, calambres y elevada mortalidad neonatal.
Volver inicio
al
202
3) TIAMINA Fue aislada por Funk en 1910 de la cutcula del arroz, sin embargo la enfermedad que produce su carencia, el beri-beri se conoca en China desde el 2600 AC. La vitamina esta formada por una Piridina unida por medio de un Metileno a un anillo Tiazlico, (Fig. 7a - 5).
NH 2 Metileno C N C HC 3 N C C CH 3 H C S C CH CH 2 2 O O
a)
CH N 2 C
OPOPO O O
2,5 DIMETIL- 4 AMINOPIRIMIDINA b)
4 - METIL - 5 HIDROXI ETILTIAZOL
Pirofosfato
PIRUVATO CON DIFERENCIALES DE CARGA + Y O R C + S C COOH H+ R OH C C C CH 3 COOH S C CO 2 R ACETALDEHDO ACTIVADO OH C C C CH 3 S C R ACETALDEHIDO O C H C C CH 3 H S C
R1
+ N
C C CH 3
R2
R1
R2
R1 N R2
R1
+ N
R2
Carbanin en el Anillo TIAZOLICO
Fig. 7a - 5. Estructura de la Vitamina B1 o Tiamina. La coenzima presenta un Pirofosfato en el extremo OH del anillo Tiazlico y se denomina Tiamina Pirofosfato o TPP. Fig. 7b - 5. Mecanismo de accin de la Coenzima TPP. Eliminacin del grupo Carboxilo como CO2
La coenzima participa en descarboxilaciones (Fig. 7b - 5) y transcetolaciones. La TPP puede ser considerada como una coenzima portadora de aldehdos activados. Su mecanismo de accin es por medio de la formacin de un Carbanin en el anillo tiazlico al soltar este un protn, enseguida este carbanin se une a los grupos Cetos, debido al diferencial de carga positivo en el carbn Ceto y este diferencial de carga negativo en el Oxgeno electronegativo. Una vez formado el aducto este pierde el CO2 quedando el 2-hidroxietil derivado que abandona la coenzima como un aldehdo quedando esta ltima inalterada como al principio. En la reaccin del Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa, (Fig. 8 - 5) la enzima Piruvato Descarboxilasa emplea a la Coenzima TPP en la reaccin de descarboxilacin para formar un Acetaldehdo transitorio. Este es posteriormente entregado al cido Lipoico para que lo pase a otra Coenzima conocida como la Coenzima A. Una reaccin similar a esta es la descarboxilacin del c. -cetoglutrico en el CTC donde participa la misma coenzima TPP.
203
Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa

CH-CO-COOH 3 T P P
1
CO 2
CH-CO - S 3 HS
OH CH-C-T P P 3 H
2
S L S H S H S L
1 : 2 : 3 :
Piruvato Descarboxilasa Dihidrolipoil Transacetilasa Dihidrolipoil Deshidrogenasa

FADH 2
FAD
NAD
NADH + H
Fig. 8 - 5. Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa en la mitocondria.
En el hombre la Tiamina es parcialmente sintetizada por las bacterias del intestino, pero la cantidad no es suficiente para satisfacer las necesidades y por lo tanto debe estar en la dieta. La forma activa de la coenzima es la fosforilada o la conocida como Tiamina Pirofosfato (TPP). La Tiamina se encuentra en la mayora de los tejidos animales y vegetales. Su dficit produce acumulacin de c. Pirvico e incluso de c. Lctico en la sangre, acarreando una serie de trastornos en el metabolismo de los Hidratos de Carbono. La carne de pescado crudo posee una enzima conocida como Tiaminasa, que destruye a la vitamina y en aquellos pases donde se le consume de esta forma se observa una elevada incidencia de Beri-Beri. El sndrome de Wernicke-Korsakoff es un desorden autosmico recesivo que es ms comn en los Europeos que en los Asiticos, ya que estos ltimos son an capaces de resistir dietas deficientes en Tiamina. Ocurre aqu que los pacientes presentan fibroblastos con una menor afinidad por la Tiamina y se les debe suministrar una mayor cantidad de la vitamina, ya que la Transcetolasa (fig.9 - 5) de la Va de las Pentosas la une con 10 veces menos afinidad que la normal. En estos casos, no se pueden reintegrar a la Va de la Gliclisis como Fructosa-6-P, el exceso de productos de la va de las Pentosas (Ribulosa-5-P transformada por Epimerasa en Xilulosa-5- P y Ribosa-5-P) tanto en el Hgado como en el Tejido Adiposo y Glndula mamaria. Este sndrome tambin afecta a los Alcohlicos, lo cual se debe a dietas generalmente ricas en carbohidratos que aumentan la demanda de Tiamina durante su metabolismo y a la
204
inhibicin por el alcohol de una ATPasa implicada en la absorcin de la vitamina desde el intestino. En general la persona aquejada presenta confusin, dao en el sexto nervio ocasionando oftalmoplejia (parlisis en el nervio motor del ojo) y nistagmus u oscilacin rtmica de los ojos, todo esto es acompaado de psicosis, temblores en las manos, labios cados, mirada extraviada e incapacidad para desplazarse correctamente y retener en la memoria hechos cotidianos.
CH2OH =O HO - - H H-
Transcetolasa + Tiamina Profosfato O HO
CH2OH =O HO - - H H - - OH
-2
+
H - - OH CH2PO3
Xilulosa-5-P
H - - OH H - - OH
-2
+
H - - OH
-2
CH2PO3
CH2PO3
H - - OH -2 CH2PO3
Eritrosa-4-P
Gliceraldehido-3-P Fructosa-6-P
5 Carbones
4 3 Carbones Carbones Transferencia de 2 Carbones
6 Carbones
Xilulosa-5-P
Eritrosa-4-P
Gliceraldehido-3-P Fructosa-6-P
Fig. 9 5. Transcetolasa de la Va de las Pentosas
Volver inicio
al
205
4) BIOTINA. Se la aisl de la yema de huevo en 1931 y se la sintetiz en 1942, (Fig. 10 - 5). En 1940 se demostr que un factor termolbil presente en la clara de huevo, la glicoprotena Avidina presentaba una gran afinidad por la biotina de la yema impidiendo las reacciones enzimticas en que participaba la biotina. Por lo tanto la ingestin de huevo crudo no aporta provecho vitamnico en este aspecto. La Biotina se encuentra asociada a una serie de enzimas que intervienen en la carboxilacin de los sustratos como se muestra aqu: ENZIMAS 1) Piruvato Carboxilasa 2) Acetil CoA Carboxilasa 3) Propionil CoA Carboxilasa 4) -Metil Crotonil CoA Carboxilasa VIAS METABOLICAS Gluconeognesis Sntesis de cs. Grasos Entrada de los restos de cs. Grasos de cadena impar al Ciclo Tricarboxlico Catabolismo de la leucina
La Biotina es importante para el metabolismo de los hidratos de carbono, lpidos y protenas al intervenir en reacciones de carboxilacin y transcarboxilaciones.
La parte activa de la molcula aparece con un recuadro

O C H H N C HC 2 S BIOTINA TIPO N H
C CH
H CH CH
CH 3
C OOH O C H N C HC 2 S N H
C CH
H CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 C OOH
BIOTINA TIPO
Fig. 10 - 5. Estructura de la Biotina Alfa en la clara de huevo y de la Biotina Beta en
la carne de vacuno.
206
La Coenzima se une covalentemente a una Lisina de la enzima husped mediante su grupo carboxilo y durante la reaccin toma un grupo carbonilo activado con ATP en la forma de Carbonil-Fosfato para ser luego entregado al sustrato de la reaccin (Fig. 11 - 5) Su carencia es caracterizada por dermatitis escamosa con una piel griscea acompaada de sequedad piel y mucosas. La carencia se asocia con anorexia, nuseas y postracin.
O
ATP
HCO 3
Mn
HO P O O C O
ADP
Parte activa de la molcula

O O C H H N C HC 2 N H C H
O O C C N H C HC 2 N H C CH S H C H C H (C H) 3 2 CO NH ENZIMA
H O P O
C H C H C H (C H) 3 2 CO NH ENZIMA
O O C O
BIOTINA
BIOTINA
BIOTINA cargada con un carbonilo
Fig. 11 - 5. Mecanismo de accin de la Biotina.
Volver inicio
al
5) COBALAMINA.
207
Solo en 1955 se logr determinar su estructura qumica, aunque se le conoca desde 1925 como un factor aislado a partir de hgado de ternera capaz de curar la anemia perniciosa. La Cobalamina es una vitamina sintetizada exclusivamente por las bacterias intestinales de los rumiantes, siendo posteriormente almacenada en el hgado. La ingesta de una dieta que incluye carne de rumiantes, leche y queso, se considera adecuada como fuente de vitamina B12 en el hombre. Los vegetales no tienen vitamina B12. La estructura de la vitamina consiste en un ncleo tetrapirrlico con un tomo de Co en su centro unido por cuatro nitrgenos. A esta estructura se le denomina anillo de CORRINA. El Co se encuentra coordinado por debajo de este anillo, a uno de los Nitrgenos pertenecientes al complejo formado por la 5,6-Dimetil-Bencimidazol Ribosa Fosfato. El otro punto de unin de este complejo al anillo es lateral y ocurre por medio del 3' Fosfato y el Aminoisopropanol, unido a uno de los anillos pirroles (Fig. 12 - 5).
H O OH OH
5' Deoxiadenosina
N
N H N O C C CH 2 N H2 HC 3 CH 2 CH 2 O CH 3 N N N +3 Co CH N CH 3 H 2 C N H2 H CH 2 O NH 2
HN 2
H O CH C 2 HC 3 CH O C HN 2 CH 2 3 CH 2 O CH 2
Anillo de Corrina o Tetra pirrol

HN 2
CH
2 CH 2 C NH
CH 3
O N N O O OH H
CH OH
Amino
CH 3
CH O C H
P
H O
Iso - Pro panol
5 , 6 - Dimetil - Beicimidazol Ribosa Fosfato
CH
2 H H
Fig. 12 - 5. Estructura de la vitamina B12 o Cobalamina Deoxiadenosina.
cargada con una
5-
Para la absorcin de esta vitamina se requiere del factor intrnseco, que es una glucoprotena secretada por las clulas parietales del estmago. Cada molcula de glucoprotena fija dos molculas de vitamina B12, evitando la degradacin de esta. Una vez fijada, pasa al intestino donde se une a receptores especficos del ilen. En esta porcin del intestino se libera y entra a la clula intestinal pasando enseguida a los microsomas donde se transforma en coenzima B12 o 5-deoxicobalamina.
208
O N H H C O P O
H C 2 H O H
S IN T S .P U R IN A S
CHO O HC H N 2 H N P O
H C 2 H
S IN T S . P IR IM ID N A S
N
N AD P H + H
dTM P
O
H O H
N H O P P
O
H O H
7, 8 D ihid ro F o la to T im id ila to S inta s a
T H F
+
N H 3
5 - A m in o im id a zo l - 4 - c a rb o xa m id a R ib o n u c le tid o
O H
T H F
F o rm il G lic in a m id a R ib o n u c le tid o H C O P O
H C 2 H
O N H N 2
N 10 F o rm il TH F
P O P N - F o rm ila m in o im id a zo l
H N 2
H C 2
N 10 F o rm il TH F
P P
O
H
N H O P
O
H O H H O H
dU M P
N 5 ,N 1 0 M e tile n TH F
N AD P
O H O H G lic in a m id a R ib o n u c le tid o
4 - C a rb o xa m id a R ib o n u c le tid o
N 5 ,N 1 0 -M e te nilTH F NH4 N 5 - F o rm i m ino -T H F

+
T H F N AD P H + H N 5, N 10 M e tile n TH F
S er-T rans H idroxim etilas a
M TH F R e d uc ta s a
T H F
T H F
N 5 M e til T H F
G lu
F orm im ino G lu T rans feras a
H is
M et
B 1 2 H o m o C y s te in a
G ly
G lic ina D es c arboxilas a
Ser
H om oc is tena M etil T rans feras a o M etionina S intas a
CO2 + NH4 + NADH+H
G ly + NAD+
Fig. 13 - 5. Importancia de la Vitamina B12 y el c. Flico en la disponibilidad de Purinas, Pirimidinas y en el metabolismo aminoacdico. 210
La falta de la vitamina B12 provoca la aparicin de anemia megaloblstica caracterizada por un bajo recuento de eritrocitos acompaados de un gran tamao. La vitamina B12 y el c. Flico actan en conjunto y se necesitan para la sntesis de los cidos nucleicos. Intervienen en la sntesis de Purinas y Pirimidinas, necesarias para la formacin de Nucletidos que se necesitan para la sntesis de cidos nucleicos disponibles para la divisin celular durante la maduracin de las clulas sanguneas Como se observa en la figura 16 - 5, en la vitamina conocida como Folacina o c. Flico, existen dos Nitrgenos denominados N5 y N10 que es donde se unen los grupos a transportar. Por lo tanto el grupo Metilo unido al N5 se denomina N5-Metil Tetrahidroflico (N5-Metil -THF) y al ser entregado a la Cobalamimna, el cido Flico queda libre como THF. Ahora la Metil-Cobalamina transfiere el grupo Metilo a la Homocistena para finalmente formar Metionina (fig. 14 - 5). En caso contrario, no se libera c. Flico y se acumula como N5-Metil THF, por falta de Cobalamina o B12. Cmo consecuencia de ello se debilita el metabolismo de los aminocidos en aquella reaccin que se dirige de Homocistena a Metionina (Met) y tambin desde Histidina (His) a Glutmico (Glu). La acumulacin del N5-Metil THF afecta los niveles de N5-N10Metilen-THF, N10-Formil-THF y por consiguiente, la sntesis de las Purinas y Pirimidinas. Ambas son necesarias para la formacin de los cidos nucleicos en aquellas clulas precursoras de los eritrocitos. Por otro lado, la sntesis de Glicina (Gly) a partir de Serina (Ser), tambin se ve afectada (fig. 13 5). En el hombre la forma activa de la vitamina B12, es la Metil Cobalamina (CH3-Cobalamina) y la 5-Desoxiadenosil o 5-Deoxiadenosil Cobalamina. La primera de ellas, se emplea en la conversin de Homocistena a Metionina por la Homocistena Metil Transferasa junto al N5-Metil-THF en el citoplasma, como s observa en la figura 14 5. La segunda de ellas aparece involucrada en el reordenamiento del compuesto L-MetilMalonil-SCoA, producto de la -Oxidacin de los cidos grasos impares en la Mitocondria y del metabolismo de los aminocidos ramificados a Succinil-SCoA para entrar al CTC (Fig. 15 5).
C H3
Acumulacin de N5-Metil THF Treonina, Metionina, Isoleucina, por falta de B12 Acs. Grasos Impares
N5 - THF 3 CH3-CH2-CO-SCoA, Propionil-SCoA CH
COBALAMINA o B12
ATP + Homocistena Metil Transferasa COBALAMINA o B12
S C H2 C H2 C H N H2 COOH
Metionina
THF CO2 + ATPC H 3

ScoA Bajo Propionil nivel de Carboxilasa
COBALAMINA
o Metionina Sintasa
COOH C H2 CH 2
5- Desoxiadenosil Metil-Cobalamina SH
CH CH 3 COOH
THF por falta D - METILMALONIL - SCoA de B12
C H2 Cobalamina Homocistena C H2 C H N H2 Mutasa CO OH
D metil C O S Co A C O S Co A Malonil - SCoA Racemasa Succinil - SCoA Valina L - Metilmalonil CoA Fig. 14 - 5. La Metilcobalamina interviene en la sntesis de la Metionina por metilacin de la Homocistena. Fig. 15 - 5. La deoxi o desoxicobalamina interviene en el reordenamiento de la L-Metil211 Malonil-SCoA
La falta de B12 en los animales jvenes produce un retraso en el crecimiento y una falta de coordinacin en los movimientos junto a procesos inflamatorios del hgado y la lengua. En las aves, fuera del retraso en el crecimiento se observa una reduccin en la capacidad de incubacin de huevos con numerosas malformaciones. Volver inicio al
212
6) ACIDO FOLICO. En 1945 se determin su estructura qumica y se procedi a sintetizar esta vitamina, pero se le conoca desde 1935 como un factor que se encontraba presente en el hgado y las levaduras, cuya carencia provocaba anemia Macroctica o Megaloblstica.
A c . Flic o
P T E R IN A R
O H
P A m ino B enzoico
G lutm ic o
5
N C H 2
10
N H
O C N H
C O O H C H C H C O
N H N N
2 C H2
M etileno
E l grupo transportado R puede estar unido a los N itrgenos 5 o 10 e incluso am bos N itrgenos al m ism o tiem po R = - C H O - C H O - C H = N H - C H = C H -C H 3 A c. N 5 - Form il T H F A c N 10 - Form il T H F A c. N 5 - Form im ino TH F A c. N 5 - 10 M etilen T H F A c. N 5 - 10 M etenil T H F A c. N 5 - M etil T H F
Fig. 16 - 5. Estructura del cido Flico y Grupos transportados en N5 y/o N10.
TABLA QUE INDICA LA UNIN DE LOS GRUPOS A TRANSPORTAR

CH2 | CH - CH2 N 10- C CH2 | CH - CH2 N 10- C CH2 | CH - CH2 N 10- C
/ N5 H
H THF
/ N5
/ N5
CH3 N5-Metil THF
CH NH2
N5- Formimino THF
CH2 | CH - CH2 N 10 - C
/ N5
CH
/ N5
CH2 | CH - CH2 N 10 - C
/ N5
CH2 | CH - CH2 N 10 - C
O N10-Formil THF
CH2
CH N5, N10 Metenil THF
N5,N10- Metilen THF
213
Su estructura se observa en la figura 16 5, junto a los grupos que transfieren mediante su enlace a uno u ambos Nitrgenos N5 y N10, como se observa en la Tabla que la acompaa. El c. Flico esta formado por una Pterina que se encuentra unida por un metileno al c. para-Aminobenzoico, formando entre ambos el c. Pterico. Este a su vez se une al grupo Amino del c. Glutmico formando el c. Pteroilglutmico. En la forma natural la molcula de c. Pterico se une a un Poliglutamato, es decir no es tan solo una molcula de c. Glutmico sino que varias de 3 a 7 unidades. Los grupos transferidos por el c. Flico intervienen en una serie de reacciones, como la formacin de dTMP a partir de dUMP (fig. 13 - 5), en la sntesis de Metionina a partir de Homocistena donde el radical N5- Metil-THF transfiere el Metilo a la Cobalamina y esta como Metilcobalamina lo entrega a su vez a la Homocistena para formar finalmente Metionina (Fig. 17 - 5). Tambin se le encuentra en el catabolismo de la Histidina a c. Glutmico y en la interconversin de la Serina y la Glicina por la Transhidroximetilasa (Fig. 13 - 5): Serina Transhidroximetilasa Glicina + Hidroximetil THF <--------------------------------------------> Serina + THF El c. Flico se encuentra en las hojas de espinaca o los vegetales verdes, hgado, huevos, queso, leguminosas y carne de vaca. Su carencia en el hombre produce anemia megaloblstica asociada a una leucopenia y es imposible de distinguirla de la carencia de vitamina B12. Los eritroblastos incapaces de llevar a cabo la mitosis presentan una fase S muy larga y mueren en la mdula sea. Si la mejora se obtiene rpidamente con dosis fisiolgicas de c. Flico, se atribuye la anemia a la carencia de esta vitamina. Si la deficiencia es de vitamina B12 el paciente no se repone con las dosis normales de c. Flico y se la denomina Anemia Perniciosa. .
ATP
METIONINA
COBALAMINA O B12
METIONINA SINTASA
N5,N10-METILEN THF
METILEN -THF REDUCTASA
Gly
S- ADENOSIL - METIONINA CICLO SAdenosil Metionina 3 Pi HOMOCISTENA
N5-Metil THF
CICLO FOLATO Ser
CISTATIONINA SINTASA
METIL COBALAMINA
THF
CISTATIONINA CISTENA
Fig. 17 5. Cadena por medio de la cual se transfiere el grupo Metilo desde la Ser hasta la SAdenosil Metionina, con la ayuda del c. Flico y de la Vitamina B12. La S- Adenosil Metionina es empleada para Metilar diversos compuestos.
214
En la Fig. 17 5, se observa la formacin de la S - Adenosil Metionina mediante la intervencin del c. Flico y la vitamina B12. La S- Adenosil Metionina transfiere el grupo Metilo a las Bases del RNAt, a los aminocidos de las protenas, a la Fosfatidil Etanolamina para formar Fosfatidil Colina, a la Adenina o la Citosina del DNA, al c. Guanidino actico para formar Creatina y a la Noradrenalina en la sntesis de Adrenalina. Es el principal agente metilante. Cualquiera falla en la enzima Cistationina Sintasa produce acumulacin de Homocistena que aparece luego en la orina. Una falla en las otras enzimas Metionina Sintasa o MetilenTHF Reductasa, tambin pueden conducir a la acumulacin de Homocistena.
Metionina
Formato
THF
N5Formimino Glu
Nucletidos de Purina
B12
Homocistena dTMP Serina
N10-Formil THF
His
Glu
N5 Metil THF
FADH2 FAD
B12
N5- Formimino-THF
Glicina
dUMP
N5, N10 Metilen THF
N5, N10 Metenil THF
NADP
NADPH + H
Fig. 18 - 5. Distintas interconversiones del c. Flico en el metabolismo de los aminocidos Gly, Ser, His, Glu, Met y los Piridn Nucletidos
En la figura 18 5, se observan en un cuadro resumen las distintas interconversiones del c. Tetrahidroflico junto a la vitamina B12 o Cobalamina y el metabolismo de los aminocidos junto a su intervencin en la sntesis de Purinas y Pirimidinas incluyendo el paso de dUMP a dTMP.
215
La falta de c. Flico en mujeres durante la gestacin produce defectos en el tubo neural de los recin nacidos conocido como espina bfida o abierta, debido a que las vrtebras no cubren bien el tubo neural y el cerebro no se desarrolla totalmente. En el animal despus de un tratamiento con sulfamidas y antibiticos que matan la flora intestinal se produce una falta de c. Flico que acarrea trastornos del crecimiento, anemia y desnutricin, cada de pelo, despigmentacin, trastornos en la reproduccin, lactancia y malformaciones fetales
Volver inicio
al
216
7) PIRIDOXINA O VITAMINA B6. La Piridoxina fue reconocida en la dcada de 1930 como un derivado de Pirimidina con tres grupos distintos en la posicin 4, la Piridoxina o Piridoxol, el Piridoxal y la Piridoxamina (Fig. 19 - 5).
CH OH 2 HO CH CH OH 2
N
Piridoxina
HO CH 3 CHO CH OH 2
N
Piridoxal
HO CH 3 CH NH 2 2 CH OH 2
N
Piridoxamina
Fig. 19 - 5.Tres formas o vitmeros de la vitamina B6.
Se le encuentra en las levaduras, grmenes de cereal, verduras, frutas, yema de huevo, leche, carnes rojas e hgado. Su funcin se caracteriza por estar asociada a enzimas como:
1) Transaminasas, donde el grupo amino de un aminocido pasa a un Cetocido, en este caso el primero se transforma en un Cetocido y el segundo en un aminocido, (Fig. 20 5).
Son importantes la Glutmico Pirvico Transaminasa (GPT) y la Glutmico Oxaloactico Transaminasa (GOT). GPT Alanina + c. -Cetoglutrico <----> c. Glutmico + c. Pirvico
217
NH O C 3 C H NH2 COOH Alanina C H HO HC 3 H O CHO 2 N PALP P OH OH C H C 3 O C H
2 2 CHO 2
O P OH OH
HO HC 3
COOH Pirvico
N Piridoxaminafosfato
NH2 COOH CH2 CH 2 C COOH HO O HC 3 CHO 2 N Piridoxaminafosfato C H 2 COOH O P OH OH CH2 CH 2 C H NH 2 HO HC 3 C
O H O CHO 2 N Piridoxalfosfato P OH OH
COOH Ac. Glutmico
Ac. Alfa - Cetoglutrico
Fig. 20 - 5.Reaccin de transaminacin por la enzima Glutmico Pirvico Transaminasa.
GOT Ac. Asprtico + Ac. -Cetoglutrico<----> c. Glutmico + c. Oxaloactico 2) Transformacin de ciertos aminocidos en aminas o neurotransmisores por descarboxilacin en las reacciones tipo: R-CH-NH2-COOH ----> R-CH2-NH2 + CO2 3) Desaminasas, deaminacin oxidativa de la Serina y de la Treonina en el Hgado. 4) Degradacin del triptfano. 5) Sntesis del c.-Amino-Butrico. En el hombre su falta es difcil de diagnosticar, pero se caracteriza por Dermatosis seborreicas, acn, calambres, etc. En el animal se produce retraso del crecimiento, formacin de costras, pelaje sin brillo, pelo hirsuto y edemas en los ojos. Se observa en aves una disminucin de la puesta y gran mortalidad embrionaria.
Volver inicio
al
218
8) AC. ASCORBICO O VITAMINA C. Su carencia se conoce desde hace ms de 2000 aos y se manifestaba principalmente por la enfermedad denominada Escorbuto (fig. 22 5). Esta dolencia era conocida por los navegantes de largas travesas. En 1928 Szent-Giorgy logr aislarla y su estructura se determin en 1932. La vitamina C se identific como el c. L-ascrbico, (Fig. 21 - 5).
1 2 3 4 5 6
C C OH O C OH
H HO
C C H
CH OH 2
Fig. 21 - 6. Estructura del c. Ascrbico. Sus tomos de carbono aparecen numerados.
Estructuralmente se define como la lactona de un cido hexurnico que consta de un grupo alcohol primario en C6, y de un grupo alcohol secundario en C5 ms un radical lactona que une los carbones 1 y 4. Su regin funcional es el doble enlace entre los carbones 2 y 3 donde se entregan o se aceptan dos protones por medio de una oxidacin reversible. El Ascorbato es capaz de potenciar la accin de la vitamina E al reaccionar con el radical Tocoferil (Fig. 25 - 5) y regenerar a la vitamina E formando el radical estable Ascorbil A-. Se le encuentra en vegetales y frutas ctricas, pero se destruye en parte por la coccin. El c. Ascrbico interviene en la Hidroxilacin de la Prolina durante la sntesis del Colgeno, por lo tanto durante el escorbuto el tejido conectivo pierde su rigidez ya que faltan los enlaces hidrgenos entre los aminocidos hidroxilados (Ver Captulo de protenas). Otra de las funciones de la vitamina C es como antioxidante al proteger contra los compuestos txicos formados por el Oxgeno como lo es el Superxido. Junto a la vitamina E estara protegiendo a los cs. grasos poli-insaturados presentes en las bicapas celulares. Tambin interviene en el metabolismo del hierro, donde es necesaria para su absorcin y en el metabolismo de la Tirosina. Solo en el cobayo se puede inducir como modelo un escorbuto con atrofia muscular y ausencia de movimiento, inhibicin del crecimiento y retraso en los procesos de cicatrizacin.
219
Fig. 22 5. Presencia de llagas atribuidas al Escorbuto
Volver inicio
al
220
B) VITAMINAS LIPOSOLUBLES. Estas vitaminas son derivadas de Isopreno, no son solubles en agua y se las puede considerar tambin como lpidos. Se encuentran en el Hgado de los animales y en las semillas oleaginosas. Las megadosis de estas vitaminas son txicas y se acumulan en el tejido graso y en el hgado del hombre. Su absorcin ocurre en la mucosa intestinal y es similar a la de un lpido requiriendo de secrecin biliar. En otras palabras pasan por el sistema linftico hasta entrar a la sangre y unirse a las lipoprotenas del plasma. Estas vitaminas liposolubles se identifican por los nombres de: 1) Vitamina A con tres vitmeros o formas distintas de la misma vitamina: a) Retinal b) Retinoico c) Retinol 2) Vitamina D, con varias otras formas, Ergocalciferol de origen vegetal y Colecalciferol de origen animal. La forma ms activa es el 1,25-Dihidroxi-Colecalciferol. 3) Vitamina E, cuyo nombre es Tocoferol 4) Vitamina K, conocida como Filoquinona o Menaquinona segn la identidad de su cola hidrofbica. Volver inicio al
1) VITAMINA A Desde la antigedad se suministraba Hgado para sanar algunas enfermedades humanas, conocidas ahora como asociadas a la carencia de las vitaminas liposolubles, pero no fue hasta la dcada del 30 y el 40 cuando se logr sintetizar los factores responsables de la cura. Los compuestos como Retinol, Retinal y Retinoico provienen del - Caroteno, pigmento vegetal que se encuentra en zanahorias y tomates. Este se absorbe en las paredes del intestino y posteriormente durante su metabolismo es degradado por uno de sus extremos (Fig. 23 - 5). Es conocido como Pro-vitamina A y puede inactivar al Oxgeno singlet (Oxgeno reactivo de alta energa) al atrapar su energa para convertirse de la forma cis a la forma trans. Con ello impide las reacciones txicas causadas por el Oxgeno aberrante y tiene un efecto anticancergeno. La vitamina A se puede encontrar en sus tres formas como Retinal, Retinol y Retinoico en el aceite de hgado de pescado, hgado de mamferos, mantequilla, leche, queso y huevos.
Importancia en la visin. El Retinal forma parte de un pigmento visual en las clulas en bastn, que se denomina Rodopsina formado por la unin entre la protena Opsina y el Retinal, (Fig. 24 - 6). Cuando la luz ilumina las clulas en bastn de la retina, la protena Rodopsina se separa del retinal que
221
pasa de la forma cis a la trans en la insaturacin del C 11, pero en la oscuridad se regenera pasando nuevamente el C 11 a la forma cis y se une nuevamente a la Opsina para completar otro ciclo visual. La reconversin del Retinal en la oscuridad ocurre por medio de una Isomerasa que transforma la forma alcohol o Retinol 11 trans a Retinol 11 cis, pero la enzima tiene un Km alto y necesita el aporte de Retinol en la dieta para llevar a cabo la isomerizacin adecuadamente (Fig. 24 - 5). Una Oxido Reductasa es la encargada de pasar reversiblemente Retinal a Retinol.
17
16 7 1
19 9 11
20 13 15
2 3 4
6 5 18
10
12
14
Caroteno 8'
C HO
apo 8 ' CAROTENAL 12 '

C HO
A partir del precursor
Caroteno
Se forman tres VITAMEROS de la APO !2 ' CAROTENAL VITAMINA A
C HO
Retinal o Vit A
17 16 7 1 2 3 4 18 6 5 8 10 12 14 C HO H 2 19 9 11 20 13 15
COO
Retinoico o Vit A
Retinol o Vit A
Fig. 23 - 5.Degradacin de la molcula de Beta-Caroteno.
La falta de retinal produce ceguera nocturna, que se caracteriza por la falta de percepcin de los contornos en los objetos al oscurecer. La Rodopsina al recibir un fotn cambia su configuracin y activa cataltica mente a las molculas de una protena intermediaria denominada Transducina, para empezar una amplificacin estilo cascada. La Transducina activa una enzima que rompe al segundo mensajero GMPc con lo que se cierran los poros de entrada al ion Sodio polarizndose la membrana. Si se restauran los niveles de GMPc se abren nuevamente los poros y la membrana se despolariza disparndose un potencial de accin. El c. Retinoico es tambin de importancia en la sntesis de las glicoprotenas que actan como lubricante en las mucosas.
222
Su mecanismo de accin parece ser el de facilitar el transporte de Hidratos de Carbono al Lmen del retculo endoplsmico rugoso por medio del movimiento Cis - Trans que facilitara la entrada de Hidratos de Carbono para la sntesis de las Glicoprotenas.
Luz Rodopsina
Retinal - 11 - cis
17 16 7 1 2 6 8 3 5 4 18 19 9 11 12 10 13 14 15 1 2 6 3 5 4 18 8 17 16 7 19 9 11 20 13 15
Rodopsina
Retinal - 11 - trans
CHO
10
12
14
Retinol o Vit A
CHO
Opsina
Retinol Deshidrogenasa Retinal Isomerasa
Opsina
Retinol - 11 - cis
Retinol - 11 - trans
DIETA
Debido al alto Km de la Enzima se requiere del aporte de la dieta para saturarla

Fig. 24 - 5. Ciclo Visual.
Si las protenas no s Glicosilan no se lubrican las mucosas y se resquebrajan entrando en ellas las infecciones. Esta enfermedad se denomina Xeroftalmia y afecta no solo al ojo provocando la opacidad de la crnea, sino que a otros lugares como, lengua, tubo digestivo, etc. La forma alcohlica de la vitamina denominada Retinol presenta analoga con el mecanismo de accin de los esteroides sexuales, ya que aumentara la fertilidad y podra actuar en el control de la expresin de algunos genes. La carencia de esta vitamina en animales especialmente hembras produce Hiperqueratosis metaplsica de las mucosas, atrofia de los ovarios y disminucin de la tasa de puesta y fecundacin, mientras que en los fetos su falta produce malformaciones y muertes embrionarias. Volver inicio 2) VITAMINA D. al
223
El raquitismo (fig. 25 - 5) es conocido desde la antigedad, ya que el empleo del aceite de hgado de bacalao y la luz solar como paliativos a esta enfermedad, no tuvieron importancia hasta el siglo XVIII o XIX. Solo desde 1930 en adelante se aisl la vitamina D y se pudo realizar su sntesis.
Fig. 25 - 5. Piernas arqueadas producto del Raquitismo
La incidencia de luz UV en la dermis del hombre provoca la ruptura del anillo B en el 7 deshidrocolesterol, produciendo la molcula de Colecalciferol o vit. D, (Fig. 26 - 5). La otra forma denominada Ergosterol es sinttica. Si esta vitamina no se encuentra en la dieta de una persona que recibe una adecuada cantidad de luz UV, se le puede considerar como una hormona. En general la Vit. D es un esteroide ciclopentanofenantrnico que difiere en sus formas por la cadena lateral hidrocarbonada.
224
La Hipofosfatemia o la Hipocalcemia gatillan el mecanismo que estimula la formacin del

PIEL
2H C
DIETA
Luz
HO
Colecalciferol
HO
HIPOFOSFATEMIA
HIGADO
2H C
Colecalciferol
25 - Hidroxilasa
OH 25
7 - Deshidrocolesterol
HIPOCALCEMIA
HO
25 - OH - Colecalciferol
1 - Hidroxilasa RION
1HO OH 25
HO
1,25 - Di - OH - Colecalciferol
INTESTINO
TUBULO CONTORNEADO DEL RION
Absorcin de Calcio
CALCEMIA FOSFATEMIA
Se disuelve hueso para liberar Calcio

Fig. 26 - 5.Formas activas de la Vitamina D y su metabolismo.
metabolito ms activo de la vit. D. El 1,25-Dihidroxi Colecalciferol que estimula en el tbulo contorneado del rin la reabsorcin de Ca junto con incrementar la asimilacin de Ca en el intestino y a la vez la liberacin de Ca por el hueso mediante la accin de los osteoclastos. Este sistema se regula a su vez produciendo el intermediario 24,25-Dihidroxicolecalciferol de bajsima actividad. Una vez restaurado los niveles de Ca y Fsforo normales, el mecanismo de liberacin de Ca se detiene al ser controlada por retroalimentacin la hidroxilacin del vitmero 1,25 Dihidroxicolecalciferol. En los animales jvenes su falta provoca inhibicin del crecimiento, prdida de peso corporal y disminucin del apetito junto a algunas crisis tetnicas, como es el caso de los lechones. Por otro lado, se puede observar tambin una deformacin de los huesos del esternn en pollos junto a la columna vertebral y huesos de la pelvis en mamferos. En las aves su falta se caracteriza por la produccin de huevos con cscara delgada, embriones mal formados y trastornos posturales. En los humanos se producen nios con las piernas arqueadas hacia fuera. Volver inicio al
225
3) VITAMINA E Es ampliamente conocida como un agente estabilizador de membranas y a la vez antioxidante. Se le sintetiz en la dcada del 30 y se la identific como un -Tocoferol. La Vitamina se encuentra formada por un anillo sustituido de Benzoquinona (Hidroxicromona) con una cadena fitil saturada (Fig. 27 - 6) o insaturada (Tocotrienol). La parte activa es el grupo hidroxi, ubicado en los anillos centrales y que puede romperse homolticamente generando el radical Tocoferilo (TO ) con un electrn no apareado.
C H 3 C H H C 3 C H 3 O C H 3 C H 3 C H
H O
3 3 C H 3
D L -T O C O F E R O L
R a d ic a l T o c o fe rilo
R
Fig. 27 - 6. Estructura de la vitamina E junto al radical Tocoferil.
La vitamina E se localiza en las membranas celulares con el anillo hacia el medio acuoso interior o exterior de la clula y la cadena fitilo hacia el centro, en contacto con las colas del resto de los Fosfolpidos de tal manera que puede difundir lateralmente. A consecuencias de ello inhibe la destabilizacin de las membranas y sus Fosfolpidos, al contribuir a la unin de los cidos grasos que se puedan encontrar libres, ya que estos ltimos actan muchas veces como detergentes de las membranas provocando la disrupcin de la bicapa. Por otro lado, el Tocoferol es tambin capaz de provocar estabilizacin del complejo LDL-Colesterol, impidiendo su oxidacin y posterior degradacin. De esta manera se impide el depsito de Colesterol en las arterias y el inicio de la enfermedad cardaca. El Tocoferol se encuentra en el aceite de trigo, maz y semillas oleaginosas, mientras que en los animales se le halla en hgado, huevo y productos lcteos. Su metabolismo se ha relacionado con el control de la sntesis de los grupos HEME, el manejo del Fe y el estado de oxidacin de la Coenzima Q entre otras cosas. La carencia de Tocoferol provoca en animales distrofia muscular y degeneracin de la fibra muscular cardaca, carencia de espermios y anomalas en los tejidos fetoplacentarios. Antes de analizar las reacciones en que interviene el Tocoferol, es necesario considerar algunas caractersticas de los Radicales Libres. Estas especies qumicas poseen una alta reactividad, ya que son producidas por ruptura homoltica de un enlace covalente. Los Radicales Libres se caracterizan por tener uno o ms electrones desapareados en su capa ms externa y pueden ser clasificados como reductores (donan electrones a una molcula aceptora y esta se reduce) o como oxidantes (aceptan electrones de una molcula donante y la oxidan). A su vez son capaces de atacar macromolculas claves
226
del metabolismo celular, como son los Fosfolpidos de membrana, Protenas y cidos Nucleicos, es decir son los causantes del estrs oxidativo en la clula. En la Tabla 1 5, se observa de forma genrica las etapas de Iniciacin, Propagacin y Terminacin de las reacciones en cadena producidas durante el ataque por un Radical Libre- Oxidante , a una membrana (LH: Lpido reducido, L: Radical metileno y LOO : Lpido peroxidado o Radical Alquil Peroxilo) junto al efecto protector de un Antioxidante-H: TABLA 1 - 5 LH + Oxidante ------ L + Oxidante H L + O2-------- LOO LOO + LH ----- L + LOOH L + L ---- eliminacin del radical L + LOO ---eliminacin del radical LOO + Antioxidante-H--- LOOH + Antioxidante Iniciacin Ciclo de Propagacin Ciclo de Propagacin Terminacin Terminacin Terminacin de la reaccin en cadena Siempre que se pueda atrapar el Radical la reaccin en cadena termina.
A continuacin en la Tabla 2 6, se observan los Potenciales de Reduccin (E) a pH 7,0 de las distintas parejas Redox, cuyos Radicales se encuentran ordenados desde el ms Electropositivo al ms Electronegativo. TABLA 2 5. Pareja Redox HO , H+ / H2O (Radical Hidroxilo / Agua) LOO , H+ / LOOH (Radical Peroxilo/ Alquilo reducido) o Alquil peroxilo GS / GS(Radical Glutatin / Glutatin reducido) c. Graso c. Graso Poli-insaturado , H+ / Poli- insaturado-H (Radical metileno / c. Graso reducido) TO , H+ / TOH (Radical Tocoferilo / Tocoferol) H2O2, H+ / H2O, HO (Perxido de Hidrgeno / Radical Hidroxilo) Ascorbato -, H+ / Anin Ascorbato Radical Ascorbato / Ascorbato monoanin O2 / O2 (Oxgeno/ Oxgeno Superxido) E Volt + 2,310
+ 1,000
+ 0,920 + 0,600
+ 0,480 + 0,320 + 0,282 - 0,330
El radical Tocoferilo por su posicin en la Tabla 2 5, es capaz de atrapar los radicales libres y disipar su energa. Su Potencial Redox (E = + 0,480 volt), le permite actuar
227
concertadamente con la Vitamina C o Ascorbato (E= + 0,282 volt) formando una Cadena de Transporte de Electrones protectora. El orden en que reacciona el Tocoferol (TOH) con un Radical Alquil Peroxilo (LOO ) sera el siguiente: LOO + TOH Ascorbato + TO LOOH + TO Ascorbato + TOH
Los compuestos de ms arriba en la Tabla 1 5, sacan electrones a los de ms abajo, de esta manera se elimina al Radical Peroxilo ( LOO) dejando un Radical Tocoferilo ( TO ). ste ltimo puede ser reciclado por Ascorbato. De esta manera un radical que se encuentra en un bicapa lipdica es sacado a un medio acuoso, donde se encuentra el radical Ascorbato que recupera el Tocoferol. Por lo anterior es posible asumir que ambas vitaminas E (Tocoferol) y C (Ascrbico) parecen actuar de manera concertada. En la figura 28 - 5, se observa la cadena por la cual NADH soluble es el reductor final que regenera al c. Ascrbico de la cadena. Los Lpidos reducidos LH de la membrana en presencia de un compuesto X y Oxgeno, pueden dar origen a los radicales L (radical metileno) y LOO ( radical peroxilo). Ambos producen reacciones en cadena dando origen a otros radicales (Fig. 31 - 5). Sin embargo su accin puede ser frenada mediante la accin del Tocoferol TOH. Este ltimo es capaz de entregar radicales H y TO, capaces de cancelar las reacciones de propagacin por medio del electrn faltante. Por otro lado el c. Ascrbico o Vitamina C, puede recuperar al radical TO al reducirlo nuevamente a TOH. A su vez el c. Ascrbico como radical C , se recuperar por medio del NADH +H.
NADH
NAD
C X XH
O2 TOH
LH L LOO
TO LOOH
LOOH
LH
Fig. 28 - 5. Formacin de radicales libres por accin de un compuesto X y peroxidacin con O2
Fuera de actuar como antioxidante y proteger los cidos Grasos insaturados, Protenas y DNA, la vitamina E o Tocoferol estabiliza la estructura de las membranas y
recientemente se le atribuye un rol en la transduccin de seales.

Volver inicio al
228
a) EL OXIGENO COMO FUENTE DE RADICALES LIBRES La fuente de Radicales Libres es generalmente el Oxgeno. Aunque este es esencial para la vida y normalmente poco reactivo, puede ser convertido en una serie de compuestos aberrantes, cuando es reducido de manera secuencial (fig. 29 5). Es decir, electrn por electrn hasta aceptar finalmente un total de 4 electrones para formar agua. La adicin de un primer electrn al Oxgeno forma Superxido ( O2 - ). Este al recibir un segundo electrn forma Perxido de Hidrgeno (H2O2), que no es un radical libre, sin embargo es un fuerte de compuesto oxidante. A continuacin al recibir tres electrones el Oxgeno genera el Radical Hidroxilo ( OH . ), que es altamente reactivo. Estos compuestos intermediarios decaen en energa a medida que son reducidos y algunos de ellos son an capaces de generar compuestos potencialmente txicos para las clulas como el Radical Perhidroxilo ( .OOH) a partir del Superxido ( O2 - ).
O O Superxido
O:H
O O:
Oxgeno Singlete
Radical Perhidroxilo
+e +e
+7 ,6 Kcal/mol
- 21,7 Kcal/mol
H :O O : H
Perxido de Hidrgeno
+h = + 22 Kcal/mol
+e H O Radical Hidroxilo +e
- 8,8 Kcal/mol
O O Oxgeno Triplete (estado basal)
+ + H :O:H
Agua
Energa Libre Estndar G
- 53,7 Kcal/mol
H :O:H
Agua
Fig. 29 5. Ubicacin de las formas aberrantes del Oxgeno segn su energa y estado de reduccin.
El Oxgeno triplete o basal se denomina as, ya que genera tres bandas cuando es sometido a la tcnica de EPR (Electrn Paramagnetic Resonance). Esta consiste en aplicar un fuerte campo magntico que desplaza a la nube electrnica hacia un polo del enlace y luego la hace resonar o agitar con un haz de microondas. Una fraccin de esta energa es absorbida por la molcula y la otra es emitida, lo que permite estudiar las interacciones que ocurren en ella. En el caso del Oxgeno singlete, este nombre (del ingls single: nico, solo) se refiere a una forma activada del Oxgeno por medio de radiacin (h x ) y presenta tan solo una banda a diferencia del triplete con tres bandas.
229
Volver inicio
al
b) LOS LPIDOS COMO BLANCO DE LOS RADICALES LIBRES
Entre las molculas atacadas por los radicales libres, encontramos que son especialmente susceptibles los cidos grasos poli-insaturados (fig. 30 5). Estos poseen grupos Metilenos ( CH2-) cuyos Hidrgenos pueden ser removidos fcilmente debido a la presencia del doble enlace en el tomo de carbono adyacente. El radical Hidroxilo, OH (reducido con tres electrones), es uno de los compuestos aberrantes ms eficientes en empezar el ataque, en otras palabras es la chispa que inicia el fuego, mientras que el Superxido O2 - no es lo suficientemente reactivo. As tenemos que el ataque por el radical Hidroxilo (OH), sobre un cido graso poli-insaturado como el Araquidnico, se produce en tres etapas bien definidas: La primera de ellas es la de Iniciacin, donde se retira un hidrgeno junto con un electrn (de manera homoltica) del grupo Metileno, formando un radical libre del mismo cido Graso. ste se denominado ahora Radical Metileno. El electrn desapareado tiene resonancia y puede cambiar de posicin al trasladarse por la cola del cido graso considerado como un dieno conjugado. El Radical Metileno, puede reaccionar directamente con el Oxgeno triplete u Oxgeno comn, que tambin puede ser considerado como un biradical con dos electrones desapareados (O : O). De esta manera, se extrae nuevamente un electrn al cido graso para transformarlo en el Radical Peroxilo (LOO ). Este cido graso convertido ahora en Radical Libre, puede sustraer otro protn a una nueva molcula intacta de c. Araquidnico, entrando en un Ciclo o Etapa de Propagacin, el que termina por destruir gran parte de una bicapa lipdica. Sin embargo, la presencia de Tocoferol (Fig. 31 5), puede detener la Propagacin, mediante una nueva Etapa de Terminacin, es decir cuando se dona de manera homoltica un protn y un electrn por el Tocoferol al Radical del cido graso poliinsaturado, se forma nuevamente el cido graso reducido. A su vez el radical Tocoferilo ( TO ), puede reaccionar consigo mismo para formar un dmero incapaz de causar dao o bien puede reaccionar con el Ascorbato.
El Radical Tocoferilo, es tambin capaz de hacer perder energa al Oxgeno singlet (fig. 29 5), aportando electrones con un espn opuesto cancelando su estado activado.
230
AC. ARAQUIDNICO Sustraccin de un H y formacin de un Radical Metileno
OH
O || C FOSFOLPIDO O || C FOSFOLPIDO O || C FOSFOLPIDO FOSFOLPIDO - Radical Metileno
Dieno conjugado
ETAPA DE INICIACIN
O2
Radical Peroxilo
O - O
O || C FOSFOLPIDO
FOSFOLPIDO H Poli-insaturado ETAPA DE PROPAGACIN
Hidroperxido
O - OH
O || C FOSFOLPIDO
FOSFOLPIDO - Radical Metileno Formacin de un nuevo Radical Metileno al sustraer el Radical Peroxilo un Protn. El Radical Metileno formado entra a un Ciclo de Propagacin
Fig. 30 5. Etapa de Iniciacin con el radical hidroxilo ( OH) y formacin de un dieno conjugado que formar a su vez un radical peroxilo (ROO) mediante la accin del Oxgeno basal. El radical Peroxilo propaga la reaccin a otro fosfolpido con formacin de un Hidroperxido y otro radical Metileno que entran nuevamente a la misma va.
Radical Metileno
O || C FOSFOLPIDO
HO - Tocoferol
ETAPA DE TERMINACIN
c ARAQUIDONICO INTACTO
O || C FOSFOLPIDO
O Tocoferol
Radical Tocoferilo
Dmero inactivo Tocoferol O O Tocoferol
O Tocoferol
Fig. 31 5. Etapa de Terminacin auspiciada por el Tocoferol, cuyo radical Tocoferilo se puede desactivar formando un dmero consigo mismo o reaccionar con el Ascorbato para recuperar su estado original.
Volver inicio
al
231
4) VITAMINA K Se la conoci a principios de siglo como factor antihemorrgico y se consigui sintetizar en 1939. Su ncleo es un 2 metil-1,4 naftoquinona (Fig. 32 - 5) y se la conoce tambin como Menadiona. Cuando posee una cadena lateral cuya metilacin puede variar, forma varios vitmeros como el K1 o 2-metil 3-fitil Naftoquinona y el K2 o 2-metil 3-difarnesil-1,4 Naftoquinona. Su mecanismo de accin esta involucrado en la coagulacin de la sangre al interactuar con los factores de la coagulacin. La vitamina K acta junto a una carboxilasa que introduce grupos carboxilos en el residuo aminoacdico del c. Glutmico, perteneciente a la secuencia de alguno de los factores de la coagulacin. El glutmico recibe un carboxilo en el carbono (Gama) y de esta manera tendr dos carboxilos libres con dos cargas negativas a las que se puede unir el Calcio para disparar el proceso de coagulacin. Se le encuentra presente como K1 en las hojas verdes de los vegetales y como K2 en la flora intestinal. La terapia prolongada con antibiticos disminuye su presencia.
O
H
Menadiona o 1 , 4 Naftoquinona
CH 3
O Filoquinona
O
CH 3 CH 3 CH 3 CH 3
K1
2 - Metil - 3 - Fitil - 1 - 4 - Naftoquinona CH 3
CH 3
O
K2
CH 3 H
2 - Metil - 3 - Difarnesil - 1 - 4 - Naftoquinona
n
Ca O COO CH 2 N H CO 2 C O OOC COO Ca +2 N H C O O C CH
+2 O C O
CH C H2 CH
C H2 C O CH
C H2 CH N H
Fig. 32 - 5. Estructura de los vitmeros de la Vitamina K. Los compuestos de la figura 33 - 5 son derivados de la Hidroxicumarina y poseen una estructura algo similar a la vitamina K, por lo que se convierten en inhibidores competitivos y se emplean como anticoagulantes. La carencia de vitamina K provoca en el animal hemorragias de las mucosas acompaada de astenia y en los pollos una coloracin subictrica. El trbol descompuesto por hongos (mal ensilado) produce una molcula similar a la vitamina K denominada Hidroxicumarina. Esta bloquea la accin de la vitamina K, competitivamente y provoca hemorragias en el ganado.
232
OH
OH
H C H
O OO O
OH
CH 2 CH O
CO
CH 3
DICUMAROL CH OH 3
VARFARINA
CH 2 CH
O O FENIL - PROPILHIDROXICUMARINA
O FENILINDANEDIONA
Fig. 33 - 5. Compuestos antagnicos a la Vitamina K empleados como anticoagulantes. En el hombre la medida del tiempo de coagulacin de la sangre, ser una buena forma de comprobar la existencia de obstruccin biliar causada por un clculo o una inflamacin del coldoco, que impiden la secrecin biliar necesaria para absorber lpidos como la Vitamina K. Volver inicio al
233
REFERENCIAS. Las Vitaminas. , J. Leboulanger. , Publicacin de Laboratorios Roche. Para qu sirven las vitaminas?., P.Langley-Danysz., Mundo Cientfico, Vol 80, 548-557,1988. ,Respuesta de los fotorreceptores a la luz J.L. Schnapf y D.A. Baylor., Investigacin y Ciencia, No 129, 20-28,1987. La Biochimie de L'oxygne C. Deby., La Recherche, Vol 22, 56-64, 1991.
234
Hctor Rocha L. Bioenergtica
BIOENERGTICA
327
1) EJEMPLO DE SITUACIONES TERMODINAMICAMENTE FAVORABLES 330 2) INTRODUCCIN A LA BIOENERGETICA 333 3) PRINCIPIOS Y LEYES TERMODINAMICAS 336 4) EQUILIBRIO DE ESTADO ESTABLE Y EQUILIBRIO TERMODINMICO 340 5) REACCIONES ENDERGNICAS Y EXERGNICAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO 343 6) CARACTERSTICAS DEL CATABOLISMO 348 7) CARACTERSTICAS DEL ANABOLISMO 349 8) ENFOQUE ACTUAL DE LA TERMODINCA APLICADA A LA EXISTENCIA DE LAS MACROMOLCULAS 352 9) CONCLUSIONES GENERALES 356 10) EL ATP 357 11) SNTESIS DE ATP 359 359 363
a) TRANSFERENCIA DE GRUPOS FOSFATOS
b) TRANSFERENCIA DE PROTONES Y ELECTRONES 12) GLOSARIO 369
328
1) EJEMPLOS DE SITUACIONES TERMODINAMICAMENTE FAVORABLES. En nuestro caso la aplicacin de la termodinmica a los procesos biolgicos consiste en llevar la estricta cuenta de la energa y materia que entra y sale de los procesos metablicos.
329
A su vez, estos procesos ocurrirn en compartimientos que se pueden considerar como abiertos, cerrados y/o aislados que podrn estar representados por organelos, citoplasma o clulas. Al emplear esta aproximacin termodinmica, ser posible enfocar desde una macromolcula hasta un individuo completo, junto a las influencias que el entorno ejerce sobre este y a su vez las que el individuo ejerce sobre el entorno e incluso se puede llegar ha desarrollar conceptos ecolgicos. Sin embargo, en este captulo, nos referiremos a los procesos que ocurren en una clula y estos podrn incluir reacciones metablicas de activacin o degradacin de sustratos, transferencia de energa en forma acoplada desde una reaccin a otra, generacin de gradientes de concentracin y carga, etc. En resumen, para entender como ocurren los procesos bioqumicos desde el punto de vista termodinmico, ser necesario entender previamente varios ejemplos relacionados con aquellos eventos u fenmenos que suceden espontneamente o que son considerados como, termodinmicamente favorables o factibles y que ocurren inadvertidos durante la experiencia cotidiana. En general a este tipo de fenmenos no se les presta mayor atencin y se aceptan como si fueran procesos garantizados de que siempre procedern de la misma manera. Dentro de este mbito podemos analizar como ejemplo, lo que suceder con un proceso caracterizado por la dispersin de molculas de perfume desde una botella (Fig. 17). Si dejamos una botella de perfume abierta dentro de una porcin del espacio o en un sistema aislado, que se considera a presin, volumen y temperatura constante. Sin duda que al cabo de un tiempo, el lugar terminar por estar igualmente perfumado en todas sus direcciones. En otras palabras las molculas que estaban en el medio lquido de la botella y a corta distancia unas de otras pasarn a estar separadas, ocupando el volumen total del espacio. Las molculas de perfume tratan de encontrar la mayor distancia entre s.
PROCESOS Estado Sistema aislado A ESPONTANEOS Estado B DESORDEN
DE
ORDEN
PERFUME
Solo aplicando energa se puede devolver
Fig 1 7. Las molculas se separan espontneamente al salir de su recipiente.
Es obvio que no todas las molculas de perfume, volvern a agruparse en un pequeo volumen del espacio constituido por la botella. Este ltimo proceso no es espontneo y para invertirlo, habra que suministrar energa externa al sistema o trabajo desde afuera del sistema en consideracin. Este consistir en comprimir el aire, para luego destilarlo y separar sus componentes. Una vez aislado se retornar a su respectivo recipiente. Otro ejemplo prctico similar al anterior, puede ser visualizado al poner en contacto dos soluciones con distinta concentracin de Sacarosa (Fig. 2 -7). A tiempo 0, ambas soluciones se encuentran separadas por medio de una interfase formada por su desigual densidad. Posteriormente en la solucin ms concentrada, difunde el soluto hacia la menos concentrada o bien el agua de la solucin ms diluida tiende a difundir al interior de la solucin ms concentrada. Despus de un tiempo determinado x, ambos compartimientos
330
permanecern con igual concentracin. Lo sucedido anteriormente, constituye un proceso espontneo, no depende de la cantidad de tiempo transcurrido, podra ser mucho o poco, sin embargo el resultado final siempre ser igual. Para invertirlo tendramos que gastar nuevamente energa para evaporar el agua y concentrar la solucin resultante. Esto significa aplicar energa desde el exterior del sistema. Esto indica que el proceso inverso no es espontneo o termodinmicamente favorable.
Tiempo 0
Tiempo X
soluto sin carga

5M 1M 3M
Equilibrio Osmtico
Fig 2 -7 . La Sacarosa difunde hasta igualar la concentracin en el recipiente.
Un tercer caso (Fig. 3 7), puede estar representado por un compartimiento que tiene una determinada solucin de NaCl y que se encuentra separado de otro lleno de agua pura. La membrana que los separa es solo permeable a los iones positivos de Na+, pero no a los iones de Cl-, ya que se comporta como una bicapa lipdica.
C1, 1 2,C2 C1, 1 C2, 2
C1 > C2 1 > 2
C = C1 - C2 = 1 - 2
Fig 3 - 7. El gradiente de concentracin y potencial o voltaje se oponen.
A medida que migran los iones Na+ desde el compartimiento ms concentrado al ms diluido o izquierda a derecha. Ocurre que el compartimento 2 de igual volumen al 1 se hace positivo, mientras que el 1 se hace negativo. El proceso se detiene cuando algunos iones positivos son empujados nuevamente al compartimiento 1, hasta alcanzar una cierta distribucin. Es interesante notar, que no se produce la electroneutralidad (igualdad de iones positivos y negativos) en ambos compartimientos, ya que la concentracin y distribucin de los iones no es igual. Esta particular distribucin genera una diferencia de potencial ( 1 2 ), que se opone a la posterior migracin de nuevos iones positivos al compartimiento 2.
331
Existe aqu una imparidad entre la distribucin de concentracin y carga a ambos lados de la membrana. La tendencia espontnea a difundir desde el compartimiento ms concentrado (1) al ms diluido (2) determinado por C1> C2, se contrapone a la tendencia de moverse en la direccin opuesta debido a las cargas negativas del compartimiento 1 y las positivas del 2. Las distintas fuerzas opuestas que se enfrentan aqu, tanto la producida por la diferencia de potencial como la producida por la diferencia de concentracin son capaces de llegar al equilibrio. Desde el punto de vista energtico este efecto se reduce a la expresin: Gc = Gp
La energa en base a la diferencia de concentracin, esta dada por la ecuacin: G c = 2,3 RT Log C1/C2 log e = 2,3 Log 10 R: CTE de los gases T: t absoluta en Kelvin La energa en base a la diferencia de voltaje o potencial a ambos lados, est dada por la ecuacin: Gp = z F ( 1 2 ) Z: Carga de los iones F : Constante de Faraday Cuando ambas tienden a igualarse, se tiene la ecuacin de Nernst: = ( 1 2 ) = 2,3 RT Log C1/C2 --------------------------------zF
Esta ltima ecuacin indica el potencial al cual no existe paso de iones positivos a travs de la membrana. Se le conoce tambin como el potencial de reposo ( ), equilibrio o de relajacin entre concentracin y voltaje a ambos lados de la membrana. Por otro lado al continuar con nuestro anlisis, a pesar de que podemos encontrar en que direccin migran los sistemas no es posible determinar el camino por el que lo hacen, es decir la forma en que una molcula de perfume, la molcula de Sacarosa o un in recorren una trayectoria, desde la zona ms concentrada a la mas diluida. Este camino no se conoce, ni tampoco se debe considerar el tiempo que se demoran en hacerlo, tan solo el estado inicial y final es el importante. Los tres ejemplos de los casos anteriores ocurren en lo que se llama sistemas aislados del exterior. No intercambian materia ni energa con el entorno. Volver al inicio 2) INTRODUCCION A LA BIOENERGETICA.
332
Ahora, al analizar sistemticamente los ejemplos anteriores desde el punto de vista termodinmico, podemos considerar que un evento o proceso, debe ser considerado dentro de una porcin del espacio denominado sistema (Fig. 4-7). Este mismo sistema se encuentra a su vez rodeado por el entorno y todo ello, se halla contenido en un espacio que se denomina Universo. Al continuar con la misma lnea de pensamiento, podemos decir que el proceso que ocurre dentro del sistema puede ser de tres tipos: aislado, cerrado y abierto (Fig. 4 7). UNIVERSO A UNIVERSO B UNIVERSO C
NO HAY INTERCAMBIO DE ENERGA (E) NI DE MATERIA (M)
INTERCAMBIO DE ENERGA (E) SOLAMENTE
INTERCAMBIO DE ENERGA (E) Y MATERIA (M)
Sistema Aislado
Sistema Cerrado E
Sistema Abierto E M
ENTORNO
ENTORNO
ENTORNO
Fig. 4 - 7. En los tres Universos A, B y C se observan tres tipos de sistemas
En los sistemas aislados no hay intercambio de materia ni energa con el entorno y pueden ser considerados como ejemplo, aquellos procesos que ocurren dentro de un recipiente de doble pared reflectante y con vaco entre ambas paredes. Aqu no se permite la entrada o salida de calor (botella trmica). Es decir, no hay intercambio de materia y energa. Si una botella trmica con 500ml de agua a la temperatura de t1= 90C, recibe 500ml de agua a la temperatura t2 = 10C, la temperatura interna descender hasta alcanzar un equilibrio entre ambas masas de lquido (40C), siguiendo el principio de Le Chatelier-Brown. Este equilibrio no ser con la temperatura que existe al exterior de la botella o su entorno, sino que la temperatura final estar dada por la ecuacin Q = m x c x t ( m = masa de ambos volmenes de lquido, c = calor especfico del agua, t = temperatura, aplicada a cada una de las masas de agua) Qt (final) = Q ( 90C) - Q (10C) (m1 + m2 ) x c x t (final) = m1 x c x t1 m2 x c x t2 si c es igual en ambos: m1 x t1 m2 x t2 t (final) = ------------------------------------------------ = 40 C ( m1 + m2 )
333
Los procesos que ocurren al interior de un organelo, pueden ser tambin considerados como pertenecientes a un sistema aislado. Si en el interior del organelo existe una enzima, que requiere de cierto pH para manifestar su actividad. Cualquier cambio de este, provocar un cambio en la conformacin de la enzima tomando energa desde el entorno o liberndola hacia el entorno. Este cambio en su conformacin afectar su sitio activo y por lo tanto su actividad enzimtica. Al continuar con la descripcin de los sistemas, encontramos que estos pueden ser del tipo cerrado cercano al equilibrio o cerrado lejos del equilibrio. En un proceso cerrado se intercambia energa con el entorno y si es cercano al equilibrio, se puede considerar como ejemplo, lo que ocurre en el agua al bajar la temperatura. Esta pasa desde un estado amorfo o desordenado a un estado cristalino u ordenado. Aqu se produce una disminucin de la entropa o desorden y una disminucin de la energa contenida en la masa o volumen de agua. El agua se organiza en una estructura ordenada, cuando libera el calor de fusin que es de 80 cal/gr. Este proceso no es espontneo o favorable, pero la baja de temperatura permite una menor agitacin de las molculas y a la vez se libera energa al entorno lo lleva la lleva hasta ese lmite. En este punto la agitacin molecular que mantiene a las molculas separadas, es sobrepasada por la fuerza de atraccin entre las molculas de agua que actan entre s como dipolos dbiles. Este efecto las conduce a formar una red cristalina de molculas estticas con una estructura ordenada que se denomina hielo. En el otro caso, un sistema cerrado lejos del equilibrio, se puede incluir como ejemplo a un depsito aislado que sirve como calentador elctrico de agua. En este sistema, se mantiene en el interior una temperatura constante mayor que la del entorno, mediante el flujo de electricidad hacia una resistencia la cual produce calor. Otro de estos mismos ejemplos, puede incluir a un refrigerador con una temperatura de 4C en su interior y de 25C en el entorno. En este caso existe un compresor que gasta energa elctrica licuando el gas refrigerante. Posteriormente, al circular en forma de lquido por las caeras en el interior del refrigerador se expande y atrapa el calor, el que se disipa en un radiador externo antes de ser comprimido nuevamente con gasto de energa. En ambos casos anteriores, para mantener al agua caliente en el calentador y la temperatura baja en el refrigerador, se requiere de un buen aislamiento en ambos. Si este fuera un 100% efectivo se mantendr la temperatura constante en el interior de ambos y el sistema se puede considerar como cerrado lejos del equilibrio. Sin embargo a pesar de ello, ambos sistemas tratarn siempre de alcanzar el equilibrio con la temperatura del entorno debido a que su aislamiento no es del todo perfecto (nunca lo ser). Si no hay flujo elctrico en el calentador de agua, este transfiere su calor al entorno y se enfra o en el caso del refrigerador, entra calor desde el entorno hasta igualar su temperatura con el exterior. En ambos casos, sino se aporta energa se alcanzar el equilibrio termodinmico o la misma temperatura del entorno. Una aproximacin biolgica a un sistema cerrado lejos del equilibrio, puede ser un sistema transportador de Glucosa del tipo mediado, donde una protena reconoce especficamente a la Glucosa y mediante un cambio conformacional acoplado a la hidrlisis del ATP, lleva Glucosa al interior de la clula en contra de un gradiente de concentracin. Este proceso ocupa ATP como energa para concentrar Glucosa adentro del compartimiento. Si no hay suministro de ATP, la Glucosa puede difundir al exterior e igualar las concentraciones en ambos lados. En este caso la molcula de ATP debe proveer de energa suficiente para mantener el gradiente, ms otra porcin de energa que se debe disipar hacia el entorno, para que el proceso sea termodinmicamente favorable.
334
Por ltimo, los casos anteriores han servido para visualizar a un nuevo sistema, reconocido como abierto donde se mantiene un orden lejos del equilibrio, mediante un flujo constante de energa y materia. Un automvil recibe combustible o energa qumica en la forma de un lquido con una masa determinada. Este a su vez se oxida o combustiona con el Oxgeno del aire. Como resultado se produce una mezcla de gases a una alta temperatura que se encuentra constituida por molculas ms pequeas y desordenadas (CO, CO2 y H2O), cuyo calor se pierde por el escape. Del total del calor producido por la combustin interna se emplea una parte en el desplazamiento mecnico del automvil y la otra parte, se pierde o disipa hacia el entorno por el radiador y escape. Mientras exista combustible el sistema se mantiene en equilibrio de estado estable, es decir produciendo trabajo (desplazamiento) y calor, lejos del equilibrio con el entorno. Por otro lado, sin combustible el sistema toma la temperatura del entorno y no hace trabajo entrando ahora al equilibrio de tipo termodinmico. Un automvil con el tiempo es presa de la entropa, es decir sufre un desgaste mecnico, que se puede medir en ciertos miligramos de metal que se desprenden de su motor y en aquellas partes donde ocurra roce entre metales. Un ser vivo tambin se encuentra sometido a las mismas fuerzas externas, pero se autorepara hasta que este ltimo sistema cae tambin bajo la entropa. Otro ejemplo similar de sistema abierto estara constituido por un dispositivo calentador de agua conectado a una red domiciliaria. Este aparato entrega energa calrica que proviene de la combustin del gas empleado como combustible, a una masa de agua que entra fra y sale caliente. Este sistema es capaz de intercambiar energa y masa a la vez. Si consideramos al gradiente de Glucosa planteado anteriormente como un sistema abierto, este puede mantenerse en equilibrio de estado estable. Siempre que se aporte Glucosa desde el exterior y se ocupe en su interior de producir ATP, manteniendo as un flujo continuo que depender del empleo de la energa producida como ATP para su transporte y degradacin. La particularidad de este sistema biolgico, es que la misma Glucosa al degradarse, genera la suficiente energa en la forma de ATP, tanto para activar a la molcula de Glucosa, como para permitir que se contine degradando a medida que lleguen nuevas molculas intactas. Adems parte de la energa producida se debe ocupar en algn tipo de trabajo til, que puede ser la sntesis de otras molculas o la contraccin muscular. Ms an, parte de esta misma energa deber disiparse hacia el entorno, para satisfacer el segundo principio de la Termodinmica y permitir que el sistema considerado como abierto migre o se relaje en una determinada direccin y sentido. Volver al inicio 3) PRINCIPIOS Y LEYES TERMODINMICAS Cuando se hace un balance de las energas de un proceso como lo hara un contador con los haberes y deberes de una compaa, se observa que ninguna de las transferencias de energa ocurre con un 100% de eficiencia y una fraccin siempre se pierde hacia el medio u entorno para que la transferencia sea factible. Es decir, se debe pagar un impuesto a cada transferencia de fondos. Por ejemplo, los distintos componentes de la ENERGIA TOTAL DE UN SISTEMA (100%) pueden ser desglosados en 30% de ENERGIA QUIMIOSMOTICA (capaz de crear un gradiente a ambos lados de una membrana), un 30% de ENERGIA QUIMICA (capaz de sintetizar una molcula) y finalmente un 40% de ENERGIA CALORICA la que se pierde hacia el entorno, impidiendo la eficiencia 100%.
335
Como se ha observado anteriormente una molcula qumica tiene una cierta cantidad de energa interna representada por los diversos tipos de interacciones como son los enlaces covalentes e interacciones dbiles, nmero de dobles enlaces, nmero de estructuras resonantes, repulsin electrosttica, tensin de los enlaces. A la vez se encuentran otros tipos de energas, como son la de vibracin y rotacin exceptuando la energa nuclear. Por lo tanto, parte de la energa interna de una molcula puede ser modificada qumicamente, como se observa a continuacin en la molcula ejemplo: A-A-A-A. Esta se puede descomponer y dar origen a 4 molculas de A, liberando una cierta cantidad de energa. Se debe tener en cuenta que la energa liberada es igual a la que se gastara en sintetizarla nuevamente, ms una cierta cantidad para hacer la reaccin viable. Es decir parte de ella debe disiparse al entorno debido a las consideraciones entrpicas. De esta manera el proceso ser factible, posible o favorable: A-A-A-A ------------- A + A + A + A + Energa
Siempre se esta perdiendo energa hacia el entorno, tanto en la degradacin como en la sntesis de una molcula. La energa antes y despus del proceso se define como: E = E antes - E despus = Q W. Aqu el trmino Q lo podemos emplear con signo positivo o + Q, que viene siendo el calor que se absorbe o se transfiere desde el entorno al sistema con un aumento de la Energa interna E, mientras que de la forma - Q o con signo negativo, se libera o se transfiere al entorno y es cuando E disminuye. Por otro lado, + W es el trabajo que se hace sobre el entorno y que disminuye la energa interna. Solo cuando W lleva signo negativo como W, es el trabajo que el entorno hace sobre el sistema y en este caso E puede aumentar. De esta manera E solo representa el calor que se maneja en el sistema durante el estado inicial y el estado final en el curso de una transformacin qumica. As tenemos, que si oxidamos un mol de Glucosa en el organismo vamos a producir calor manteniendo la temperatura corporal y vamos a ejercer varios tipos de trabajos. Entre ellos tenemos el trabajo quimiosmtico para mantener la constancia de nuestro medio interno, el trabajo mecnico efectuado por los msculos cuando nos desplazamos de un lugar a otro o bien el trabajo para mantener la conduccin nerviosa o atrapar algo de la energa en otra molcula qumica, etc. Son todos estos, ejemplos de transformacin energtica de un tipo a otro. Por lo tanto, el cambio de energa interna de un mol de Glucosa, se desglosa en la cantidad total de calor que puede producir menos el trabajo que puede efectuar una vez que se haya oxidado, es decir: E = Q - W W = P V y y a la vez P V = n R T
336
La ecuacin: E = E (estado inicial sistema) - E (estado final sistema) = Q W simboliza el primer principio de la termodinmica e indica que la diferencia de energa interna de un sistema, es decir la energa entre su estado inicial y final despus que ha ocurrido un proceso, depender del contenido total de su energa calrica Q ( la energa contenida en su interior por las interacciones internas) menos el trabajo que el entorno realiza sobre el sistema o el sistema sobre el entorno. De esta forma, se indica que la energa se transforma de un tipo en otro o de calrica a mecnica o de mecnica a elctrica. Es decir, la energa no se crea, ni se destruye y los cambios de energa interna E, dependern exclusivamente de los estados iniciales y finales del sistema definidos por sus condiciones de P, V y T. E es una funcin de estado (inicial y final) Por ejemplo, si oxidamos un litro gasolina se deber definir el estado de una molcula desde su condicin inicial, inalterada y completa, que puede ser en estado slido, lquido o gaseoso hasta su oxidacin total a CO2 gas y H2O lquido. Se incluye aqu su cambio de estado, es decir el sistema puede pasar desde lquido a gas por lo que se debe considerar el cambio de volumen V a Presin constante. Como W puede estar representado por P V significar que el sistema puede efectuar una cierta cantidad de trabajo moviendo algn pistn. Por el contrario, los cambios en los sistemas biolgicos son de un volumen muy pequeo y las reacciones no ocurren con gases sino que en solucin, no se empujan pistones aqu y no se le dar importancia a P V, ya que las reacciones se llevan a cabo a presin constante. En los sistemas biolgicos tendremos que el calor liberado por la oxidacin de un mol de Glucosa equivale solamente a la energa interna del sistema o E, que representa la energa que poseen la molculas debido a sus interacciones internas como enlaces covalentes, energa vibracional y rotacional antes del proceso de oxidacin y despus que esta se ha oxidado y convertido a CO2 y se encuentra en la forma de in soluble - HCO3 y H2O. Por lo tanto, tendremos que E ser igual a Q o el calor total liberado, que ser igual al contenido de energa de la molcula. A su vez, este calor puede ser disipado y parte de l ser atrapado qumicamente por otras molculas que se encuentran en proceso de sntesis u formacin. Por lo tanto es necesario aplicar aqu una nueva funcin de estado que se conoce como Entalpa o H. Esta se aproxima o es equivalente a E cuando W es 0. Es decir, no se efecta trabajo sobre el medio ni este aplica trabajo sobre el sistema. Aqu no se emplea PV y para medir los cambios de energa de un proceso se ocupar aquella forma de energa conocida como calor. Luego, tenemos que H = E a W = 0 y Presin constante, considerando que V es muy pequeo en cualquier proceso biolgico. Por otro lado, un cambio de entalpa H, no tiene que ver con que una reaccin sea espontnea o no. En otras palabras no hay compatibilidad entre espontaneidad y el
337
valor de cambio de la energa interna. Al disolver NaCl en agua se produce un proceso endotrmico donde H aumenta, lo que indica que se toma energa del medio. Esta disolucin enfra las paredes del vaso que la contiene al tomar energa del entorno y aumenta el desorden al separar los iones Sodio de los iones Cloro. Por otro lado cuando se mezcla c. Sulfrico con agua, se libera calor al entorno lo que caracteriza a un proceso exotrmico y H disminuye. Aqu se produce una rpida = elevacin de la temperatura debido a la interaccin agua - SO4 y la interaccin + + agua in H , para producir in Hidrnio H3O . Ambos iones liberan energa al romper las interacciones agua-agua y formar las interacciones agua-ion, haciendo que en todo caso aumente tambin el desorden, acompaado de corrientes de conveccin, vapor y turbulencia. En ambos procesos anteriores el agua se interpone entre los iones tanto de una sal (NaCl) como de un cido (H2SO4), para ello se rompen las interacciones que mantienen la identidad de la sal y el cido, para formar nuevas interacciones con el agua. Como esta es un dipolo hidrata y recubre a los iones disminuyendo sus cargas netas superficiales. Ambos procesos migran hacia un estado donde se toma o se libera energa del entorno dependiendo del balance de energa necesario para romper las interacciones consigo mismo y formar nuevas con el agua. La nica fuerza que los mueve es la separacin de los iones o aumento del desorden o entropa: a) Baja la temperatura (toma energa)) Energa del Entorno + Sal de NaCl + H2O ---------------- NaH2O + Cl---H2O b) Sube la temperatura (entrega energa) H2SO4 + H2O ---------------------------------- H+----H2O + SO=4 ----H2O + Energa al Entorno Despus de analizar estos ejemplos se puede pasar al segundo principio de la termodinmica, que especifica que todo proceso ser del tipo espontneo cuando camina, migra o se relaja en la direccin del aumento de la entropa u desorden: G = H - T S Como S no puede ser medido, nos referiremos a G que indicar de manera indirecta cuando una reaccin sea espontnea o no. Si G es negativo se dice que es exergnico y si es G es + ser endergnico. Cuando G es igual a 0, el sistema se encontrar en equilibrio termodinmico. Mientras que H permanecer como el contenido total de energa del sistema. Al aplicar el enfoque la segunda ecuacin de la termodinmica a las molculas biolgicas, encontramos que algunas se degradan en otras ms simples y desordenadas, mientras que otras toman la energa de las primeras y se ordenan. Se comportan de manera acoplada entre sntesis y degradacin o catabolismo y anabolismo mediante una molcula intermediaria transportadora de energa entre uno y otro proceso como lo es el ATP. La sntesis no es un proceso espontneo o termodinmicamente factible, ya que introduce
338
orden en las estructuras moleculares que se crean y este proceso requiere de energa qumica en la forma de ATP. Por otro lado, parte de la energa que se gasta en la sntesis debe perderse al entorno, para as lograr siempre un aumento de la entropa del Universo o en otras palabras hacer la distribucin de la energa ms uniforme. La energa interna de las molculas puede ser ahora representada por H, que se denominaba anteriormente como el contenido energtico o calrico de una sustancia. Sin embargo, ahora pasar a ser o representar el orden interno de la molcula conocido como E. La cantidad que se libere depender de la cantidad de desorden o entropa que se produzca cuando el sistema tienda al equilibrio o G tienda a ser igual a 0. En este caso tendremos que: H = E = T S o en otras palabras: Orden = Contenido interno de energa = Desorden para salir de el estado actual o dirigirse en uno u otro sentido, es necesario tomar o dar energa y la ecuacin anterior se puede aproximar empricamente a: Orden = Desorden + Energa que es homloga a: H = TS + G Como ejemplo tenemos las siguientes reacciones: o o Glucosa + 6O2 = 6CO2(gas) + 6H2O(lquido) + Energa Glucgeno + nO2 = nCO2(gas) + nH2O(lquido) + Energa Triacil Gliceroles + nO2 = nCO2(gas) + nH2O(lquido) + Energa Tambin puede ocurrir el caso contrario, al invertir la ecuacin anterior : Energa + Desorden = Orden G + T S = H
que en su forma biolgica es homlogo a la Fotosntesis: o Energa Radiante + nCO2 (gas) + nH2O (lquido) = Celulosa nATP + nCH3COO-S-CoA = cido Graso + nH-S-CoA. o bien de otra manera: SINTESIS = DEGRADACION + ENERGIA o an:
339
ANABOLISMO = CATABOLISMO + ENERGIA o: REDUCIDO = OXIDADO + ENERGA La degradacin, el desorden y el estado oxidado son espontneos, proceden en la direccin en que liberan energa hasta alcanzar un nivel en que entran en equilibrio con el entorno. Cuando su energa se hace igual a la del entorno, se detienen. Por lo tanto, para activarlos nuevamente se necesitar de una fuente de energa externa que al ser aplicada al sistema degradado, desordenado u oxidado, lo lleve nuevamente a formar una estructura o molcula compleja. Este proceso del tipo no espontneo requiere de energa. Si la que se sintetiza es una macromolcula con una sola unidad que se repite muchas veces, bastar con que otra molcula se degrade en forma acoplada para generar orden y energa. Volver al inicio 4) EQUILIBRIO DE ESTADO ESTABLE Y EQUILIBRIO TERMODINMICO En la figura que aparece a continuacin (fig. 5 7) se puede observar como varias molculas individuales de un sustrato metablico, entran a un compartimento de una clula y a travs de varios pasos sucesivos se ordenan progresivamente en una molcula de tres unidades. Estas posteriormente se unen entre s generando una macromolcula de mayor tamao por medio de una sucesiva adicin de unidades de tres. Posteriormente ante un requerimiento energtico de la clula, la macromolcula de almacenamiento se descompone progresivamente, hasta liberar la molcula unitaria original. Esta ltima es posteriormente degradada en otras de menor tamao an y finalmente eliminada del compartimiento.
La reaccin a, que introduce sustrato en contra de un gradiente de concentracin, es seguida por b, c y x. Son en general todas aquellas que producen orden, no son espontneas o favorables desde el punto de vista termodinmico, mientras que las reacciones u, v junto a w, si son todas favorables, ya que tienden al desorden. En otras palabras, las primeras son endergnicas y las segundas exergnicas, mientras que el sistema se mantiene en equilibrio de estado estable. Las reacciones x, z, u, v deben producir energa para que las otras reacciones a, b, c y d procedan de izquierda a derecha. Adems, debe disiparse parte de esta energa al entorno para que el sistema en conjunto proceda desde la molcula unitaria en el exterior hacia la molcula degradada y posteriormente eliminada fuera del compartimento.
MOLCULA UNITARIA a b c d 340 x z
MOLCULA DEGRADADA
MACROMOLCULA
En
Fig. 5 7. Sntesis y degradacin de una macromolcula. Al profundizar en estos conceptos, podemos aplicarlos a las molculas biolgicas como lo son Glicgeno, Almidn o Celulosa e incluso a la formacin de las bicapas de fosfolpidos y micelas. Encontramos aqu, que las macromolculas se encuentran en equilibrio de estado estable entre dos tendencias. Una de ellas es la tendencia al orden, como es la sntesis que la lleva a un estado energtico por sobre el equilibrio termodinmico con el entorno. Es decir, se debe gastar energa en extender la macromolcula al agregar nuevas unidades. La otra tendencia es al desorden, donde se libera energa hacia el entorno en base a la degradacin de la macromolcula en sus unidades (Fig. 5 -7). Las molculas de Glucosa que constituyen las unidades del Glicgeno se encuentran unidas mediante enlaces covalentes. Estos enlaces se forman por medio de una reaccin de transferencia de energa con gasto de ATP. Es decir, se activa a la molcula de Glucosa por unin al nucletido UTP quedando como UDP-Glucosa. De esta manera cuando se agregan nuevas molculas de Glucosa la reaccin se convierte en exergnica y favorable. A su vez un gasto de un UTP equivale a un gasto de un ATP. Por medio de este mecanismo se extiende y crece la molcula de Glicgeno generando un determinado orden, aunque repetitivo. Este proceso de crecimiento no es espontneo o favorable y debe ser acoplado a otro proceso que s lo sea. Esta labor, como se observa recae en la hidrlisis del ATP, que aporta energa y a su vez se desordena al hidrolizarse. El proceso aqu descrito, es siempre posible mientras se disipe una parte de la energa del ATP al entorno, de esta manera es posible que se mantenga lejos del equilibrio termodinmico.
341
MOLCULA MS COMPLEJA EN EQUILIBRIO DE ESTADO ESTABLE Y LEJOS DEL EQUILIBRIO TERMODINMICO
E N E R G I A
ORDEN DESORDEN
ADP + P
MOLCULA MENOS COMPLEJA
H2O
ATP
ORDEN DESORDEN ENERGA BASAL EN EQUILIBRIO TERMODINMICO CON EL ENTORNO
Fig 6 - 7. Las molculas se sintetizan y permanecen en estado estable y luego se degradan
Por otro lado, la macromolcula de Glicgeno sola, fuera del contexto de la sntesis tiende a degradarse, a liberar energa o bien equilibrar su energa con la del entorno. Este proceso puede ocurrir mediante su hidrlisis que la puede llevar a su descomposicin total en sus unidades de Glucosa. En resumen, para mantener a la macromolcula con un determinado tamao y orden. Se debe contar con un aporte continuo de energa en la forma de ATP y otro de materia prima como es la Glucosa. En caso contrario la energa acumulada en la macromolcula de Glicgeno se disipar hacia el entorno, dejando subproductos desordenados y de menor tamao. Otro ejemplo biolgico a considerar es la compleja estructura de las bicapas de fosfolpidos que forman membranas cerradas alrededor del citoplasma, ncleo y organelos (Fig 7- 7). Estas membranas cuentan con una particular disposicin, que se puede entender como ordenada y repetitiva. El extremo polar de cada molcula se halla en contacto con el agua mientras que el otro extremo, el apolar se oculta de esta. Como sabemos esta particular disposicin, se debe a que los residuos alqulicos de los fosfolpidos no son capaces de interaccionar con un dipolo dbil como es el agua y a la vez restringen la capacidad de las molculas de agua para moverse en todas las direcciones coartando su libertad de desplazamiento. En otras palabras, el agua pierde su fluidez. Por consiguiente, la nica manera de que el agua recupere su estado de libertad y desorden, es agrupando a los fosfolpidos de la manera que presenten la menor superficie dirigida hacia el agua. De esta forma las molculas de agua ganan en desorden y las molculas de fosfolpidos ganan en orden, generando un sistema acoplado que a su vez libera cierta cantidad de energa hacia el entorno para que el proceso sea favorable.
342
MOLECULAS DE FOSFOLPIDOS SEPARADOS O EN DESORDEN
MOLCULAS DE FOSFOLPIDOS EN ORDEN EN BICAPAS O MICELAS
+
MOLCULAS DE AGUA EN ORDEN O MENOS FLUIDO MOLCULAS DE AGUA EN DESORDEN O EN FORMA MS FLUIDA
Fig 7 - 7. Formacin de una estructura ordenada en micela o bicapa mientras las molculas agua ganan en desorden o el agua se hace ms fluida.
de
Volver al inicio 5) REACCIONES ENDERGNICAS Y EXERGNICAS EN EL METABOLISMO INTERMEDIARIO Las constantes de equilibrio de las reacciones bioqumicas y las energas que estas toman o entregan al medio se han medido siempre, en sistemas aislados en condiciones estndar (pH 7, Temperatura de 25 C, Presin 1 atm), donde se conserva la materia y la energa. En este enfoque, se tratar de hacer una aproximacin a la forma real en que ocurren los procesos bioqumicos en un sistema abierto, sin pretender alcanzar la explicacin total de estos procesos en la realidad. La ecuacin que relaciona la tendencia real ( G ) de un sistema que puede ser exergnico, en equilibrio o endergnico con la tendencia natural ( G ) dada por la constante equilibrio, junto a la otra tendencia ( 2,3 R T log P/S ) dada por las concentraciones reales de sustrato ( S ) y producto ( P ) de la misma reaccin, cuando esta es parte de una va metablica, se encuentra dada por la ecuacin general: P G = G + 2,3 R T log --- ( 1 ) S G = - 2,3 R T log Keq (2) ; P Keq = ---- ( 3 ) S
En la ecuacin 2, cuando la concentracin de Sustrato S es igual a la de Producto P, se tiene que la Keq es igual a 1 y que G es igual a 0. la reaccin se encuentra en equilibrio termodinmico. Se dirige tanto de derecha a izquierda como de izquierda a derecha. Se la puede desplazar a uno y otro lado solamente si pertenece a una cadena de reacciones donde S y P son sustratos o productos de otras reacciones y cada una de ellas influir en la que se ha considerado. A continuacin se explicarn estos conceptos.
343
El valor de G0' indicar la tendencia natural de la reaccin. De esta manera cuando obtenemos un valor G con signo negativo significa que la reaccin llega al equilibrio con ms producto que sustrato. Esta reaccin es denominada Exergnica o termodinmicamente favorable y cuando se obtiene un valor G con signo positivo llegar al equilibrio termodinmico con ms sustrato que producto. En este caso ser denominada Endergnica o termodinmicamente desfavorable. Cuando una reaccin alcanza su equilibrio qumico, no necesariamente debe estar en una relacin P/S = 1, sino que puede alcanzar distintas proporciones mayores o menores de 1. En este momento se dice que el sistema ya no progresa ms es decir, se encuentra estable. Este sistema pudo efectuar trabajo en su camino hacia la estabilidad o hacia el equilibrio y una vez alcanzado este, no toma ni entrega energa. El equilibrio termodinmico se diferencia del equilibrio de estado estable en que este ltimo es dinmico o capaz de continuar por medio de otras reacciones que aporten continuamente sustrato y a la vez remuevan producto de la reaccin sacndola del equilibrio con el entorno o el equilibrio termodinmico. A continuacin se pueden observar algunos ejemplos de reacciones individuales que alcanzan su equilibrio termodinmico: CASO 1 Condicin inicial a tiempo 0: S-------------->P 100mM 0mM Condicin final a tiempo indefinido: S--------------->P 50mM 50mM Cuando se lleg al equilibrio, la relacin entre substrato y producto alcanz la proporcin 50/50. En este caso cuando la Keq = 1, G es tambin = 0. CASO 2 Condicin inicial a tiempo 0: S--------------->P 100mM 0mM Condicin final a tiempo indefinido: S--------------->P 20mM 80mM En este caso al alcanzar el equilibrio la Keq = 80/20 = 4 o bien G = - 1357 log 4 = - 817 cal/mol y es exergnica. En general se dice que una reaccin qumica es Exergnica cuando libera energa, la Keq es > 1 y ocurre desde una molcula de alta a una de baja energa o bien de una molcula estructuralmente compleja a varias otras molculas
344
estructuralmente simples o ms oxidadas. La reaccin procede aqu de izquierda a derecha. CASO 3. Condicin inicial a tiempo 0: S-------------->P 100mM 0mM Condicin final a tiempo indefinido: S-------------->P 80mM 20mM La constante de equilibrio Keq = 20/80=0.16, lo que entrega un valor de: G = - 1357 log 0.16 = + 1080 cal/mol con signo positivo. Se dice aqu, que una reaccin qumica es Endergnica cuando toma energa del medio y para que ocurra se le debe suministrar energa. Esto sucede cuando la Keq es < 1 y la reaccin procede desde molculas simples u oxidadas a una molcula reducida, compleja y de alta energa o una molcula con varios grupos fosfatos en su estructura. Cmo es posible empujar una reaccin Endergnica? Durante el metabolismo intermediario el producto de una reaccin es el sustrato de la siguiente, por lo que las concentraciones no se mantienen constantes y las energas finales de una va metablica son la suma algebraica de las reacciones parciales acopladas con signo negativo o positivo. Por lo tanto si acoplamos una reaccin Exergnica con una Endergnica es posible que esta ltima ocurra, ya que la energa que necesita la tomar de la primera siempre y cuando exista una cantidad extra de energa que se entrega al entorno. Si solo toma la justa energa que necesita quedar solo en equilibrio ( G = 0 ) y hacia donde se desplace la reaccin depender de la cantidad de substrato o producto presente. Si estos son a la vez tomados por otra reaccin posterior o aportados por una reaccin previa, este par de reacciones tomar el mismo sentido en que se aporte sustrato o se remueva el producto. Al analizar el caso de una reaccin que se encuentra en medio de una va metablica donde el sustrato es el producto de la reaccin anterior y a su vez el producto es el sustrato de la reaccin que la precede. Es posible concluir que puede variar en uno u otro sentido de manera independiente a las tendencias individuales de la reaccin central. La energa no solo depender de la concentracin de sustratos y productos, sino que tambin depender de la energa que tenga la estructura molecular involucrada como sustrato o como producto. En la Tabla 1- 7 se puede ilustrar cuando una reaccin esta lejos del equilibrio y en que sentido puede proceder, basndose en la ecuacin general: G = - 2.3 R T Log Keq + 2.3 R T Log P/S si G0' = - 2.3 R T Log Keq
TABLA 1 - 7 345
G a) b) c) d) e) + 4071 2714 1357 0 1357
G0' -1357 - 1357 - 1357 - 1357 - 1357
Log Keq 1 1 1 1 1
Keq 10 10 10 10 10
2.3 R T Log P/S Log P/S - 2714 - 1357 0 + 1357 + 2714 -2 -1 0 1 2
P 1 1 5,5 10 100
S 100 10 5,5 1 1
f) g) h) i) j)
+ 4071 + 2714 + 1357 0 - 1357
+ 1357 + 1357 + 1357 + 1357 + 1357
-1 -1 -1 -1 -1
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
+ 2714 + 1357 0 - 1357 - 2714
2 1 0 -1 -2
100 10 5,5 10 1
1 1 5,5 100 100
Esta ecuacin explica el caso en que S y P, son intermediarios de otras reacciones y su concentracin puede variar independientemente a la Keq de la reaccin para S y P: A<---->B<---->[S]<---->[P]<---->C<---->D En el caso descrito en la Tabla 1- 7 a), la Keq es de un valor de 10, lo que significa que la reaccin ser exergnica con -1357 cal/mol y ms an en condiciones reales en que por aporte de B en la cadena de reacciones la concentracin del sustrato S pase a ser 100 veces mayor que la del producto P que pasa a C. La reaccin S---->P se hace ms exergnica an, dando un total de - 4071 cal/mol. En el caso c), la tendencia natural de la reaccin dada por su Keq y su Go , la mantiene exergnica aunque la concentracin real de S y P es igual a 5,5 / 5,5 debido al efecto de B y C. En este caso no hay contribucin ninguna por la variacin de la concentracin de S y P en la va metablica y la reaccin central permanece exergnica. En el caso d), la G final de la reaccin es de 0 o bien se encuentra en equilibrio, ya que su tendencia natural a ser exergnica es balanceada por la distribucin de S y P debido a la contribucin aportada por B y C. Finalmente en e) la reaccin se torna endergnica por la gran acumulacin de P = 100. En los casos desde f), en adelante la reaccin es endergnica en su tendencia natural debido a su baja Keq, sin embargo a medida que las concentraciones reales aportan S y remueven P por el efecto de B y C, ocurre que en los casos sucesivos g y h, se hace menos endergnica y ms exergnica para llegar al caso i donde esta en equilibrio, para finalmente llegar a j, donde se torna nuevamente exergnica. En la siguiente figura se puede observar un grfico de energa libre de la reaccin versus logaritmo de la relacin P/S.
346
+ 4071 + 2714 + 1357 -2 -1 - 1357 - 2714 - 4071 0
Keq = 10
2 log (P)/(S)
Keq = 0,1
Fig 8 7. Grfico G versus log P/S.
En este grfico se puede emular una recta similar a la ecuacin y = m x + n, donde m es la pendiente igual a 2,3 RT y n es el intercepto igual a 2,3 RT log Keq o G. Entonces se puede graficar G que pasa a ser la variable Y junto a la variable X que pasa a ser la relacin log P/ S.
(P) G = G + 2,3 RT log ---------(S)
Y = n (intercepto) + m (pendiente) X
Se observa que ambas reacciones con distinta constante de equilibrio pueden pasar de exergnicas al equilibrio con G =0 y posteriormente a endergnicas a medida que el producto se acumula y no sea removido. Volver al inicio
6) CARACTERISTICAS DEL CATABOLISMO.
347
La secuencia de reacciones destinadas a la produccin de energa parte con reacciones de activacin de las respectivas molculas que se pretenden degradar u oxidar. De esta manera hay que gastar algo de la energa para llevar las molculas de sustrato a un nivel ms elevado, donde sean susceptibles de sucesivas modificaciones qumicas que liberen la energa contenida en sus interacciones internas. Para degradar Glucosa, cidos Grasos o Aminocidos y obtener ATP, hay que llevar estas molculas a un estado de inestabilidad estructural mediante la excitacin de la molcula. Debemos incrementar su estado vibracional o aumentar su densidad electrnica, para luego romperla en molculas ms pequeas que entreguen ms energa que la originalmente gastada en destabilizar la molcula original. Por otro lado, para continuar con este proceso se debe producir ms energa que la necesaria para impulsar las reacciones desfavorables, como lo son aquellas reacciones de sntesis de macromolculas, contrarias a la degradacin. Las reacciones de sntesis no son termodinmicamente factibles o espontneas y son del tipo endergnico. Ms an parte de la energa producida en la degradacin se debe disipar al entorno para as aumentar la entropa y hacer que todo este sistema sea factible. Esto significa que siempre existir un equilibrio dinmico entre degradacin y sntesis, con algo de energa perdida hacia el medio externo como es el calor, para que un proceso sea termodinmicamente favorable. El catabolismo se puede comparar con el desorden, la oxidacin o la degradacin de las molculas para producir energa.
, , Molcula Activada : Unidades de molculas biolgicas
ATP
+
Energ a de Activai Energa adquirida en la Dieta
Energa disipada al Entorno Energa ocupada en la Sntesis
DEGRADACIN DE MOLCULAS: PROCESOS EXERGNICOS
SINTESIS DE MOLCULAS: PROCESOS ENDERGNICOS
COORDENADA DE REACCION
Energa de la Degradacin
Energa ocupada en la Activacin
Energa ocupada en la Sntesis
Energa disipada al Entorno
Fig. 9 - 7. El catabolismo produce suficiente energa qumica para impulsar a las reacciones no espontneas del anabolismo ms una cantidad extra que debe perderse hacia el medio.
El catabolismo se puede estudiar analizando lo que sucede al degradarse la molcula de Glucosa (Ver Captulo 7). El primer paso consiste en aplicar energa a la molcula para
348
destabilizarla y este proceso ser eficiente siempre que la energa aplicada sea menor que la extrada. La Glucosa puede ser llevada a remontar la barrera de energa para hacerla ms inestable y liberar parte de su energa mediante las siguientes modificaciones que se enlistan a continuacin: a) Transformar su anillo de seis miembros en uno de cinco. (La nube electrnica se encuentra de esta manera forzada a contener los mismos electrones en un menor espacio). b) Adicin de grupos cargados en zonas opuestas de la molcula. (Al tener similar carga estos grupos se repelern unos a otros introduciendo estrs estructural.) c) Llevar la molcula de la forma silla (relajada) a la forma bote (comprimida). De esta manera las nubes electrnicas se encuentran ms prximas. d) En el caso de la oxidacin de otras molculas como los cidos grasos se recurre a la activacin con CoASH y ATP para excitar los orbitales. Todo este manejo se emplea para el cebado de la Glucosa y se realiza mediante reordenamientos estructurales catalizados por varias enzimas en reacciones parciales no espontneas que necesitan de ATP para ser termodinmicamente favorables. Por otro lado, es necesario reafirmar que el hecho de que se empleen enzimas no garantiza que una reaccin suceda en una direccin u otra, solo garantiza la velocidad con que tomar una u otro direccin. Las enzimas no impulsan a las reacciones desfavorables o favorables, solo las hacen ms rpidas y se demoran menos en alcanzar el equilibrio. Volver al inicio 7) CARACTERISTICAS DEL ANABOLISMO. Para crear una molcula durante el anabolismo, es necesario entregar energa. Cada una de las unidades que componen una estructura compleja se debe agregar aportando energa no solo a la estructura, sino que a la reaccin misma para que esta sea posible. En el fondo las estructuras qumicas no son ms que una representacin material de una fraccin de la energa empleada en su sntesis. Cada molcula que se adiciona a una macromolcula durante la sntesis, debe traer consigo algo de energa extra. No solo para poder integrarse a un sistema ms complejo como el de la macromolcula, sino que para hacer su integracin termodinmicamente favorable. Esta energa tambin puede ser aportada por el ATP. Como a esta altura se domina el concepto de catabolismo y anabolismo, es necesario pasar a explicar como se relacionan ambos mediante el equilibrio de estado estable. De esta manera es posible mantener una integridad estructural capaz de efectuar trabajo como ocurre con el metabolismo intermediario. Para graficar el significado de este concepto podemos recurrir a la siguiente analoga. Si disponemos de tres recipientes a distintas alturas donde cae el agua desde el superior al inferior, el recipiente del medio tendr un nivel o volumen constante, siempre que el flujo de entrada sea igual al de salida. La entrada puede considerarse como anabolismo y la salida como catabolismo y si ambos presentan igual flujo, se mantiene el equilibrio de estado estable. Este ejemplo se puede trasladar a un sistema cerrado donde se sintetizan molculas nuevas y a la vez se destruyen molculas de la dieta para obtener energa. Sin embargo, para que ambas series de reacciones ocurran termodinmicamente, es sabido que se debe de perder algo de energa hacia el entorno o al medio circundante. Algunas estructuras se desordenan emitiendo energa al medio y solo parte de ella puede ser atrapada como energa qumica o ATP y esta puede ser ocupada en
349
la sntesis. La eficiencia no es nunca 100%, por eso la energa liberada durante el catabolismo es mayor que la empleada en los procesos de sntesis (anabolismo). La clula en s, es un sistema abierto donde parte de la energa pasa al medio externo para permitir que ocurran ciertos procesos internos. Es interesante destacar aqu que los organismos vivientes se encuentran a presin y temperatura constante. Ninguno de ellos lleva a cabo reacciones bioqumicas remontando barreras de energa mediante alta presin, como podra suceder durante la compresin de gases por un pistn en un cilindro o aumentando la energa trmica a voluntad para alcanzar el estado activado en las reacciones moleculares.
Mamiferos Energia Barreras de Energia
Reptiles
Coordenada de Reaccion
Fig 10 - 7. Los reptiles son ms eficientes que los mamferos.
Dentro de la naturaleza de los seres vivos y desde el punto de vista macromolecular, se pueden considerar como ms eficientes termodinmicamente a los reptiles (Fig 10 -7), ya que no controlan su temperatura interna y deben esperar hasta alcanzar una temperatura ptima. Este proceso ocurre por medio del empleo de la energa radiante externa, con ella suben su temperatura y las enzimas son capaces de adquirir la conformacin ptima para catalizar sus reacciones. Al mismo tiempo como no tienen que luchar contra una agitacin trmica constante como los mamferos, sus enzimas toman ms dbilmente a los sustratos y los sueltan como productos con una mayor facilidad, lo que redunda en una barrera de energa menor para las mismas reacciones comparadas a las de un mamfero (Fig. 10 - 7). Sin embargo, las reacciones bioqumicas poseen las mismas constantes de equilibrio en ambas especies. Por otro lado, las plantas no ingieren molculas complejas y solo se alimentan de CO2, H2O y sales, pero sintetizan molculas tanto o ms complejas que las de los animales. Por lo tanto en las plantas se debe impulsar una serie de reacciones desfavorables (no espontneas) con energa de alguna fuente. Esta ltima es la energa radiante del Sol (Fig. 11 - 7).
350
FOTOSINTESIS ENERGIA RADIANTE SINTESIS DE NUEVAS MOLCULAS
Energa radiante ETAPA CLARA excitacin de electrones del Fotosistema y generacin de gradiente electroqumico
ATP NADPH
Glucosa
Energa necesaria para impulsar las reacciones endergnicas de sntesis
Energa radiante empleada en la sntesis de ATP
ETAPA OSCURA
CO2, H2O
ANABOLISMO ENERGIA QUE SE PIERDE AL ENTORNO
ENERGIA RADIANTE
ENERGIA QUMICA
Fig 11- 7. La energa radiante se transforma en energa qumica para impulsar las reacciones endergnicas de sntesis ms lo que se pierde al entorno.
En la planta existe un sistema transductor de energa denominado Cloroplasto. En el ocurren los procesos destinados a almacenar la energa radiante en las estructuras qumicas. El sistema biolgico dentro del Cloroplasto dispone de electrones de alta energa bombeados por la absorcin de la energa radiante. Esta ocurre por medio de varios pigmentos distintos. Posteriormente, los electrones excitados entregan paulatinamente su energa a travs de un sistema quimiosmtico destinado a producir molculas de alta energa como ATP y NADPH. A continuacin mediante una serie de reacciones qumicas de reduccin con NADPH e impulsadas por la energa del ATP, se obtiene finalmente almidn y el crecimiento de complejas estructuras. Durante la noche cuando los Cloroplastos no reciben luz y no pueden actuar como atrapadores y transformadores de energa, el metabolismo procede a degradar las complejas molculas sintetizadas durante el da en el interior de otros organelos conocidos como Mitocondrias. Estas estructuras se encuentran especializadas en la produccin de energa por oxidacin con O2 mediante la degradacin de molculas complejas. Durante este proceso se destruye lo que se sintetiz en el da para as obtener ATP, pero ahora en la Mitocondria. Volver al inicio
351
8) ENFOQUE ACTUAL DE LA TERMODINCA APLICADA A LA EXISTENCIA DE LAS MACROMOLCULAS. Nuevos enfoques termodinmicos han visualizado la existencia de un equilibrio jerrquico (por rangos) en la organizacin de los sistemas vivientes. Este equilibrio se desarrolla con una complejidad progresiva, desde una simple molcula hasta un organismo superior e incluso alcanza al medio ambiente donde este organismo prospera, es decir su nicho ecolgico. Cada uno de los distintos grados de complejidad, que van desde molcula, estructura supramolecular, organelo, clula, etc., presentan a la vez una componente temporal y espacial. As las molculas ocupan un espacio dado y tienen una vida media menor que la estructura o molcula que componen y a su vez cada estructura ocupa otro espacio y tiene a su vez una vida media de menor tiempo, que el organelo al cual pertenecen y as sucesivamente. El grado de organizacin y compartamentalizacin de estas agrupaciones de molculas, se debe a la creacin de nuevas estructuras cada vez ms estables y complejas unas de otras. Si consideramos la relacin que existe entre el DNA y las protenas. Asumimos que el DNA debe ser estable con una funcin especfica, mientras que las Protenas muestran una variedad de funciones especficas, que se adaptan y relacionan con el medio. En otras palabras el DNA es en la actualidad, una molcula considerada como sinnimo de orden, informacin y complejidad, tanto en su funcin como en la preservacin del cdigo gentico, mientras que las protenas podrn ser consideradas como representantes de la complejidad y efectoras de las ms diversas funciones. En general, los organismos son coherentes y no se comportan como un motor movido por calor (mquina a vapor, motor de combustin interna, motor diesel, motor Stirling, etc.). Los organismos son sistemas isotrmicos que transfieren la energa desde una estructura compleja a otra desordenada y a la vez el desorden lo transforman en coherencia u orden y complejidad mediante mecanismos acoplados. Es posible observar que un sistema biolgico se desordena (ingesta de comida) y libera energa (catabolismo) para que aquel otro sistema acoplado al primero, se ordene (anabolismo) y mantenga su jerarqua estructural tanto en el espacio como en el tiempo. Por otro lado, como se ha vislumbrado a lo largo de este Captulo, el trmino de Orden es algo ms complicado y en realidad debiera de significar dentro de los seres vivos, el grado de complejidad jerrquica que alcanzan sus estructuras supramoleculares. Una molcula de Glicgeno o una de Celulosa, pueden ser consideradas como ordenadas, pero no complejas mientras que una Protena s es compleja, ya que no repite constantemente sus subunidades, sino que estn dispuestas siguiendo la informacin guardada en el DNA. Por ejemplo, un conjunto de letras puede estar desordenado y no significar nada, sin embargo si pertenecen a uno de los muchos idiomas y se agrupan entre s mediante ciertas reglas gramaticales, dan origen a un significado. Igual cosa sucede con un cido nucleico, el ordenamiento de un grupo de nucletidos y posteriormente de los distintos grupos de aminocidos en una secuencia puede no significar absolutamente nada, respecto a cumplir una funcin determinada. Una palabra en un idioma significa algo y en otro nada. Por lo tanto, en un principio se pudieron crear innumerables
352
secuencias y combinaciones, mientras no se impusieran las leyes evolutivas que seleccionaron solo determinados significados como beneficiosos para la sobrevivencia de un lenguaje. Este ltimo pas entonces a ser complejo. Igual cosa pudo haber sucedido con las macromolculas complejas como las Protenas y el DNA. (Fig. 12 ). Estas molculas pasaron desde aminocidos y nucletidos a macromolculas complejas de gran tamao y fueron capaces de portar informacin. El Glicgeno es una molcula tan solo ordenada y no compleja, donde una estructura bsica se repite constantemente. Una bicapa de Fosfolpidos es otra agrupacin de molculas ordenadas a diferencia del DNA y las Protenas, donde se encuentra una secuencia compleja de unidades, ya sea de aminocidos o nucletidos que portan informacin. Las molculas portadoras de informacin son aquellas que han sobrevivido en el tiempo y han sido seleccionadas mediante cuellos de botella evolutivos. A su vez han reaccionado bajo distintos cambios evolutivos impuestos por las leyes de la herencia y como producto de ello han logrado alcanzar mayores y mltiples grados de complejidad, haciendo aparecer nuevas protenas mediante procesos que se encuentran en la actualidad siendo investigados por la ciencia de la Protemica ( ver captulo XX), etc. Muchas lneas de evolucin molecular ocurrieron en paralelo dentro de un determinado periodo de tiempo. De esta manera se unieron desde los nucletidos innumerables polinucletidos, para as formar distintas secuencias. Dentro de estas se preservaron y/o tuvieron xito aquellas macromolculas que portaban informacin correspondiente al cumplimiento de una funcin especfica impuesta por el ambiente y que entregaba una ventaja a su portador. Aquellas propiedades que entregan al DNA la capacidad de portar informacin y a las Protenas el ser una molcula que puede cumplir una determinada funcin, pudo ser originada por la delegacin de ambas caractersticas desde el RNA. Esta ltima macromolcula puede tener ambas funciones, pero a medias y es posible que se necesitara una divisin de las funciones o especializacin, que hizo viables tanto al DNA como a las Protenas. Se requirieron por lo tanto distintas presiones selectivas para lograr un tipo determinado de organismo adaptado a su ecosistema. Bajo estas premisas es posible intentar subir un peldao desde la ecuacin anterior: Orden = Desorden + Energa a la forma de: Compleijidad = Informacin + Orden + Energa El paso de Orden a Complejidad ha sido bastante debatido en la actualidad e incluye nuevos conceptos, como aquel que considera la aparicin de los sistemas emergentes como resultado de una serie de situaciones ambientales, que se explicar a continuacin. Por ejemplo, en la siguiente figura (fig. 12 7) se hace una comparacin entre la aparicin del lenguaje y la generacin de molculas complejas.
353
ORDEN DESORDEN
sonidos y letras al azar Palabras al azar, pero con significado en cualquier idioma
COMPETENCIA
COOPERACIN COMPETENCIA
SISTEMA EMERGENTE: COMUNICACI N
COMPLEJIDAD Informacin mediante frases con sentido y significado
Letras del abecedario a, x, b, z, u v, r , t s, u , w, , m ,o , etc.
agua, water, eau, wsser, aqua, soup, campo, esta,camin, sopa, siente crudo, caliente este, etc. GLICGENO MICELAS Y BICAPAS Macromolculas repetitivas, son como una palabra que se GLUCOSA, FOSFOLPIDOS AMINOCIDOS NUCLETIDOS
un IDIOMA determinado
COOPERACIN
Esta sopa parece agua
TOMOS DE C, H, O, N, S, P
COMPETENCIA
RNA molcula que contiene informacin y es efectora de la informacin a la vez
PROTENAS Molculas especializadas efectoras de la informacin DNA molculas especializadas que contienen solo informacin
COOPERACIN
Fig. 12 7. Evolucin de un idioma y el traspaso de informacin bajo la influencia de las presiones del entorno.
354
Hctor Rocha L. Bioenergetica
Los gritos guturales que alguna vez emplearon los primates y otras especies para advertir de ciertas conductas e intenciones a su grupo, frente a la existencia de amenazas, comida o llamados de apareamiento, pasaron por un cuello de botella evolutivo mediante la competencia y cooperacin entre los individuos de una misma especie. En el caso de los ancestros humanos, estos redujeron un sonido determinado a una representacin grfica constituida por los ideogramas. Posteriormente, los ideogramas dieron paso a las letras que representaban o describan a este ideograma, en base a una convencin de smbolos que a su vez representaban un idioma y permitan una mayor riqueza a la descripcin. Las palabras se emplearon entonces para describir una caracterstica o una accin determinada y a medida que pas el tiempo las exigencias de la comunicacin generaron una conexin coherente entre las palabras para as formar frases. Estas ltimas pasaron informacin de un individuo a otro. Sin embargo, existen distintos idiomas y lo que en un idioma determinado o una agrupacin de palabras significa algo en base a la convencin de smbolos empleados, en otro idioma no significan absolutamente nada. Por lo tanto, los cuellos de botella evolutivos crearon los distintos idiomas y fueron capaces de adicionar informacin al mensaje transmitido o lograron hacer una diferencia entre las frases coherentes y aquellas que no llevaban significado alguno. De esta manera el entorno fue un forjador de las distintas combinaciones de letras primero y luego de palabras, para lograr constituir un idioma y contribuir al traspaso de la informacin que entrega nuevas pautas de conducta y ventajas para el individuo informado comparado al desinformado. Lo que distingue a una frase coherente es que un cierto grupo de letras al azar han llegado a simbolizar un significado complejo. De esta manera es posible pasar desde el desorden o azar a la complejidad de un idioma en el traspaso de la informacin. Un idioma constituye un sistema emergente y ocurre su aparicin cuando se desarrollan nuevas estructuras, pautas y propiedades complejas, como resultado de las interacciones del entorno y entre los individuos de una determinada especie como son competencia y cooperacin. La aparicin de una propiedad emergente no puede ser predicha con anterioridad. Una bandada de pjaros o un cardmen de peces, se comporta distinto a un individuo e igual cosa un grupo de palabras que constituyen una frase con un cierto significado. Por ejemplo, el mercado de valores es un sistema emergente con un cierto grado de complejidad regulado por la demanda y oferta del petrleo, terrorismo, consumismo, estacin del ao, etc. Al considerar a las macromolculas como DNA y Protenas, dentro de este anlisis encontramos que solo el 3 % de todo el DNA humano es informacional o realmente complejo. Gran parte de este cerca del 97% se encuentra formado por repeticiones al azar de distinto tamao, denominado DNA satlite. El 3 % es estrictamente informacional y codifica al menos para cerca de 30.000 genes. Dentro de los genes, la informacin ms valiosa corresponde a la disposicin espacial de los distintos sitios activos de las enzimas, ya que distintas especies cuentan con enzimas con los mismos sitios activos para reacciones similares. A su vez las enzimas son capaces de catalizar determinadas reacciones del metabolismo intermediario cruciales para la sobrevivencia del individuo. Sin embargo, tan solo aquellas secuencias que acompaan a los sitios activos, poseen una mayor variedad y azar entre ellas. Es decir, estas secuencias pueden cambiar en distintas especies considerando el medio interno y externo que cada uno de las distintas especies hace uso, sin generar alteraciones en las vas metablicas. Mientras que las secuencias cruciales para la disposicin del sitio activo en el espacio y los residuos catalticos mismos,
355
no cambian ya que son los mejores aminocidos para llevar a cabo una funcin determinada y se encuentran los mismos aminocidos seleccionados en distintas especies. Por otro lado, es conocido que existen ms protenas que genes, ya que se cree que alcanzan a un nmero cercano al milln. Por lo tanto existen mecanismos subyacentes estudiados por la ciencia de la Protemica, donde se ha observado el empleo de los mismos dominios especializados en distintas protenas. De esta manera es posible aumentar la variedad con distintas combinaciones de dominios proteicos. Volver al inicio 9) CONCLUSIONES GENERALES. Finalmente, al analizar las reacciones bioqumicas encontramos que se pueden dividir en TRES tipos generales: a) Exergnicas o espontneas o termodinmicamente favorables, ocurren de izquierda a derecha cuando el sustrato tiene mayor energa que el producto. Liberan la energa almacenada en la estructura del sustrato hacia el producto. Su constante de equilibrio es >1. b) Endergnicas o no espontneas o termodinmicamente desfavorables, cuando ocurren de derecha a izquierda ya que el sustrato tiene menos energa que el producto. En caso de ocurrir de izquierda a derecha deben tomar energa del medio o de otra reaccin. La constante de equilibrio es <1. c) Aquellas reacciones que se encuentran con la misma probabilidad de izquierda a derecha que de derecha a izquierda, es decir no toman ni entregan energa y su constante de equilibrio es = 1. Para proceder deben recurrir al aporte constante de sustrato y la remocin de producto en uno u otro sentido. Volver al inicio
356
10) EL ATP. El ATP es considerado como una molcula intermedia en cuanto a su nivel de energa ya que existen otras molculas fosforiladas de mayor y menor energa que ella (Fig. 13 - 7). Su principal rol, es el de transportador de energa para procesos biolgicos tan variados como la conduccin nerviosa, la contraccin muscular, la presin osmtica, la
NH
N
O
N O
H H
CH2 O P O P O P O O O O
Mg +2
H OH OH
Fig. 13 - 7. El ATP se compleja al Mg+2.
generacin de gradientes de concentracin, etc. En todos ellos, es el ATP el que suministra energa al perder uno o dos de sus fosfatos. El secreto de su energa est en su estructura, la que se puede comparar a un resorte comprimido que guarda energa potencial y que luego se extiende realizando trabajo. Los grupos fosfatos de su estructura tienen una alta densidad electrnica y menos estructuras resonantes (12) comparadas con las del ADP y Fosfato (18). Las formas hidrolizadas como ADP y P o AMP y PP, pueden acomodar paulatinamente a los electrones, adems cada fosfato a pH 7.5 tiene una carga negativa, por lo tanto si la estructura se rompe perdiendo uno o ms de sus fosfatos los electrones restantes se acomodan ms fcilmente y las cargas negativas se encontrarn en esta nueva situacin algo ms separadas por lo que los productos de la hidrlisis son mucho ms estables. La carga que posee el ATP puede variar con el pH. En medio bsico es negativa y todas sus cargas se hallan presentes y es por lo tanto inestable. A mayor pH o basicidad del medio el ATP libera mayor energa. Por el contrario en medio cido, la molcula de ATP es ms estable pues las cargas negativas se encuentran con sus protones y se anulan las cargas negativas.
357
Otra razn que favorece la hidrlisis del ATP son los factores entrpicos, lo que significa que el producto de la hidrlisis est representado por un mayor nmero de molculas desordenadas que una sola molcula de sustrato. Adems, el Fosfato es muy bien hidratado, es decir interacciona favorablemente con el agua siendo cubierto con molculas que disminuyen su densidad de carga superficial. El ATP se puede hidrolizar de distintas formas liberando energa: G ATP ---------------------- ADP + P - 7,3 Kcal/mol ADP---------------------- AMP + P - 8,5 Kcal/mol AMP--------------------- Ad + P - 2,2 Kcal/mol Los dos primeros Fosfatos se encuentran formando anhdridos de alta energa: O O O-POPO O O O O + O-P=OP-O O O
En las formas resonantes se observa que ambos Oxgenos con doble enlace sobre y tambin cuando las formas resonantes producen doble enlace bajo el Fsforo, compiten por los electrones del Oxgeno central, lugar donde la nube electrnica es ms dbil. El tercer grupo Fosfato , solo tiene una unin ester de baja energa con el grupo CH2OH de la Ribosa correspondiente a la Adenosina. ATP ----------------------AMP + PP - 7,7 Kcal/mol PP ---------------------- 2 P - 8,0 Kcal/mol
El ATP no solo es depositario de energa sino que tambin puede dar origen con su estructura a molculas traductoras de la comunicacin celular, como lo son los segundos mensajeros o tambin puede activar otras molculas mediante la unin de su adenilo o adenilacin como son algunas vitaminas. Volver al inicio
358
11) SNTESIS DEL ATP a) Transferencia de Grupos Fosfatos La sntesis del ATP se puede llevar a cabo en los procesos de gliclisis por fosforilacin a nivel de sustrato y en la mitocondria mediante el proceso denominado fosforilacin oxidativa. Ambos son mecanismos de transferencia de energa y el primero de ellos hace uso de molculas fosfatadas de alta energa, provenientes de la oxidacin anaerbica de la glucosa. Estas molculas de alta energa donan su fosfato al ADP mediante una reaccin acoplada donde el in fosfato es traspasado mediante una reaccin exergnica a otra endergnica ( ADP + P ---- ATP) para generar ATP. La hidrlisis del ATP en agua a 250C y pH 7 libera -7300 cal/mol y para invertir esta reaccin se necesitaran nada menos que cerca de 489,5 moles de ADP y Pi por cada mol de ATP. Esta concentracin tan alta no es posible mantenerla en solucin. ATP-------------> ADP + P -7300 cal/mol -7300 = - 2.3 R T Log Keq 7300/1357 = Log Keq Keq = ( ADP)( P )/ (ATP) = 239.614,7 Por lo tanto, la nica manera de invertir esta reaccin es enfrentndola a otra que sea mas exergnica que ella y posea a la vez un in comn a ambas reacciones, como lo es el ion Fosfato. Por ejemplo, en la serie de reacciones que se observa en la Tabla a continuacin, todos los compuestos se hidrolizan liberando ion Fosfato. Algunos de ellos son ms exergnicos que otros y se encuentran ordenados al azar. Para saber entre qu reacciones se desplazar el Fosfato, se debe tomar en cuenta su energa libre estndar o
G.
TABLA 2 REACCIONES
C - P + H2O D- P M- P N- P Y- P
+ H2O + H2O + H2O + H2O
C+P D+P M+P N+P Y+P
G Kcal/Mol - 3,7 + 2,1 0,0 - 5,0 + 4,2
La ms exergnica o inestable de las reacciones de la Tabla anteriores ser la que produce o libera 5 Kcal/mol con signo negativo y las ms endergnica ser la que toma 4,2 Kcal/mol con signo positivo. Entre ellas el ion Fosfato se desplazar de reaccin en reaccin como se indica en la siguiente figura (Fig. 14- 7).
359
G Kcal/Mol - 6,0 - 5,0 - 4,0 - 3,0 - 2,0 - 1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 Y-P D-P -2,1 Kcal/mol M-P -3,7 Kcal/mol coordenada de reaccin -2,1 Kcal/mol N-P -1,3 Kcal/mol C-P
Fig.14 -7. Grfico de energa versus coodenada de reaccin, donde se observa el desplazamiento del Fosfato entre los pares de reacciones acopladas.
Se liberaron en total 9,2 Kcal/mol, desde N-P hasta Y-P y se transfiri el grupo fosfato de molcula en molcula por medio de reacciones en pares acoplados desde la reaccin ms exergnico a la ms endergnica. Otro ejemplo ms, se puede considerar en la siguiente serie de reacciones, donde algunas de ellas son exergnicas (b, c y d), mientras que otras no son ni lo uno y ni lo otro y se encuentran en equilibrio como la a y la e. La ida principal es observar como se pueden acoplar unas con otras para sintetizar ATP. G a) Succinil - SCoA + Pi ---------------Succinil Pi + CoASH 0,0 Kcal / mol b) Succinil - P + H2O ---------------- Succinato + Pi - 11,5 Kcal/mol c) GTP + H2O ------------------------------- GDP + P - 7,3 Kcal/mol d) Creatina-P + H2O ---------------------- Creatina + P - 10,5 Kcal/mol e) GTP + ADP ---------------------------- ATP + GDP 0,0 Kcal/mol ------------------------------------------------------------------------------------------------------------El intercambio de la Coenzima CoA-SH por Pi ocurre entre dos compuestos de alta energa en la reaccin a), que ocurre en el C.T.C. de la Mitocondria. Lo que se gana aqu es el in comn Fosfato (Pi), que puede impulsar las otras reacciones posteriores. El intercambio de energa ocurre en una direccin o en otra ya, que esta reaccin posee una Keq = 1. A continuacin la reaccin b) indica que la hidrlisis del grupo fosfato es 360
muy exergnica y libera energa al entorno. Por lo tanto parte de ella se puede aprovechar al acoplarla a la reaccin c), que al invertirla ser endergnica y podr ser empujada por el ion comn Pi. Finalmente una vez generado el GTP, su grupo Fosfato se puede traspasar al ADP en otra reaccin con Keq = 1, para formar finalmente ATP. Al agrupar las reacciones desde la ms exergnica hasta la ms endergnica tenemos que: G a) Succinil-SCoA + Pi -----------------Succinil Pi + CoASH 0,0 Kcal /mol b) Succinil P + H2O -------------------- Succinato + Pi - 11,5 Kcal/mol c) GDP + P ------------------------------- GTP + H2O + 7,3 Kcal/mol e) GTP + ADP ----------------------------- ATP + GDP 0,0 Kcal/mol -----------------------------------------------------------------------------------------------------------Succinil-SCoA + Pi + ADP---------- Succinato + ATP + CoASH - 4,2 Kcal/ mol Finalmente, se observa que la energa mantenida por la unin de la CoASH al Succinilo es liberada para acoplar el ion Fosfato al ADP y formar ATP. La reaccin que ocurre en el CTC y forma Succinil-SCoA es tambin parecida a la formacin de Acetil-SCoA. En ambos casos se forman Tiosteres o uniones entre grupos Tioles (-SH) y Grupos Carboxilos (-COOH) en la forma R- CO S R . Estas uniones son de alta energa debido a la disminucin de la capacidad de resonancia entre el Carbono y el Azufre. De esta manera se eleva el nivel de energa en compuestos con cadenas alqulicas, para su posterior oxidacin como ocurre con los cidos grasos o bien para activar molculas cortas (AcetilSCoA, Cuerpos cetnicos) para su unin a otras molculas, como el Oxaloacetato y la formacin de Citrato, primera reaccin del C.T.C. Otra combinacin de reacciones similar a la anterior, ocurre cuando se dona un Fosfato de alta energa al ADP en el msculo para generar ATP. La unin N-P en la Creatina es de alta energa ya que el grupo Fosfato limita las formas resonantes de la Creatina individual: G d) Creatina-P + H2O ---------------------- Creatina + P - 10,5 Kcal/mol c) GDP + P ---------------------------------GTP + H2O + 7,3 Kcal/mol e) GTP + ADP ----------------------------- ATP + GDP 0,0 Kcal/mol ----------------------------------------------------------------------------------------------------------Creatina-P + ADP ------------------------- Creatina + ATP - 3,2 Kcal/mol En ambos casos anteriores, se observa que la reaccin menos exergnica se invierte y se acopla a la ms exergnica, mientras que el grupo Fosfato (Pi) acta como in comn. A la vez, en la reaccin acoplada final se libera energa al entorno para satisfacer la segunda ley de la termodinmica. Despus de las descripciones anteriores, es posible entender como se vuelve a restaurar un grupo Fosfato en el ADP mediante el empleo de reacciones acopladas. En el proceso Glicoltico, durante la degradacin de la Glucosa aquellas reacciones que se encuentran dedicadas a este propsito, emplean como molculas dadoras de Fosfato al 1,3Difosfoglicerato y al Fosfoenol-Piruvato (Fig. 15 - 7). Ambas molculas son de alta energa, ya que estn constituidas por un anhdrido y un ster fosfato respectivamente. La energa estructural la han adquirido por oxidacin parcial de la Glucosa y sucesivos reordenamientos moleculares (Ver Captulo 8). El 1,3-Difosfoglicerato es un anhdrido y al hidrolizarse libera 11,8 Kcal/mol mientras que el ster Fosfoenol-Piruvato libera 14,8 Kcal/mol. Ambas molculas tienen uniones con electrones deslocalizados y cargas negativas que las hacen propensas a su hidrlisis con
361
gran liberacin de energa y la formacin de productos con un nmero mayor de formas resonantes y altamente solubles en agua e hidratables cmo el ion Fosfato mismo. El Fosfoenol-Piruvato presenta tautomera entre una forma Enol y otra forma Ceto. La forma Enol es 10 a 12 Kcal/mol menos estable que la forma Ceto y la adopta principalmente con la unin del grupo Fosfato, una vez eliminado el Fosfato pasa a la forma Ceto de baja energa. OH CH2= C - COOH Enol (Menos estable) O CH3 - C - COOH Ceto (Ms estable)
Volver al
Fosforilacin a nivel de Sustrato

ANHDRIDO FOSFATADO
O O O C O P O HO C H O CH O P O O C HO C H O O O
+ ADP
ATP
CH O P O
- 11,8 + 7 ,3 - 4 ,5
Kcal/mol
1, 3 - Difosfo - Glicerato
O
3 -Fosfo-Glicerato
O C O STER FOSFATADO C O O C O PO ADP C O O CH 2 CH
ATP G
- 14 ,8 + 7 ,3
Kcal/mol
Fosfo - Enol -Piruvato
3 Piruvato
- 5 ,8
Fig. 15 - 7. El ADP toma energa en forma acoplada a la defosforilacin del 1,3-Difosfo-Glicerato y el Fosfo-Enolpiruvato.
inicio b) TRANSFERENCIA DE PROTONES Y ELECTRONES
362
Otra forma de extraer energa como ATP, es apelar a la capacidad de algunas molculas para reducirse u oxidarse reversiblemente, es decir para tomar y donar protones y electrones. Estas molculas constituyen pares, ya que coexisten parte oxidadas y parte reducidas. Estos pares se denominan Redox y consecuentemente tienen una Constante de Equilibrio, hacia la cual migran en distinta proporcin, estando finalmente una parte de ellos ms cmodos en la forma reducida, mientras que otra parte se encontrar ms cmoda en la forma oxidada. En el equilibrio, un porcentaje de las molculas se encontrar finalmente reducido y otro porcentaje oxidado, incluso habrn algunos pares en que el 50% se encuentre oxidado y el otro 50% se encontrar reducido con una Keq = 1 o un Potencial Redox igual a 0. De esta manera una serie de compuestos pueden formar Pares Redox o molculas que pueden coexistir, ya sea tanto oxidadas como reducidas al donar o tomar reversiblemente protones y electrones. Como ejemplo tenemos a los pares A/AH2 (+0,50 volt, electropositivo) y X/XH2 (-0,30 volt, electronegativo) que aparecen en la Tabla 3. Es posible medir la tendencia para donar u aceptar protones y electrones mientras se dirigen al equilibrio a travs de un sistema formado por dos celdas (Fig. 16 7), donde se hacen circular los electrones al aplicar una determinada diferencia de potencial o voltaje. Por convencin, la diferencia de potencial con valor de 0 es atribuido al par estndar del Hidrgeno en sus formas 2H +/ H2. El resto de los otros pares se le atribuye por convencin un potencial negativo si tienden a dar electrones y protones y positivo cuando tiendan a atrapar electrones y protones. Al atrapar electrones se dificulta el flujo de estos para cerrar el circuito y cuando el par tiende a entregar se facilita el flujo de electrones y se completa el circuito. El puente salino entre ambas celdas (tubo con solucin saturada de sal), es para mantener la electroneutralidad a ambos lados, mediante paso de iones positivos y negativos en una u otra direccin. En la siguiente Tabla aparece un grupo de compuestos ordenados al azar donde se entrega su Potencial Redox () Estndar:
TABLA 3 Potenciales Redox A + 2 H+ + 2 X + 2 H+ U + 2 H+ W + 2 H+ Z + 2 H+
AH + 2 XH + 2 UH + 2 WH + 2 ZH
Volt + 0,50 - 0,30 + 0,45
2 2
+ 0,65 - 0,10
363
batera A + 2 + 2H+
voltmetro
iones + y
AH2
Fig. 16 - 7. Los electrones recorren el circuito y participan con mayor o menor facilidad de la reaccin de reduccin u oxidacin. Este es el efecto que se mide en el Voltmetro.
Por convencin el par con Potencial Redox ms negativo (X/XH2 = X + 2H + 2 ---- H2 = - 0,30 volt), ser el que tienda a dar electrones cuando se invierta la forma en que se encuentra actualmente expresado, que es de oxidado a reducid. Pasando a expresar ahora su tendencia natural, la que en realidad es de reducido a oxidado (XH2-----X + 2H + 2 ) al entregar electrones, mientras que su Potencial Redox ( ) tendr un valor positivo de + 0,30 Volt:
- 0,10 Volt 2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------XH2 + Z 0,20) G = - 9200 cal/mol S calculamos la Keq de la reaccin mediante la ecuacin: - 9200 = - 2,3 RT log Keq, ser de aproximadamente 5 x 10 6. Esto indica que se encuentra desplazada hacia la formacin de producto ZH2. El valor de - 9200 cal/mol, significa que la reaccin de oxidacin de X y reduccin de Z es exergnica. La energa as liberada se puede disipar como calor al entorno o bien ser atrapada en parte en la forma de un gradiente de concentracin y carga o ms an como energa qumica en una molcula de ATP. Al ordenar todos los pares de la tabla anterior tenemos en la figura 17, una cadena de Transporte de Electrones y Protones. Los electrones fluyen desde el par XH2/X al par al final de la cadena de transporte de electrones WH2/W. Algunas de las reacciones de transferencia de electrones son muy exergnicas como de ZH2 a U, donde se liberan 25,3 Kcal/mol, mientras que otras solo liberan una fraccin de esta energa, como la hace el par UH2 hacia AH2. Los electrones parecen fluir desde el par con un valor Redox ms electronegativo de - 0,50 a + 0,50 volt.
X + 2 H+ + 2 Z + 2 H + 2 ZH
XH2
+
+ 0,30 Volt
ZH2 + X
+ 0,20 Volt
G = - n Z = - 2 x 23000 x (+
364
G Kcal/Mol 30 20 10. 0 10 UH2 20 -2,3 Kcal/mol -6,9 Kcal/mol WH2 AH2 XH2 - 9,2 Kcal/mol
EVolt
-0,50 - 0 ,40 ZH2 - 0,30 - 0,20 -25,3 Kcal/mol coordenada de reaccin - 0,10. 0 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
Fig 17-7. Grfico de Energa libre y Potencial Redox versus coordenada de reaccin. Se indica como proceden los electrones en una cadena de reacciones.
Sin embargo, el par XH2/X se encuentra ms relajado o se encuentra ms desplazado hacia el equilibrio o en otras palabras, es ms estable en la forma oxidada X que en la forma reducida XH2, por lo tanto entrega electrones y protones. Mientras que el ltimo par WH2/ W, adquiere mayor estabilidad desplazndose a la forma reducida WH2. Luego, los electrones se desplazan siempre desde el par que se encuentra ms estable en la forma oxidada que por convencin tiene un Potencial Redox de -0,30 volt o electronegativo al par que se encuentra ms estable en la forma reducida y con Potencial Redox de +0,65volt o electronegativo. De la misma forma que el sistema anterior, ocurre la Cadena de Transporte de Electrones en la Mitocondria. Esta cadena de reacciones se abastece de molculas de alta energa previamente reducidas (Coenzimas NADH y FADH2), que se producen durante la oxidacin de los sustratos metablicos. Posteriormente hace que estas Coenzimas trasfieran sus protones y electrones desde el par con un Potencial Redox ms electronegativo al par ms electropositivo, por supuesto que con la misma salvedad empleada en la cadena dada anteriormente como ejemplo ( NAD/NADH -0,32 volt; FAD/2FADH2 -0,22 volt; CoQ 0,04; O2 +2H+ +0,82). De esta manera la energa qumica se libera etapa por etapa, para formar un gradiente de concentracin y carga a ambos lados de la membrana interna en la Mitocondria. Una vez formado este gradiente, se acopla a la sntesis de ATP.
365
La Niacina o Niacinamida Adenina Dinucletido. tiene un anillo que puede participar en las reacciones de Oxido-Reduccin. Puede remover dos protones de otra molcula y uno de ellos permanece en el anillo de Niacinamida y el otro en solucin.
PARTE ACTIVA DE LA MOLCULA NIACINAMIDA

HC HC O
FOSFATO
H C C O C NH2
+
N
CH
CH O
O H H
BASE NITROGENADA
NH C 2 N C
P O
H HO OH
H N C C
NAD
FOSFATO
P O
O CH 2
RIBOSA
o
NADP
Niacinamidadenin dinucletido
O H H HO O H H
O O P O OH H
Niacinamidadenin dinucletido Fosfato

AL ADICIONAR FOSFATO AL 2' OH
RIBOSA
Fig. 18 - 7. Coenzimas NAD y NADP.
La energa total liberada la Cadena de Transporte de Electrones, que incluye al par redox inicial y final se puede calcular mediante su potencial de oxido-reduccin, que es de - 0,32 volt para NAD/NADH+ H y de +0,82 volt para el par 2H+ /H2O:
NADH + H + 2e ----------------------------- NAD + 0,32 volt O2 + 2H + 2e ----------------------------- H2O + 0,82 volt -------------------------------------------------------------------------------------NADH + H + O2 ----------------- NAD + H2O + 1,14 volt G = - n F = 2 x 23000 cal/mol volt x (+ 1,14 volt) = 52000 cal /mol
366
H R C H
H C H R +
O C NH2
O C + NH2 H R C C H
+ SUST OXID. + PROTN LIBRE
+ N R
R+ H
N
NAD REDUCIDO
SUST. RED.
NAD OXIDADADO
Fig. 19 7. Transferencia de electrones y protones desde el sustrato a la Coenzima NAD. Cerca del 17% de las enzimas existentes emplean NAD o NADP. El Hidrgeno que reduce al anillo entra como un Hidruro ( H - ), mientras que el otro queda como in Hidrgeno en solucin. Los electrones son atrados por el Nitrgeno positivo del anillo de la Piridina.
Esta energa se emplea en crear un gradiente de protones a ambos lados de la membrana con un pH de aproximadamente 6 para el espacio intermembrana y de 7 para la matriz mitocondrial que aplicado a la ecuacin de Nernst, dar el Potencial de reposo o : N = 2,3 R T pH / Z F (1)
Por otro lado tambin se debe considerar la permeabilidad de cada uno de los mltiples iones existentes a ambos lados de la membrana y este otro potencial, se encontrar dado por la Ecuacin de Goldmann que considera el grado de permeabilidad. Si este es mximo se convierte en la Ecuacin de Nernst como ocurre para el ion H+: [ Permeabilidad ( Iones + ) afuera + Permeabilidad (iones- ) adentro ] 2,3 RT Log -------------------------------------------------------------------------------------------------[ Permeabilidad ( Iones + ) adentro + Permeabilidad (iones - ) afuera ] G=----------------------------------------------------------------------------------------------------------------(2) zF Posteriormente, tenemos que al juntar las ecuaciones (1) y (2), el gradiente electroqumico depender de: Gradiente = Potencial de membrana dependiente Potencial del gradiente electroqumico de la permeabilidad de cada in de pH, dependiente de la dado por la Ecuacin de Goldmann Ecuacin de Nernst En los organelos especializados de la Mitocondria y Cloroplasto se produce ATP a expensas de un gradiente quimiosmtico que se genera por la cadena de transporte de electrones. Este gradiente cuenta con una alta concentracin de protones a un lado de la membrana y una baja en el otro lado, junto a ste se produce un gradiente de carga de forma opuesta. La Cadena de Transporte de Electrones es un proceso exergnico que libera energa y que se emplea a su vez acoplado a este ltimo sistema para capturar la energa producida por dicho gradiente por medio del Complejo V o ATP sintasa. Lo que resta de esta energa se pierde como energa calrica (Ver Captulo 12).
367
Fosforilacin del tipo Oxidativa

Espacio
Matriz mitocondrial
+ H
ATP
intermembrana
+ H + H + H + H + H
El gradiente de protones trata de alcanzar la electroneutralidad al pasar por la Fo F1 ATP asa La energa del gradiente de concentracin y carga se emplea para sintetizar ATP
Fo F1 ATP asa ADP Pi
+ H+ H
+ H
+ H H+ H
pH = 6,0 pH = 7,0
Fig. 20 7. La energa del gradiente de concentracin y carga se transforma en energa qumica contenida en el ATP
El total del sistema se asemeja a una planta Hidroelctrica, donde se acumula el agua en un lago y luego se la libera cuesta abajo (gradiente) para que mueva los turbogeneradores. Estos ltimos convierten la energa hidrulica en mecnica y esta ltima en elctrica. En el caso de la mitocondria y el cloroplasto, el gradiente de protones y electrones sera el desnivel de agua y los turbogeneradores estaran representados por un canal inico asociado a una enzima. Esta enzima es conocida por denominarse como la FOligomicina - F1 ATPasa (FoF1ATPasa) o mejor conocida como ATP sintasa. Este canal inico tiene por objeto dejar pasar los protones y aprovechar la energa que se desprende de ello para ejecutar cambios conformacionales que permitan la sntesis del ATP (Fig 19 - 7). En realidad el proceso ocurre continuamente en estado estable es decir, se forma el gradiente y continuamente se colapsa produciendo ATP. Sin alcanzar nunca el equilibrio termodinmico o equilibrio que se produce cuando se agota el gradiente y no se sintetiza ms ATP. En este Captulo se han dado algunas de las reglas por las que se rige el metabolismo intermediario destinado a la produccin y empleo de la energa tanto en su propio beneficio como para llevar a cabo alguna funcin dentro de la Naturaleza. A su vez los organismos se encuentran sometidos constantemente a las fuerzas entrpicas o del desorden, tanto a nivel de sus protenas como en la informacin almacenada en los cidos nucleicos. Por lo tanto, parte de su sobrevivencia depender de la vigilancia y reparacin de los daos que paulatinamente lo alejan del estado estable, para hacerlo entrar finalmente en equilibrio termodinmico, es decir cuando fallezca y tenga el mismo nivel energtico que el ambiente que lo rodea. Volver al inicio 368
12) GLOSARIO Entorno: Proceso: Sistema aislado: Sistema cerrado: Sistema abierto: Equilibrio Termodinmico: Es el medio que rodea a un proceso termodinmico. Intercambio de energa entre un elemento y otro. No intercambia materia ni energa con el entorno. Es aquel que no intercambia energa con el entorno. Intercambia materia y energa con el entorno Cuando una reaccin o proceso ocurre en la direccin en que agota su energa para quedar con la misma que tiene el entorno. Flujo de energa y materia de forma no lineal o predecible lejos del equilibrio. Sistema viviente. Medida del desorden de un sistema Se puede crear espontneamente segn Darwin, en respuesta a fuerzas externas o del entorno como la evolucin Es un equilibrio dinmico en que la velocidad de sntesis de un compuesto es igual a su velocidad de degradacin manteniendo un determinado nivel de energa potencial. Sin entrar en equilibrio con el entorno. Libera energa hacia el entorno o hacia otras reacciones a presin y temperatura constantes. Toma energa del entorno o de otras reacciones en condiciones de presin y temperatura constante. Es aquel que surge debido a las influencias del entorno. Por ejemplo la aparicin de orden y complejidad pudiera ser en forma espontnea. Si se deja un sistema en manos del entorno como un trozo de arcilla en una corriente de agua forma final emerger por la accin del flujo del agua arcilla. Se puede definir como la falta de linealidad en un fenmeno. Es decir no se puede extrapolar el resultado, es dinmica lineal. Puede comprender una estructura de tipo Volver al inicio
Termodinmica lejos del equilibrio: Entropa: Orden: Equilibrio de Estado Estable:
Reaccin Exergnica: Reaccin Endergnica:
Sistema emergente:
la sobre la Complejidad: no jerrquica.
369
370
REFERENCIAS 371
Qu es la vida? E. Schrdinger., Ed. Orbis, 1985 A New Look at Mechanisms in Bioenergetics, E. Racker, New York, Academic press, 1976 Entropy for Biologists: An Introduction to Thermodinamics , H.J. Morowitz, Academic Press Inc., New York, 1970 Non-Equilibrium Thermodynamics. Crossing Boundaries, VOL. 1 N 2- Spring 2002 Thermodynamic Theory of Biological Evolution and Aging. Georgi P. Gladishev http:// www.endeav.org/evolut The Hierarchical Equilibrium Thermodynamics of Living Systems in Action. Georgi P. Gladishev. http:// www.endeav.org/evolut Thermodynamics of Living Systems. http:// www. Idolphin.org/mystery/chapt7.html
372
Hctor Rocha L. Metabolismo de los Hidratos de Carbono
HIDRATOS DE CARBONO
340
1) METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO 343 2) FUENTES DE ENERGIA PARA LA CONTRACCION MUSCULAR 347 3) DISTRIBUCIN DE LAS FIBRAS MUSCULARES SEGUN EL ESFUERZO 350 4) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE METABOLISMO AEROBICO Y ANAEROBICO 352 5) LA GLUCOSA COMO SUSTRATO PREFERIDO POR LAS CELULAS 352 6) EFICIENCIA DE LA GLICOLISIS ANAEROBICA 353 7) ETAPAS DE LA GLUCOLISIS 354 8) DEGRADACION Y SINTESIS DE GLICOGENO 354 9) SECUENCIA DE REACCIONES QUE CONDUCEN A LA DEGRADACION DEL GLICGENO EN EL HIGADO Y EN EL MUSCULO. 354 10) SINTESIS DESDE GLUCOSA O GLICOGENESIS 360 11) RAMIFICACIN Y DESRAMIFICACIN DE LA MACROMOLCULA DE GLICGENO 361 12) ENFERMEDADES DEL ALMACENAMIENTO DEL GLICGENO Y PROCESAMIENTO DE LA GLUCOSA 364 13) ETAPAS DE LA GLICOLISIS 365 14 ) REGULACIN ALOSTRICA DE LA GLICOLISIS 368 15) HOMEOSTASIS DE LA GLUCOSA EN LA SANGRE 16) TRANSPORTE DE LA GLUCOSA 372 373 370
17) OTROS HIDRATOS DE CARBONO QUE ENTRAN A LA GLICLISIS 18) SEGUNDA ETAPA DE LA GLICLISIS 376 19a) Lanzadera Glicerol-Fosfato 378 19b) Lanzadera Malato-Oxaloacetato 378
341
20) VIA DE LAS PENTOSAS O VIA DEL FOSFOGLUCONATO 384 21) VISION GENERAL DE LA VIA DE LAS PENTOSAS 22) LA VIA DE LA PENTOSA FOSFATO Y LA GLICOLSIS EN ERITROCITOS 23) REVERSIBILIDAD DE LA GLICOLISIS 392 24) GLUCONEOGENESIS 393 25) LAS 3 REACCIONES MAS EXCERGONICAS DE LA GLICOLISIS NO SON COMPARTIDAS CON LA GLUCONEOGENESIS 394 26) PRINCPALES DIFERENCIAS ENTRE LA GLICOLISIS Y LA GLUCONEOGENESIS 397 391
1) METABOLISMO DE LOS HIDRATOS DE CARBONO.
342
La Gliclisis, tambin denominada va de Embden-Meyerhoff, es una va metablica que se desarroll como una forma de obtener energa qumica para los procesos metablicos, mucho antes de la aparicin del Oxgeno en la Tierra. Esta es una va primitiva, que consiste en una oxidacin anaerbica y una reduccin, es decir los protones que se arrancan a la Glucosa son empleados para reducir a los mismos productos de la degradacin de esta (Fig. 1 8). No ocurre aqu una oxidacin neta de la molcula de Glucosa, ya que hay tanto oxidacin como reduccin, siendo el NAD empleado como agente oxidante y a la vez como reductor en la forma NADH + H. En este caso, el aceptor final de los protones es una molcula distinta al Oxgeno y conocida como PIRUVATO. Cuyo origen se encuentra en la ruptura, oxidacin y reordenamiento de la misma Glucosa. La molcula de PIRUVATO, luego de ser reducida por el NADH + H+, formar el compuesto final denominada c. LCTICO (Fig. 1 - 8) o bien LACTATO, cuando est disociado.
OXIDACION ANAEROBICA DE LA GLUCOSA
H CH3 C - COOH OH AC. LACTICO 2 NAD LA COENZIMA SE OXIDA Y REDUCE CCLICAMENTE 2 NADH + 2H
C6 H12 O6 GLUCOSA ATP ATP 2 ATP Activacin
+ + +
2 ATP 2 ATP 4 ATP
NETO: solo 2 ATPs SE PRODUCEN
CH3 CO - COOH AC. PIRUVICO
CH3 CO - COOH AC. PIRUVICO
Fig. 1 - 8.La Coenzima reducida (NADH + H+) se recupera dentro de la misma va metablica y solo se emplea en la activacin la mitad del ATP producido.
La formula emprica del c Lctico (2x C3H6O3 o 2x CH3- CH -COOH) corresponde OH a dos veces la molcula de Glucosa (C6H12O6). Esto demuestra que no ha ocurrido ningn cambio neto en el estado de oxidacin de la Glucosa, excepto su divisin en dos molculas de tres carbonos. Por lo tanto, la energa extrada en la Gliclisis Anaerbica, proviene ntegramente de la ruptura estructural de la molcula de Glucosa de seis carbones en otras dos molculas de tres carbones. Esta ruta degradativa se estudi originalmente en levaduras y tambin se la conoce desde muy antiguo por el nombre de Fermentacin Alcohlica. En esta ltima, el producto final consiste en Etanol (CH3CH2OH) y Anhdrido Carbnico (CO2): Piruvato Descarboxilasa CH3-CO-COO- -------------------------> CH3-CHO + CO2 PIRUVATO ACETALDEHIDO
343
Alcohol Deshidrogenasa CH3-CHO + NADH + H-------------------------> CH3-CH2-OH + NAD ACETALDEHIDO ETANOL La Gliclisis anaerbica ha sido hasta ahora ampliamente estudiada en el msculo esqueltico, donde representa la forma bsica de obtener energa. En aquellos casos donde la circulacin no aporta la cantidad suficiente de sangre oxigenada. El ATP obtenido por el proceso anaerbico es bajo, solo dos molculas de ATP por molcula de Glucosa, lo cul representa solo un 5.3% de la energa total que se puede extraer aerbicamente. Este ltimo hecho hace necesario, que la oxidacin anaerbica disponga de una gran cantidad de sustrato almacenado. Esto se logra mediante una compleja molcula de alto peso molecular denominada Glucgeno, en los animales (Fig. 2 - 8) y Almidn, en las plantas. La Glucosa se
LADO C4 No REDUCTOR
1 - 6
CH2O H CH2O H C H2 O H
C4
CH2 OH CH 2 O H
LADO No REDUCTOR
C H2O
U N IO N E S
C 4 LADO
CH 2 O H CH2O H
No REDUCTOR
1- 4
Lado R e d u c to r
CH2 OH
CH2 OH
1 - 6
CH 2 O H
C H2 O H
C H2O
CH2O H CH2 OH
CH2O H
H O H C 2 H O H C 2
C1
CH2O H CH 2 O H CH 2 O H CH 2 O H CH2 OH CH 2 O H
C H2O
CH2 OH CH2 OH CH2 OH
1 - 6
H O H C 2 H O H C 2
C4
LADO No REDUCTOR
S O L O U N A T E R M IN A C IO N R E D U C T O R A E N E L C A R B O N O 1 Y V A R IA S NO REDUCTORAS REPRESENTADAS POR EL CARBONO 4
Fig. 2 - 8. Parte de una molcula de Glicgeno mostrando un lado reductor libre y cuatro lados no reductores o Cs 4 donde se unen o se cortan molculas de Glucosa.
une por enlaces glicosdicos 1-6 y 1- 4. Al considerar nuevamente el metabolismo del msculo, encontramos que este cuenta con varios tipos de fibras. Entre ellas encontramos a la fibra muscular blanca de tipo a y b, Tabla 1 8. Estas fibras son pobres en mitocondrias y aptas para el movimiento repentino que demanda alta energa. Su tipo sera deseable en la musculatura de un levantador de pesas o un deportista que corre los 100 mts planos. Las fibras blancas (llenas de Glicgeno), son comunes en animales capaces de atacar bruscamente, para luego permanecer inactivos metabolizando durante largos perodos su c. Lctico. Entre ellos tenemos a los Cocodrilos (Reptiles) y peces de las grandes profundidades (medio pobre en O2). Es de suponer que la va metablica anaerbica sufri un proceso evolutivo que favoreci la manera actual de obtener energa una vez que la Mitocondria hizo simbiosis con la clula y el Oxgeno apareci en la atmsfera a consecuencia de la accin de los Cloroplastos. Estos
344
descomponen el agua impulsados por la energa solar. As se pudo obtener energa ms eficientemente y el Oxgeno constituy el aceptor final de los protones. Antes de la aparicin del Oxgeno, en los organismos unicelulares primitivos la cantidad de protones en el medio externo era demasiado alta debido a la difusin del c. Lctico hacia el exterior como deshecho. Los protones formaron as un gradiente entre el exterior e interior de los microorganismos existentes y la difusin debi pasar a ser forzada, es decir se empleaba ATP para luchar contra el gradiente externo. Sin embargo, como todo gradiente los protones pretendan entrar desde el medio externo para igualar su concentracin con el interior. Para evitarlo, se gastaba una gran cantidad de ATP y en un determinado momento, este sistema se invirti permitiendo ahora la entrada de protones que se acoplaron esta vez al mecanismo energtico de sntesis de ATP, en vez de hidrlisis y que es conocido hoy como el sistema de la ATP Sintasa o FoF1 ATPasa. (Ver captulo 13). Los protones que entraron no afectaron al gradiente o bajaron el pH interno del organismo, ya que con la aparicin del Complejo enzimtico de la Citocromo Oxidasa (Ver captulo 13), se unieron finalmente al O2 formando agua. Tabla 1 8 Caractersticas Fibras Musculares Rojas Fibras Musculares Blancas Tipo a Tipo b 4,2 5,2 Mediana Rpida * ** ** * Mixto Anaerbico ** * ** * ** *** ** * *** *** Intermedia Rpida
Superficie en micromts2 3,9 Velocidad de contraccin Lenta Fuerza desarrollada * Rapidez en fatigarse * Metabolismo Aerbico No de mitocondrias ** Capilares / fibra *** Conc. de GLICOGENO * *** Conc. de TAG. * Miosina-ATPasa Lenta Miosina TAG : Triacilgliceroles
Al observar la oxidacin aerbica de la Glucosa, vemos que aqu se emplean lanzaderas (Fig. 3 8), para transportar protones desde las coenzimas del citoplasma a la Mitocondria sin reducir el Piruvato a c. Lctico como ocurre en el proceso anaerbico. Estas lanzaderas entran a la Mitocondria y entregan los protones a la Cadena de Transporte de Electrones (CTE), adems el Piruvato del citoplasma entra a la Mitocondria (no se queda en el citoplasma para formar c. Lctico) y se oxida totalmente a CO2 y H2O mediante el Ciclo Tricarboxlico. Las Coenzimas NADH y FADH2 producidas es este Ciclo, se oxidan mediante la Cadena de Transporte de Electrones. Dando origen a un proceso conocido como Fosforilacin Oxidativa (FOx.) en que el gradiente de protones formados se aprovecha en generar ATP por la ATP Sintasa. La produccin total de energa corresponde en este caso a 36 -38 ATP por molcula de Glucosa (Fig. 3 - 8). Al volver nuevamente al metabolismo del msculo, encontramos que las fibras rojas son las responsables del movimiento sostenido, ya que son aerbicas, ricas en Mitocondrias, Tabla 1 8. Estas fibras son deseables en el caso de un maratonista y son comunes en aquellos animales que capturan su presa mediante una carrera sostenida, como lo hace el Guepardo o aquellos peces de superficie conocidos como Atn y Salmn. La musculatura roja es
345
aerbica, rica en capilares sanguneos, Mitocondrias y Citocromos y tambin se le halla en aquellas aves de tipo migratorio. En resumen, segn el estado de oxigenacin del msculo este producir c. Lctico o CO2 y H2O. En el primero de los casos el c. Lctico, se dirige al Hgado donde nuevamente es transformado en Glucosa y esta abandona el Hgado para depositarse nuevamente en los msculos como Glicgeno. El Hgado es algo lento en realizar este trabajo por lo tanto es posible que se acumule c Lctico en la sangre y baje el pH estimulando la Hiperventilacin, los calambres musculares y a la vez disminuya la capacidad de fijar el O2 por la Hemoglobina.
( 6 C ) GLUCOSA CITOPLASMA
MATRIZ MITOCONDRIAL
2ATP
LANZADERA GLICEROL-P
2 NADH + 2 H+
2 FADH2
CTE
F Ox
+ 4ATP
2ATP
2 PIRUVICO
2 NADH +2H
+
2 PIRUVICO 2 CO2
2 NADH + 2 H+ 6 NADH + 6 H+ +2 FADH2
+ 2 ATP Fosforilacin a nivel de Sustrato
CTE
F Ox
+ 6ATP
2 NAD
2 ACETIL-S-CoA
+ 22ATP
2LACTICO
Este proceso no ocurre en la Gliclisis aerbica
4 CO2
CTE
F Ox
+ 2 GTP
CTC
TOTAL =
+ 36ATP
Fig 3 - 8.La oxidacin aerbica de la glucosa emplea lanzaderas para enviar protones a la mitocondria, en vez de ocuparlos en el citoplasma durante la reduccin de Piruvato a Lctico. CTE : Cadena de Transporte de Electrones, ubicada en la membrana interna de la Mitocondria. CTC: Ciclo Tricarboxlico, ubicado en la matriz mitocondrial. FOx.: Fosforilacin Oxidativa, ubicada en la membrana interna de la Mitocondria
En base a las consideraciones anteriores un buen atleta debiera de tener las siguientes condiciones: a) Aumento en el tamao y nmero de Mitocondrias. Mientras ms Mitocondrias tendremos menos necesidad de Gliclisis anaerbica o menos fatiga. El proceso de
346
oxidacin de los cidos grasos ocurre ntegramente en la Mitocondria y es totalmente aerbico produciendo una mayor cantidad de ATP que la Glucosa. b) Aumento en la capacidad de la Cadena de Transporte de Electrones, para disponer de una mayor cantidad de Coenzimas oxidadas y a la vez dar cuenta finalmente de los protones al ser estos recibidos por el O2 para formar agua. c) Aumento en el nmero de fibras rojas sobre las blancas d) Aumento de las enzimas que oxidan cidos Grasos en el interior de la Mitocondria. De esta manera los Hidratos de Carbono se pueden usar en etapas posteriores del ejercicio. e) Aumento del almacenamiento de Glicgeno en el msculo. f) Produccin de menor cantidad de c. Lctico y un mejor tamponamiento de este, por el medio interno del msculo. Volver al inicio
2) FUENTES DE ENERGIA PARA LA CONTRACCION MUSCULAR El ATP necesario para la contraccin muscular proviene de las fuentes que se sealan a continuacin y su uso depender de la rapidez con que se necesite: a) Fosfo Creatina. b) Gliclisis Anaerbica y Gliclisis Aerbica. c) Oxidacin Aerbica.
a) Fosfo Creatina Es sabido que durante los primeros segundos de un esfuerzo fsico la energa es principalmente aportada por la Creatina Fosfato. Esta es una molcula de almacenamiento de energa qumica que puede transferir su fsforo rpidamente al ADP para formar el ATP necesario para la contraccin muscular (Fig. 4 - 8). La energa que contiene la molcula de Fosfocreatina se debe a la presencia de una nube de electrones deslocalizados entre el grupo Guanidino y el Fosfato. La experimentacin ha demostrado que un msculo envenenado con Iodoacetato y CN-, donde se inhibe tanto el metabolismo anaerbico (3-P-Gliceraldehdo Deshidrogenasa) como el aerbico (Citocromo Oxidasa) respectivamente, contina contrayndose bajo la accin de las descargas depolarizantes debido a la presencia de la Creatina-Fosfato como reservorio de energa. La formacin de ATP para la contraccin muscular en este caso, es catalizada por la enzima Cretina-Fosfoquinasa (CPK), cuya reaccin es termodinmicamente favorable y perdurar hasta agotarse toda la Fosfocreatina almacenada (Fig. 4 - 8).
347
Grupo Fosfato O H O P N
Grupo Guanidino C H3 C O O H2O H CH 3 C N N CH 2 NH H 2 O C O O O P O OH
C N CH 2 O NH 2 P-Creatina
Creatina
Go'= - 10.3 Kcal/mol 7.3 Kcal/mol
ADP
ATP
Go'=
Creatina Quinasa O H O P N O CH 3 C N CH 2 NH 2 O C O ADP O 3 C H C N C N 2 O H N H2 Creatina Go'= final 3.0 Kcal/mol H CH
ATP
P-Creatina
Fig. 4 - 8. El ADP puede ser fosforilado por la enzima Creatina Kinasa.
Se ha observado que algunos atletas que requieren de grandes esfuerzos durante unos pocos segundos ingieren hasta 20 grs. de Creatina para potenciar sus msculos. Sin embargo, la cantidad normal en el organismo humano es de tan solo dos gramos. Por otro lado, existe una isoenzima de la Creatina Fosfoquinasa que es de origen mitocondrial y se encuentra unida al lado exterior de la membrana interna de la mitocondria, en el tejido muscular esqueltico y cardaco. Su principal caracterstica es que transporta P de alta energa hacia la otra isoenzima citoplasmtica. El sustrato que emplea es el ATP producido durante el proceso de Fosforilacin Oxidativa de la Mitocondria. De esta manera el ATP citoplasmtico cuyo P, provino de la Mitocondria y que fue trado por la Cretina-P pasar directamente a ser empleado en la contraccin muscular. La anterior es una forma por la que el mecanismo Aerbico complementara las exigencias energticas de un esfuerzo sostenido en el tiempo, a diferencia del mecanismo anaerbico donde solo la acumulacin de Creatina-P participara como fuente de energa en los primeros segundos de un esfuerzo fsico intenso y repentino (Fig. 5 8). La Creatina empleada puede ser metabolizada a Creatinina cclica y aparece posteriormente en la orina como marcadora de esfuerzo fsico. Tambin se le emplea en la orina de colectada en 24 hrs. como ndice de filtracin glomerular o estado del rin ya que se filtra, pero no se reabsorbe
348
Rol aerbico de la Creatina Kinasa
ADP
ATP Isoenzima Citoplasmtica Cr
C P K asa
Cr P
Membrana Externa
ADP
Membrana Interna
F o
Pi
A T P SINTASA ( Fo F1 ATPasa ) Matriz Mitocondrial
ATP C P Kasa Adenilato
Isoenzima Mitocondrial
Translocasa
F 1
ADP
ATP
Fig. 5 - 8. Las isoenzimas CPKasa mitocondrial y citoplasmtica se encuentran en el msculo cardaco.
b) Gliclisis Anaerbica y Gliclisis Aerbica Al continuar con la descripcin de las fuentes que aportan energa para un esfuerzo fsico, despus de la Fosfocreatina se emplea paulatinamente la oxidacin anaerbica de la Glucosa a partir del Glicgeno contenido en el msculo y con produccin de c. Lctico, para entrar a los tres minutos al metabolismo aerbico de tipo abierto. Es decir, este ltimo requiere de la circulacin sangunea y la respiracin pulmonar. En este momento la oxidacin aerbica mejora gradualmente por el aporte de Oxgeno que llega por todos los capilares y las Mitocondrias reciben el Piruvato proveniente de la Glucosa, que ya no acta como aceptor final de protones formando c. Lctico al recuperar las Coenzimas reducidas, sino que se emplean ahora lanzaderas para llevar los protones de las Coenzimas a la Mitocondria y el resto de aquellas Coenzimas que se ocupan en la Oxidacin total del Piruvato en la Mitocondria, se oxidan in situ por la Cadena de Transporte de Electrones (CTE), (Fig. 3 8). Se produce ahora la formacin de CO2 (Fig. 6 - 8) y H2O en la Mitocondria.
c) Oxidacin Aerbica Se emplea como sustrato una mayor proporcin de cidos Grasos que de Glucosa. Los cidos grasos llegan por la circulacin unidos a la protena Albmina y han sido liberados
349
por la accin hormonal de la Adrenalina, desde el tejido Adiposo. En el interior de la Mitocondria plenamente oxigenada y funcional se oxidan mediante el proceso denominado Oxidacin con gran produccin de ATP, CO2 y H2O. Si el esfuerzo muscular es intenso y de larga duracin o mayor de tres minutos, las fibras
SECUENCIA DE EMPLEO DE VIAS ENERGETICAS DURANTE LA CONTRACCION MUSCULAR
INTENSIDAD DE LA CONTRACCION
Cr-P Glic.-Anaerbica Ox.-Aerbica
50
TIEMPO (min)
Fig. 6 - 8. En los primeros segundos de un ejercicio violento se emplea la CrP como fuente de energa, para continuar luego con el metabolismo anaerbico y finalmente el metabolismo aerbico.
blancas pasan el trabajo a las fibras rojas, sin embargo an se emplean las blancas para los movimientos bruscos de alta intensidad (ftbol). Por lo tanto la cantidad de Ac. Lctico contina aumentando y la capacidad tamponante del msculo se sobrepasa cuando el mecanismo de transporte del Ac. Lctico al hgado se satura y no se alcanza a remover todo el cido producido. Este se acumula en las fibras musculares y acarrea calambres y posteriores desgarros. Volver al inicio
3) DISTRIBUCION DE LAS FIBRAS MUSCULARES SEGUN EL ESFURZO En los animales se puede observar claramente la representacin de cada una de los tipos de fibras musculares segn sea su modo de vida. Por ejemplo, los pectorales de las aves domsticas que se encuentran adaptadas a una vida sedentaria son solo aptos para vuelos cortos y ocasionales, requiriendo sucesivas detenciones por la gran acumulacin de c. Lctico que en ellos ocurre. Esta es la tpica fibra muscular blanca, rica en Glicgeno, blanda y apetecida em la meza. Las aves salvajes o migratorias en cambio tienen pectorales rojos, ricos en mitocondrias y abundante irrigacin sangunea que les permite mantener el vuelo por largos periodos de tiempo. Por otro lado los peces de las grandes profundidades cuentan
350
con un metabolismo mayormente anaerbico, que no les permite el esfuerzo prolongado y su estrategia de vida responde a estas condiciones. Al capturar solo presas inmviles que no demanden un mayor gasto de ATP, ya que el agua a tales profundidades es pobre en Oxgeno disuelto. Algunos de estos peces eliminan mayormente Ac. Lctico por sus branquias (Tabla 2 - 8). Distinto es el caso de la trucha, que frecuenta las aguas correntosas y oxigenadas capturando solo presas en movimiento. Este tipo de comportamiento indica la presencia de una musculatura esencialmente aerbica, aunque tambin necesita de un mecanismo anaerbico que le permita bruscas aceleraciones y detenciones, como se puede apreciar en los datos de la Tabla 2 - 8.
Tabla 2 - 8 ENZIMAS LACTATO DESHIDROGENASA* CITRATO SINTASA**
MUSCULO ROJO Pez activo: Salmn U/gr Pez inactivo: Hoplias U/gr 5,500
MUSCULO BLANCO
MUSCULO ROJO
MUSCULO BLANCO
300
68,0
8,8
576
419
3,7
2,0
(*) La Lactato Deshidrogenasa (metabolismo anaerbico), es una enzima marcadora de la fibra muscular blanca y se encuentra en similar cantidad en la musculatura blanca y roja del Hoplias. Mientras que en el Salmn tambin se encuentra debido a su movimiento de tipo explosivo tras la presa. (**) La enzima Citrato Sintasa (metabolismo aerbico), pertenece a la mitocondria y es marcadora del metabolismo aerbico en la fibra muscular roja. Se le encuentra en mayor cantidad en el Salmn que en el Hoplias, ya que el primero habita aguas correntosas donde requiere de movimiento constante. Se puede concluir que un animal exitoso durante el movimiento explosivo y de corta duracin, deber tener un metabolismo anaerbico que presente las siguientes caractersticas: 1) un elevado depsito de Glicgeno muscular 2) elevados niveles de enzimas glicolticas 3) una capacidad tamponante adecuada del msculo para tolerar los distintos niveles de Ac. Lctico. Por otro lado para una oxigenacin adecuada durante el metabolismo aerbico de las fibras musculares se requiere considerar:
351
1) El tamao del animal. Un roedor de pequeo tamao tendr mejor oxigenacin que un elefante o un cetceo. Esto se debe al hecho de que al tener menos volumen su sistema circulatorio tiene una menor sobrecarga lo que redundar a su vez en un mayor nmero de fibras rojas bien oxigenadas. Por otro lado un animal de tamao mayor deber disponer de fibras blancas para contrarrestar una oxigenacin lenta y poco eficiente. 2) La capacidad de su sistema corazn-pulmn junto al grado de irrigacin capilar en cada msculo. 3) El nmero de mitocondrias que posee un tejido. Volver al inicio
4) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE EL METABOLISMO ANAEROBICO Y AEROBICO. 1) El metabolismo Anaerbico es una fuente de energa autocontenida en el msculo para la actividad locomotora intensa, pero de corta duracin. Se caracteriza por la sntesis explosiva de ATP con gran consumo del sustrato Glucosa, mientras que el metabolismo Aerbico es para la actividad sostenida que no solo se mantiene por el Glicgeno del msculo, sino que tambin por las Grasas. Una vez que se agota el combustible presente en la clula muscular, se emplea el combustible proveniente del hgado como glucosa y triglicridos junto al proveniente del tejido adiposo. Esta caracterstica permite en el msculo un metabolismo abierto con la llegada de los substratos y la subsecuente salida de CO2 y H2O por medio del sistema circulatorio. La actividad del animal aerbico durante este periodo depender del tamao y trabajo que efecte el sistema coraznpulmn. 2) La Creatina-P se emplea en la fibra muscular blanca como un reservorio capaz de donar P al ADP, sin embargo en la fibra muscular roja tambin sirve como lanzadera de Fosfato entre la mitocondria y el sarcoplasma de la fibra muscular roja (Fig. 5 8). Volver al inicio 5) LA GLUCOSA COMO SUSTRATO PREFERIDO POR LAS CELULAS. La Glucosa contiene oxgeno en su estructura y se puede decir que NO es uno de los substratos con mayor cantidad de energa qumica. Es en s una estructura semioxidada, sin embargo soluble en agua y entre los azcares de seis carbones, solo una pequea fraccin de sus molculas se encuentra abierta en la forma de un aldehdo. Los aldehdos son conocidos por unirse a los grupos amino terminales de las protenas alterando su estructura. Por las razones anteriores la molcula de Glucosa es preferible, comparada a otros substratos de mayor energa. Tal es el caso de los cidos grasos que por estar reducidos y formar largas cadenas, son de difcil manejo debido a su tamao e hidrofobicidad y adems requieren de ciertos mecanismos especficos para su transporte. Ms an, al considerar los 20 aminocidos como fuente alternativa de energa, encontramos que no todos ellos son solubles en agua y adems poseen nitrgeno, lo que es otro inconveniente. Este ltimo debe eliminarse como Urea, Amonio o c. rico cuando son empleados como fuente de energa. Esta complicacin implica un costo extra de ATP que tambin disminuye la eficiencia de los aminocidos como fuente de energa.
352
Volver al inicio 6) EFICIENCIA DE LA GLICOLISIS ANAEROBICA. En general la Glucosa puede ser oxidada con y sin Oxgeno. As tenemos que la energa total que se desprende por oxidacin aerbica en un calormetro alcanza a 686 Kcal/mol de Glucosa, de las cuales se aprovechan 277.4 Kcal para sintetizar 38 ATPs por el metabolismo aerbico animal, lo que arroja un rendimiento del 40.4 %. En cambio, por oxidacin anaerbica se produce a partir de la glucosa un total de 47.0 Kcal /mol hasta Piruvato y de ellas se aprovechan tan solo 14.6 Kcal/mol, que corresponden a solo 2 ATPs, con un rendimiento de solo el 31.0 %. El rendimiento neto comparado con la va aerbica es en este caso de 14,6/686 o 2,1 %. El resto de la energa contina an en la molcula de Piruvato. Al comparar ambas vas tenemos que la anaerbica es solo un 5.2 % de la energa aerbica ( 2/38 ), lo cul significa poco aprovechamiento de la energa presente en la molcula de Glucosa, cuando no se cuenta con el Oxgeno como aceptor final de protones. La baja eficiencia energtica del metabolismo anaerbico es paliada a su vez por la gran cantidad de sustrato liberado por esta va. 19 veces ms Glucosa para proveer de ATP al mismo nivel que la oxidacin aerbica, Tabla 3 - 8. TABLA 3 8 -----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------AEROBICO C6H12O6 + 6 O2----->6 CO2 + 6 H2O 38ADP + 38Pi-----> 38 ATP G0' = - 686 Kcal/mol G0' = + 277.4 Kcal/mol
Rend. Aerbico : 277.4/686 * 100 = 40.4 %
ANAERBICO C6H12O6 ------------->2 CH3CHOHCOOH 2 ADP + 2 Pi------->2 ATP G0' = - 47 Kcal/mol G0' = +14.6 Kcal/mol
Rend. Anaerbico : 14.6/47 x 100 = 31.0 % Comparacin = 2/38 x 100 = 5.2 % ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
La energa total de la Glucosa extrada aerbicamente es el 40,4%, mientras que anaerbicamente se extrae solo un 2,1%: Comparacin : 14,6/686 x 100 = 2,1%
353
La oxidacin anaerbica de la Glucosa libera un poco menos de energa que la fermentacin alcohlica, sin embargo ambas participan en la sntesis neta de solo dos ATPs: C6H12O6 ----------------> 2 CH3-CHOH-COOH C6H12O6-----------------> 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 2 ADP +2 Pi-----------------> 2 ATP = - 47.0 Kcal/mol = - 50.3Kcal/mol = + 14.6 Kcal/mol
Esto se traduce en un rendimiento del 31% para la gliclisis anaerbica y del 29.0% para la fermentacin alcohlica. Ambas son mucho ms eficientes que un motor de combustin interna (10-15%). Volver al inicio 7) ETAPAS DE LA GLUCOLISIS. La Gliclisis consta principalmente de dos etapas. En la primera se renen los azcares simples, como la Glucosa del Glicgeno, la Fructosa y la Galactosa para activarlos con el gasto de dos ATPs y enseguida se rompen en dos molculas de 3-Fosfogliceraldehdo. En la segunda etapa se produce la xido-reduccin donde se produce ATP y sale Lactato. Durante la segunda etapa es cuando se libera energa por medio de las reacciones acopladas y se produce la fosforilacin a nivel de substrato, mientras que los protones extrados al 3-P-Gliceraldehido durante su oxidacin son entregados al Piruvato para formar el cido Lctico. Volver al inicio 8) DEGRADACION Y SINTESIS DEL GLICOGENO. I) DEGRADACION HASTA GLUCOSA. La Glicogenlisis es la degradacin del Glicgeno contenido tanto en el hgado (4% peso hgado) como en el msculo (0.7% peso msculo) y consiste en la hidrlisis de la compleja estructura del Glicgeno a Glucosa controlada por la accin hormonal. El mecanismo por el que se degrada el Glicgeno consiste en un sistema de amplificacin en cascada, ya que a partir del estmulo inicial provocado por una molcula de hormona en la membrana citoplasmtica, se logran liberar del Glicgeno muchas molculas de glucosa. Entre las hormonas que intervienen en el metabolismo de los Hidratos de Carbono se encuentran las producidas en el Pncreas, especficamente por los Islotes de Langherhans y son la Insulina en las clulas beta (), el Glucagn en las clulas alfa () y la Somatostatina en las clulas gama (). La insulina estimula la permeabilidad de los tejidos a la Glucosa y su empleo, el Glucagn estimula la degradacin del Glicgeno desde sus reservorios y tambin la Gluconeognesis, mientras que la Somatostatina controla su metabolizacin. Ni el cerebro, ni los eritrocitos almacenan Glicgeno, por lo tanto el aporte de glucosa a estos tejidos por el hgado es fundamental para su buen funcionamiento. Es comn en los
354
diabticos que se inyectan Insulina, la rpida entrada de la glucosa a las clulas musculares y tejidos adiposos, producindose una hipoglicemia y posterior desmayo. El Glicgeno es un polmero de la Glucosa formado por las uniones glicosdicas del tipo (1 4) y por las ramificaciones (1 6). De esta manera constituye una molcula formada por muchas ramificaciones iguales y solo parcialmente soluble en agua (Fig. 7 - 8 ), tiene solo un lado reductor -1-OH con un carbono epmero libre en un extremo e innumerables extremos opuestos con carbonos no reductores o posiciones 4-OH en las distintas molculas de glucosa. En general se encuentra en casi todas las clulas, pero principalmente en el
Lado no Reductor
CH2OH H OH H CH2OH H H OH H H
Rama lateral
Unin
1
CH2
1 6
Lado Reductor
H CH2OH H OH H H
OH
H CH2OH H OH H H
OH
6
H H OH H
H OH
H H H
OH
OH
OH
OH
1 4 Cadena
con
1 1 4
1 4
Uniones
Fig. 7 - 8. Estructura parcial de una molcula de Glicgeno.
msculo esqueltico e hgado. A continuacin se describen los mecanismos de degradacin y sntesis. Las hormonas como Glucagn, Adrenalina y ACTH actan a nivel de receptores especficos ubicados en la cara externa de la membrana celular (Fig. 8 - 8). El Glucagn activa la degradacin generalmente en el hgado y la Adrenalina en el msculo, sin embargo debido a su tamao o carga, ambos no pueden entrar a la clula y deben ejercer su influencia de manera indirecta unindose a una protena receptora especfica ubicada en la membrana celular. En ella desencadenan un cambio conformacional que a su vez estimula a la Protena G que se encuentra en el interior de la membrana. La protena G debe su nombre a que interacciona con el nucletido GTP y tiene tres subunidades denominadas alfa, beta y gama. La subunidad , es la subunidad activa de la protena G que se desprende para su accin de las subunidades y . Esta subunidad se
355
une al GTP cuando es activada previa liberacin de su GDP empleado en el ciclo de activacin anterior, para que a continuacin ambas molculas (subunidad Alfa y GTP), se unan a la enzima Adenil Ciclasa. Esta enzima tiene por objeto generar el segundo mensajero o AMPc (Adenosina Monofosfato Cclico) empleando como substrato ATP. Mientras la Hormona permanezca unida al receptor se formaran interacciones entre la subunidad , GTP y Adenil Ciclasa, que amplificaran la seal induciendo la formacin de AMPc. Una vez que la Hormona abandona el receptor, el GTP se hidroliza a GDP en la subunidad y se libera de la unin activante con la enzima Adenilato Ciclasa, volviendo a
H H R R
G G
AC AC
H H R R FD G
ATP AMP AMPc Proteina r C r+C Quinasa act. inact. Fosforilasa Quinasa Fosforilasa
FQ -OH FQ -OH FQ -OP FQ -OP
H : Hormona R : Receptor G : Protena AC: Adenil Ciclasa FD : Fosfodiesterasa R : Regulatoria C : Cataltica
GLICOGENO
(n)
inact.
HOHO-
act.
POPO-
- OH - OH
-OP -OP
VIA ACTIVA solo con enzima fosforilada
inact.
act. GLUCOSA - 1 P + GLICOGENO ( n - 1 )
Fig. 8 - 8. El mecanismo de regulacin en cascada tiene por objeto amplificar el nmero de molculas de glucosa liberadas por molcula de hormona.
unirse nuevamente con sus otras subunidades y para formar la protena G inactiva. Todas las molculas de AMP cclico que se han formado hasta este momento interactan con la enzima Protena Quinasa que tiene cuatro subunidades 2 reguladoras y 2 activadoras (Fig. 8 - 8). El AMPc se une a las subunidades reguladoras quedando libre las dos activadoras. Estas ltimas en presencia de ATP fosforilarn a la enzima Fosforilasa Quinasa, la que activar por fosforilacin en cadena a la Glicgeno Fosforilasa. Esta ltima enzima catalizar la degradacin del Glicgeno para formar muchas molculas de Glucosa1-Fosfato por medio de la reaccin entre el Glicgeno, ms varias molculas de Fosfato inorgnico. De esta manera se amplifica el efecto de una molcula de hormona al producir la fosforilacin de muchas molculas de Glucosa como se observa en la Figura 9 - 8. Las presiones selectivas derivaron en este sistema de amplificacin para producir energa disponible rpidamente, ya que si fuera la proporcin de una molcula de Glucosa por
356
molcula de Hormona, habra que tener glndulas de mayor tamao para producir ms Adrenalina para el msculo o Glucagn para el Hgado, lo que redundara en un peso mayor y dificultad de transporte. La Glucosa -1-Fosfato producida por la degradacin del Glicgeno cambia de posicin su fosfato a Glucosa-6-P por accin de una Fosfoglucomutasa. De esta forma la Glucosa6-Fosfato, puede continuar degradndose en la Gluclisis o puede entrar al sistema circulatorio previa hidrlisis del Fosfato en el Hgado, siendo llevada a los msculos u otros rganos como Glucosa.
Amplificacin en Cascada. Glucagn Adenilato Ciclasa AMPc Proteina Quinasa Enzima Fosforilada Producto.
Fig. 9 - 8. Existen distintos puntos de amplificacin en la secuencia de reacciones destinadas a degradar el Glicgeno.
Volver al inicio
9) SECUENCIA DE REACCIONES QUE CONDUCEN A LA DEGRADACION DEL GLICGENO EN EL HIGADO Y EN EL MUSCULO. HGADO Hormona + Receptor----------------> Hormona-Receptor (H-R) H-R + Prot.G-GDP(inactiva)---------> H-R-Prot.G-GTP(activa) Prot.G- GTP(activa) + Adenilato Ciclasa---------> Adenilato Ciclasa(activa)
357
Adenilato Ciclasa (activa) + ATP--------> AMPc + Protena Quinasa + AMPc ----------> Protena Quinasa (activa)-AMPc Fosforilasa Quinasa + Prot.Quinasa (activa)---------->Fosforilasa Quinasa(activa) Fosforilasa(inactiva) + Fosforilasa Quinasa(activa) + ATP------>Fosforilasa-P (activa) + ADP Glicgeno + Pi + Fosforilasa (activa) ----------------> (Glucosa-1-P)n
MSCULO Hormona + Receptor----------------> Hormona-Receptor (H-R) H-R + Prot.G-GDP (inactiva)---------> H-R-Prot.G-GTP(activa) Prot.G- GTP(activa) + Fosfolipasa C- (inactiva) -----> Fosfolipasa C- (activa) Fosfolipasa C- (activa) + Fosfatidil Inositol (PIP2) -----> Diacil Glicerol (DAG) + Inositol Fosfato (IP3) Inositol Fosfato (IP3) + Retculo Endoplsmico Liso -----> Salida de Ca +2 4Ca +2 + Calmodulina ------------------> Calmodulina (Ca +2 )4 Calmodulina (Ca +2 )4 +
Fosforilasa Quinasa (inactiva) -----> Fosforilasa Quinasa (activa)
Fosforilasa Quinasa (activa) + Fosforilasa(inactiva) + ATP -----> Fosforilasa-P(activa) Fosforilasa-P (activa) + Glicgeno + Pi -----------------> (Glucosa-1-P)n Por otro lado en la figura 10 8, se observa que en el msculo la amplificacin en cascada es desencadenada por la Adrenalina y como segundo mensajero se emplea el Inositol Trifosfato ( IP3). Este es parte de uno de los Fosfolpidos de membrana denominado Fosfatidil Inositol-P (PIP2). El IP3 acta sobre el Retculo Endoplsmico Liso que libera Ca +2, que por un lado estimula la contraccin muscular y por el otro la liberacin de sustrato Glucosa desde el Glicgeno para entregar energa a la misma contraccin. El ion Ca +2, se une a la protena denominada Calmodulina (PM 17.000kD) en 4 lugares cambiando la conformacin de esta y unindose a la enzima Fosforilasa Quinasa. Esta ltima pasa de inactiva a activa y a su vez cataliza la activacin de la Fosforilasa que finalmente cataliza el paso de Glicgeno a Glucosa-1 -P. La sntesis del Glicgeno es llevada a cabo por una enzima denominada Glicgeno Sintasa. Esta es una enzima reguladora de la va de sntesis del glicgeno y es tambin
358
fosforilada por la Protena Quinasa con lo que se inhibe en su accionar (Fig 11 - 8). De esta manera se evita un ciclo intil o ftil de sntesis degradacin que solo gastara ATP.
H R P IP 2 + DAG IP 3 E S P A C IO IN T R A C E L U L A R E S P A C IO EXTRACELULAR
P L -C
R E T C U L O E N D O P L S M IC O L IS O
C a +2
C A L M O D U L IN A
F O S F O R IL A S A Q U IN A S A IN A C T IV A
F O S F O R IL A S A Q U IN A S A A C T IV A
( G L IC G E N O ) P
F O S F O R IL A S A IN A C T IV A
F O S F O R IL A S A A C T IV A
Fig. 10 - 8. Cascada de amplificacin en el msculo
G L U C O S A -1 -P + ( G L IC G E N O ) N - 1
H R G ATP
Proteina Quinasa GLICOGENO
VIA ACTIVA solo con enzim a defosforilada
AC AMPc R C R + C Act. PO - GS GS - OP
Glicgeno Sintasa Inact.
HO - GS GS - OH
Glicgeno Sintasa Act.
UDP-Glucosa
Fig. 11 - 8.La Protena Quinasa evita los ciclos intiles al inhibir la va Glucognica durante la Gliclisis.
Volver al inicio 10) SINTESIS DE GLICGENO DESDE GLUCOSA O GLICOGENESIS.
359
La sntesis de Glicgeno empieza con la fosforilacin de la glucosa por la Glucoquinasa formando Glucosa-6-P en el hgado, ya que esta enzima debido a su mayor Km funciona solo en condiciones de sobrealimentacin. La Glucosa-6-P, pasa luego a Glucosa-1-P por accin de la Mutasa. A continuacin la Glucosa-1-P es tomada por la UDP-Glucosa Pirofosforilasa que carga de energa a la Glucosa con UTP para formar UDP-Glucosa y unir la UDP-Glucosa mediante la Glucgeno Sintasa, en una reaccin exergnica al extremo no reductor del Glicgeno (Fig. 12 - 8).
GLICGENO SINTASA UDP

CH2OH
H OH OH H H
CH2OH
H H OH OH H
Lado no Reductor
Rama lateral
1 O
CH2OH
CH2OH
H OH H
H OH H
Unin 1
H CH2OH
OH CH2OH
OH CH2 H H OH H
6
H
Lado Reductor
H OH H H H
OH
H OH H
H OH H
O O P O
OH
O N
2
HC 4
OH
1 4
OH
OH
1 4
OH
P O O
O O
H H
Pi
UDP - GLUCOSA
OH
OH
FOSFORILASA
PPi 2Pi
UTP
H
CH2OH H OH OH H OH H
PIROFOSFORILASA
O - P
Fig. 12 - 8. La molcula de glucosa debe activar su C-1 para unirlo al C-4 del Glicgeno. La liberacin de una molcula desde el Glicgeno se lleva a cabo por fosforilacin en el C-1 de la Glucosa.
La molcula de UDP-Glucosa se une al lado 4' de la Glucosa perteneciente a un extremo del Glucgeno conocido como el lado no reductor y no al extremo 1' del Glicgeno conocido como el lado reductor, donde se encuentra el carbono epmero. La Molcula de Glicgeno tiene un lado reductor (C 1') y muchos lados no reductores (C4'), donde se unen o se liberan nuevas molculas de Glucosa. De esta manera se adicionan de 6 a 12 molculas hasta que acta sobre ellas una enzima ramificante que toma este grupo de molculas enlazadas y forma una rama lateral en el carbn 6 de una de ellas. Esta enzima es una (1 4) - (1 6) Transferasa o Transglicosidasa (Fig 13 8), la que produce una unin 1- 6 o rama lateral. Va de Degradacin:
360
Glucgeno Fosforilasa Pi + GLICOGENO----------> GLUCOSA-1-P Va de Sntesis: Pirofosforilasa GLUCOSA -1-P + UTP ------> UDP-GLUCOSA + PPi PPi --------------> 2Pi Glucgeno Sintasa UDP-GLUCOSA + GLUCGENO------> GLUCOSA( 1-4) GLICOGENO + UDP Regeneracin del UTP UDP + ATP----->UTP + ADP 11) RAMIFICACIN Y DESRAMIFICACIN DE LA MACROMOLCULA DE GLICGENO. La enzima Fosforilasa rompe uniones (1 - 4) en las ramas del Glicgeno, sin embargo cuando llega a 4 unidades de Glucosa de una ramificacin del tipo (1 - 6) se detiene y no
FOSFORILASA O O O O O O O (1-4) - (1-6) TRANSGLICOSIDASA O O O O O O O O O O O 2P- O O
O O O O O O O O O O
(1-4) - (1-4) TRANSFERASA
O 3 UDP GLICGENO SINTASA O O O O O O O
(1-6) GLUCOSIDASA O O
- UDP O O O O O O
Fig. 13 8. Ciclo de ramificacin y desramificacin del Glicgeno
avanza ms. En este momento acta una enzima denominada (1 4) a (1 4) Transferasa, que lleva las tres unidades de Glucosa previas a la Glucosa de la unin (1 6) a otra
361
rama, donde el grupo en posicin 4 esta libre. De esta manera la Glucosa de la rama queda expuesta y es atacada por una (1 6) Glucosidasa que la libera como Glucosa. Esta ltima enzima es tambin reconocida como Enzima Desramificante que rompe las uniones del tipo (1 6).
Volver al inicio
12) ENFERMEDADES DEL ALMACENAMIENTO DEL GLICGENO y PROCESAMIENTO DE LA GLUCOSA.
362
Existen algunas enfermedades denominadas de Almacenamiento del Glicgeno (Tabla 4 8) y tambin del transporte de la Glucosa que dejan a las clulas con cristales de Glicgeno. En algunos casos la Macromolcula no se pueda degradar y en otros almacenar. De esta manera se pierde el control para mantener una determinada concentracin de Glucosa en la sangre y la disponibilidad de esta para liberar energa bajo requerimiento. Por otro lado, algunas molculas transportadoras de Glucosa, son tambin susceptibles de fallas al no poder entregar sustrato a una enzima determinada provocando enfermedades similares a la carencia total o parcial de la misma enzima. Tabla 4 8 Volver al inicio
NOMBRE DE LA ENFERMADA D Von Gierke
TI PO Ia
ENZIMA AFECTADA Glucosa-6- Fosfatasa
ORIGEN Hgado
MANIFESTACIONES Hepatomegalia Falla renal Hipoglicemia severa Disfuncin trombocitaria Como Ia anterior con neutropenia e infeccin bacteriana
Ib
II
Pompe
Glucosa-6-P Translocasa Microsomal -1,4 Glucosidasa Microsomal y Glucosidasa, tambin Maltasa cida Enzima Desramificante. Hgado y Msculo Enzima Desramificante anormal en el Hgado Enzima del Msculo normal Enzima Ramificante Fosforilasa Muscular
Hgado
IIIa
Cori o de Forbes
IIIb
Forma infantil sobrevive hasta 2 aos. La Juvenil produce Miopata y en el adulto distrofia muscular. Se encuentra Glicgeno en los lisosomas Hepatomegalia en nios y Hgado Msculo Miopata Esqueltico y Estructura del Glicgeno alterada cardaco En el hgado similar a IIIa Hgado Estructura del Glicgeno alterada msculo esqueltico y cardaco Msculo Esqueltico y Cardaco Hgado y Msculo Msculo esqueltico Hgado Hepatoesplenomegalia, cirrosis. Estructura del Glicgeno alterada Fatiga y Calambres con ejercicio, Mioglobinuria Hepatomegalia, Leve Hipoglicemia, Hiperlipidemia y Cetosis, mejora con la edad Como V con anemia, hemoltica
IV V
Andersen Mc Ardle, SchmidtPearson Hers
VI
Fosforilasa en Hgado
VII
Tarui
PFK-1 Msculo Fosforilasa Kinasa
Msculo, Eritrocito Hgado, leucocitos, msculo Hgado
VIb, VIII o IX XI
Como VI
FanconiBickel
Transportador de Glucosa-2( TGLU-2)
Falla en el crecimiento, hepatomegalia, raquitismo, disfuncin del tbulo contorneado proximal
363
13) ETAPAS DE LA GLICOLISIS. Se ha sugerido en la literatura que el rol de la Gliclisis en el hgado sera la transformacin de Glucosa en cidos grasos mientras que en el msculo sera la obtencin de energa qumica en forma de ATP. A continuacin se indican las etapas principales de la Gliclisis a partir de la Glucosa proveniente del Glicgeno o de la circulacin perifrica: a) ACTIVACION DE LA GLUCOSA 1) Fosforilacin 2) Isomerizacin 3) Formacin de las Triosas-Fosfato. b) RUPTURA DE LA GLUCOSA Y OXIDACION 1) Oxidacin 2) Primera extraccin de energa 3) Reordenamiento 4) Segunda extraccin de energa 5) Reduccin
VIA GLUCOGENICA
P
CH2OH O H OH H H OH H OH
H HO
VIA GLICOLITICA
GLUCOSA
AT P ADP
Fructosa 6-Pasa
H HO
CH2O H OH H O H
P
H OH OH
Hexoquinasa
GLUCOSA-6-P
CH2OH
O 2HC H H
O H
Fructosa - 6 - P Isomerasa
OH OH H
FRUCTOSA-6-P
AT ADP
Fructosa - 1,6 Bi-Pasa

P
O 2HC H H
OH H
O H
CH2 O
OH
Fosfofructo Quinasa (PFK1)
FRUCTOSA-1,6 -Di-P
Fig. 14 - 8.Activacin de la Glucosa con gasto de dos ATPs en la va Glicoltica. De esta manera la molcula excitada ser ms fcil dividirla en dos. En la va Glucognica se liberan dos Fosfatos hasta Glucosa.
a) En la primera etapa de la Gliclisis se logra superar una barrera de energa por medio de la activacin con una molcula de ATP, seguido de una isomerizacin de la molcula de
364
Glucosa a Fructosa y a continuacin una segunda activacin con ATP (Fig. 14 - 8), para producir la Fructosa-1,6-bifosfato. Este tratamiento produce la destabilizacin posterior del anillo de la Fructosa-1,6-bifosfato, favoreciendo su forma abierta y la subsecuente ruptura de este para formar dos triosas fosforiladas (Fig. 15 - 8), como la Fosfo-Dihidroxicetona y el 3-Fosfo-Gliceraldehido.
V IA G L U C O G E N IC A
6
O2H C 5 H H 4 OH
O OH
1 C H 2O 2 OH
V IA G L IC O L IT IC A
P
3 H
F ru c to s a 1 ,6 -B i-P
A ld o la s a
3 CH OH 2 2 C O 1 CH O 2
+
P
4 HC 5 6 CH
O OH
CH O 2
P - D i - O H - C e to n a
3 -P -G lic e ra ld e h id o
Fig. 15 - 8.Ruptura de la molcula de Fructosa activada por la Aldolasa. La reaccin es reversible.
Debido a los dos ATPs iniciales que han cargado la molcula de energa al fosforilarla, la molcula se ha tornado ms inestable y reactiva dividindose en dos nuevas molculas de tres carbones cada una. En la primera etapa encontramos que la Glucosa presente en el sistema circulatorio es capaz de entrar a los tejidos (msculo, tejido adiposo) por medio de la Insulina y que la Glucosa endgena almacenada como Glucgeno puede ser liberada por las hormonas Glucagn (hgado) y Epinefrina (msculo). Las molculas provenientes de ambas fuentes pueden converger en la formacin de Glucosa-6-P. La Glucosa-1-P proviene de la accin de la Fosforilasa sobre el Glicgeno y posteriormente pasa a Glucosa-6-P por accin de una Mutasa ( Fosfoglucomutasa). La Glucosa libre no fosforilada que proviene del sistema circulatorio es el substrato de las enzimas que catalizan su fosforilacin, llamadas Hexoquinasa Muscular (Km= 0,10 mM) y Glucoquinasa del Hgado (Km= 10,0 mM). Siendo la Hexoquinasa aquella con mayor afinidad o menor Km. La Glucoquinasa solo fosforila Glucosa en exceso dirigida a la Glicognesis. Glucoquinasa Sangre Hexoquinasa Citoplasma Glucosa + ATP ----------> GLUCOSA-6-P + ADP Glicgeno Fosfoglucomutasa Glucosa-1-P ---------------> GLUCOSA-6-P Pi + GLUCOSA <--------------- GLUCOSA-6-P Glucosa-6-Pasa
365
La reaccin catalizada por las isoenzimas es irreversible debido a lo excergnico de su mecanismo. Por lo tanto en el caso de que se libere glucosa al sistema circulatorio se debe hacer uso de otra enzima denominada Glucosa-6-Fosfatasa. Esta se encuentra presente en el retculo endoplsmico del hgado y rin catalizando la reaccin inversa, ya que la Glucosa-6-P an guarda suficiente energa para hacer viable (exergnica) esta reaccin. Esta enzima no se encuentra en msculo por lo que la Glucosa que entra al msculo no vuelve a salir y puede solamente convertirse en Glicgeno, c. Lctico o CO2 y H2O. En el paso siguiente disminuye el tamao del anillo de la Glucosa-6-P desde seis miembros a cinco como ocurre en la Fructosa-6-P y esta reaccin es catalizada por la Glucosa-6-P Isomerasa: Glucosa-6-P- Isomerasa GLUCOSA-6-P ---------> FRUCTOSA-6-P PFQ1 (Fosfofructo Quinasa) FRUCTOSA-6-P + ATP --------> FRUCTOSA-1,6-BI-P Fructosa-1,6-Bi-Fosfatasa FRUCTOSA + Pi <-------- FRUCTOSA-1,6-BI-P En esta primera etapa las dos reacciones que requieren de aplicacin de energa hacen uso del ATP para convertirse en exergnicas, es decir de Glucosa a Glucosa-6-P en que se liberan 4.0 Kcal/mol para mantener 3.3 kcal/mol en la estructura fosforilada y la Fructosa-6-P que pasa a Fructosa-1,6-di-P, en que se liberan 3.4 Kcal/mol y se eleva la energa de la estructura en 4.0 Kcal/mol ms, dando un total de 7.3 Kcal/mol ( Tabla 5 - 8 )
Volver al inicio
14 ) REGULACIN ALOSTRICA DE LA GLICOLISIS
366
Entre las enzimas reguladoras de la Gliclisis encontramos a la Glucoquinasa y a la Hexoquinasa. Ambas son activadas por Glucosa-6-Fosfato e inhibidas por ATP. A diferencia de la enzima que cataliza la va inversa, la Glucosa-6-Fosfatasa que se activa con ATP y se inhibe con AMP y ADP (Fig. 16 - 8)
Glucoquinasa ( HIGADO ) ( MUSCULO ) Hexoquinasa
GLUCOSA+ATP
GLUCOSA-6-P+ADP
Glucosa-6-Pasa Fosfofructoquinasa FRUCTOSA-6-P + ATP FRUCTOSA-1,6-DI-P + ADP
Fructosa - 1,6 - Bi -fosfatasa FOSFOENOL PIRUVATO
Piruvato Quinasa
+ ADP
Fosfoenol piruvato Carboxiquinasa ( CITOPLASAMA)

Glucosa Glucoquinasa
Fructosa-1-P Prot. Reg. Glucosa-6-P Fructosa-6-P Prot. Reg.
Malato Deshidrogenasa
Fosfofructo Quinasa Fuctosa-2,6-DI-P AMP ATP ,Citrato
PIRUVATO + ATP Piruvato carboxilasa ( MITOCONDRIA )

Fructosa - 1,6 Bifosfatasa ATP Piruvato Quinasa
Moduladores Alostricos
Hexo quinasa Estimula Inhibe
Piruvato Carboxilasa
- 6 Fosfatasa
ATP
Acetil-S-CoA ATP Acetil-S-CoA Acs. Grasos de cadena larga
AMP Fuctosa-2,6-DI-P
Fig. 16 - 8. Enzimas regulatorias de la Gliclisis y Gluconeognesis.
Por otro lado, la Fosfofructoquinasa (PFQ1), es la enzima marcapaso de la Gliclisis, es inhibida alostricamente por ATP y Citrato (proveniente del Ciclo Tricarboxlico) y a su vez se estimula por AMP y ADP. En otras palabras el exceso de metabolitos energticos la inhibe y el aumento de subproductos de la degradacin del ATP la estimula. De esta manera se mantiene un nivel constante de intermediarios en la va metablica. La enzima que cataliza el paso opuesto durante la Gluconeognesis es la Fructosa-1,6Bifosfatasa (FBP1), esta enzima es activada por ATP y Citrato e inhibida por AMP (Fig 17 8). En el hgado existe an otra enzima reguladora de esta etapa y se denomina Fosfofructoquinasa-2-Fructosabifosfatasa-2 (PFK2-FBP2) de carcter bifuncional. En una sola protena residen ambas actividades catalticas como la sntesis e hidrlisis de la Fructosa-2,6-Bifosfato. Esta molcula es en s un modulador alostrico de la PFK1. El aumento de la concentracin de Fructosa-2,6-bifosfato estimula a la PFK1 y a la Gliclisis inhibiendo la Gluconeognesis, mientras que una baja inhibe la Gliclisis y favorece la Gluconeognesis (Fig 16 - 8). De esta manera la hipoglicemia estimula la liberacin del Glucagn por el pncreas e inhibe la Gluclisis en el hgado para favorecer a la va Gluconeognica. Por este mecanismo se dispone de Glucosa libre para lanzar a la circulacin sangunea y restaurar la glicemia. La cadena de eventos que describe este sistema de control se detalla a continuacin en la Figura 17 - 8 y en la Tabla 5 - 8:
367
Hipoglicemia
Pancreas Glucagn Adenil Ciclasa
Glicgeno Sintasa Inact. Glicgeno Sintasa D Act.
Proteina Quinasa Activa
Fosforilasa Inac.
Fosforilasa Act. Glicgeno Glucosa-6-Pasa en Hgado, Rin e Intestino. GLUCOSA Glucosa-1-P Glucosa-6-P
Fig 17 - 8. Cadena de eventos para restaurar la Glicemia desde el Hgado.
Tabla 5 - 8 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Hipoglicemia--->Pncreas--->Glucagn--->Glucagn-Receptor---> Prot. G--->Adenil Ciclasa --->AMPc--->Prot. Quinasa Activa Prot. Quinasa Activa ATP + PFK2 activa -------------------------> ADP + PFK2 inactiva Fosforilada FBP2 inactiva FBP2 activa PFK2 inactiva o Fosforilada FBP2 activa P + Fructosa-6-P <-------------- Fructosa-2,6-BI-P Disminucin -------------------------> Disminucin del modulador de la actividad alostrico Fructosa-2,6-BI-P en la PFK1 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------En el caso contrario en que ocurra una Hiperglicemia, se desencadena el mecanismo que retira glucosa del plasma y que se encuentra descrito en la Figura 18 - 8.
368
Solo las reacciones exergnicas son susceptibles de ser controladas, no sucede as con las
H iperglicem ia
Insulina G lucagn
Aum ento de Transporte entrada de G lucosa extraheptica.
Dism inuyen En todos los Tejidos G lucosa Sangre G lucosa-6-P G lucosa-1-P UTP + ADP Aum entan
Fosforilasa a Act. G licgeno Sintasa D Inact.
Fosforilasa b Inact. G licgeno Sintasa I Act.
UTP +
UDP-G lucosa + PP i
G LICO G ENO + UDP
UDP + ATP
Fig. 18 - 8. Cadena de eventos para restaurar los niveles de Glucosa en la sangre.
reacciones endergnicas o cercanas al equilibrio. Estas ltimas solo se regulan por aporte de substrato y remocin de producto. Volver al inicio
15)
HOMEOSTASIS DE LA GLUCOSA EN LA SANGRE
Dependiendo de la concentracin de Glucosa en la sangre se liberan dos tipos de hormonas para mantener la concentracin de Glucosa constante. Los sensores que detectan el aumento o la baja concentracin de Glucosa se encuentran en el Pncreas. Estos receptores propician la liberacin de Insulina o Glucagn, es decir cuando aumenta la Glucosa en la sangre, menos Glucagn y ms Insulina se libera del Pncreas. Por otro lado cuando la Glucosa disminuye, menos Insulina y ms Glucagn es liberado por el Pncreas. Ambas hormonas actan a nivel del Hgado. El Hgado es la bodega de Glicgeno, por lo tanto la Insulina promueve la formacin de Glicgeno a partir de la Glucosa que entra por la sangre. Por otro lado Glucagn estimula la formacin de Glucosa a partir de Glicgeno (Fig. 19 8). La Diabetes es un trastorno relacionado con el manejo de la Glucosa. La Diabetes Mellitus se produce por la incapacidad de producir ADH y se promueve la retencin de agua. Por otro lado la Diabetes Mellitus, se caracteriza por no producir suficiente Insulina por lo que la Glucosa no entra a los tejidos y no se convierte en Glicgeno, por lo que se acumula en la sangre causando una serie de alteraciones, ya que la Glucosa en mayor concentracin y tiempo en los tejidos se abre y su grupo aldehdo se une espontneamente a los grupos amino de las protenas alterndolas (cataratas en el cristalino, unin a la Hemoglobina, envejecimiento prematuro de rin, etc)
369
Superponindose al mecanismo anterior, se encuentra la Adrenalina secretada por las Suprarrenales, que en un caso de emergencia ( accidente, temblor, ejercicio repentino) prepara al organismo para luchar o arrancar. Esto se logra degradando Glicgeno y sacando Glucosa a la circulacin, a la vez se aumenta el ritmo cardaco y la velocidad de la respiracin. Una vez que la emergencia ha pasado, los niveles de Adrenalina disminuyen y se impone el mecanismo anterior regulado por el Pncreas con sus receptores y la secrecin de Insulina y Glucagn que regulan al Hgado.
+ INSULINA Receptor Pancreas HIGADO
AUMENTO DE GLUCOSA
TOMA GLUCOSA DE LA SANGRE Glucosa a Glicgeno
Nivel Normal de Glucosa en la Sangre
Nivel Normal de Glucosa en la Sangre
DISMINUCIN DE GLUCOSA +GLUCAGN Receptor Pancreas

Fig 19 8. Homeostasis de la Glucosa
ENTREGA GLUCOSA A LA SANGRE Glicgeno a Glucosa HIGADO
Volver al inicio
16) TRANSPORTE DE LA GLUCOSA
370
Glucosa y Fructosa deben atravesar membranas por medio de una familia de 5 protenas transportadoras denominadas GLUT, ya que poseen cierta homologa entre s.
Tabla 6 - 8
NOMBRE DEL TRANSPORTADOR GLUT 1 GLUT 2
TEJIDO
MAYORA DE LAS CLULAS HGADO, CLULAS BETA, HIPOTLAMO, MEMBRANA BASOLATERAL, INTESTINO DELGADO NEURONA, PLACENTA, TESTCULOS MUSCULO ESQUELTICO Y CARDACO, TEJIDO ADIPOSO MUCOSA, INTESTINO DELGADO, ESPERMA
PROPIEDADES
ALTA CAPACIDAD Y BAJA AFINIDAD. Km 2 -3 mM ALTA CAPACIDAD, PERO BAJA AFINIDAD. Km MAYOR DE 5 mM Km MENOR DE 1 mM ACTIVADO POR INSULINA ESPECFICO DE FRUCTOSA
GLUT 3 GLUT 4 GLUT 5
En la Tabla 6 - 8, aparecen las protenas que se encuentra a cargo del transporte facilitado desde lugares de alta concentracin a los de baja concentracin. La Glucosa se une a la protena y esta hace un movimiento de flip-flop en la membrana liberando el azcar al interior para recuperarse y repetir nuevamente el proceso. La cantidad transportada depende del gradiente de concentracin y el nmero de transportadores Glut. El transporte tambin puede ser al exterior desde el tejido. En tejido Gluconeognico como hgado y rin la concentracin de Glucosa intracelular excede la conc. de Glucosa de la sangre durante el ayuno. La exportacin de Glucosa ocurre por medio de Glut2. Glut 4 es el transportador relacionado con la Insulina, se encuentra inactivo cuando est unido a la membrana del Golgi (Fig. 20 8). Llega a la membrana celular por un proceso que requiere de ATP y una vez empleado en la entrada de Glucosa, vuelve nuevamente al Golgi donde permanece inactivo. La insulina influencia el balance estimulando la Exocitosis y presentacin de Glut4 para la entrada de Glucosa, posteriormente por Endocitosis desaparece el receptor de la superficie celular. La actividad muscular aumenta el nmero de Glut4 en la membrana plasmtica por el mismo mecanismo. La actividad muscular sola puede controlar los niveles de Glucosa sin demasiada necesidad de Insulina.
371
R e c e p to re s a c tiv o s
E n d o c ito sis
E xo c ito s is
R e c e p to re s in a c tiv o s
GOLGY
Fig. 20 - 8. Reciclaje de receptores la Glucosa mediados por Insulina
Volver al inicio
17) OTROS HIDRATOS DE CARBONO QUE ENTRAN A LA GLICLISIS Algunos Hidratos de Carbono (fig. 21 8), bastante comunes en los alimentos
MALTOSA - D G lu c o p ir a n o s il (1 -4 ) -D G lu c o p ir a n o s a CH2O H O OH OH - D G lu c o s a HO CH2O H O OH HO OH - D G lu c o s a LACTOSA -D G a la c to p ira n o s il (1 -4 ) -D G lu c o p ir a n o s a CH2O H HO OH OH -D - G a la c to s a O O OH O OH CH2O H O OH -D -G lu c o s a CH2O H O OH OH CH2O H O OH
SACAROSA - D G lu c o p ira n o s il (1 -2 ) -D F ru c to fu ra n s id o
-D -F ru c to s a CH2O H O OH
OH -D - G lu c o s a
Fig. 21 - 8. Maltosa, Sacarosa y Lactosa
372
estn representados por Maltosa (dos Glucosas unidas por enlaces (1 - 4), Sacarosa (Una Glucosa y una Fructosa unidas por enlace ( 1 2)) y Lactosa (Una Galactosa y una Glucosa unidas por enlace (1 4).
-D-Galactosa Glucosa-1-P UTP PP OH

Galactoquinasaa UDP-Glucosa Pirofosforilasa
-D-Galactosa-1-P
UDP-Glucosa
Epimerasa UDP-Galactosa OH
-D-Galactosa-1-P
Uridil Transferasa
Glucosa 1-P
Fosfoglucomutasa
Glucosa-6-P
Fig. 22 8. Inversin del grupo OH en el carbono 4 de la Galactosa.
Todos ellos son hidrolizados por las Maltasas, Sacarasas y Lactasas intestinales, dando lugar a las Hexosas, entre las cuales tenemos a la Glucosa, Galactosa y la Fructosa. La Fructosa es metabolizada al formar Fructosa-6-P, mientras que en el hgado pasa a Fructosa-1-P por la Fructoquinasa. Posteriormente se descompone por la Aldolasa B en Fosfodihidroxicetona y D-Gliceraldehido que finalmente se fosforila a Gliceraldehido-3-P. La Fructosa entra sin regulacin por la PFK, as que se convierte fcilmente en grasa. La Galactosa para convertirse en Glucosa debe activar su carbono 4 y dar vuelta el grupo OH (fig. 22 8), por lo tanto se activa con Galactoquinasa y ATP para formar Galactosa-1-P, posteriormente reacciona con UDP-Glucosa, para alcanzar un mayor grado de energa como UDP-Galactosa. A continuacin una epimerasa invierte el grupo 4-OH pasando a formar UDPGlucosa. La UDPGlucosa reacciona cclicamente con una nueva molcula de Galactosa-1-P activndola y quedando ahora como Glucosa-1-P que puede continuar con la Gliclisis. Una vez que han entrado los distintos monosacridos a la va glucoltica y se encuentran activados como la Fructosa-1,6 di-P, se produce la ruptura del anillo de Fructosa que porta los dos centros con cargas negativas representados por el fosfato. La enzima Aldolasa por medio de una Lisina que se une al C5 de la Fructosa-1,6-bifosfato logra abrir el anillo, seguido de una polarizacin de los carbonos 3 y 4 y la subsecuente ruptura del enlace por escisin Aldlica y formacin de las dos triosas fosfato. El equilibrio favorece a la formacin de la Fosfodihidroxicetona, pero el 3-P-Gliceraldehido se forma en menor proporcin y es
373
arrastrado rpidamente a la formacin del 1,3- Difosfoglicerato, catalizado por la enzima Isomerasa. Aldolasa FRUCTOSA-1,6-BI-P -------> 3-P-GLICERALDEHIDO + P-DIHIDROXICETONA Isomerasa P-DIHIDROXICETONA ------------> 3-P-GLICERALDEHIDO En la Glndula mamaria lactante se produce la sntesis de la Lactosa (Fig. 23 8). Este es el azcar de la leche y consta de una molcula de Glucosa y otra de Galactosa. Para ellos se debe tomar una molcula de Glucosa y la posicin del grupo OH del carbono 4, por sobre el plano del anillo, es decir se debe efectuar una epimerizacin para as convertir la Glucosa en Galactosa. Posteriormente, se une a la Glucosa para formar una molcula de Lactosa.
GLUCOSA 1
GLUCOSA-6-P 2
GLUCOSA-1- P UTP 3 PPi UDP-GLUCOSA
5 LACTOSA UDP-GALACTOSA
Fig. 23 8. 1. Hexoquinasa. 2. Fosfoglucomutasa. 3.UDP-Glucosa Pirofoaforilasa. 4. UDP-Galactosa4-Epimerasa 5. Sntesis de Lactosa
El metabolismo de la Galactosa es algo conflictivo ya que se pueden producir algunas enfermedades caracterizadas por la falla de algunas de las enzimas de este metabolismo. As tenemos las Galactosemias tipo I y II, caracterizadas por la prdida total o parcial de la enzima Galactosa-1-P-Uridil Transferasa o la Perdida de la Galactoquinasa respectivamente. Los recin nacidos con este problema no crecen adecuadamente y despus de ser amamantados se producen vmitos, diarrea y se comportan de forma indiferente. Se les denomina intolerantes a la Lactosa ( Glucosa-Galactosa). Se produce dao en el hgado que conduce a cirrosis, elevadas conc. en la sangre de azcares reductores como galactosa (hipergalactosemia), pero no de glucosa. Estos sntomas se encuentran acompaados de Acidosis metablica con hipercloremia, Galctitol urinario e hiperaminoaciduria. La Galactosa circulante es reducida por la enzima Galactosa reductasa que emplea NADPH y se encuentra presente en los tejidos neurales y en las lentes del ojo. El Galactitol produce hinchazn del cristalino por osmosis, ya que atrae el agua con una formacin concomitante de cataratas. La /UDP- Galactosa epimerasa tambin puede fallar afectando en un caso solo a los eritrocitos y linfocitos, mientras que en el otro caso afecta a todos los tejidos con sntomas similares a la Transferasa.
374
Volver al inicio 18 ) SEGUNDA ETAPA DE LA GLICLISIS
b) En la segunda etapa de la Gliclisis en la Figura 24 - 8, se procede a la oxidacin y extraccin de energa en base a los productos de ruptura de la Glucosa. Se empieza por las molculas de 3-P-Gliceraldehido, ya que la molcula de Glucosa se rompi en dos. Una de estas triosas, la P-di-Hidroxicetona se isomeriz luego, por medio de la TriosaFosfato-Isomerasa en 3-P-Gliceraldehido. Se dispone de esta manera de dos molculas de 3-P-Gliceraldehido que sern rpidamente oxidadas por NAD+, mediante la enzima 3Fosfogliceraldehdo Deshidrogenasa. De esta manera se oxida con NAD para formar c. 3-P-Glicrico, el que reacciona con Fsforo inorgnico dando origen a un anhdrido altamente exergnico, que posee dos fosfatos con carga negativa. Ambos se encuentran a corta distancia uno del otro y uno de ellos posee una alta densidad electrnica, con menos formas resonantes que las encontradas en el producto de su hidrlisis. Esta molcula es el c. 1,3-di-Fosfo-Glicrico, capaz de liberar 11,8 Kcal/mol por hidrlisis y constituye la fuente de energa qumica para sintetizar ATP.
3-Fosfo-Gliceraldehdo Deshidrogenasa
3-P-GLICERALDEHIDO + NAD+ -----------> 3-P-GLICERICO + NADH+H
3-P-GLICERICO + Pi --------> AC.1.3-DI-P-GLICERICO
El NADH + H+ que se obtiene como producto de la oxidacin, podr entregar al cido Pirvico sus protones, para formar cido Lctico regenerndose la coenzima, como NAD+ , en la ltima reaccin de la Gliclisis. En el caso de que fuera una oxidacin aerbica el NADH + H+ , se recuperara con molculas aceptoras de protones, tal como el Oxaloacetato o la P-Dihidroxicetona, que al reducirse forman consecutivamente Malato y Glicerol-P. Ambas molculas llevan los protones a la mitocondria donde se oxidan nuevamente. Estos transportadores o lanzaderas de protones deben su existencia a que el NADH+H+ es impermeable a las membranas mitocondriales y no podra entrar a oxidarse y salir nuevamente. Las molculas transportadoras o lanzaderas Malato y Glicerol-P, entregarn los protones a la Cadena de Transporte de Electrones en el interior de la mitocondria, para volver a salir nuevamente en bsqueda de otras unidades reductoras. Estas vas de transporte de protones son conocidas como Lanzadera Glicerol-P-Fosfodihidroxicetona (fig. 23 8) y Lanzadera Malato-Aspartato (fig. 24 8). Ambas son empleadas en la oxidacin aerbica de la Glucosa.
375
P Dihidroxi- CH2 - OH HC O cetona C O + CH - OH

CH2 - O-P CH2 - O-P
Gliceraldehido - 3- P
P-DHC Isomerasa
HC O
X2
CH - OH CH2 - O-P NAD
Gliceraldehido - 3- P
Pi 3- P Gliceraldehido Deshidrogenasa
O C - O- P CH - OH
NADH + H
1,3 - B i P ADP Glicerato Quinasa ATP
CH2 - O - P
1,3 - B I - P- Glicrico Molcula de alta nerga
O C OH CH2 CH2 - O - P
3 - P - Glicerico
Mutasa
O C OH CH2 - O - P
H2O
ADP
O C OH
ATP
NADH + H O C OH
-
NAD O C OH C
HO Enolasa C O - P C O Lctico Piruvato CH2 - OH CH3 Quinasa CH3 DeshidroCH2 2 - P - Glicerico P - Enol Piruvico c. Piruvico genasa c. Lctico
Molcula de alta energa
Fig. 24 - 8.En la segunda parte de la Gliclisis se puede apreciar como se recicla la coenzima NAD reducida a oxidada.
376
Glicgeno
Lanzadera Glicerol P dirigida a la Mitocondria

Glicerol - P CH2O - P CH - OH CH2 - OH Glicerol - P Glicerol - P
CH2O - P CH - OH CH2 - OH
CH2O - P CH - OH CH2 - OH FAD
CH2- O - P 3 - Fosfo Gliceral dehido CH - OH CHO NAD
Pi
CH2 - O - P CH - OH O C- O- P- O O O
2H
C.T.E.
2 H+
1,3 Di - Fosfo Glic[erico
N AD H + +H
Espacio Intermembrana.
CH2O - P C O CH2 - OH
P - Dihidroxicetona
FADH2
P - Dihidroxicetona
P - Dihidroxicetona
Piruvato
CITOPLASMA
Membrana Externa
Matriz
Membrana Mitocondrial Interna
Fig. 25 - 8. Los protones van directamente del 3-Fosfo-Gliceraldehido a la Cadena de Transporte de Electrones en la Mitocondria (CTE).
En resumen, la forma Anaerbica de recuperar el NADH+H+ en el citoplasma es:
NADH + H + PIRUVATO----->LACTATO + NAD La forma Aerbica, de recuperar el NADH+H+ en el citoplasma con ayuda de Lanzaderas y la Mitocondria es mediante: Volver al inicio 19 a) LANZADERA GLICEROL - FOSFATO 19 b) LANZADERA MALATO
377
La lanzadera Glicerol-P se encuentra principalmente en el msculo esqueltico y cerebro (Fig.25 - 8), mientras que la lanzadera Malato-Asprtico se le halla en el hgado, rin y corazn (Fig. 26 - 8). El cido Oxaloactico no puede salir de la mitocondria por lo tanto debe transaminar para formar c. Asprtico que luego de otra transaminacin en el citoplasma vuelve nuevamente a Ac. Oxaloactico.
Lanzadera Malato Oxaloacetato dirigida a la Mitocondria

Glicgeno
3 - p Gliceraldehido
CH2- O - P CH - OH CHO
Malato COO H C CH2 COO NAD OH H
Malato COO C CH2 COO + + H H + H NADH + H+ NAD OH H COO C CH2 COO
Malato OH
CH2 - O - P CH - OH O CO - P- O O O
NADH + H
COO Oxaloacetato C O CH2 COO
Glu
COO C O CH2
+ H+ H
CT E
Glu
-Cetoglutarato
COO COO Oxalo Acetato H - C - NH3 CH2 COO Aspartato
COO H - C - NH3 CH2 COO Aspartato
COO H - C - NH3 CH2 COO Aspartato
-Cetoglutarato
Piruvato
Fig 26 - 8. Los protones viajan en el Malato a la Cadena de Transporte de Electrones (CTE) mientras que el Oxaloacetato vuelve al exterior como Aspartato, despus de transaminar con Ac. Glutmico.
Al continuar con la Gliclisis encontramos la primera reaccin de fosforilacin a nivel de sustrato donde se generan dos ATPs mediante una reaccin exergnica con un in comn como el Fosfato. Quinasa 1,3-DI-P-GLICERICO + ADP ----------------> ATP + 3-P-GLICERICO Desde el c. 3-P-Glicrico, se produce un reordenamiento y deshidratacin por los que la molcula de sustrato vuelve a ganar energa transformndose ahora en Fosfoenol Piruvato,
378
molcula altamente exergnica de alta densidad electrnica con cargas negativas prximas entre s. Mutasa 3-P-GLICERICO --------------> 2-P-GLICERICO Isomerasa 3-P-GLICERICO ---------------------------> P-ENOLPIRUVATO + H2O Quinasa P-ENOLPIRUVATO + ADP -------------------------> ATP + PIRUVATO Las dos molculas de P-Enol Piruvato son capaces de generar un ATP cada una que junto a las dos anteriores daran un total de cuatro. Sin embargo, para desestabilizar la molcula de glucosa usamos dos ATPs, de manera que ahora restan solo dos ATPs para las funciones de la clula. A esta reducida eficiencia se debe la tremenda amplificacin que ocurre durante la regulacin en cascada, la cual tiene por objeto de aumentar el nmero de molculas de ATP. Finalmente, la reaccin en que se recupera la coenzima reducida ( NADH + H) produce Ac. Lctico y es catalizada por la Lactato Deshidrogenasa, que es una Isoenzima ampliamente distribuida en los tejidos con formas M4 (muscle) y L4 (liver) junto a otras combinaciones de M y L. Lactato Deshidrogenasa PIRUVATO + NADH + H ------------> LACTATO + NAD En la Figura 27 - 8, se puede apreciar la va Glicoltica en su totalidad mientras que su balance es el siguiente: GLUCOSA + 2 ADP + 2 Pi + 2 NAD------------>2 PIRUVATO + 2 ATP + 2 NADH + 2H 2 PIRUVATO +2 NADH +2 H----------->2 LACTATO + 2 NAD Si la concentracin de Glucosa es 100mM, la concentracin de ADP 20mM y la de Pi es de 2mM. Cundo se detendr la reaccin y cul es el reactivo limitante? Esto no ocurrir cuando se agoten los 2 mM de Pi ya que se regenera constantemente con la formacin de lactato. La reaccin solo se detendr cuando se agoten los 20mM de ATP, los cuales consumirn 10mM de Glucosa dejando 90mM de ella y formando finalmente 20mM de ATP. En la Tabla 6 - 8, se pueden apreciar las reacciones individuales de la Gliclisis donde la energa de cada reaccin ha sido calculada en base a la Keq como /\Go' y tambin como /\G total, que depende de las concentraciones reales en equilibrio de estado estable para cada substrato y producto en las distintas reacciones de esta va. En base a los datos se puede concluir que muchas de las reacciones son desfavorables en el sentido de la formacin de Piruvato y que se caracterizan por tener una Keq < 1 y un /\Go' positivo o endergnico, sin embargo se hacen exergnicas debido a la acumulacin de substrato por la reaccin anterior
379
o bien por la rpida remocin de su producto debido a la reaccin posterior en la misma va. De esta manera las reacciones exergnicas "empujan" o "tiran" respectivamente de las reacciones endergnicas al encontrarse entremezcladas en una misma va. Este efecto no solo puede ocurrir entre dos reacciones vecinas a lo largo de la va sino que en reacciones endergnicas y exergnicas que se encuentran bastante separadas entre si. En la Figura 28 - 8 aparecen los perfiles de energa obtenidos en base a las /\Go' y las /\G de la Tabla 7 - 8. Es interesante notar que al graficar los valores de /\Go' (Fig. 28 - 8) obtenidos en base a las Keq de cada reaccin, se observa claramente las etapas sealadas anteriormente, empezando con el gasto de ATP para llevar a cabo las reacciones iniciales de tipo endergnico y remontar la barrera de energa que impone el destabilizar y romper la glucosa. En el grfico se observa que la oxidacin y la extraccin de energa es claramente exergnica a excepcin de los reordenamientos moleculares. Ambos perfiles, solo coinciden en que terminan a un nivel menor de energa que de donde empezaron.
380
CH2 OH O H H OH H H
A T
P P
ADP
H
CH2 O O H OH H
P
H
O 2HC
O H
OH
CH2 OH
P P
O 2HC H H
O
OH
CH2 O
A T
OH
ADP
HO
OH HO
H
OH
OH OH
OH
H e x o q u in a s a
OH
G lu c o s a
G lu c o s a - 6 - P Is o m e r a s a
OH
G lu c o s a - 6 - P
F ru c to s a - 6 - P
F os fo fru c toQ u in a s a A ld o la s a
F ru c to s a 1 ,6 - B i - P
CH2 - OH
HC
P - D i h i d r o x i c e to n a
C eton a
+
P
HC O
3 - P G lic e r a ld e h id o
CH - OH CH2 O
CH2 - O
P - D H C - Is o m e r a s a
X2
+ P i
CH - OH CH2 O -
N AD
P
3 - P - G lic e ra ld e h id o
N AD H
+ H
O C - O CH - OH
D e s h id ro g e n a s a
1 ,3 - B i - P G lic r ic o P
N AD
O C HO C - O
N AD H
H
O
AT
ADP
H 2O
O C O O
A T
O
ADP
CH2
C - O C O
O
-O -
O
O H O
1 ,3 - B i - P G l i c e r a to Q u in a s a
CH3
L c ti c o
P ir u v a t o Q u in a s a
C
CH2
P
E n o la s a
P
M u ta s a
C H CH2
CH3
D e s h id ro g e n a s a
CH2 - OH
L ac ta to
P ir u v a t o
P - E n o l - P ir u v a t o
2 - P - G lic e r a t o
3 - P - G lic e r a t o
Fig. 28 - 8. La Gliclisis mostrando las fases de produccin de ATP y formacin de c. Lctico.
381
TABLA 7 - 8 Go' G
Reacciones Glucoquinasa Hexoquinasa A) GLUCOSA + ATP----> GLUCOSA-6-P + ADP + H Glucosa-6-P Isomerasa B) GLUCOSA-6-P----> FRUCTOSA-6-P FosfofructoQuinasa C) FRUCTOSA-6-P + ATP-->FRUCTOSA-1.6-DIFOSFATO + ADP + H Aldolasa D) FRUCTOSA-1,6-DIFOSFATO----> 3P-GLICERALDEHIDO + P- DIHIDROXICETONA P-Dihidroxicetona Isomerasa E) P-DIHIDROXICETONA---->3-P-GLICERALDEHIDO 3-P- Gliceraldehdo Deshidrogenasa F) 3-P-GLICERALDEHIDO + P + NAD --> 1,3-BIFOSFOGLICERATO + NADH + H 1,3 Difosfoglicerato Quinasa G) 1,3-BIFOSFOGLICERATO + ADP--> 3-FOSFOLICERATO + ATP 3-Fosfoglicerato-Mutasa H) 3-FOSFOGLICERATO---->2-FOSFOGLICERATO 2-Fosfoglicerato-Enolasa I) 2-FOSFOGLICERATO---->FOSFOENOLPIRUVATO + H20 Fosfoenolpiruvato-Kinasa J) FOSFOENOLPIRUVATO + ADP + H----> PIRUVATO + ATP
-4.0 + 0.4
-8.0 - 0.6
-3.4
-5.3
+5.7 +1.8
- 0.3 + 0.6
+ 1.5 - 4.5 + 1.1 + 0.4 - 7.5
- 0.4 + 0.3 + 0.2 - 0.8 - 4.0
En el perfil en base a las Keq o G, la parte intermedia presenta drsticos cambios de energa que ocurren de la reaccin C hasta la G, sin embargo estos cambios se hacen menos evidentes en el perfil obtenido en base a las concentraciones reales en estado estable. Este cambio se debe al juego de concentraciones que ocurre en cada reaccin individual donde la acumulacin de sustrato o producto en algunas reacciones sirve para amortiguar lo exergnico de otras reacciones y a la vez para empujar reacciones demasiado endergnicas. Es decir, las concentraciones reales de los sustratos y productos se amortiguan unos a tros al proceder las reacciones en conjunto comparado con el perfil que muestra solo las reacciones individuales o tendencias individuales (Go Keq) de cada reaccin, sin estar acopladas unas con otras. En el perfil en base a las Keq o G, se liberan en total - 8,5 Kcal/mol mientras que en el perfil obtenido en base a las concentraciones reales de sustrato y producto en cada reaccin, se liberan - 18, 3 Kcal/mol. Esto indica que las concentraciones en estado estable favorecen la formacin del compuesto final, que es el Piruvato.
382
Perfil de Energa de la Gliclisis

15 ENERGIA .Kcal/mol10 5 0 -5 -10 -15 -20 -25 -30 -35 A B C D E F G H I J
Cambios de Energa G, en base a la Keq de cada reaccin
Cambios de Energa G, en base a las reacciones acopladas en Estado Estable
Las reacciones se encuentran en la Tabla 5.
Reacciones
Fig. 29 - 8. La curva superior muestra la distribucin de la energa en base a la Keq y la curva inferior muestra la energa al alcanzar el equilibrio estado estable.
Volver al inicio
20) VIA DE LAS PENTOSAS O VIA DEL FOSFOGLUCONATO. Esta va se descubri en el hgado, al no tener efecto la inhibicin de la Gliclisis con fluoruro y iodoacetato sobre el empleo de la glucosa por la clula (El Fluoruro inhibe a la enzima de la Gliclisis conocida como Enolasa y el Iodoacetato inhibe a la enzima Gliceraldehido-3Fosfo-Deshidrogenasa de la misma va). La Va de las Pentosas es casi inexistente en el msculo esqueltico. La va de las Pentosas oxida a la Glucosa de seis carbones y la transforma en un azcar de cinco, produciendo dos molculas de NADPH + H. Esta ltima es una Coenzima requerida durante la sntesis de los cidos Grasos y Esteroides. Se la emplea aqu, como agente reductor de los grupos cetos, durante la sntesis de lpidos en el hgado, tejido adiposo, glndula mamaria y corteza adrenal. Las reacciones metablicas prefieren en estos casos NADPH sobre NAD como agente reductor. Otra de las fuentes de NADPH es la Enzima Mlica, ubicada en el citoplasma. Esta cataliza el paso de Malato a Piruvato con perdida de CO2 y pertenece al sistema (lanzadera) que saca Acetil-SCoA desde la mitocondria (Ver captulo de Lpidos) al citoplasma.
383
La primera reaccin se caracteriza por la oxidacin de la Glucosa, mediante la enzima Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa que forma como producto 6-Fosfoglucono--Lactona y la primera molcula de NADPH (Fig. 30 - 8).
O CH O P O 2 O O H H OH OH H + OH Glucosa - 6 - Fosfo Deshidrogenasa + NADP NADPH + H + +
O CH O P O 2 O O H H OH OH H OH H H OH
H OH H - D - Glucosa - 6 - Fosfato O CH O P O 2 O O H H OH + OH H OH H H OH 6-P GluconoLactonasa H O 2 H H H COOH C OH H O
6 - Fosfoglucono - Lactona
HO C
C OH C OH
6 - Fosfoglucono - -Lactona
C H O P O 2 O Acido 6 - Fosfoglucnico
Fig. 30 - 8. Formacin del primer NADPH y el cido Glucnico.
La reaccin es inhibida por los cidos Grasos y el NADPH mismo. A continuacin la Lactona es hidrolizada por la 6-Fosfo-Glucono-Lactonasa, aunque la reaccin puede ocurrir tambin sin enzima, formando el cido 6-Fosfoglucnico. Desde aqu en adelante la enzima 6-Fosfoglucnico Deshidrogenasa cataliza la descarboxilacin del cido 6 Fosfoglucnico con NADP para formar la D-Ribulosa-5-Fosfato, CO2 y la segunda molcula de NADPH (Fig. 31 - 8). Esta primera fase se considera irreversible por ser muy exergnica. A continuacin la enzima Fosforiboisomerasa, cataliza el paso reversible desde D-Ribulosa-5-Fosfato a D-Ribosa-5Fosfato. En total se producen 2 NADPH ms un CO2 y la Ribosa-5-Fosfato (Fig.31 8) La Pentosa formada por oxidacin, puede ser dedicada a la sntesis de Nucletidos o bien integrarse nuevamente al metabolismo de los Hidratos de Carbono. Esto ltimo se logra mediante una serie de reacciones cclicas que ocurren en el citoplasma de los tejidos que necesitan NADPH, produciendo un total de 12 NADPH y 6 CO2 por molcula de Glucosa que entra a este sistema (Fig. 32 - 8).
384
COOH H HO H H C C C OH H OH + O O P O O
Acido 6 - Fosfogluconico Deshidrogenasa

Mn NADP NADPH + H + +
CH C
2 O
OH
C O2 +
H H
C C
OH OH O P O O
C OH C H 2
C H O 2
Acido 6 - Fosfoglucnico H CH C H H C C 2 O OH OH O O P O O OH
D - Ribulosa - 5 - Fosfato H I H - C OH Fosfocetopentosa C= O Epimerasa HO- C- H O P O XILULOSA O H- C -O-H C H2 - O H
Fosforiboisomerasa
H H H
C C C
O OH OH
C OH C H O 2
C H 2
D - Ribulosa - 5 - Fosfato
D - Ribosa - 5 - Fosfato
Fig. 31 - 8. Formacin de un segundo NADPH, CO2 y la Ribosa - 5- Fosfato.
O CH H OH H OH -D - Glucosa - 6 - Fosfato H OH 2 O O H P O O OH + + 2 NADP + H H HO 2
H C C O OH + O O P O O CO 2
2 NADPH
2 H+ +
H H
C OH C OH C H 2
Fig. 32 - 8. Balance final de la Va de las Pentosas.
La primera reaccin por la que se integra a la va Glicoltica la Ribulosa-5-Fosfato es catalizada por una Fosfocetopentosa epimerasa (Fig. 31 - 8). En esta reaccin la Ribulosa5-Fosfato pasa a Xilulosa-5-Fosfato por medio de un intermediario-2,3-enediol . A continuacin la enzima Transcetolasa (Fig. 31 8), en presencia de la coenzima TPP y Mg, transfiere el Cetol de la Xilulosa-5-Fosfato al aldehdo aceptor de la Ribosa-5-Fosfato para formar D-Sedoheptulosa-7-Fosfato y D-Gliceraldehido-3-Fosfato.
385
C H OH 2 C H OH 2 C HO C H H C OH CH O 2 O P O O TPP Mg O C HO C H O
Mitad Dihidroxiacetona TRANSALDOLASA

O P O O
H C O
TRANCETOLASA
H C OH H C OH H C OH CH O 2
H C OH H C OH CH 2 O O P O O
D - Xilulosa - 5 - Fosfato
H C O
D - Sedoheptulosa - 7 - Fosfato
D - Eritrosa - 4 - Fosfato
CH OH 2
H C O O P O O HO
C C H
H C OH H C OH H C OH CH O 2 O P O O
H C OH CH O 2
H C OH H C OH CH O 2 O P O O
D - Gliceraldehido - 3 - Fosfato
D - Fructosa - 6 - Fosfato
Fig. 33 - 8. Accin de la Transcetolasa y Transaldolasa en la transferencia de un grupo cetol desde la Xilulosa-5-P a la Ribosa -5-P y desde la Sedoheptulosa-7-P al Gliceraldehido-3-P.
La siguiente reaccin (Fig.33 - 8), es catalizada por la enzima Transaldolasa que transfiere la mitad Dihidroxiacetona desde la Sedoheptulosa-7-Fosfato al Gliceraldehdo-3-Fosfato para formar Fructosa-6-fosfato y Eritrosa-4 Fosfato. Finalmente la Transcetolasa (Fig. 34 - 8), acta transfiriendo el cetol desde la Xilulosa-5Fosfato a la Eritrosa-4-Fosfato de la reaccin anterior o la que provena de la Sedoheptulosa7-Fosfato. Con esta reaccin se forma Fructosa-6-Fosfato y Gliceraldehdo-3-fosfato, los cuales se pueden integrar a la Gliclisis y ser oxidados despus de CO2 y H2O.
386

H C H H H C C C H O O H O H O O P O O TRANSCETO LASA T P P M g H H H C C C H O O H O O P O O
D - E r it r o s a - 4 F o s fa to C H C HO H C C C H 2 O H O H O H O O P O D - X ilu lo s a - 5 - F o s f a t o O
D - G lic e r a ld e h id o - 3 F o s fa to C H 2 O H O H O H O P O D - F ru c to s a - 6 - F o s fa to O O H
C H O H H C C C
C H O 2
Fig. 34 - 8. Accin de transferencia del Cetol desde la Xilulosa-5-P a la Eritrosa-4-P.
En general se puede decir que la Va de las Pentosas: a) Es una Va Citoslica que se deriva de la Gliclisis y ocurre principalmente en Hgado, Glndulas Suprarrenales, Tejido Adiposo, Glndula Mamaria y aquellos tejidos donde se lleva a cabo la proliferacin celular. b) Es la va primaria para la produccin de NADPH + H que se emplea en la sntesis de Colesterol y sus derivados como son las Hormonas Esteroidales y las Sales Biliares. c) Otro de sus productos es la Ribulosa-5-P que se emplea en la sntesis de Nucletidos que se dirigen a la sntesis de cidos Nucleicos d) Los intermediarios de esta va se pueden restituir y ciclar a la Gliclisis por conversin de Fructosa-6-P y Gliceraldehdo-3-P. En la Tabla 8-8, se puede apreciar el resumen de la Va de las Pentosas.
Tabla 8 - 8
387
RESUMEN DE LA VIA DE LAS PENTOSAS Para volver a la Gliclisis 3 Pentosas (3XC5) (2XC6) y un Gliceraldehido-3-P (C3.).
ETAPA IRREVERSIBLE
se convierten en 2 Fructosas-6-P
3 X C6
ETAPA REDOX 6 X NADP 6 x NADPH + H 3CO2
PRODUCCIN DE PENTOSA-P Y NADPH
3 x C5
ETAPA DE INTERCONVERSIN REVERSIBLE EL EXCESO DE PENTOSA-P VUELVE AL METABOLISMO CENTRAL
INTERCONVERSIN DE AZCARES
2XC6 final
C3 final
TRANSALDOLASA
TRANSCETOLASA
RESUMEN Transferencia de carbones para reintegrar a la Gliclisis 2 Fructosas-6P (C6 final) y un Gliceraldehido -3-P (C3 final)
C6 final
C5 C5
C3
C7
C4 C6 final
C5
C4
TRANSCETOLASA
C3 final
Volver al inicio
21)
VISION GENERAL DE LA VIA DE LAS PENTOSAS
388
En el paso X de la Figura 35 - 8 se encuentran las enzimas Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa, Lactonasa y cido-6-Fosfoglucnico Deshidrogenasa, mientras que en el paso Y se encuentran las enzimas Fosforiboisomerasa, Fosfocetopentosa Isomeras, Transcetolasa, Transaldolasa y nuevamente la Transcetolasa. Por medio del aporte de Fructosa-6-Fosfato y Gliceraldehdo-3-Fosfato a las enzimas de la Gliclisis se produce un total de 12 NADPH, 6 CO2 y un Fosfato, sin permitir que la Pentosa fosfato se acumule en los tejidos que emplean NADPH + H.
FORAMA
6H O 2 12 NADP
CICLICA
DE
LA
VIA DE LAS PENTOSAS
Glucosa - 6 - Fosfato
X
5 Glucosa - 6 - Fosfato
6 Ribulosa - 5 - Fosfato
6CO 2 + 12 NADPH + 12 H +
ISOMERASA
4 Fructosa - 6 - Fosfato 5 Fructosa - 6 - Fosfato Gliceraldehido - 3 Fosfato
ISOMERASA
Fructosa - 6 -Fosfato Dihidroxicetona Fosfato
Gliceraldehido - 3 - Fosfato
Pi
ALDOLASA FRUCTOSA - 1,6 - BIFOSFATASA
Fructosa - 1, 6 -Bifosfato H O 2
Fig. 35 8. Visin cclica de la Va de las Pentosas
Volver al inicio
22) LA VIA DE LA PENTOSA FOSFATO Y LA GLICOLSIS EN ERITROCITOS.
389
Los Eritrocitos emplean la Gliclisis anaerbica cuyo ATP sirve para activar las bombas que mantienen la Osmolaridad. Por otro lado, la Va de las Pentosas produce NADPH + H que ayuda a mantener al Fe +3 de la Metahemoglobina como Fe +2, ya que algunas veces el Oxgeno abandona el grupo Heme llevndose un electrn y produciendo O2 -1 (Superxido). Adems, uno de los productos de la Gliclisis es el 2, 3-Bifosfoglicerato que es un modulador de la actividad de la Hemoglobina (fig. 36 -8).
G lucosa
P G liceraldehdo-3-PD eshidrogenasa N AD H + H
G liceraldehdo-3-P
N AD
1,3 Bi-P-G licerato

AD P + P AT P 1,3 D i-PG licerato Q uinasa
Bi-P-G licerato mutasa
2,3-Bi-P-G licerato
P 2,3-Bi-P-G licerato F osfatasa
3-P- G licerato
P iruvato
Fig. 36 - 8. El 2,3-Bi-P-Glicerato proveniente de un tejido con actividad metablica anaerbica modula a la Hemoglobina, hacindola ms rgida para que libere Oxgeno.
En el eritrocito el NADPH + H de la Va de las Pentosas se emplea para mantener reducido al Glutatin ( -Glutamil-Cisteinil-Glicina) en la forma G-SH. Este tripptido se encuentra en su forma oxidada como G - S - S - G y es capaz de proteger a las membranas de la accin de los Perxidos (H2O2), Superxidos (O2 -1 ) y el radical OH . , que producen la Hemlisis. El H2O2, tambin produce Metahemoglobina que no es capaz de transportar O2. Por lo tanto, aquellas personas que sufren deficiencias en la produccin de NADPH, sufren de una falta de estabilidad de sus Eritrocito. La importancia de este sistema se puede resaltar con una enfermedad de origen mediterraneo denominada Favismo. Esta proviene de la isla denominada Cerdea y ocurre aqu, que se desencadena en la primavera por la ingestin de Habas o la aspiracin del polen de dicha planta. Ocurre aqu que los subproductos de la digestin de las Habas, generan en el intestino sustancias extremadamente oxidantes o bien la aspiracin de su polen, genera una reaccin alrgica de tal magnitud que disminuye la vida media de los Eritrocitos por estrs oxidativo. Si la persona, no cuenta con los niveles de G-SH o NADH + H adecuados por falta o deficiencia de la Glucosa-6-P Deshidrogenasa, ubicada al inicio de la Va de las Pentosas, se produce una marcada Anemia Hemoltica. Esta es una clara demostracin de la conexin entre enfermedad, estrs oxidativo y la enzima Glucosa-6- P Deshidrogenasa.
390
Esta ltima tiene su gen en el telmero del cromosoma X. Las hembras heterocigticas son normales, mientras que en los varones la deficiencia se expresa completamente. Volver al inicio 23) REVERSIBILIDAD DE LA GLICOLISIS. La Gluclisis es tambin reversible y se denomina en este caso Gluconeognesis (Fig. 37 8). Esta va inversa ocurre principalmente en hgado y rin. Los precursores de la Glucosa sern ahora aminocidos, piruvato y glicerol. En esta va se hace uso de algunos pasos en comn con la Gliclisis, excepto en las etapas donde se encuentran las enzimas marcapasos o aquellas que imponen una elevada barrera de energa al proceso inverso. Aqu se comparten solo las enzimas que pueden catalizar en ambos sentidos, segn la acumulacin de sustratos y productos, adems las reacciones de carcter reversible no son muy exergnicas o endergnicas (+ o 3Kcal/mol). En estos casos las enzimas marcapasos como la Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y la Piruvato Quinasa se inhibirn controladamente, activndose otras enzimas que catalizarn la va inversa y que hacen uso de ATP o GTP, para sortear las barreras de energa o bien emplearn la energa restante,
GLUCONEOGENESIS
GLUCOSA + ATP GLUCOSA - 6 -P + ADP
FRUCTOSA - 1,6 BIFOSFATASA
CTC
GLUCOSA- 6 - Pasa
AAS
FRUCTOSA -6 - P + ATP FRUCTOSA -1,6 - DI -P + ADP
: :
CICLIO TRICARBOXILICO AMINOACIDOS
3 - P -GLICERALDEHIDO + P - DI - HIDROXICETONA 2x ( 3 - P -GLICERALDEHIDO )
2 x ( 1, 3 - DI - P - GLICERICO+ ADP) 2 x ( 3 - P - GLICERICO + ATP )

PIRUVATO
2 x ( 2 - P - GLICERICO ) 2 x ( C O + GDP)
2 P - ENOL PIRUVATO CARBOXI QUINASA
2 x (P - ENOL IRUVATO+ GDP ) 2 x ( PIRUVATO + ATP )
ACETIL - S - CoA PIRUVATO CARBOXILASA

PIRUVATO OXALOACETATO CITRATO
AAS
+ ATP + C O2
+
MALATO
ADP
GLUCONEOGNICOS
ISOCITRATO
2 x ( OXALOACETATO) 2 x ( GTP ) 2 x ( MALATO )
FUMARICO
CTC
ALFA - CETO GLUTARATO
SUCCINICO
AAS
GLUCONEOGENICOS
SUCCINIL - S - Co A
AAS
GLUCONEOGENICOS
Fig. 37 - 8. Reposicin de la Glucosa en ayunas por medio de la Gluconeognesis. 391
que se encuentra an presente en los intermediarios de la Gliclisis que antes eran productos y ahora sern sustratos. Volver al inicio 24) GLUCONEOGENESIS. La Gluconeognesis tiene por objeto reponer la Glucosa ante un estado de ayuno, por medio de su sntesis a partir de Piruvato, Lactato, Glicerol y Aminocidos Gluconeognicos en el hgado (Fig. 34 - 8). El cerebro necesita diariamente 120 gr de Glucosa, mientras que otros tejidos como los eritrocitos y msculo, requieren de aproximadamente 40 gr diarios dando un total de 160 gr/da. La glucosa que satisface estas necesidades proviene de los fluidos corporales con 20 gr/da y del Glicgeno con alrededor de 190 gr/da, lo que arroja un exceso de 50 gr/da. Por lo tanto, los estados de sobrealimentacin y la ayuna tendern a inducir la Glicognesis y la Gluconeognesis respectivamente. Otra causal para la sntesis de glucosa es cuando se recupera la Glucosa gastada durante la actividad intensa y repentina desarrollada por el msculo esqueltico (Fig. 35 - 8), Durante la actividad fsica extrema que ocurre al correr los 100 mts. planos, se requiere de ATP en forma repentina en un medio de baja oxigenacin muscular, lo que lleva a formar una gran cantidad de c. Lctico. El nivel de NADH/NAD es elevado en el citoplasma en comparacin al mismo nivel en la Mitocondria. El c. Lctico pasa como tal desde el msculo al sistema circulatorio siendo llevado posteriormente al hgado. La otra forma de transportarlo desde el msculo al hgado es como Alanina, la que se forma al transaminar Piruvato con Ac. Glutmico (Ver metabolismo de los Aminocidos). Posteriormente en el hgado se transforma nuevamente en Glucosa a partir de Piruvato con la participacin energtica de la mitocondria, siendo luego incorporado como Glucosa a la circulacin y retornando nuevamente al msculo en reposo donde se almacena la Glucosa como Glicgeno (Fig. 38 El msculo y el cerebro no tienen forma de sintetizar Glucosa y dependen del hgado para su recuperacin. Otro rgano gluconeognico es tambin el rin, pero este proceso no ocurre
MUSCULO
[ GLICOLISIS ]
SANGRE
HIGADO
[ GLUCONEOGENESIS ]
Glicgeno
Glicgeno
Glucosa
Glucosa
Glucosa
Citoplasma
Citoplasma Mitocondria Piruvato Ac. Lctico Alanina Piruvato Ac. Lctico
Ac. Lctico
Fig. 38 - 8. Flujo del Piruvato al Hgado como c. Lctico o Alanina para generar all Glucosa y reponerla nuevamente en el msculo. 392
all hasta la inanicin. Este trfico entre msculo e hgado se denomina el Ciclo de Cori (Fig 38 - 8). La degradacin anaerbica de una molcula de glucosa produce 2 ATPs, mientras que su sntesis por el Hgado emplea 6 ATPs ms NADH + H+. El Oxgeno empleado por la mitocondria para eliminar al Ac. Lctico se denomina el Dbito o la Deuda de Oxgeno. El hgado para sintetizar glucosa a partir de piruvato debe invertir tres reacciones exergnicas e irreversibles dirigidas hacia la GLICOLISIS, las que se examinarn a continuacin. Volver al inicio 25) LAS 3 REACCIONES MAS EXERGONICAS DE LA GLICOLISIS NO SON COMPARTIDAS CON LA GLUCONEOGENESIS. 1) La reaccin de Glucosa a Glucosa-6-P catalizada por la enzima Hexoquinasa de Km 10 mM ocurre en el msculo y es irreversible ya que no existe en este tejido la Glucosa-6Fosfatasa. En el hgado se encuentra la enzima Glucoquinasa con Km 0,1 mM, cuyo producto la Glucosa-6-P se puede hidrolizar para invertir la reaccin con la enzima Glucosa-6-Fosfatasa presente en el retculo endoplsmico del hepatocito: Glucoquinasa Hexoquinasa GLUCOSA + ATP -----> GLUCOSA-6-P + ADP Glucosa-6-Pasa GLUCOSA-6-P + H2O --------> GLUCOSA + Pi
-2.9Kcal/mol
La Glucosa-6-Pasa no esta presente en msculo y cerebro que solo reciben glucosa, pero no son capaces de sintetizarla de novo. 2) La siguiente etapa irreversible es la reaccin catalizada por la Fosfofructoquinasa que se invierte con la enzima Fructosa-1,6- Bifosfatasa, esta ltima es activada por ATP y Citrato e inhibida por AMP y ADP. Solo una de las vas es a la vez activa, sin embargo se ha visto que algunos insectos son capaces de producir ciclos intiles o ftiles en esta etapa de la Gliclisis, con el fin de generar energa calrica por hidrlisis neta de ATP para elevar de esta manera su temperatura interna y emprender vuelo en los das fros. Estos ciclos tambin se denominan ciclos de sustrato y pueden ser empleados como medios de regulacin o amortiguadores de la formacin de producto en una de ambas direcciones Gliclisis o Gluconeognesis. FosfoFructo Quinasa FRUCTOSA-6-P + ATP------>FRUCTOSA-1,6-DI-P + ADP Fructosa-1,6-DI-Pasa FRUCTOSA-1,6-DI-P + H2O --------> FRUCTOSA-6-P + Pi
-3.4 Kcal/mol
- 3.9 Kcal/mol
393
3) La etapa ms exergnica, es de Fosfoenol Piruvato a Piruvato catalizada por la Piruvato
GLICOLISIS
O O C O P O HO C CH 2 O
GLUCONEOGENESIS Mem b. Ext.

ADP ATP
O C O C O CH 3
Mem b. Int.
Matriz Mitocondrial
PIRUVATO C O+ ATP O
C 2 O
FOSFO ENOLPIRUVATO CO 2 GDP FOSFO ENOL PIRUVATO CARBOXI QUINASA
C O CH 3
ADP + P i
O C O
CTC
PIRUVATO
O C O C O C H C O O
GTP
PIRUVATO CARBOXILASA
C O C H C O
MALATO DHasa
NADH + H NAD
O C O C OH CH 2 C O O O C O
(AOA)
C OH CH 2 C O O
NADH + H
AC. OXALOACETICO
MALATO DHasa
NAD
(AOA)
AC. MALICO
AC. MALICO
CITOPLASMA
MITOCONDRIA
CTC
Fig. 39 - 8. La reaccin de Piruvato a Fosfoenol-Piruvato se invierte mediante 4 reacciones y con el gasto de 4 ATPs.
Quinasa (fig. 39 8), presenta una gran barrera de energa y se puede invertir por los siguientes cuatro pasos. Piruvato Quinasa 1) 2 P-ENOL-PIRUVATO + 2ADP-------> 2PIRUVATO + 2ATP G= -7.5 Kcal/mol
La Piruvato Quinasa es estimulada alostricamente por la Fructosa-1,6-Bifosfato e inhibida por ATP.
394
Biotina 2) 2 PIRUVATO + 2CO2 + 2ATP --->2 OXALOACETATO + 2 ADP + 2 Pi G= - 1,0 Kcal/mol La Piruvato Carboxilasa requiere de la vitamina Biotina para la carboxilacin y es estimulada indirectamente por el exceso de Acetil CoA mitocondrial e inhibida por ADP. Luego, el Oxaloacetato es reducido en el interior de la mitocondria para formar Malato. Ambos Oxaloacetato y Malato se mezclan con las mismas molculas provenientes del CTC formando un mismo pool. Cmo la reaccin procede en forma exergnica hacia Malato cuando el CTC se encuentra a baja velocidad, se acumula malato que sale de la mitocondria, se oxida en el citoplasma y con la enzima Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa y GTP logra formar Fosfoenol Piruvato, que se dirige hacia la sntesis de Glucosa. Malato Deshidrogenasa Mitocondrial 2 OXALOACETATO + 2 NADH + 2 H<----->2 MALATO + 2 NAD G= 7,1 Kcal/mol
Malato Deshidrogenasa Citoplasmtica 3) 2 MALATO + 2 NAD------->2 OXALACETATO + 2 NADH + 2 H
G= + 7,1 Kcal/mol
Las reacciones de Oxaloacetato a Malato dentro de la mitocondria y de Malato a Oxaloacetato, fuera de la mitocondria en el citoplasma, ocurren impulsadas por los distintos niveles de NAD y NADH +H que hay en cada uno de estos lugares. Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa 4) 2 OXALACETATO + 2 GTP---->2 FOSFOENOLPIRUVATO + 2CO2 + 2GDP G= +1,3 Kcal/mol ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------2 PIRUVATO + 2 ATP + 2 GTP --->2 FOSFOENOLPIRUVATO + 2 ADP + 2 GDP +2Pi 2 x(+ 0,3 Kcal/mol) Por lo tanto, la Gluconeognesis en la direccin inversa y compartiendo algunas pasos con la Gliclisis a partir de Piruvato gasta el equivalente a 6 ATPs ms dos molculas de NADH +H 2 PIRUVATO + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH + 2H + 4 H2O ----> GLUCOSA + 4 ADP + 2 GDP + 2 NAD + 6 Pi /\Go' total = - 9 Kcal/mol La ecuacin general es an exergnica, debido al gasto de ATP y GTP los cuales invierten los pasos mas exergnicos de la Gliclisis, sin embargo sin este aporte de energa sera imposible sintetizar nuevamente la molcula de Glucosa y restaurar a la vez la energa perdida. Por lo tanto la Gluconeognesis es endergnica.
Volver al inicio
395
26) PRINCPALES DIFERENCIAS ENTRE LA GLICOLISIS Y LA GLUCONEOGENESIS. 1) La Gliclisis se lleva a cabo con reacciones que ocurren ntegramente en el citoplasma, mientras que la Gluconeognesis a pesar de compartir algunas de ellas en el citoplasma, necesita del concurso de la mitocondria para su desarrollo. 2) La Gliclisis produce solo 2 ATPs netos por fosforilacin a nivel de sustrato, mientras que la Gluconeognesis necesita de 6 ATPs. La Gliclisis es exergnica mientras que la Gluconeognesis es endergnica. 3) En la Gliclisis se produce una oxido-reduccin con el empleo de la coenzima NAD. En la Gluconeognesis se emplea NADH + H+ como reductor, adems de la Biotina en la carboxilacin del Piruvato y la Tiamina, en la descarboxilacin del Oxaloacetato. 4) Las etapas irreversibles de la Gliclisis son las tres reacciones ms exergnicas. Dos se invierten debido a que el producto an tiene suficiente energa para proceder en forma inversa con otras enzimas (la Glucosa-6-P y la Fructosa-1,6-di-P), mientras que la tercera necesita de cuatro etapas para invertirse ya que es muy exergnica, dos de ellas ocurren en la mitocondria catalizadas por las enzimas Piruvato Carboxilasa y Malato Deshidrogenasa, mientras que las otras dos son catalizadas en el citoplasma por la Malato Deshidrogenasa Citoplasmtica y la Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa. 5) Las enzimas marcapasos de la Gliclisis son a) Hexoquinasa b) Fosfofructo Quinasa y c) Piruvato Quinasa en cambio en la Gluconeognesis son la a) Piruvato Carboxilasa , b) Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa, c) Fructosa-1,6-Bifosfatasa y d) Glucosa-6-Fosfatasa. 6) La Gliclisis es estimulada por AMP, ADP, Fructosa 2,6 Bifosfato y la Gluconeognesis es estimulada por ATP, Citrato y Acetil-S-CoA. 7) Tanto la degradacin del Glicgeno como su sntesis se efectan por el lado no reductor. 8) Principales Enzimas marcapasos de la Gliclisis (Tabla 9 8): Tabla 9 8 Enzimas Reguladoras Hexoquinasa PFK 1 Activadores Alostricos ------------AMP, Inhibidores Glucosa-6-P ADP, ATP, Cofactores Alostricos Mg ++, Mn ++
Citrato Fructosa-2,6-BI-P
Piruvato Fructosa-1,6-BI-P ATP, Alanina ---------Quinasa * Fosforilacin por medio del Glucagn con disminucin de la actividad
396
9) Principales enzimas Marcapasos de la Gluconeognesis (Tabla 10 8) Tabla 10 8 Enzimas Reguladoras Glucosa-6-Pasa Fructosa-1,6Bi-Pasa 1 Fructosa-1,6 -bi-Pasa 2 Piruvato Carboxilasa Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa Activadores Alostricos ----------ATP, ----------Acetil-S-CoA ----------Inhibidores Alostricos ---------Cofactores ------- producto Glucosa ------------------Biotina ---------Inh. por el Pi, y
Citrato ----------------------ADP ADP
10) En la carboxilacin del piruvato se emplea Biotina (Piruvato Carboxilasa) y en la descarboxilacin del c. Oxaloactico Tiamina pirofosfato (Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa). 11) Hormonas involucradas en la liberacin de glucosa desde el hgado y rin a los tejidos. Glucagn: a) Estimula la liberacin de Glucosa mediante la degradacin de Glicgeno y la inhibicin de la Gliclisis propiciando la Gluconeognesis. As se obtiene Glucosa por dos vas, una por sntesis y otra desde el Glicgeno. El Glucagn estimula directamente a la Fosfoenolpiruvato Carboxiquinasa y activa por fosforilacin a la FBP2 disminuyendo los nivelas del activador alostrico de la PFK1, Fructosa-2,6-BI-P. 12) Hormona involucrada en la captacin y metabolismo de la Glucosa por el msculo y tejido adiposo. Insulina a) Propicia el paso de la Glucosa desde la sangre a los msculos y tejido adiposo, tambin inhibe la sntesis de la Piruvato Carboxilasa, Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa, Fructosa 1,6 Bifosfatasa y Glucosa-6-Pasa mientras que el Cortisol aumenta su sntesis de novo propiciando la Gluconeognesis a partir del catabolismo de las protenas.
Volver al inicio
397
REFERENCIAS Biochemical Adaptation , P. W. Hochachka & G. N. Somero, Princeton University Press , 1984. Biochemistry, L. Stryer, W.H. Freeman and Co, New York, 1988.
398
402
Hctor Rocha L. Ciclo Tricarboxlico.
CICLOS TCA Y GLIOXLICO 1) CICLO TRICARBOXILICO 405 2) APORTE DE SUBSTRATOS Y SALIDA DE PRECURSORES EN EL CICLO 407 3) DESTINO DE LOS CARBONES EN EL CICLO 410 4) COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA 411 5) DESCRIPCION DEL CICLO 412 6) REACCIONES ANAPLERIOTICAS 415 7) HOMOLOGIA DE LOS PROCESOS OXIDATIVOS 415 8) DESCARBOXILACIONES DEL CICLO TRICARBOXILICO 417 9) REGULACION DEL CICLO TRICARBOXILICO 419 a) Sntesis de Hidratos de Carbono b) Sntesis de cidos Grasos 420 419
10) CONSIDERACIONES ENERGETICAS DEL CICLO 422 11) EL CTC EN DISTINTOS ORGANOS 423
12) CICLO GLIOXILICO EN PLANTAS 425 13) METABOLISMO EN LOS RUMIANTES 426
403
1) CICLO TRICARBOXILICO.
404
El Ciclo Tricarboxlico (CTC) es donde convergen los intermediarios de los Hidratos de Carbono, cidos Grasos y Aminocidos desaminados, para su oxidacin total a CO2. Este Ciclo es tambin conocido por los nombres de Ciclo del cido Ctrico y/o Ciclo de Krebs. Este ltimo, fue quin lo descubri al determinar la funcin de una serie de reacciones que ocurran en la matriz mitocondrial y cuyo propsito era la descarboxilacin oxidativa del Acetil-SCoA. Esta molcula se encuentra formada por la unin de dos carbones que forman el grupo Acetilo (CH3-CO-) a la Coenzima A que cuenta con el grupo tiol (-SH), formando un tio-ster. La Coenzima A, es conocida como transportadora y activadora de grupos de dos o ms carbones que se encuentran representados por los Acetilos y los Acilos, estos ltimos como derivados de los cidos grasos (Ver Captulo de las Vitaminas y Lpidos). Como aceptor del grupo Acilo, el Ciclo Tricarboxlico emplea a una molcula de cuatro carbones denominada c. Oxaloactico. De esta manera se produce una molcula mayor representada por el c. Ctrico, que posee seis carbones con tres grupos carboxilos. Esta molcula despus de unos arreglos estructurales, es oxidada por la Coenzima NAD, cuya funcin es atrapar los protones desde los sucesivos intermediarios liberando a la vez CO2 durante el proceso. La molcula de cuatro carbones que se forma despus de ambas oxidaciones o descarboxilaciones, es la Succinil-SCoA que libera energa para formar GTP y posteriormente se vuelve a oxidar de Succnico a Fumrico con FAD. Luego, se hidrata y reordena experimentando una oxidacin ms, con NAD para formar nuevamente el aceptor Oxaloacetato, completando el Ciclo. Las Coenzimas oxidantes NAD y FAD una vez reducidas, dependen del Oxgeno para su regeneracin, ya que pasan a la Cadena de Transporte de Electrones (CTE), ubicada en la membrana interna de la Mitocondria, para entregar all sus protones y volver nuevamente al Ciclo por ms (Fig 1 - 9).
GDP + P i Sustrato Reducido Rico en Protones. Coenzimas Oxidadas NAD y FAD C.T.C Sustrato Oxidado en forma de CO 2 GTP Coenzimas Reducidas NADH + H y FADH2
n ATP
n HO
2
C.T.E.
nO
nADP + nP i
Fig 1 - 9. Las Coenzimas NAD y FAD que oxidan los intermediarios del CTC entregan los protones al Oxgeno en la Cadena de Transporte de Electrones.
El camino que recorren los protones aportados por las Coenzimas del Ciclo Tricarboxlico es algo complejo, ya que antes de pasar al aceptor final de elementos reductores, que en este caso es el Oxgeno, son an capaces de aportar energa para generar ATP mediante un mecanismo de tipo quimiosmtico. Este proceso ocurre a ambos lados de la membrana interna de la mitocondria y se denomina Fosforilacin Oxidativa (PO). En este lugar se
405
aprovecha la energa aportada por las Coenzimas reducidas que a su vez la obtuvieron de oxidar a los intermediarios del Ciclo Tricarboxlico. Las Coenzimas una vez oxidadas repiten su accin y de esta manera se mantiene un flujo constante hacia y desde la CTE, (Fig. 2 - 9).
G DP + P i CH - CO SCoA 3
3 NAD +FAD
11 ATP
4 H2O
2C O
2 ADP G DP
GTP
3 NADH + H + FADH2
O2
11 ADP + 11 P i ATP
Fig. 2 - 9. Por cada molcula de Acetil-SCoA que entre al CTC se producen 12 ATPs y dos molculas de CO2.
El CTC es uno de los procesos del metabolismo intermediario donde se produce CO2 por descarboxilacin oxidativa y a la vez ocurre una fosforilacin a nivel de sustrato que forma GTP. La reaccin de balance general incluye tanto el proceso que ocurre en el Ciclo como la oxidacin de las coenzimas NAD y FAD en la Cadena de Transporte de Electrones (CTE): CTC CH3-CO-S-CoA+3NAD+FAD+GDP+Pi------------>GTP+2CO2+CoASH+3NADH+3H+FADH2 CTE 3NADH+3H+11ADP+11Pi+FADH2+2O2--------------->3NAD+FAD+11ATP+4H2O --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------CH3-CO-SCoA+GDP+11ADP+12Pi----------------->11ATP+GTP+2CO2+CoASH+4H2O Mientras mayor sea el nmero de mitocondrias en un tejido mayor ser la cantidad de ATP generado, con la excepcin del tejido graso pardo. Este tejido tiene unas mitocondrias que no generan un gradiente quimiosmtico para sintetizar ATP, sino que liberan la energa directamente en forma de calor (ver Cadena Transportadora de Electrones, Captulo 12). El Ciclo Tricarboxlico parece ser el colector principal de sustratos y a su vez el productor mayoritario de coenzimas reducidas. Por ejemplo en el salmn las fibras musculares de
406
contraccin rpida y anaerbicas emplean como combustible Glucosa, mientras que las lentas y aerbicas emplean cidos grasos y algn Piruvato que proviene de la Glucosa, sin embargo tambin concurren al metabolismo aerbico los aminocidos deaminados. Por ejemplo cuando se emplean marcadamente ambas fibras durante las migraciones de estos peces corriente arriba, se recurre a ests durante las ltimas etapas cuando se han quemado los otros combustibles, para reponer a los intermediarios del Ciclo. En los msculos voladores de los himenpteros (mariposas), se emplea como combustible para sus vuelos el Piruvato de la Glucosa y del Glicerol-P. En otros, como es el caso de la langosta se emplea Glucosa para vuelos cortos y para vuelos migratorios se recurre a la Oxidacin de los cidos grasos y su posterior oxidacin en el CTC. Entre los cefalpodos (calamares, pulpos) se emplea la Prolina como combustible la que entra como -Cetoglutrico al CTC. El hombre no es mucho ms distinto de los otros especmenes, ya que un maratonista emplea en primer trmino Glucosa proveniente de los msculos y almacenada como Glicgeno, posteriormente ocupa el Glicgeno heptico el cul se agota como a los 15 Km dependiendo de su tamao y peso. Contina luego, con la oxidacin de los cidos grasos para terminar con la energa aportada por los aminocidos, que se obtienen mediante la degradacin de protenas tisulares, especialmente del msculo. En el caso de una huelga de hambre el mecanismo de degradacin de substratos ocurre de orden similar (Ver Captulo 10). Volver inicio 2) APORTE DE SUBSTRATOS Y SALIDA DE PRECURSORES EN EL CICLO El aporte de carbonos al Ciclo proviene de los Hidratos de Carbono, los cidos Grasos y los Aminocidos: 1) Los sustratos que provienen de la Glucosa son el Piruvato y el Oxaloacetato. El primero entra a la Mitocondria por medio del Complejo Piruvato Deshidrogenasa y formar despus de una descarboxilacin Acetil-SCoA, mientras que el Oxaloacetato tambin se formar a partir de Piruvato en el interior de la Mitocondria por medio de una reaccin anapleritica en que ocurre una carboxilacin con gasto de ATP y catalizada por la enzima Piruvato Carboxilasa . El cido Mlico es uno de los intermediarios del Ciclo y bajo ciertas condiciones de regulacin, puede salir de este y de la Mitocondria para formar en el citoplasma FosfoenolPiruvato, este ltimo se dirige a la sntesis de la Glucosa. 2) El Acetil-SCoA es tambin producto de la -Oxidacin que sufren los cidos Grasos en el interior de la Mitocondria, ya que pueden ser oxidados en sucesivas unidades de dos carbones. Los cidos grasos impares al oxidarse de dos en dos desde el carboxilo a la cola alqulica, pueden entrar al CTC no solo como Acetil-SCoA al Ciclo sino que tambin como el compuesto de tres carbones denominado Propionil-SCoA. Este ltimo pasa de 3 a 4 carbones mediante una carboxilacin y reordenamiento para formar el intermediario del CTC conocido como Succinil-SCoA, (Figs. 3 - 9 y 4 - 9). al
407
Enzi ma Act i vador a C oAS H + ATP CH 3 CH2 COOH P + ADP
Pr opi oni l S Co A CARBOXI LASA
Met i l Mal oni l Mut asa
ATP P + + CO ADP 2 CH COOH 3 CH 2 CH CH 3 C SC oA C SC oA O
COOH H C CH3 C SC oA O
B12
COOH CH 2 CH 2 C SC oA O
RUMI ANTES O A c. Pr opi ni co Pr opi oni l SC oA
DMet i l Mal oni l SC oA
Succi ni l SC oA
LMet i l Mal oni l SC oA

Fig. 3 - 9. El c. Propinico en rumiantes y la Propionil-SCoA de los cidos grasos impares pueden entrar al Ciclo como Succinil-SCoA.
Bajo ciertas condiciones de regulacin en el Ciclo, el cido Ctrico puede abandonar la Mitocondria descomponindose nuevamente en Acetil-SCoA y c. Oxaloactico con gasto de un ATP. El Acetil-SCoA es transportado desde el interior de la Mitocondria al citoplasma y pasar a ser el precursor de los cidos grasos al entrar al complejo enzimtico de la cido Graso Sintasa. En los rumiantes el principal precursor de la Gluconeognesis es el c. Propinico. Este cido es el producto principal del metabolismo fermentativo en su estmago segmentado y tambin entra al CTC despus de una carboxilacin y reordenamiento al igual que los cidos grasos impares, en la forma de Succinil-SCoA (Fig. 3 - 9). 3) La entrada de los aminocidos al CTC, ocurre a travs de sus esqueletos hidrocarbonados. Esto ocurre una vez que han perdido el amonio y son capaces de formar algunos de los intermediarios del Ciclo como: -Cetoglutarato, Succinil-SCoA, Fumarato y c. Oxaloactico (Fig. 4 - 9). En general, dentro de este grupo estn todos los intermediarios que pueden formar Malato. Esta ltima molcula es a su vez precursora de la Glucosa y los aminocidos que formen parte de ella son conocidos como Glucognicos, en cambio los esqueletos hidrocarbonados de los aminocidos Cetognicos, sern aquellos que formen solamente Acetil-SCoA. Como esta molcula se adiciona al Oxaloacetato para formar Citrato. Este ltimo bajo ciertas condiciones pasar al citoplasma y se descompondr nuevamente como Acetil-SCoA y Oxaloacetato, logrando transportar al exterior Acetil-SCoA que actuar como precursor de la sntesis de los cidos grasos. De esta manera se convierten en grasas hidratos de carbono y algunos aminocidos. Otros aminocidos tan solo por deaminacin oxidativa y/o transaminacin forman inmediatamente intermediarios directos del Ciclo. Estos son los aminocidos Glutmico y Asprtico que forman los Cetocidos -Cetoglutrico y c. Oxaloactico respectivamente.
408
Aminocidos
HIDRATOS DE CARBONO
OXIDACIN DE LA GLUCOSA
PRODUCTO DE LA OXIDACIN DE LOS CIDOS GRASOS
SINTESIS DE ACIDOS GRASOS
Acetil - SCoA
Citrato
Aminocidos
Ac. Oxaloactico Cis - Acontico
Mlico
Isocitrato CO 2
Fumrico
Cetoglutarato CO 2
Aminocidos
Aminocidos
Succnico
Succinil - SCoA
Aminocidos
ACIDOS GRASOS DE CADENA IMPAR
Fig. 4 - 9. Aporte y remocin de los intermediarios del Ciclo.
Volver inicio
al
3) DESTINO DE LOS CARBONES EN EL CTC. Durante el CTC. un compuesto de dos carbones se combina con un aceptor de cuatro para sintetizar uno de seis carbones (Fig 5 - 9). Este compuesto se reordena pierde por descarboxilacin oxidativa un carbono como CO2, dejando a un intermediario de solo 5 carbonos que luego por otra descarboxilacin oxidativa pierde otro CO2. Restando
409
finalmente solo 4 carbonos que por medio de un reordenamiento, hidratacin y posterior oxidacin generan nuevamente el aceptor de cuatro carbonos para que al reiniciar el ciclo se acepten nuevamente dos carbonos ms nuevamente.
Rol de los Carbones durante el C.T.C.

REORDENAMIENTO SINTESIS
6C
OXIDACION
CO 6C 5C
2C + 4C
OXIDACION
2
OXIDACION
4C
HIDRATACION
CO 4C 4C
REORDENAMIENTO
Balance del C.T.C. 2 Piruvato 2 CO

2
2 NADH 2 Acetil-SCoA
6 NADH
NADH
/ ATP
GTP
= ATP
2 GTP 4 CO
30 ATP 6 CO 2
FADH 2 2 FADH
2 FADH 2
8 NADH
2/
ATP
Fig 5 - 9. Rol de los carbonos que entran al CTC y balance final de dos molculas de Piruvato que se oxidan totalmente.
DESTINO DE LOS CARBONOS EN EL CTC. Sntesis Reordenamiento Oxidacin 4C + 2 C ----------> 6 C---------------------->6 C-------------->5 C --- CO2 Oxidacin Reordenamiento Hidratacin ---------------->4 C ------------------------>4C-------------------------------> - CO2 Oxidacin ---------------> 4 C. Volver inicio 4) COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA, REACCION DE ENTRADA AL CICLO. El Piruvato que proviene de la Glucosa entra a la mitocondria para ser descarboxilado por el complejo de la PIRUVATO DESHIDROGENASA y dar Acetil-SCoA: al
410
CH3COCOO- + NAD+ + CoASH ----------> CH3CO-SCoA + CO2 + NADH Piruvato Acetil-SCoA En este complejo se encuentran tres enzimas (Fig. 6 - 9), y la primera se denomina PIRUVATO DESCARBOXILASA. Esta emplea la Tiamina Pirofosfato que es la Coenzima proveniente de la vitamina B1 para descarboxilar el Piruvato con salida de CO2, de esta manera el piruvato queda unido como un etil hidroxi a la Coenzima. Este primer paso hace irreversible la cadena de reacciones que se encuentran a continuacin. En un segundo paso el etil hidroxi es tomado por el c. Lipoico de ocho carbones, que posee en su parte activa un puente disulfuro, formando con el etil hidroxi un tio-ester. El cido Lipoico acta como un pasador de pelotas y lleva al Tiol-ester a la segunda enzima o DIHIDROLIPOIL TRANSACETILASA que a su vez lo traspasa a la CoASH, la que lo acepta por el lado de su grupo SH para que finalmente se forme el Acetil-SCoA que sale libre de la reaccin.
COMPLEJO DE LA PIRUVATO DESHIDROGENASA.
CH C
CoASH 3 O TPP CH3 C S CH CO2 H C 3 OH S L S L S O HS L HS
CH C
3 O
COOH
SCoA
FAD NADH + H +
TPP
PIRUVATO DESCARBOXILASA
DIHIDROLIPOIL TRANSACETILASA
FADH 2
DIHIDROLIPOIL DESHIDROGENASA
NAD
Fig. 6 - 9. Descarboxilacin del Piruvato en la Mitocondria por el Complejo de la Piruvato Deshidrogenasa.
El cido Lipoico queda reducido despus de la segunda reaccin y se debe oxidar para recuperar su reactividad en la forma de un puente disulfuro. Con este fin se entrega el par de protones de ambos grupos tioles del cido Lipoico al FAD. Esta reaccin es catalizada por la tercera enzima o DIHIDROLIPOIL DESHIDROGENASA, donde el grupo de la Coenzima reducida FADH2 se encuentra unido covalentemente a la enzima y debe deshacerse de los protones pasndolos a su vez al NAD, para as formar NADH + H que s se encuentra libre y puede entregar finalmente los protones a la C.T.E. reoxidndose.
411
Las tres reacciones del complejo son reguladas por los niveles de Acetil-SCoA, si su concentracin es baja o el ATP se encuentra disminuido, se activa la cadena del complejo de la Piruvato Deshidrogenasa y si es alto se inhibe (Fig. 7 - 9). El control se ejerce directamente por fosforilacin sobre la Piruvato Descarboxilasa por una enzima denominada Piruvato Descarboxilasa Quinasa. Al estar fosforilada se inactiva y al estar defosforilada por otra enzima denominada Fosfoprotena Fosfatasa se activa.
Piruvato Deshidrogenasa
Acetil SCoA
Citrato Sintasa NADH
Acetil - SCoA NADH ATP
OXALOACETATO
ACETIL - SCoA
OXIDACION DE CIDOS GRASOS CETOCIDOS
MALATO
CITRATO
Fig. 7 - 9. Regulacin de la entrada del Piruvato al CTC.
Volver inicio 5) DESCRIPCION DEL CICLO.
al
En la primera reaccin del CTC, (Fig. 8 - 9), el Acetil-SCoA se combina con c. Oxaloactico para formar Ac. Ctrico, saliendo CoASH al romperse el enlace tiol-ester. Esta reaccin es catalizada por la CITRATO SINTASA, enzima alostrica regulada por los niveles de ATP y citrato. Ambos la inhiben y a la vez puede ser activada por AMP y ADP. Esta reaccin es exergnica. En el segundo paso el c. ctrico se isomeriza por deshidratacin hasta cis-aconitato y luego por hidratacin se convierte en el ismero denominado c. isoctrico. Este reordenamiento permite la salida del primer carbono de la molcula. Esta reaccin es catalizada por la enzima ACONITASA. El tercer paso ocurre cuando el Ac. Isoctrico es descarboxilado por oxidacin a -ceto glutrico de 5 carbones. La energa que se libera en la oxidacin y descarboxilacin se emplea para conducir en parte a la reaccin y es tambin atrapada junto a los protones por la coenzima NAD, que al oxidarse posteriormente en la CTE es aprovechada en la fosforilacin oxidativa como ATP, mientras que los protones son entregados al Oxgeno. La reaccin es catalizada por la ISOCITRATO DESHIDROGENASA, enzima alostrica activada por ADP e inhibida por ATP. Esta ltima reaccin es exergnica.
412
H O 2
C H
Ac. Oxaloactico NADH + H
O S - Co A COO C CH O
Citrato Co A - SH
C OO
2 C H2 HO C COO CITRATO SINTASA
H O
C OO C H2 C
Cis - Aconitato
NAD
2 COO COO -
2 COO -
CH
COO -
H
Mlico
MALATO DESHIDROGENASA
CH COO ACONITASA
H O 2
C OO H HO CH 2 C COO CH COO Isocitrato
C C H
OH H
FUMARASA
OOC H C
COO C H
Fumrico
Succinato y Fumarato son molculas simtricas y los Cs 1 y 2 son indistinguibles de los Cs 3 y 4
ISOCITRATO DESHIDROGENASA
NAD NADH + H CO 2
C OO H
CETOGLUTARATO
- OOC
SUCCINO DESHIDROGENASA
COO C H2 2 C OO
Ac. Succinico
TIOQUINASA GTP
DESHIDROGENASA
CH2 C H C COO
Co A - SH NAD
Cetoglutarato
CH
GDP + P i
C OO
Co A - SH
H O
CO 2 C H2 NADH + H C H C S - Co A Succinil - SCoA
Fig. 8 - 9. Panorama del Ciclo Tricarboxlico.
En la cuarta etapa del Ciclo, el c. -cetoglutrico es nuevamente descarboxilado en una reaccin exergnica por oxidacin con NAD y parte de su energa se emplea para activar al compuesto restante de 4 carbones con CoASH. De esta manera se forma el enlace ster tiolsuccinato que dar origen a la Succinil-SCoA. La coenzima reducida NADH sigue el mismo camino del caso anterior. Esta reaccin es catalizada por un complejo multienzimtico similar a la descarboxilacin oxidativa del piruvato que es otro cetocido. Este complejo se denomina CETOGLUTARATO DESHIDROGENASA. En una quinta etapa sale la CoASH y la energa de la ruptura del enlace ster se emplea para la fosforilacin a nivel de sustrato que forma GTP, lo cual equivale a la formacin de un ATP. Esta reaccin es catalizada por la SUCCINATO TIOQUINASA. En la sexta etapa el c Succnico es oxidado con FAD para formar FADH2 que sigue la ruta de las coenzimas reducidas a la CTE. Esta reaccin es catalizada por la SUCCINO DESHIDROGENASA, que es la nica enzima unida a la membrana interna de la mitocondria. En la penltima o sptima etapa el c. Fumrico es hidroxilado por la FUMARASA para producir el cido L-Mlico. En la octava y ltima etapa, el c. mlico pasa a c. Oxaloactico por la MALATO DESHIDROGENASA que emplea NAD como coenzima oxidante. Aunque el equilibrio de la reaccin est desplazado hacia la formacin de c. Mlico, la reaccin ocurre debido a la
413
rpida remocin de los productos NADH + H y Oxaloactico, ya que est acoplada a la primera reaccin del Ciclo que es decididamente exergnica. La velocidad del Ciclo depende del estado de energa en que se encuentre la mitocondria, as tenemos que un estado de alta energa significa una alta relacin de NADH/NAD junto a una alta relacin de ATP/AMP. En este caso el ciclo funcionar lentamente, mientras que un estado de baja energa con alto nivel de NAD/NADH o ADP/ATP, el Ciclo funcionara rpidamente para producir ms Coenzima reducida (NADH + H y FADH2) que concurren a oxidarse a la CTE para producir una mayor cantidad de ATP. En la Tabla 1 -7, se observa el tipo de reaccin, el nombre de la enzima, el cambio qumico ocurrido y la energa de cada una de ellas individualmente. Tabla 1 - 7 TIPO DE REACCIN QUMICA
CONDENSACIN DESHIDRATACIN HIDRATACIN DESCARBOXILACIN OXIDATIVA DESCARBOXILACIN OXIDATIVA FOSFORILACIN A NIVEL DE SUSTRATO DESHIDROGENACIN HIDRATACIN DESHIDROGENACIN BALANCE : - 2,0 - 8,0 - 0,7 0 -0,9 +7,1 - 10,7
REACCIN
Acetil-CoA + Oxaloacetato + H2O Citrato + CoA-SH + H+ Citrato Cis-Aconitato + H2O Cis-Aconitasa + H2O Isocitrato Isocitrato + NAD+ -Ketoglutarato + CO2 + NADH -Cetoglutarato + NAD+ + CoA-SH Succinil-SCoA + CO2 + NADH Succinil-SCoA + Pi + GDP Succinato + GTP + CoA-SH Succinato + E-FAD Fumarato + E-FADH2 Fumarato + H2O L-Malato L-Malato + NAD+ Oxaloacetato + NADH + H+
ENZIMA
Citrato Sintasa Aconitasa Aconitasa Isocitrato Deshidrogenasa -Cetoglutarato Deshidrogenasa Succinil-SCoA Sintasa Succinato Deshidrogenasa Fumarasa Malato Deshidrogenasa
ENERGA DE LA REACCIN Kcal/mol

- 7,7 + 1,5
Volver inicio 6) REACCIONES ANAPLERIOTICAS.
al
414
Existen algunas reacciones que estn destinadas a reponer algunos de los intermediarios del CTC. El c. Oxaloactico cumple una funcin cataltica en este, ya que despus de su adicin experimental o in vitro se ha observado un elevado consumo de Oxgeno, mayor que el necesario para metabolizarlo. Por lo tanto, los mecanismos para mantener su concentracin en estado estable son de fundamental importancia para el metabolismo oxidativo. La primera de estas reacciones que aporta Oxaloacetato, es por la carboxilacin del Piruvato con ATP y Biotina en el hgado y rin por la enzima PIRUVATO CARBOXILASA. Esta es una enzima alostrica y es activada por Acetil-SCoA (Fig. 7 - 9): Biotina CH3-CO-COOH + CO2 + ATP-------->Ac. OXALOACETICO + ADP + Pi Otras reacciones que alimentan de intermediarios al CTC. , son las originadas por la Transaminacin de algunos aminocidos, como lo son el Aspartato y el Glutamato. Estos aminocidos por accin de una Transaminasa, con una constante de equilibrio cercana a uno, cuyas reacciones son reguladas por aporte de substrato y remocin de productos forman los intermediarios del CTC, Oxaloacetato y -Cetoglutarato: PALP ASPARTATO + PIRUVATO---------------->OXALACETATO + ALANINA PALP Glutamato + PIRUVATO---------------------> -CETOGLUTARATO + ALANINA Otro caso de inters ocurre en el msculo cardaco y esqueltico donde la enzima Mlica produce Piruvato a partir del Malato que encuentra en el citoplasma. El Malato proviene del Citrato que ha abandonado la Mitocondria cuando el CTC est inhibido por exceso de ATP. Malato + NADP------------------> NADPH + H + CO2 + PIRUVATO Esta enzima produce gran parte del NADPH necesario para el metabolismo biosinttico de los Lpidos en el citoplasma a partir del Citrato. Este ltimo al salir al citoplasma se descompone en sus precursores, Acetil-SCoA y Ac. Oxaloactico por la accin de la Citrato Liasa con el gasto de una molcula de ATP. El Acetil-SCoA transportado al citoplasma desde la mitocondria ser el precursor de los cidos grasos. Volver inicio 7) HOMOLOGIA DE LOS PROCESOS OXIDATIVOS. La cadena de reacciones de la PIRUVATO DESHIDROGENASA es similar a la del complejo -CETOGLUTARATO DESHIDROGENASA, que incluye una descarboxilacin y la formacin de un compuesto activado con CoASH, como lo es el Acetil-SCoA y la Succinil-SCoA. Ambas enzimas hacen uso de las coenzimas NAD, FAD, TPP, CoASH y del c. Lipoico. al
415
El metabolismo intermediario recurre en estos casos a secuencias repetidas de reacciones por representar el mecanismo ptimo para descarboxilar un cetocido. Similar caso ocurre entre la Beta Oxidacin de los cidos grasos y la cadena de reacciones que ocurren en el Ciclo, desde la Succinil-SCoA hasta el c. Oxaloactico. Se parte de un cido graso activado por CoASH en el caso de la -Oxidacin o un cido dicarboxlico como el Succnico, que tambin es activado por CoASH en el CTC y ambos se oxidan primero con FAD en vez de NAD, por ser termodinmicamente favorable el empleo de esta coenzima. Luego se procede a hidratar en ambos casos formando el L-Hidroxiderivado para oxidar nuevamente con NAD, dando como producto final un cetocido. Este ltimo es el c. Oxaloactico en el CTC y el CetoacilSCoA en el caso del cido graso. En el CTC durante la etapa en que se oxida al cido Succnico, la CoASH no acompaa a la reaccin todo el tiempo como en la Oxidacin, ya que el cido Succnico es una molcula de menor tamao y con menor dificultad para ser activada. Volver inicio al
8) DESCARBOXILACIONES DEL CTC.
416
Al iniciarse la primera vuelta del CTC entra Acetil-SCoA y c. Oxaloactico y a medida que progresa el Ciclo se pierden dos carbones como CO2. Estos pertenecen solo al Oxaloactico y no al Acetil-SCoA. Los carbones del Acetil-SCoA se emplean para regenerar los carbones
H O 2
C H3
O S - Co A C OOH C
Co A - SH
Citrato
C OO
C H2 C COO
H O 2
Ac. Oxaloactico
O
CITRATO SINTASA
HO
C OO
C H2 C CH COO COO
Cis - Aconitato
NADH + H NAD
C H 2 C OOH
CH
COO
H O 2
H
Mlico
COO C C
C OO
H HO CH 2 C COO CH COO -
Isocitrato
ACONITASA
OH
H H
FUMARASA
OOC H C
COO
ISOCITRATO DESHIDROGENASA
NAD
Fumrico
C OO
H
SUCCINO DESHIDROGENASA CETOGLUTARATO
NADH + H CO 2
C OOC H O
TIOQUINASA
GTP
C H2 C H C COO
Co A - SH NAD
Cetoglutarato
C OO
C H
COO
DESHIDROGENASA
2
-
CH2
CH2
GDP + P i
C OO
C H
CO 2 NADH + H
CH2
COO
C OO Co A - SH
2
S - Co A
H O
C C
Ac. Succinico
Succinil - SCoA
Fig. 9 - 9. Destino de los carbones marcados del Acetil-SCoA.
perdidos del Oxaloacetato de la segunda vuelta al Ciclo, de tal manera que no son los carbones que entran en una vuelta, los mismos que ss pierden. Esto ocurre de forma desfasada en las vueltas posteriores, (Fig. 9 - 9) Al introducir un Piruvato marcado en los tres carbones, se pierde el primero que se encuentra en el grupo Carboxilo durante la reaccin de la Piruvato Deshidrogenasa, quedando marcado los dos carbones del Acetil-SCoA, los carbonos restantes no salen como CO2 en la primera vuelta del Ciclo sino que en las sucesivas. En la vuelta nmero dos durante la formacin del Succinato ( molcula simtrica), la posicin de los carbones se vuelve aleatoria. Es decir, los carbones metileno del Succinato pueden ser ambos del grupo metilo del Acetil-SCoA. De esta manera el c. Oxaloactico de la primera vuelta que perdi dos carbones como CO2, los repone con los del Acetil-SCoA y tendr ahora los cuatro carbones marcados. Es decir existe una simetrizacin de la marca debido a la reaccin Fumarato - Malato - Oxaloacetato. En la segunda vuelta sale el 50% de la marca del Oxaloactico como CO2. Estos pertenecen al carbono carbonilo del Acetil-SCoA y nuevamente se regenera Oxaloactato, an marcado en los cuatro carbones, esta vez con el carbono metilo del Acetil-SCoA y con el otro 50%
417
restante de la marca de tal manera que en la tercera se pierde 25% y en la cuarta el otro 25%. En otro caso si el Oxaloactico entra marcado en los cuatro carbones se pierden los dos carboxilos en la primera vuelta del Ciclo con el 50% de la marca y se pierden 25% en la segunda y los otros 25% en la tercera.
Volver inicio
al
9) REGULACION DEL CICLO TRICARBOXILICO.
418
Las reacciones que tienen a cargo la regulacin del ciclo son en general exergnicas (Fig. 10 - 9) y afectan segn su estado de actividad la velocidad con que ocurre el Ciclo o la acumulacin de intermediarios que pueden tomar otras vas biosintticas.
PIRUVATO
Acetil - SCoA Complejo Piruvato Deshidrogenasa
NAD , Ca , AMP y CoA SH NADH , ATP , CH3 CO - SCoA , ACS. Grasos CITRATO
OXALOACETATO Citrato Sintasa
+ NAD , ADP
MALATO
NADH , ATP ISOCITRATO Isocitrato deshidrogenasa , Ca ,NAD + ADP ATP , NADH
FUMARATO -Cetoglutarato Deshidrogenasa SUCCINIL- SCoA
-CETOGLUTARATO SUCCINATO
Ca , NAD Succinil - SCoA , NADH
Fig. 10 - 9. Las enzimas regulables del CTC son las ms exergnicas.
a) Sntesis de Hidratos de Carbono. Cuando la enzima CITRATO SINTASA disminuye la afinidad por el Acetil-SCoA a causa de la inhibicin alostrica por exceso de ATP o un alto nivel de NADH/NAD (Fig 10 - 9 y 11 - 9), Succinil-SCoA o Citrato, se acumula el cido Oxaloactico y como la reaccin previa a esta en el inicio del Ciclo es endergnica, el Oxaloacetato se devuelve a Malato. Este ltimo difunde fuera de la Mitocondria donde por efecto del nivel NAD/NADH pasa a Oxaloacetato citoplasmtico. El cul mediante la enzima FOSFOENOL PIRUVATO CARBOXIQUINASA y GTP s descarboxila y fosforila para dar origen al Fosfoenol-Piruvato que entrar a la va de la Glucognesis dando origen a Glucosa.
419
CITOPLASMA
C O
MATRIZ
2 Acetil - SCoA
Piruvato CARBOXILASA
MITOCONDRIAL
GLUCOSA
PIRUVATO
ATP C O
2
ADP P
C H2 C C O P - Enol Piruvato CARBOXI QUINASA COO C O O O
O P O
P Enol - Piruvato
OH
CITRATO
COO C O C H2 COO
Ac. Oxalo Ac[etico Malato
GDP GTP
CO 2
ISOCITRATO
Ac. Oxalo Ac[etico
NADH + NAD
DESHIDRO GENASA
CETOGLU TARATO
C H2 COO
Malato DESHIDRO GENASA
COO NADH + NAD COO H C OH

Ac. Malico
OH
Succinil - SCoA
C H2 COO
Ac. Malico
C H2 COO
SUCCINICO
FUMARICO
Fig. 11 - 9. La acumulacin de Oxaloactico desplaza la reaccin hacia Malato y este ltimo fluye fuera de la mitocondria, como precursor de la Gluconeognesis.
La Citrato Sintasa es tambin estimulada por altos niveles de ADP. Volver inicio b) Sntesis de cidos Grasos. Cuando se acumula Citrato (Figs. 10 - 9 y 12 - 9), por inhibicin de la ISOCITRATO DESHIDROGENASA a causa de un alto nivel de la razn ATP/ADP, el Citrato sale de la mitocondria y se descompone por medio de la CITRATO LIASA y ATP. La energa del ATP se emplea en activar la CoASH para la unin con el acetilo y proceder a formar nuevamente ACETIL-SCoA. Este ltimo se dirige a la sntesis de cidos Grasos. El c. Oxaloactico restante de la descomposicin del Citrato, puede ser reducido a Malato, el cul puede entrar nuevamente a la mitocondria y extraer cclicamente ms Acetil-SCoA al formar Citrato. Por otro lado si el Malato no entra puede ser tomado por la Enzima MALICA, que ocupa como coenzima NADP para formar por descarboxilacin Piruvato. Este ltimo puede entrar nuevamente a la mitocondria y participar en la salida de otra molcula de Citrato o bien pasar a la formacin de Oxaloacetato y continuar hacia la Gluconeognesis al formar Malato. El Piruvato tambin puede producir c. Oxaloactico mediante la enzima Piruvato Carboxilasa y este ltimo puede formar ms Citrato con Acetil-SCoA mediante la enzima Citrato Sintasa. al
420
Otra situacin en que se produce una regulacin sobre las enzimas ISOCITRATO DESHIDROGENASA y -CETOGLUTARATO DESHIDROGENASA se desarrolla al acumularse el NADH, este ltimo por ley de accin de masas, desplaza las reacciones catalizadas por ambas enzimas a su forma inversa, incluyendo en ello a la Malato Deshidrogensa. Ambas enzimas son tambin activadas por Ca+2 en el msculo, cuando necesita ATP durante la contraccin. Individualmente la Isocitrato Deshidrogenasa es estimulada por ADP e inhibida por ATP mientras que los niveles de Mg +2 la afectan cooperativamente. La -Cetoglutarato Deshidrogenasa es tambin inhibida por Succinil-SCoA.
MATRIZ MITOCONDRIAL
CH C 3 O COOH CoASH
CITRATO SINTASA
CITOPLASMA
SINTESIS DE ACIDOS GRASOS
CH C CoASH + ATP CITRATO LIASA
3 O
S CoA ACETIL-SCoA
S CoA ACETIL-SCoA
HO
CH C CH COOH COOH
COOH C O CH2 COOH AC. OXALOACETICO
CITRATO ADP + P
COOH C O CH2 COOH AC. OXALOACETICO

NAD NADH + H
PIRUVATO ADP + P Biotina CO 2 + ATP CARBOXILASA CH C 3 O CH C 3
ENZIMA MALICA
COOH H C OH CH2 COOH

AC. MALICO
O NADP CO 2 NADPH + H
COOH AC. PIRUVICO
COOH AC. PIRUVICO
PRODUCCION DE NADPH PARA LA SINTESIS DE ACIDOS GRASOS
Fig. 12 - 9. La enzima Mlica produce NADPH mientras que la Citrato Liasa produce Acetil-SCoA para la Sntesis de los Lpidos.
Volver inicio
al
421
10) CONSIDERACIONES ENERGETICAS DEL CICLO. En todo el Ciclo Tricarboxlico existen dos reacciones endergnicas y son el paso de Citrato a Isocitrato y el paso de Malato a Oxaloacetato (Fig. 13 - 9). La primera reaccin es arrastrada por las dos descarboxilaciones sucesivas que ocurren desde el Isocitrato a Succinil-SCoA, siendo la segunda de -Cetoglutarato a Succinil-SCoA mucho ms exergnica que la primera. La segunda reaccin endergnica listada arriba, es arrastrada por la unin del Oxaloacetato al Acetil-SCoA para formar Citrato la cual si es exergnica.
Energa
Kcal/mol
Perfl de Energa.
0
-2 -4 -6 -8 -10 -12 -14 -16 -18 -20 A Citrato B C Isocitrato E F G Fumarato Succinil - SCoA Succinico Alfa - Cetoglutarato D H Malato I Oxaloacetato Productos
Excergnica
Deshidratacin Hidratacin
DESCARBOXILACION Y OXIDACION
Endergnica
Condensacin
Excergnicas
Oxidacin
DESCARBOXILACION Y OXIDACION
Endergnica
Oxidacin
FOSFORILACION A NIVEL DE SUBSTRATO
Hidratacin
cis - Aconitato
Fig. 13 - 9. Distribucin de la Energa libre estndar durante el Ciclo Tricarboxlico.
Existen otras reacciones fuera de las dos reversibles mencionadas anteriormente, que pueden ser tambin levemente reversibles en el Ciclo, ya que son poco exergnicas y constituyen el paso de Succinil-SCoA a Succinato, el paso de Succinato a Fumarato y el paso de Fumarato a Malato, donde la cada de energa como se observa en la Figura 13 - 9 no es muy pronunciada.
Volver inicio
al
422
11) El CTC EN DISTINTOS ORGANOS A continuacin en la Tabla X se pueden observar las distintas particularidades del Ciclo Tricarboxlico en diferentes rganos como son el Hgado, Msculo esqueltico, Corazn y Cerebro. As tenemos que en el hgado la entrada al Ciclo puede ser por medio del Acetil SCoA que proviene del Piruvato que A su vez deriva del c. Lctico muscular o la Glucosa almacenada como glicgeno del mismo Hgado. Por otro lado el Piruvato proveniente de la Glucosa o la Alanina, puede entrar directamente al Ciclo como Oxaloacetato despus de sufrir una reaccin anapleritica de Carboxilacin con Biotina y ATP. A su vez los cidos grasos pueden entrar como Acetil-SCoA despus de sufrir la -Oxidacin en la mitocondria y si son impares producen una cola de Propionil-SCoA que puede entrar al Ciclo como Succinil-SCoA, despus de ser carboxilada y reordenada. Los aminocidos tienen varias formas de entrar al Ciclo, ya sea como Acetil-SCoA o como algunos de los intermediarios sealados en la Tabla despus de sufrir algunas modificaciones consistentes en deaminaciones y descarboxilaciones. En el msculo segn sea la fibra muscular roja o blanca el empleo del CTC ser diferente, as tenemos que en la fibra muscular blanca las mitocondrias son escasas y se produce normalmente c. Lctico, el que difunde hacia el sistema circulatorio como Alanina o c. Lctico mismo y entra al CTC del Hgado como Acetil-SCoA. La fibra muscular roja tiene abundantes mitocondrias y oxida, ya sea Glucosa y/o cidos grasos totalmente a CO2 y H2O. En algunos casos de inanicin o cuando se padece de la diabetes inspida, tambin se puede aceptar Cuerpos Cetnicos que se cortan con la enzima Tiolasa y forman posteriormente Acetil-SCoA. Ciclo Tricarboxlico CTC en distintos tejidos Sustratos que abastecen de intermediarios al Ciclo
Glucosa Piruvato Lactato cidos Grasos pares cidos Grasos impares
Entrada al Ciclo bajo la forma De

Acetil-SCoA Oxaloacetato Acetil-SCoA Acetil-SCoA y Succinil-SCoA
Salida del CTC en la forma de
Hgado (Lanzadera Malato-Aspartato)
CO2 y H2O CO2 y H2O CO2 y H2O Malato a Gluconeognesis Citrato a sntesis de Acs. grasos o CO2 y H2O Malato a Gluconeognesis o CO2 y H2O Malato a Gluconeognesis o CO2 y H2O
Aminocidos
Ala, Gly, Ser, Thr, Cys, Ile, Leu, Trp, Phe, Tyr, Leu, Lys Glu, Gln, Arg, His, Pro Acetil-SCoA
-Cetoglutrico
Ile, Met, Val
Succinil-SCoA
423
Tyr, Phe
Fumarato
Malato a Gluconeognesis o CO2 y H2O Malato a Gluconeognesis o CO2 y H2O CO2 y H2O Lactato sale a la sangre con direccin al hgado en la fibra muscular blanca (pocas mitocondrias) CO2 y H2O CO2 y H2O CO2 y H2O
Asp, Asn
Oxaloacetato
Msculo, segn sea la Fibra muscular roja o blanca. Lanzadera Glicerol-P Ayuno e inanicin Corazn (Ocupa 15% del oxgeno y la Lanzadera MalatoAspartato) Ayuno e inanicin
Glucosa Piruvato
Acetil-SCoA
cidos Grasos Cuerpos Cetnicos cidos Grasos
Acetil-SCoA -Hidroxibutrico Acetoactico Acetil-SCoA
Cuerpos Cetnicos Lactato y Piruvato Glucosa (se emplea muy poco) Glucosa
-Hidroxibutrico Acetoactico Acetil-SCoA
CO2 y H2O CO2 y H2O
Cerebro (Ocupa 20% de todo el Oxgeno, ms aerbico que el corazn y ocupa Lanzadera Glicerol-P, baja conc. de NADH) Mitoc. sin enzimas para oxidacin de los cs. grasos.
Acetil-SCoA Oxaloacetato
CO2 y H2O Se pierde Cetoglutarato del CTC que se dirige a sintetizar neurotransmisores
Cuerpos Cetnicos
-Hidroxibutrico Acetoactico
El corazn es el segundo rgano ms aerbico, ya que el primero es el Cerebro y hace uso principalmente de los cidos grasos y cuerpos cetnicos, mientras que la oxidacin de la glucosa es casi inexistente. El Cerebro ocupa principalmente Glucosa y al Ciclo Tricarboxlico entra como Acetil-SCoA y como Oxaloacetato, ambos a partir de Piruvato. En este caso la Glucosa es la nica molcula que aporta 2 (Acetil-SCoA) y 4 (Oxaloacetato) carbones al Ciclo para formar el Citrato o c. Ctrico de seis carbones. Es posible entrar al Ciclo como Cuerpo Cetnico (c. Acetoactico), previamente activado por el intermediario del Ciclo Succinil-SCoA que le transfiere su CoASH quedando como Acetoacetil-SCoA que con la Tiolasa pasa a AcetilSCoA.
424
Volver inicio 12) CICLO GLIOXILICO EN PLANTAS.
al
Este Ciclo ocurre en los Glioxisomas de las plantas, especialmente en las semillas y se emplea para convertir cidos Grasos en Glucosa (Fig. 14 - 9). Se le puede considerar a este Ciclo como anapleritico y su balance general es: 2Acetil-SCoA + NAD + 2H2O--------->Succinato + 2CoA-SH + NADH + H En l se emplean dos enzimas distintas al resto, la Isocitrato Liasa y la Malato Sintasa. Ambas permiten la incorporacin de dos molculas de Acetil-SCoA al Ciclo Tricarboxlico. Las reacciones normales de descarboxilacin del CTC no se encuentran presentes en este Ciclo Glioxlico.
ACETIL - SCoA HIDRATOS DE CARBONO
C H3 C O SCoA
CoASH COOH C H2 HO C Citrato Sintasa C O O H CITRATO C H2 COOH Aconitasa COOH C H2 H C
BETA OXIDACION ACS. GRASOS
COOH OXALOACETATO C O CH 2 COOH
COOH
HO CH NADH + H Malato Deshidrogenasa NAD H COOH C OH H C O AC. GLIXILICO COOH ISOCITRATO Isocitrato Liasa
C H2 Ac. MALICO COOH Malato CoASH + H+ Sintasa
COOH
C H3 C O + H O 2 ACETIL- SCoA SCoA
Fig. 14 - 9. Ciclo biosinttico o Ciclo Glioxlico.
El Malato acumulado de esta manera se destina a la sntesis de Hidratos de Carbono al igual que en la Gluconeognesis. Volver inicio 14) METABOLISMO EN LOS RUMIANTES. al
425
El estmago de los rumiantes se divide en cuatro secciones y de ellas el rmen es la que posee la mayor cantidad de microorganismos ( 1010 microorganismos/ cm3 ). La Celulosa de las plantas es el principal alimento de los rumiantes y consiste en molculas de Glucosa unidas por enlaces (1-4). En la primera parte de este estmago segmentado (rmen), la celulosa sufre el ataque de las enzimas microbiales o en otras palabras es fermentada, produciendo c. Actico, c. Propanoico y c. Butanoico ms CO2 y Metano (CH4). El proceso es considerado un tanto ineficiente ya que se pierde el 40% de la energa. Los cidos producidos por los microorganismos sern luego los principales precursores de las molculas complejas del animal. Solo los cidos nombrados anteriormente sern la fuente primaria de energa mientras que la produccin de Metano (80 lts/da) es tan solo una prdida de energa. La Glucosa que se libera de la Celulosa no pasa directamente a la sangre ya que la emplean los mismos microorganismos, por lo tanto la Glucosa que necesita el rumiante proviene de la sntesis de novo, es decir a partir de intermediarios del CTC. El cido Propanoico, principal componente de la fermentacin se activa a Propionil-SCoA y luego se transforma en Succinil-SCoA como se observa en el captulo de vitaminas y cidos grasos. Posteriormente entra al CTC y puede salir como Malato para ser ocupado en la sntesis de Glucosa necesaria para el animal y una parte de ella es posteriormente transformada en Galactosa para la leche. El Glicerol-fosfato producido en la Gluconeognesis es empleado para la sntesis de TAG. Propionil-SCoA Carboxilasa Biotina Propionil-SCoA + CO2 + ATP---------------------> D-Metilmalonil-SCoA del Rmen Metilmalonil-SCoA Racemasa Metilmalonil-SCoA ------------------------------> L-metilmalonil-SCoA Metilmalonil-SCoA Mutasa B12 o Cobalamida L-Metilmalonil-SCoA ---------------------------> Succinil-SCoA Succinil-SCoA----> C.T.C. ----> Malato ----> Gluconeognesis La Lactosa presente en la Leche junto a sus triglicridos provienen de los productos de la fermentacin de la Celulosa, como el Acetil-SCoA y Propionil-SCoA: Gluconeognesis---------> Glucosa---------> Lactosa--------- Leche Gluconeognesis--------> Glicerol-3-P --------> Triglicridos Acetato -------> Acetil-SCoA ------> cidos grasos -------> Leche
426
del Rmen c. Propinico -----> Propionil-SCoA -----> cidos grasos -----> Leche del Rmen Ningn aminocido es esencial para los rumiantes ya que sus microorganismos los pueden sintetizar de similar manera que las vitaminas. Algunas sales de Amonio y la Urea misma pueden servir como fuentes de Nitrgeno a los microorganismos para formar aminocidos. Por otro lado las protenas de las plantas son hidrolizadas directamente en el rmen y sus aminocidos pueden pasar luego a la sangre o bien pueden ser deaminados y finalmente convertidos en cidos grasos, sin embargo la mayora de ellos pasa a constituir la protena de los microorganismos. De esta manera se multiplican en gran cantidad para ser posteriormente hidrolizados y aprovechados en otras secciones del estmago. Por este medio se enriquece la composicin aminoacdica aportada por las plantas y constituyen la fuente de aminocidos para la protena Casena que se encuentra en la leche. Cuando los rumiantes deben amamantar sus cras y el suministro de Celulosa es bajo suelen padecer de Cetosis. Este desorden se caracteriza por la presencia de cuerpos cetnicos en la sangre a causa de una excesiva degradacin de Triglicridos, cuya presencia se manifiesta por un olor dulzn en el aliento, orina y leche del animal. La causa se atribuye a la falta de un nivel normal de Oxaloacetato durante el inicio del CTC, para as permitir la entrada del Acetil-SCoA que viene como producto de la -Oxidacin de los cidos grasos. Por esta razn el Acetil-SCoA se acumula y origina los cuerpos cetnicos por un mecanismo que aparece en el captulo de Lpidos. El Oxaloacetato se encuentra disminuido a causa de que el Malato, su precursor se dirige a la Gluconeognesis para palear la falta de Lactosa producida por la dieta pobre en Celulosa. La cura para esta enfermedad consiste en el suministro de Glucosa endgeno, ya que en la dieta lo aprovecharan solo los microorganismos. Volver inicio al
427
REFERENCIAS Complexes of Sequential Metabolic Enzymes., P.A. Srere. Ann. Rew. Biochem. Vol 56, 89124, 1987. Biochemistry., L. Stryer, Third edition, 1988 W.H. Freeman and Co., NY
428
Hctor Rocha L. Fotosntesis
430
METABOLISMO EN LAS PLANTAS 1) FOTOSINTESIS 433 2) ESTRUCTURA GENERAL DEL SISTEMA FOTOSINTETICO 434 3) COMPUESTOS PROTEICOS DE LA MEMBRANA TILACOIDES, ANTENA COLECTORA 435 4) TRANSPORTE FOTOSINTTICO DE ELECTRONES 439 a) Fotosistema II 441 b) Citocromo b6/f 445 c) Fotosistema I 446 d) ATP sintasa 447 5) FIJACIN DEL CO2 448 6) FIJACIN DE CO2 EN PLANTAS C3 449 7) RUBISCO 451 455
8) FOTORRESPIRACIN 9) CICLO GLICOLATO
456
10) PLANTAS DEL TIPO C4 11) VARIEDAD EN LOS MECANISMOS DESCARBOXILACIN 12) LAS PLANTAS CAM 460 461 458
13) FIJACIN DEL NITRGENO 14) FLUORESCENCIA 466 469
15) FACTORES qP y qN
431
1) FOTOSNTESIS Las plantas son capaces de convertir la energa radiante del sol en energa qumica. Esta es a su vez empleada en la sntesis de complejas estructuras qumicas, donde el ATP es la
432
principal molcula transportadora de energa. Durante este proceso la energa del sol se almacena en las estructuras qumicas. La fotosntesis consta de dos etapas, donde la primera de ellas se le conoce como Etapa Clara o Fotoqumica y se describe por medio de la ecuacin de Hill. En ella se observa la necesidad de luz y agua para generar poder reductor en la forma de NADPH. En esta etapa se sintetiza el ATP y se libera O2 al medio como subproducto. 2H2O + luz ---> O2 + 4H+ + 4e ( Etapa clara o Fotoqumica conocida como Reaccin de Hill) La segunda parte es la Etapa Oscura, que se caracteriza por la fijacin de CO2 y su posterior reduccin mediante NADPH + H, para la sntesis de Hidratos de Carbono por medio del Ciclo de Calvin. CO2 + 4e + 4H+ ---> (CHOH)n ( Etapa oscura o Ciclo de Calvin) El proceso por el que ocurre la conversin de energa radiante en energa qumica requiere de complejos sistemas de molculas excitables por la luz, transportadores de electrones, enzimas y membranas que se encuentran ubicados en los Cloroplastos, (Fig. 1 -10). Estos organelos tienen por funcin producir energa qumica como ATP, romper el H2O para liberar O2 y obtener protones, cuyo destino ser la reduccin de Coenzimas que a su vez participarn en la reduccin de CO2 durante la sntesis de los Carbohidratos. En cambio las Mitocondrias animales tambin producen ATP, pero emplean O2 para oxidar Coenzimas
En la Grana o apilamiento de membranas tilacoidales se producen las reacciones claras que necesitan luz. En el Estroma se llevan a cabo las reacciones oscuras que no necesitan luz
Membranas Tilacoidales
Memb. Ext. Memb. Int
Estroma
Grana
LUZ
H O 2 NADP ADP + Pi HIDRATOS DE CARBONO
O 2
NADPH + H ATP
CO
ETAPA
CLARA
ETAPA
OSCURA
Fig 1 - 10. Estructura del Cloroplasto presente en el mesfilo de las hojas. La sntesis de Hidratos de Carbono se lleva a cabo en el Estroma y la ruptura del agua en las membranas Tilacoides o Grana.
433
reducidas cuyos protones se obtienen de la oxidacin de Carbohidratos y otros substratos. De esta manera los protones se entregan finalmente al O2 formando H2O metablica. Volver al inicio 2) ESTRUCTURA GENERAL DEL SISTEMA FOTOSINTETICO El Cloroplasto es un organelo constituido por tres membranas que a su vez definen tres espacios fsicos funcionalmente diferentes (Fig. 1 - 10). a) La membrana externa lo separa del citoplasma y lo asla como identidad, esta membrana tiene una constitucin porosa y permite el paso de las molculas con relativa facilidad en ambos sentidos. b) La membrana interna en cambio presenta varios sistemas de transporte para dejar pasar precursores y productos siendo muy selectiva. El espacio interno que rodean ambas membranas externa e interna, se denomina Estroma y es donde se encuentran muchas enzimas destinadas a la fijacin del CO2 junto al Ciclo de Calvin donde se lleva acabo la Sntesis de los Hidratos de Carbono. c) La tercera membrana es la Tilacoidal (Fig.2 - 10) en cuyo seno se encuentran embebidos los sistemas transductores de energa. Estos se denominan Fotosistema II o P 680 y el Fotosistema I o P 700. Ambos fotosistemas capturan energa radiante a 680 y 700 nm respectivamente. Esta energa se emplea para llevar electrones de bajo a alto potencial reductor. Una vez excitados los electrones sern capaces de fluir a travs de una cadena de transportadores empleando su energa en la formacin de un gradiente quimiosmtico que posteriormente se acopla a la sntesis de ATP. Las membranas tilacoidales al encerrar un espacio de forma discoidal se apilan entre s formando la estructura denominada como Grana (Fig. 1 - 10). Los lmenes internos de los compartimentos intratilacoidales se encuentran en algunos casos conectados entre s. A
Tilacoides
ATP sintasa
Fotosistema I I
Fotosistema I
Citocromo b f
Fig. 2 - 10. Distribucin de los Complejos del Fotosistema II, Citocromos b6/f y Fotosistema I junto a la ATP Sintasa en la membrana Tilacoides.
434
ambos lados de esta membrana es donde se forma el gradiente quimiosmtico o gradiente de protones como consecuencia del flujo de electrones entre ambos Fotosistemas y de la presencia de una bomba de protones que los pasa desde el estroma al lumen. (Fig 16 - 10). La diferencia de concentracin de iones hidrgenos entre lumen y estroma, es de alrededor de 2,5 unidades de pH. Como consecuencia de este gradiente los protones pasan ahora desde el lumen al estroma generando con ello ATP por medio de una ATP Sintasa, que posee un canal inico destinado a permitir el paso de los protones capturando la energa del gradiente quimiosmtico en la forma de ATP (Fig. 16 - 10). Volver al inicio 3) COMPLEJOS PROTEICOS DE LA MEMBRANA TILACOIDES, ANTENA COLECTORA Su funcin es captar la energa radiante entre los 400 y 700 nm y transferirla a los Centros de Reaccin donde se encuentran los Fotosistemas II y I. La antena colectora acta como un embudo para transferir la energa de los fotones al Centro de Reaccin (Fig. 3 - 10) El proceso de captacin de la energa radiante est a cargo de los pigmentos fotorreceptores de la antena, as tenemos que una hoja con 70 millones de clulas tiene aproximadamente cinco mil millones de Cloroplastos y cada uno de ellos cuenta aproximadamente con 600
Antena
Luz
Fotones
f
f f f
MOLECULAS DE LA ANTENA
CLOROFILA
CAROTENOIDES
fotn
Fotosistema
Fig. 3 - 10. Los fotones excitan a los pigmentos que conducen la energa al centro de reaccin.
millones de molculas de Clorofila las que estn unidas a las protenas de la membrana t tilacoidal. Solo 250 a 300 de ellas se encuentran en cada antena y transfieren la energa de la luz
435
con la ayuda de pigmentos especiales que poseen enlaces dobles conjugados, estos se excitan a diferentes longitudes de onda que las Clorofilas y aprovechan la mayor parte del espectro de luz visible. En los pigmentos la presencia de dobles enlaces conjugados es necesaria para as disponer de electrones que puedan excitarse produciendo una redistribucin de su nube dentro de la estructura molecular del pigmento. Posteriormente, al volver a decaer en energa, los electrones excitados retornan a sus orbitales originales emitiendo a su vez fotones, por medio de un fenmeno denominado fluorescencia. Este se transmite de una molcula colectora a otra,
Espectro de la Luz que alcanza la Tierra
Clorofila b
Absorcin
Clorofila a
300
400
500
600
700
800
nm
Ficoeritrina
Absorcin
Caroteno
Ficocianina
300
400
500
600
700
800
nm
Fig. 4 - 10. Espectros de Absorcin de la luz solar presentado por los pigmentos de la antena.
siendo finalmente canalizado hasta el centro fsico de la antena, que se encuentra formado por un par de Clorofilas sin Mg. Este par se halla tanto en el fotosistema P680 como en el P 700 y ambos constituyen los dadores de electrones primarios. Entre los pigmentos de la antena colectora encontramos a las Clorofilas a y b con cuatro anillos de Pirrol, desde el I al IV, los que se ligan en un Tetrapirrol con un tomo de Mg en el centro y una cadena Fitol en el anillo IV (Fig. 5 - 10). La Clorofila a tiene un grupo Metilo en la posicin 3, mientras que la Clorofila b posee un Formilo en la misma posicin y se le encuentra en plantas superiores y algas. Entre los pigmentos accesorios de la antena se encuentra el Beta-Caroteno, la Ficoeritrina y la Ficocianina que cubren el espectro de las luz solar que alcanza la Tierra (Fig. 4 - 10).
436
Estos pigmentos se excitan con una longitud de onda distinta a la Clorofila para aprovechar todo el espectro de la luz solar (Fig. 4 - 10).
CLOROFILA a
Ntese la presencia de dobles enlaces conjugados en el anillo
CH CH 2 CH 2
CLOROFILA b
CH
CHO
3 CH 2 CH
II
N Cadena Fitol Mg
HC 3 IV CH CH 3 3 CH 3 CH O 3 C O H CH CH 2 2 H H C CH 3 O
N
III CH 3
HC
3
O O
Fig. 5 - 10. Molcula de Clorofila.
Las Clorofilas poseen mximos de 460 y 660nm en el tipo a y mximos de 430 a650nm en el tipo b (Fig. 5 - 10).
Caroteno
Dobles enlaces conjugados
C H3 C H3
CH
CH 3
HC 3
3
CH CH 3 3
CH 3
CH 3
CH 3
Fig. 6 - 10. Pigmento -Caroteno.
437
Los pigmentos accesorios poseen mximos de absorcin distintos a la Clorofila y contribuyen a cubrir el total del espectro de luz visible supliendo a las Clorofilas en regiones en donde su absorcin es deficiente. Entre los pigmentos accesorios se encuentran los Beta-Carotenos (Fig. 6 - 10), con mximos de absorcin entre 400 y 500nm (Fig. 4 - 10).
FICOERITROBILINA
Cuando este grupo se esterifica a una protena se forma la FOCOERITRINA COO CH 3 CH CH 3 CH 3 CH CH 2 COO CH CH 2 2 CH 3 CH 3 CH2 CH
N H
N H
N H
Diferencias
FICOCIANOBILINA
COO CH CH CH 3 3 CH 3 CH 2 CH 2 CH COO CH
Cuando este grupo se esterifica a una protena se forma la FICOCIANINA
entre ambos pigmentos
CH 2 2 CH 3 CH 3
CH 2
N H
N H
N H
Fig. 7 - 10. Molcula de Ficoeritrina.
Las Ficobilinas, formadas por tetrapirroles de cadena abierta como la Ficoeritrobilina (Fig. 7 10), que se encuentra presente en las algas rojas y que conjugada a una protena constituye la Ficoeritrina con mximos de absorcin entre los 500 y 600 nm (Fig. 4 - 10). Otro de los pigmentos accesorios lo constituyen las Ficocianobilinas (Fig. 7 - 10), presentes en las algas verde-azuladas que conjugados con una protena pasan a formar las Ficocianinas que absorben entre las regiones de 500 y 700 nm (Fig. 4 - 10).
Volver al inicio
438
4) TRANSPORTE FOTOSINTTICO DE ELECTRONES. La presencia y disposicin de los Fotosistemas en el Cloroplasto permite "elevar" el Potencial Redox [ un Pot. Red. negativo (-) tiene capacidad para donar electrones y es un reductor fuerte mientras que un Pot. Red (+) tiene capacidad de aceptar electrones y es un oxidante fuerte] desde + 0,81 a - 0,32 volt (Fig. 8a - 15), es decir llevar los electrones cargados negativamente desde un polo (+) a un polo (-). Este proceso, no es espontneo y requerir
'
Eo
1,0 a) 0,5 Cl*
Cl*
PS I 0,0 0,5 1,0

H2O 1/2 O2
Fd
PQ PS I I
Cit b / f
6
Pc
Cl
Cl
b)
LUZ Fd
PS I I
PQ
Cit b / f
6
PS I Pc
2 H2O
O2
+ 4H
Fig 8a - 10. Esquema Z de la cadena de transporte de electrones en el Cloroplasto. Fig 8b - 10. Los Fotosistemas II y I estn integrados en la membrana Tilacoides.
de la energa aportada por la luz sobre los Fotosistemas II y I, (Fig. 8b - 15). Una vez que el Fotosistema II ha elevado la energa de los electrones, es entonces posible que funcione normalmente la cadena de transporte de electrones desde el potencial electronegativo al electropositivo en la membrana Tilacoides. De esta manera se genera un gradiente de protones a travs de esta membrana, donde la energa conservada por este gradiente se emplear posteriormente en la sntesis de ATP. A continuacin, el Fotosistema I volver a "elevar" el Potencial Redox de los electrones para que en un ltimo paso se reduzcan el NADP a NADPH + H+ completando la cadena (Fig. 9 - 10). El problema que ocurre en el Cloroplasto radica en que no se puede iniciar una cadena de transporte con electrones electropositivos de baja energa, lo que no ocurre en la Mitocondria, ya que la cadena se inicia de inmediato con electrones electronegativos a - 0,32 volt y que son producidos por las Coenzimas reducidas. Por esta razn se requiere de la energa radiante para pasar los electrones electropositivos del Cloroplasto a electronegativos e iniciar la cadena reductora que finalizar con la reduccin del NADP. En general al comparar los Cloroplastos con las Mitocondrias se observa que los primeros rompen el agua y producen NADPH para reducir CO2, formando molculas hidrocarbonadas,
439
mientras que las Mitocondrias forman hidrocarbonadas por oxidacin con O2:
agua
metablica
destruyen
molculas
Cloroplasto 2H2O + 2NADP ---------------> O2 + 2NADPH + 2H+ Mitocondria O2 + 2NADH + 2H+ -------------->2H2O + 2NAD Se puede simplificar an ms el concepto, concluyendo que la Fotosntesis ocurre con la ruptura del agua para producir Oxgeno y la Respiracin animal con la formacin de agua a partir del Oxgeno.
' Eo
[V]
FOTOSISTEMA i i
FOTOSISTEMA I
- 1,6 - 1.4 - 1.2 - 1.0 - 0,8 - 0,6 - 0,4 - 0,2 0 0,2 0,4 0.6 0,8 1,0
El Ciclo Q pasa protones
P 700 *
Clorofila acept.de e Filoquinona Prot Fe - S Ferredoxina ferredoxina NADP dep.
P 680 *
Feofitina Plastoquinona Quinona
Luz
NADP + NADPH
Luz Ciclo Q Complejo Citoc b / f 6

Plastocianina
H+
P 700 HO 2
Mn Mn
P 680
1/2
al lumen desde el estroma
+ O2 + 2 H
Fig. 9 - 10. Bombeo de electrones por los Fotosistemas II (P680) y I (P700) entre la ruptura del agua para formar O2 y la formacin de la Coenzima NADP reducida.
Fotosntesis (Cloroplasto, PS II) 2 H2O < -------------------> O2 + 4H+ + 4 electrones Respiracin Animal (Mitocondria, Citoc. Oxidasa) Volver al inicio
440
a) El FOTOSISTEMA II. El Fotosistema II esta formado por las siguientes molculas (Fig. 10 - 15).
Centro de Reaccin P S 2.
Luz
f
2H
f f
+
f f f ANTENA
CLOROFILA
6 8 0 nm
P680
CAROTENOIDES
Clorofila s/Mg
Fotn = PLASTOQUINONA Q A
D1 D2
QB H 2
LIBRE
FEOFITINA
P680
Tyr Z 33 Mn
Mn 23
4 X 2H O
2
Complejo Disruptor del H 2 O

4 H + + O2
Fig 10 - 10. Fotosistema II
a) El sistema P680 esta formado por dos Clorofilas que absorben luz a 680 nm y que se encuentran unidas a los polipptidos D1 y D2.. Su funcin es actuar como donadores primarios de electrones. b) La Feofitina formada por una Clorofila sin Mg y cuya funcin es aceptar el electrn del P680. c) La Plastoquinona QA o Quinona unida a una protena que acta como aceptor primario de electrones desde la Feofitina. d) La Plastoquinona QB o Quinona libre que acta como aceptor secundario de electrones desde la Plastoquinona QA. Esta Quinona es capaz de difundir libremente entre los complejos proteicos despus de ser reducida a diferencia de la QA que es fija. e) El sistema oxidante del agua con sus 4 tomos de Mn. f) El factor Z con los polipptidos D1 y D2 que aportan un residuo de Tyr y que actan como un conjunto donador secundario de electrones para restituir el electrn del P680. El Complejo Fotosinttico II funciona de la siguiente manera:
441
Los fotones excitan a las molculas de Clorofila de la antena y la energa de excitacin es transferida en este embudo desde una molcula de Clorofila a otra (Fig. 10-13), hasta alcanzar al complejo donador primario de electrones o P680 representado en las figuras 1113 y 12-13. Este centro de reaccin es parte del fotosistema PS II y se encuentra formado por un par de molculas de Clorofila. Al ser excitado el sistema P680, transfiere un electrn en 1012 seg. a una molcula adyacente de Feofitina (Clorofila sin Mg) y adquiere de esta manera carga positiva al quedar como catin P680+. Ahora el electrn pasa desde la Feofitina a la Plastoquinona o Quinona A en 200 x 10-12 seg. y posteriormente en una forma ms lenta, en 200 x 10-6 seg. pasa a la Quinona B que se encuentra libre. Cuando la Quinona B est doblemente reducida, difunde libremente hacia el Complejo b6-f donando sus electrones al Ciclo Q. Desde el Complejo b6-f los electrones pasan a una pequea protena denominada Plastocianina y desde all se dirigen al Fotosistema I.
Secuencia de Polarizacin del Fotosistema II .
QB
Energa Radiante
QB Q
A
QB Q
A
QB Q
A
Feo P 680* Z
Los Fotones exitan
al sistema P
680
Feo P Z
FACTOR Z PEPTIDO
Feo P680 Z
Feo P Z
Mxima separacin de las cargas
680
P 680*
Feo
( DONADOR PRIMARIO ( ( CLOROFILA SIN MAGNESIO )
A ( PLASTOQUINONA )
( QUINONA LIBRE )
QB
Fig. 11 - 10. Polarizacin del Fotosistema II.
El sistema P680 oxidado al quedar con carga + recupera su electrn por medio de un polipptido D1 cuyo residuo de Tyr denominado factor Z permanece como Tyr Z+ despus de donar su electrn. Esta polarizacin o separacin mxima de cargas en el PS II, se traduce en una capacidad oxidativa de tal magnitud que es capaz de extraer en forma secuencial 4 electrones desde los
442
4 tomos de Mn que se encuentran asociados a las protenas del PS II y que estn involucradas en la oxidacin del agua.
Este ltimo sistema posee 5 etapas independientes y se le denomina reloj oxidante (Fig. 13 10). Este reloj proporciona electrones a las Clorofilas ubicadas en el l centro de reaccin del Fotosistema II (P680).
a) 4P
+
4H
2 Q + 4 Fotones
4 P + + 0
4P
4 P
+ 680
2QH
B + 4Z 2 +
680
DONADOR PRIMARIO
+ 4 Z +
680
680 +4 4 Z + [ Complejo con M n ] 0 +2 H O

2
[ Complejo con M n ] +4
+ + 4H + O
2
[ Complejo con M n ]
2 H2 O + Q B +
4 Fotones
2 QH B
procedente de la antena
b)
Complejo Disruptor del Agua +4 2 H

2
Energa Fotnica f
4Z _ e
+ 4P 680 Q B H
2
4H
[ Complejo con Mn ]
0 4Z
+ _ e 4P 680 Q B
Paso de 4 O 2
en forma individual
Fig 12a - 10. Polarizacin del Fotosistema II junto al paso secuencial de los 4 electrones producto de la ruptura del agua. Fig 12b - 10. Visin similar del mismo proceso.
Cuando el P680 recibe un fotn el reloj avanza un estado S o en una etapa de oxidacin dinmica de sus tomos de Mn. Los que son capaces de liberar un electrn por etapa, excepto en la etapa S4 en cuyo estado de oxidacin, se libera espontneamente una molcula de Oxgeno para luego volver luego al estado So completando un ciclo.
443
Reloj Oxidante del Agua .
P680
e e O 2
e e
2 H2 O
+ 2H e
S4
So
H e
S3
+ H e
S1 S2
e
Fig. 13 - 10. Reloj que indica como el complejo Mn -proteico libera secuencialmente 4 electrones para oxidar el agua.
Volver al inicio
444
b) CITOCROMO b6/f El Complejo del Citocromo b6/f, (Fig. 14 - 10) se encuentra a medio camino de la cadena de transporte de electrones entre el sistema P680 y el P700. Esta formado por varios polipptidos transportadores de electrones codificados por el ncleo y el cloroplasto. El polipptido que se une a la Quinona recibe de esta protones y electrones, donando los electrones al siguiente transportador y liberando los protones a travs de la membrana mediante el Ciclo Q, descrito previamente en las mitocondrias. En este complejo se encuentran el Citocromo b563, una protena de Rieske Fe-S y el Citocromo c552. El flujo de electrones viene desde la Quinona reducida QB H2 que participa en el ciclo Q, pasa al citocromo b6/f y se dirige desde aqu a la Plastocianina. La entrada de protones al espacio intratilacoidal o lumen ocurre mediante el Ciclo Q que provoca una diferencia de pH de 3,5, ya que el Estroma tiene un pH de 8 y el espacio intratilacoidal de 4,5.
Citocromo b6/f
+
LUMEN O ESPACIO INTRATILACOIDAL
Rieske Fe S
Polipptido Quinona
+ H
C i t. b6
C i t. f
Ferredoxina Nucletido Reductasa
TILACOIDES
Ciclo Q
ESTROMA
+ H
BOMBEO DE PROTONES
Fig. 14 - 10. Citocromo b6/f con Ciclo Q que bombea protones al espacio intratilacoidal y que pasa electrones entre el PS II y PS I.
Volver al inicio
445
c) FOTOSISTEMA I. En forma similar a la anterior el Fotosistema I, (Fig. 15 - 10) atrapa luz mediante los pigmentos de la antena, Clorofila a y b ms los Carotenoides, para canalizar esta energa al centro de reaccin formado por las dos Clorofilas. Estas se encuentran unidas a un dmero proteico con subunidades A y B que atraviesa la membrana y constituye el centro P700.Este sistema pierde un electrn hacia un aceptor Ao, conocido por ser una forma especial de Clorofila como es la Feofitina del Fotosistema II, quedando ahora como P700+ y Ao-.
Centro de Reaccin PS I Luz

70 0 nm
f
2H
f f
+
f f NADP f ANTENA
CLOROFILA
CAROTENOIDES NADPH + H P 700

: Clorofila s/Mg
o FEOFITINA Ferredoxina 4 Fe - 4 S 4 Fe - 4 S e FILOQUINONA e f B FERREDOXINA REDUCTASA Fotn = f
PLASTOCIANINA f
Fig 15 - 10. Fotosistema PS I encargado de excitar los electrones nuevamente para formar NADPH.
El compuesto Ao- es un fuerte reductor que pasa los electrones a la Filoquinona y luego desde all a la protena Fe-S que su vez los pasa a la Ferredoxina (tambin es una protena Fe-S). El ltimo aceptor de electrones es la Ferredoxina-NADP Reductasa que transfiere electrones desde la Ferredoxina reducida al NADP para quedar finalmente como NADPH + H+. A continuacin se produce la polarizacin del Fotosistema I y de forma similar al caso anterior el P680+, se restaura con un electrn de la Plastocianina, protena que contiene Cu y que se encuentra en la cadena en una posicin previa al Fotosistema I.
Volver al inicio
446
d) ATP SINTASA
H+
ADP + P ATP
ESTROMA ATP SINTASA

II III III IV III II
CF1 MEMBRANA CFo TILACOIDAL 2 H+ LUMEN
2H2O Mn PSII
+ O2 + 4H Q H2 Cyt b / f Q 2 H+ NADP
6
Pc PS I Fd NADPH + + H
LUZ
LUZ
Fig 16 - 10. Destino de los protones provenientes de la ruptura del agua y los aportados por el Ciclo Q en la sntesis de ATP.
Este sistema funciona bsicamente de la misma forma que en las mitocondrias y se encuentra impulsado por un gradiente de protones que existe en ambos lados de la membrana tilacoides (Fig. 16 - 10). El gradiente se encuentra formado por los protones importados desde el Estroma por el Ciclo Q ms la ruptura del agua que ocurre en el lado luminal. La salida de los protones hacia el estroma se realiza por medio del canal inico CFo asociado a la enzima CF1. Entre ambos constituyen la ATP Sintasa. El paso de estos protones provoca a su vez en la parte CF1 cambios conformacionales que varan la afinidad de la enzima por el ADP, Pi y el ATP. La reaccin necesita de Mg. La parte CF1 consta de 3 subunidades que se encuentran intercaladas con 3 subunidades , ms las subunidades , y (Fig. 16 - 10). A su vez las subunidades y constituyen el sitio activo que junto a la subunidad estn codificadas por el genoma del Cloroplasto. El canal inico o parte Cfo de la enzima comprende a las subunidades I, III y IV que tambin se encuentran codificadas por el genoma del Cloroplasto, mientras que las subunidades , y II se encuentran codificadas por el ncleo. En la Figura 16 - 10, se puede apreciar la disposicin de los dos Fotosistemas, el citocromo b6/f y la ATP sintasa. Los protones se acumulan en el espacio intratilacoidal bombeados por el Ciclo Q del Citocromo b6/f y salen por medio de la ATP Sintasa que aprovecha la energa del gradiente de carga y concentracin para la sntesis de ATP.
447
Volver al inicio
448
5) FIJACION DEL CO2. Solo el 1% del total de la energa radiante que alcanza la Tierra es aprovechada por las plantas para generar biomasa. La eficiencia con que se fija el CO2 puede variar entre ellas, as tenemos que se aproxima al 2% en las plantas conocidas como C4 y en otras conocidas como C3 ni siquiera se alcanza el 1%. Las plantas como organismos dependientes de la luz tienen un metabolismo que procede en dos etapas, la primera consta de una serie de reacciones ya descritas que constituyen la etapa clara que arroja como productos fotosintticos ATP, NADPH y O2 por la ruptura del agua. La etapa oscura en cambio, consta de reacciones de fijacin de CO2 y sntesis de hidratos de carbono (Fig. 17 - 10). Durante la fijacin del CO2, se ha determinado que algunas plantas mantenidas en un invernadero, donde se acumula el CO2, experimentan un inusitado desarrollo (plantas denominadas C3) y que otras en similares condiciones no experimentan beneficio alguno (plantas denominadas C4). Esta diferencia se debe principalmente a la forma como ambos tipos fijan el CO2. En general entre las plantas existen tres estrategias distintas de fijacin: a) Las C3, se encuentran en los climas templados con temperaturas inferiores a 30oC y se denominan as por el compuesto de tres tomos de carbono que se genera al fijar el CO2 durante el da. b) Las C4, pertenecientes a climas tropicales o subtropicales, con temperaturas superiores a los 30oC y que fijan el CO2 mediante la formacin de un compuesto de cuatro tomos de carbono durante el da. c) Las CAM ( Crassulacean Acid Metabolism) por Metabolismo cido de la Crasulaceas. Estas plantas se encuentran en climas desrticos y para no perder agua por los estomas proceden a abrirlos solo por la noche para fijar el CO2 mediante la formacin de un compuesto de cuatro tomos de carbono. Este ltimo se almacena hasta el da siguiente donde se procede a incorporarlo.
CITOPLASMA
CLOROPLASTO
LUZ ETAPA CLARA ETAPA OSCURA
CICLO DE CALVIN Y BENSON H2O 1/2 O2 NADPH Cyt b6/f NADP ADP ATP
FOSFOFRUCTO QUINASA RUBISCO CICLO DE REDUCCION FOTOSINTETICA GLICERALDEHIDO 3 P DEL CARBONO ALMIDON DESHIDROGENASA TRIOSA ATP CO 2
NADPH
FOSFATO FRUCTOSA 1,6 BIFOSFATASA

SUCROSA
Fig 17 - 10. Esquema simplificado de la etapa clara y oscura en el Cloroplasto.
449
Volver al inicio 6) FIJACIN DEL CO2 EN PLANTAS C3. Las plantas C3 son las ms comunes y se encuentran presentes en todos los climas templados e incluyen al tomate, trigo, cebada, remolacha, papa, tabaco, espinaca, girasol, etc. En general desde las bacterias fotosintticas, las algas azules o cianofceas, los musgos y helechos hasta todos los rboles, incluyendo las conferas, pertenecen a este grupo. Para la fijacin del CO2 todas las plantas C3, C4 y CAM, poseen el Ciclo de Reduccin Fotosinttica del Carbono (RFC) o Ciclo de Calvin y Benson (Fig. 18 - 14). En este Ciclo el CO2 se integra a una molcula de 5 carbones para luego formar dos molculas de tres carbones o triosas fosfato (C3), a continuacin estas son nuevamente fosforiladas y enseguida reducidas por los productos de la etapa clara de la fotosntesis (ATP y NADPH). De esta forma el destino final del CO2 puede consistir en: a) ser reciclado como el metabolito aceptor de CO2, la Ribulosa-1,5-Bifosfato de 5 carbones en el Estroma. b) ser destinado a la sntesis de Almidn en el Estroma del Cloroplasto. c) ser exportado para la sntesis de Sacarosa en el citoplasma. La enzima que cataliza la fijacin del CO2 se llama Ribulosa -1,5-Bifosfato Carboxilasa y puede ser tambin abreviada con el nombre de Rubisco. La estructura celular de las hojas en una planta C3 difiere notablemente de las plantas tipo C4 como se aprecia en las Figuras 18 - 10 y 24 - 10. En un corte transversal de la hoja perteneciente a una planta C3 se observa en la parte superior de ella la cutcula y parte de su epidermis donde se encuentran intercalados los
CORTE TRANSVERSAL DE UNA HOJA EN UNA PLANTA C 3

EPIDERMIS SUPERIOR ESTOMA CUTICULA
CELULAS EN EMPALIZADA
CELULAS ESPONJOSAS MESO VASOS DEL FLOEMA FILO Y XILEMA
TEJIDO LAGUNAR
EPIDERMIS INFERIOR
ESTOMA
Trigo
Fig. 18 - 10. Estructura de la hoja en plantas C3.
450
estomas que permiten la entrada del CO2. Desde aqu el CO2 difunde hacia el Mesfilo con su tejido en empalizada alcanzando el tejido esponjoso donde todos los Cloroplastos poseen la enzima Rubisco para fijar el CO2. Finalmente hacia el centro se encuentra el haz vascular que rodea a los vasos del floema y xilema por donde se transporta la savia. De esta manera en todos los Cloroplastos de las plantas C3 se lleva a cabo el Ciclo de Calvin y Benson o Ciclo Fotosinttico Reductor para fijar el CO2. Este ciclo se puede dividir en tres eventos (Fig. 19 - 10) que son: a) Fijacin de CO2 o Carboxilacin b) Reduccin con NADPH c) Regeneracin
BALANCE DEL CICLO DE CALVIN .
2X3
CO + 2
H O 2
2X3
Ribulosa - 1,5 - Bifosfato
2X6
FIJACION
3 - Fosfoglicerato
2 x 3 ADP 2 x 3 ATP
2 x 6 ATP 2 x 6 ADP
1 , 3 - Bifosfoglicerato
2X6
REDUCCION REGENE RACION
2X3
Ribulosa - 5 - Fosfato
2 x 6 ( NADPH + H ) 2 x 6 ( NADP + Pi )
2 X 3 Pi
2X6 2X5
2X1
Glucosa
Fig. 19 - 10. En el Ciclo de Calvin y Benson por cada tres molculas de CO2 se sintetiza una Triosa fosfato y se consumen 9 ATPs y 6 NADPH.
Volver al inicio
451
7) RUBISCO a) Fijacin de CO2 o Carboxilacin La enzima fijadora de CO2 denominada RuBisCO, es la enzima que se encuentra en mayor cantidad en la naturaleza. Esta enzima cataliza la unin del CO2 a compuestos de cinco carbonos como la Ribulosa-1,5-Bifosfato, para formar luego dos molculas de tres carbones o 3-Fosfoglicerato (Fig. 20a - 10). La enzima tiene 8 subunidades catalticas grande y 8 subunidades reguladoras pequeas (Fig. 20b - 10). Cada subunidad grande tiene 475 aas. y un PM de 50kD. A su vez se encuentran codificadas por una sola copia del gen rbc L por genoma del Cloroplasto. Las 8 subunidades reguladoras pequeas tienen 120 aas. cada una y un PM de 15kD. La subunidad pequea se encuentra codificada por una familia de genes rbc S que se encuentran presentes en el genoma nuclear. Las dos subunidades se pliegan y asocian en el Cloroplasto con ayuda de Chaperoninas y Cochaperoninas, para formar dos capas con un total de 16 subunidades denominadas L8S8 holoenzima. El sitio activo esta formado por residuos del lado Ct de una subunidad L y los residuos del lado Nt en la siguiente subunidad L. La enzima recin aislada tiene una Km para el CO2 que se encuentra entre 18 y 20 microMolar. Su sntesis es activada por las condiciones de luz y su actividad por conocidos
RuBisCO
Ribulosa - 1,5 - Bifosfato + CO
a)
CH C 2 O O
2
O
2 ( 3 - Fosfoglicerato )
O P O O
2
OOC O H
CH C
2 OH
P O
3
Cetocido
Enediol Intermediario
C H C CH 2 O H O H O O C C CH O O H O O P O O
P O
C O 2
H O 2 + O
O H CH C H H 2 O O P O O CH OOC HO H C O OH O
5
O CH OOC C OH + P O CH 2 OH O P O O 2 O O OOC C
P O
C C CH
O H O H O
Ribulosa - 1, 5 - Bi - P
O P O O
1
L S 8 8
C C CH 2
O O H O O P O
4
O
Carbanion
O H C C CH 2 O O H O O P
3 - P - Glicerato
b) Rubisco
S
Intermediario
O
L
S
L L
S S
Hidratado
3 - P - Glicerato
Desde arriba
vista lateral
Fig 20a - 10. Fijacin del CO2 y transformacin en dos Triosas Fosfato. Fig 20b - 10. La enzima Rubisco
452
modificadores alostricos como: NADPH, 6- Fosfogluconato, Fructosa-1,6-bifosfato junto a un pH y concentracin de MgCl2 adecuados. El CO2 fuera de ser uno de los substratos, es tambin considerado un activador de esta enzima. En presencia de CO2, como se observa en la Figura 20a - 10, la Rubisco cataliza la unin del CO2 a la forma enedilica (2) de la Ribulosa-1,5-Bifosfato (1) para formar un BetaCetocido (3). Este se hidrata en un compuesto de seis carbones de carcter inestable (4) que se hidroliza en dos molculas de c. 3-Fosfoglicrico (5) (Fig. 20a - 10). Una de las curiosidades que presenta esta enzima consiste en su afinidad por O2, ya que pudo haber evolucionado qumicamente cuando los niveles de Oxgeno en la Tierra eran muy bajos y esta molcula no interfera, (Fig. 21 - 10). Esta propiedad no le confiere ninguna ventaja evolutiva y se comporta en la realidad como una Ribulosa Bifosfato Carboxilasa/Oxigenasa en 1/3 de su catlisis normal. La actividad Oxigenasa es Dismutsica, debido a que le permite romper a la Ribulosa-1,5Bifosfato en 3-Fofogliceraldehido de tres carbones y en Fosfoglicolato de dos carbones, es decir forma dos productos desiguales (Fig. 5 - 10). Al mismo tiempo se inicia aqu una serie de reacciones que culminan en un Ciclo diferente al de Calvin y que se denomina Ciclo Fotorespiratorio Glicolato, ya que emplea al compuesto denominado c.Gliclico que cuenta con dos carbones. Esta anomala supuestamente favoreci la evolucin de las plantas C4, consideradas de orgenes ms recientes. En ellas el CO2 se concentra primero disminuyendo la posibilidad de entrada del O2 y posteriormente se le transporta a la enzima fijadora Rubisco. En la Tabla 1 - 10 y la Figura 21 - 10 se puede apreciar como vara la afinidad de la enzima por las concentraciones de CO2 y O2 en una solucin que se encuentra en equilibrio con la atmsfera. Si la concentracin de CO2 es de 10 uMolar ( micromolar), la enzima se encuentra saturada en un 25% con solo 20 micromolar de CO2. Al mismo tiempo con 250 uMolar de O2, la enzima se encontrar competitivamente saturada por sobre el 50%. De esta manera se puede apreciar claramente la interferencia provocada por el Oxgeno ante la fijacin del CO2. TABLA 1 - 10 10 microMolar Conc. de CO2 en una solucin en equilibrio con la atmsfera 250 microMolar Conc. de O2 en una solucin en equilibrio con la atmsfera 20 microMolar Km para el CO2
Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa
Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa/Oxigenasa
200 microMolar Km para el O2
453
% Sat. 50 %
Km
10
20
[CO ] 2
% Sat. 50 %
200
[ O ] 2
M
250
Fig 21 - 10. Curvas de saturacin para la afinidad de la Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa-Oxigenasa por CO2 y O2.
Volver al inicio b) Reduccin con NADPH. Al continuar nuevamente con el Ciclo de Calvin y Benson se observa que el 1,3-DifosfoGlicerato es reducido mediante NADPH + H por las Isoenzimas de la Gliclisis en el Estroma para formar el 3-Fosfogliceraldehdo (Fig. 22 - 10) En el primer paso la enzima 3-Fosfglicerato Kinasa cataliza el paso del Gama- Fosfato del ATP al 3-Fosfoglicerato para ganar energa en el 1,3-Difosfoglicerato y a continuacin en un segundo paso la enzima 3-Fosfogliceraldehdo Deshidrogenasa reduce empleando NADPH + H y la energa del paso previo, para as formar el 3-Fosfo-gliceraldehido. Este ltimo se emplea nuevamente para sintetizar Ribulosa, (Fig. 22 - 10). Este ciclo sera del tipo cumulativo si solo se formaran sucesivas molculas de Ribulosa destinadas a captar un mayor nmero de molculas de CO2, sin embargo esto no ocurre, ya que el 3-Fosfogliceraldehdo dedica alguna de sus molculas a vas alternativas como son la fabricacin de Almidn en el Estroma y de Sucrosa en el Citoplasma. El 3-Fosfogliceraldehdo que sale del Ciclo, (Fig. 21 - 10) es tomado por la Triosa Fosfato Isomerasa para formar la Fosfo-Dihidroxicetona que junto a otra molcula de 3-
454
Fosfogliceraldehdo y la accin de la Aldolasa formar la Fructosa-1,6-Bifosfato. Esta ltima molcula mediante la enzima Fructosa-1,6-Bifosfatasa formar la Fructosa-6-Fosfato que ser destinada a la sntesis de Almidn por las enzimas del Estroma. La Fosfo-dihidroxicetona puede tambin dejar el Cloroplasto y pasar al citoplasma mediante un antiporter, que por medio de otras isoenzimas del tipo isomerasa y aldolasa, formar Fructosa-6-Fosfato que se dirigir a la sntesis de Sucrosa. Volver al inicio c) Regeneracin. En esta etapa se construye nuevamente una molcula de Ribulosa destinada a fijar nuevamente el CO2 y se emplean varios intermediarios que van de tres a siete carbones (Fig. 22 - 10). El 3-Fosfogliceraldehdo se une a la Fosfodihidroxicetona en una reaccin catalizada por la Aldolasa para formar la Fructosa-1,6-difosfato que a continuacin por medio de la Fructosa1,6-bifosfatasa da origen a la Fructosa-6-Fosfato. Esta ltima por medio de la enzima Transcetolasa, se rompe en Eritrosa-4-Fosfato y el Glicoaldehdo-Tiamina Pirofosfato que se encuentra en el sitio activo de la enzima. A continuacin la Eritrosa-4-Fosfato junto a la Fosfodihidroxicetona se unen para dar origen a la Sedoheptulosa-1,7-difosfato de siete carbones. Esta molcula por accin de la Sedoheptulosa-1,7-difosfatasa produce la
C O OP COO H C OH CH OP 2 C O C C C C H OH OH OH CH OP 2
ATP
NADPH
3 P - Gliceraldehido
CHO H C OH
OH
CO
CH OP 2
3 - P - Glicerato
HO
1,3 D i - P Glicerato
CH OH 2 C O CH OP 2
CH OP 2
CH OP 2 C O H H C C OH OH
H H H
CH OP 2 C HO H H C C C O H OH OH
CH OP 2
P - D i - OH Cetona
CHO H H C C OH OH
CH OP 2
Sedoheptulosa -1,7 B i P Pi
CH OH 2 C HO H H H CHO H H H C C C OH OH OH CH OH 2 C HO H C C H OH O CH OP 2 C C C C H OH OH OH O
Ribulosa - 1,5 - Bi P ATP

CH OH 2 C H H C C O OH OH
CH OP 2
Fructosa - 1,6 - Bi P Pi
CH OH 2 C HO C C C O H OH OH
CH OP 2
Eritrosa - 4 P
CH OP 2
Ribulosa - 5 P
Sedoheptulosa - 7 P
H CH OH 2 C O T H
CH OP 2
CH OP 2
Fructosa - 6 P
Ribosa - 5 P
C H 2O P
Xilulosa - 5 - P
ALMIDON
Fig. 22 - 10. La regeneracin de la Ribulosa requiere de complejas reacciones que incluyen intermediarios que van de tres a siete carbones.
455
Sedoheptulosa-7-Fosfato. La enzima Transcetolasa rompe la molcula de Sedoheptulosa-7Fosfato para dar Ribosa-5-Fosfato y nuevamente Glicoaldehdo-Tiamina Pirofosfato unido a la enzima. Ambos Glicoaldehdo-Tiamina Pirofosfato, el anterior y el recin formado son transferidos desde sus distintas enzimas al Gliceraldehido-Fosfato para formar Xilulosa-5Fosfato por medio de la Transcetolasa. Desde aqu en adelante, la Xilulosa-5-Fosfato y la Ribosa-5-Fosfato por medio de las enzimas Ribulosa-5-Fosfato Isomerasa y la Ribosa-5-Fosfato Epimerasa se transforman respectivamente en Ribulosa-5-Fosfato, que por accin de la Ribulosa-5-Fosfato Quinasa y ATP producen finalmente la Ribulosa-1,5-Difosfato. Como se puede observar el Ciclo es endergnico y requiere de ATP para ser llevado a cabo, especialmente en las reacciones de 3-Fosfoglicerato a 1,3-Difosfoglicerato, antes de la etapa de reduccin y en el paso de Ribulosa-5-Fosfato a Ribulosa-1,5-Bifosfato, para activar la molcula de Ribulosa de tal manera que la unin del CO2 y la ruptura en dos molculas de tres carbonos sea exergnica. En general se necesitan aqu tres molculas de ATP para fijar una de CO2. Volver al inicio 8) FOTO RESPIRACIN El proceso denominado Fotorespiracin, (Fig. 23 - 10) ocurre en las plantas C3, y se produce con desprendimiento de CO2 y absorcin de O2 en condiciones de elevada temperatura ambiental, alta presin parcial de O2 y baja presin parcial de CO2. El producto de la Fotorrespiracin es el Fosfoglicolato, que no es de utilidad a la clula y por consiguiente al mantener en existencia estos dos carbonos implica un gasto de dos ATPs extras por molcula de CO2.
456
CLOROPLASTO
Ribulosa - 1,5 - Bifosfato + O 2 P - Glicolato Glicolato
O
PEROXISOMA
FOTORESPIRACION
Glicolato
O
MITOCONDRIA
Fosfoglicolato 3 - Fosfoglicerato + Glioxilato Glicina Glicina

H Glu O
2
O
CH C 2 O O H O H O H 2 O P O O
2
CH 2
O HO 2 P2 2 O O
O
H H
O2
C CH
Forma Enedilica
O P O
CHOP CH O HH -O-O C O H CH OH 2 2 2 O H H COO COO CCO O Pi

H O C CH O H 2 O
CG + CH O N 2H 3
C
O P O O CHN 2 C
HO H 3 2
CHO
OH
C H2 COO
CH
COO
O
O H P P - Glicolato
O H
O P O
COO
Ac. Gliclico
CICLO Ribulosa de -1,5 - di P

2
3-PGlice rato
O
+
H H C C O O P O O
NAD NADH + H
O H O
Intermediario en el sitio activo
CALVIN CH P O
C C C O O H O
CH 2
C O2
ADP
H H
Ribulosa - 1, 5 - Bi - P
O P O
ATP
2
CH OH 2
O
CH OH 2 CH OH COO NAD Glicerato
O H O
NH CH OH 3 2 Gliceraldehido - 3 - P HOH C CH C O
+ 3
NH
NH 3
CH
CH OH COO NADH + H COO
COO
HOH C CH 2
COO
Fig. 23 - 10. Tan solo uno de los productos deHidroxipiruvato la actividad dismutsica de la Ribulosa1,5-Bifosfato Carboxilasa puede entrar al Ciclo de Calvin (3-Fosfogliceraldehdo) Fig. 24 - 14. El Ciclo Fotorespiratorio Glicolato demanda gasto extra de ATP a la clula y no es beneficioso. Se consume O2 y se libera CO2, pero no hay formacin de ATP.
Glicerato
Serina
Serina
Volver al inicio 9) CICLO GLICOLATO
La foto respiracin se produce en tres compartimentos de las clulas de las hojas verdes, el Cloroplasto, la Mitocondria y el Peroxisoma (Fig. 24 - 10). El Fosfoglicolato, se produce en el Cloroplasto como producto de la interaccin con el Oxgeno de la Ribulosa-1,5-Bifosfato. Este se defosforila y es transportado al peroxisoma como Glicolato donde por medio de una oxidacin directa con Oxgeno forma el Glioxilato y Perxido de Hidrgeno. El Glioxilato transamina luego con el c. Glutmico para formar Glicina, la que viaja a la Mitocondria, donde por cada 2 molculas de Glicina se formar una de CO2 que va a la atmsfera y otra molcula de Serina. A continuacin los tres carbones de la Serina son reenviados al Cloroplasto va Peroxisoma y entran nuevamente al Ciclo de Calvin como Glicerato despus de fosforilarce a 3-Fosfoglicerato.
457
Volver al inicio
9) PLANTAS DEL TIPO C4. El mecanismo denominado C4 ocurre en plantas de las zonas tropicales y semitropicales como la caa de azcar y el maz, que presentan un crecimiento agresivo en condiciones de alta intensidad lumnica y temperaturas superiores a 30oC. La estructura de la hoja se aprecia en la figura 25-10.
CORTE TRANSVERSAL DE UNA HOJA DE UNA PLANTA C 4 ESTOMA
MAIZ
SUPERFICIE
CORONA EXTERNA CUBIERTA CORONA INTERNA PERIVASCULAR
VASOS
EPIDERMIS INFERIOR
ESTOMA
Fig. 25 - 10. Estructura de las hojas en plantas C4.
Las plantas C4 evolucionaron por ser ms eficientes que las C3, ya que la enzima Rubisco a altas temperaturas disminuye la afinidad por el CO2 y acta como Oxigenasa y no como Carboxilasa, predominando en ellas la foto respiracin lo que implica un mayor gasto de ATP. La fijacin ocurre en este caso de manera concntrica hacia el interior. El CO2 se fija a un compuesto de tres carbones en el citoplasma de la clula Mesfila para generar otro de cuatro. Estas clulas contienen mitocondrias que no poseen la enzima Rubisco (Fig. 26 - 10). A continuacin el compuesto portador del CO2 o C4 pasa a las clulas de la Vaina Vascular o Cubierta Perivascular (parte central que rodea los vasos transportadores) que s poseen Cloroplastos con la enzima Rubisco. En este lugar se libera el CO2 para que sea tomado por la enzima y lo incorpore al Ciclo de Calvin. Posteriormente el compuesto de tres carbones que resta de esta entrega, vuelve desde las clulas de la Vaina Vascular al Mesfilo para ser carboxilado nuevamente por ms CO2 y
458
continuar de esta manera con su transporte cclico. Este sistema se denomina Ciclo de Hatch y Slack.
SUPERFICIE DE LA HOJA Malato Deshidro genasa HO MESOFILO VAINA VASCULAR VASOS
COO CO 2 FOSFO ENOL PIRUVA TO CAR BOXILASA CH 2 CH 2 COO Ac. OXALO ACETICO
COO H C CH COO
COO HO C H CH COO Ac. MALICO Enzima Malica CO 2
CICLO DE CALVIN
Ac. MALICO Piruvato Fosfato Dikinasa O CH3 C O COO PIRUVATO
HCO 3
CH H C
2 O
O P
CH 3 C O COO PIRUVATO
Rubisco
COO O FOSFO PIRUVATO
Organizacin funcional de las clulas mesfilas y perivasculares para concentrar y luego fijar el CO2.
Fig 26 - 10. Las Clulas del Mesfilo se conectan a la Vaina Vascular por medio de las membranas celulares para entregar Malato y recuperar Piruvato.
La Rubisco recibe de manera localizada el CO2, para que lo integre al Ciclo de Calvin y posteriormente a la sntesis de Almidn. El transporte y la incorporacin son simultneos durante el da en la plantas C4. En las plantas C3 se encuentra solo Mesfilo generalizado y no poseen la capa de Vaina Vascular concentradora de la accin. Sin embargo, por cada CO2 que se fije en las C4, se requieren dos ATPs extras comparados a los tres ATPs necesarios empleados por las C3. Esto indica que se requerir un total de cinco ATPs por cada molcula de CO2 que se fije por este mecanismo, lo que significa desde un punto de vista energtico que a las plantas C4 les es ms caro fijar el CO2 en comparacin a las C3. Este hecho no presenta un mayor problema en las zonas tropicales con exceso de luz y calor o durante el verano cuando las C4 sobrepasan en crecimiento a las C3. Todos los mecanismos anteriores permiten un aumento de 10 a 60 veces en la concentracin de CO2, al comparar los mismos tejidos con las plantas C3 y un incremento de dos a tres veces en la eficiencia de los cultivos. Volver al inicio 11) VARIEDAD EN LOS MECANISMOS DE DESCARBOXILACION.
459
Existen cerca de tres mecanismos distintos para la Descarboxilacin en la celulas de la Vaina Vascular en las plantas C4 y cada uno de ellos se distingue por el nombre de la enzima que lleva a cabo esta accin. El primero de ellos se denomina ME-NADP+(Malic Enzyme-NADP), con la Enzima Mlica-NADP dependiente (Fig. 27 - 10). En otro tipo de plantas se llama mecanismo de la enzima Fosfoenol-Piruvato Carboxilasa (Fig. 28 - 10) y por ltimo el mecanismo tipo ME-NAD (Malic Enzyme-NAD) con la enzima Mlica-NAD dependiente (Fig. 29 - 10).
SUPERFICIE DE LA HOJA Malato Deshidrogenasa

HO
MESOFILO
VAINA VASCULAR
VASOS
CO 2
COO
FOSFO HCO 3 ENOL PIRUVA TO CAR BOXILASA
COO C H 2 NADPH + H O H C CH 2 CH COO COO NADP Ac. OXALO Ac. MALICO ACETICO
COO C H CH COO
CICLO DE CALVIN NADP NADPH + CO 2 RUBISCO Ribulosa 1, Bifosfato 3 - Fosfo Glicerato
Ac. MALICO
CH H C
2 O
O P O
Piruvato Fosfato Dikinasa

O
Enzima Mlica NADP Dependiente

CH 3 O C O
ATP
CH C
COO FOSFO - ENOL PIRUVATO
COO PIRUVATO
COO
AMP + PPi
PIRUVATO
PRODUCTOS
Fig. 27 - 13. La descarboxilacin es por medio de la Enzima Mlica dependiente de NADP.

SUPERFICIE DE LA HOJA MESOFILO VAINA VASCULAR VASOS
CO 2
CICLO DE
Oxalo acetato
HCO 3 FOSFO ENOL PIRUVA TO CAR BOXILASA
Asprtico
Asprtico
Oxalo acetato
CALVIN 3 - Fosfo Glicerato
Fosfoenol Piruvato Carboxilasa
CO 2
RUBISCO
P - Enol Piruvato
Piru vato
Ala
Ala
Piru vato
P - Enol Piruvato
Ribulosa 1,5 Bifosfato
PRODUCTOS
Ala : Alanina
Fig. 28 - 10. La descarboxilacin es por medio de la Fosfoenol Piruvato Carboxiquinasa.
460
SUPERFICIE DE LA HOJA MESOFILO VAINA VASCULAR VASOS
CO 2
CICLO
Oxalo acetato
HC O 3 FOSFO ENOL PIRUVA TO CAR BOXILASA
DE
Asp
Oxalo acetato
CALVIN
Malato
3 - Fosfo Glicerato
Enzima MALICA-NADdependiente
CO 2 Ribulosa 1,5 Bifosfato
P - Enol Piruvato
RUBISCO
Piru vato
Ala
Ala
Piru vato
PRODUCTOS
Fig 29 - 10. En esta descarboxilacin se emplea la enzima Mlica NAD dependiente.
Volver al inicio
12) LAS PLANTAS CAM. Las plantas CAM se denominan as por "Crassulacean Acid Metabolism" o Metabolismo cido de las Crasulceas (Fig. 30 - 10). Estas plantas pertenecen a climas desrticos y para evitar la deshidratacin deben abrir sus estomas durante la noche captando CO2. A continuacin lo almacenan como cido Mlico en vacuolas que al da siguiente lo liberan para ser transportado y posteriormente incorporado al Ciclo de Calvin mediante la enzima denominada Rubisco. Las CAM son plantas del tipo suculento, es decir poseen tejidos destinados a retener agua. As encontramos como exponentes de este mecanismo a la Pia y al Cactus, aunque no relacionadas entre s, poseen el mismo mecanismo metablico para fijar CO2. Cuando lo estomas se encuentran abiertos durante la noche el CO2 se fija por medio de la enzima Fosfoenolpiruvato Carboxilasa al Fosfoenol Piruvato para formar el Ac. Oxaloactico. Este ltimo por accin de la Malato Deshidrogenasa, es luego reducido a cido Mlico, el que se almacena en una vacuola durante la noche para evitar as trastornos de pH. Durante el da se lo libera gradualmente cuando los estomas se encuentran cerrados y no se intercambian gases, ni se pierde agua. Durante esta etapa el c. Mlico difunde desde la vacuola al citoplasma donde s descarboxila por medio de la enzima Mlica NAD o NADP dependiente, pasando a Piruvato. El CO2 liberado por esta reaccin ingresa al Cloroplasto donde es fijado por la Ribulosa-1,5-Bifosfato Carboxilasa entrando al Ciclo de Calvin. El Piruvato que resta de la descarboxilacin del Malato entra a la Mitocondria (Fig. 30-13), donde participa del Ciclo de Krebs que aporta con otra cantidad de CO2, que pasa al Cloroplasto para ser integrado nuevamente al Ciclo de Calvin.
461
Separacin Temporal de los Procesos de Fijacin de CO2 .

NOCHE Estomas abiertos DIA Cierre de los Estomas Sale el Malato de la vacuola Ribulosa - 1,5 Bi - P Carboxilasa Piruvato - P Diquinasa ATP + Pi AMP + PP i FEP
Fosfo Enol Piruvato
Fosfo Enol Piruvato Carboxilasa CO FEP 2 CO
CO 2
HC HC
CO
AOA Malato
CALVIN
Piruvato
Enzima Mlica NAD o NADP dependiente
CLOROPLASTO
CO
Malato VACUOLA El Malato se almacena en la vacuola durante la NOCHE
Piruvato
KREBS
CO
Ac CoA
MITOCONDRIA
Fig. 30 - 10. La fijacin de CO2 mediante la formacin de c. Mlico ocurre solo en la noche. Durante el da el c. Mlico entrega el CO2 al Ciclo de Calvin
Segn el estado energtico del metabolismo de la planta el Piruvato puede ser tomado por la enzima Piruvato Fosfato Diquinasa que lo transforma en Fosfoenolpiruvato y desde all contina hacia la Gluconeognesis (Fig. 30 - 10). Volver al inicio 13) FIJACIN DEL NITROGENO. Algunas plantas son incapaces de fijar el gas Nitrgeno por si mismas y para hacerlo requieren de la cooperacin de microorganismos simbiontes o de la presencia de fertilizantes nitrogenados. En la Figura 31 - 10, se puede apreciar el Ciclo del Nitrgeno, donde este es fijado desde la atmsfera y reducido por las bacterias en Amonio NH4+. El amonio puede pasar a formar parte de organismos superiores, sin embargo las bacterias del suelo durante el proceso de Nitrificacin lo pueden oxidar a Nitrito NO2- (Nitrosomonas) y posteriormente pasarlo a Nitrato por las Nitrobacter. A su vez las plantas pueden asimilar formas inorgnicas de Nitrgeno como Nitrato o Nitrito, que por medio de la Nitrato Reductasa en el citoplasma y la Nitrito Reductasa en el
462
Cloroplasto pueden transformarlo en Amonio. Otras formas orgnicas de nitrgeno como la Urea, tambin pueden ser asimiladas por la planta. En la planta el amonio se incorpora a los cetocidos formando especialmente el aminocido Glutmico y la Glutamina que se emplean como transportadores primarios de nitrgeno junto al Aspartato y la Asparegina. De esta manera se producen todos los aminocidos en la planta que puede ser ingerida por los animales donde se enriquece y multiplica su contenido. Durante el proceso llamado Desnitrificacin, los animales en estado de putrefaccin retornan Amonio al suelo por accin de los microorganismos y este puede nuevamente pasar a Nitrito primero y luego a Nitrato completando el Ciclo.
N2
Bacterias Desnitrificantes
ATMOSFERA
N2
Bacterias fijadoras de Nitrgeno
SUELO
Amino cidos
Plantas Superiores
Animales Superiores Putrefaccin + NH 4
NO 3
Bacterias Nitrificantes Nitrobacter
Bacterias Nitrificantes Nitrosomonas N O2 Nitrito
Fig 31 - 10. Ciclo del Nitrgeno.
Las Leguminosas como el trbol, alfalfa y soya tienen un papel preponderante en la fijacin del Nitrgeno y la bacteria que hace simbiosis con estas plantas pertenece al gnero RHIZOBIUM. Otra de las bacterias que hace simbiosis pertenece al gnero Frankia en los Actinorhizoides, sin embargo su metabolismo no ha sido lo suficientemente estudiado al igual que las cianobacterias del gnero Nostoc. La simbiosis es siempre entre plantas superiores y bacterias o algas azules. La interaccin de las bacterias con la raz ocurre a partir de un intercambio de seales qumicas con la planta que concluye en la fijacin de estas por los pelos radiculares. La infeccin por la bacteria se
463
manifiesta con una hinchazn y un incremento de la corriente citoplasmtica que avanza hasta la base del pelo. A continuacin las bacterias penetran por la rotura del tubo y alcanzan las clulas corticales e inducen la formacin del ndulo. Los ndulos tienen aspecto rosado o rojo pardos debido a la presencia de Leghemoglobina. Una vez en el interior las bacterias estn rodeadas por una membrana peribacterioide y expresan su actividad Nitrogensica dirigida por los genes Nif y se denominan ahora simbiosomas. La fijacin biolgica de Nitrgeno es llevada a cabo por el Complejo de la Nitrogenasa, presente en la bacteria simbionte o simbiosoma (Fig. 32 - 10). A medida que la bacteria entrega Amonio a la planta, esta ltima le entrega Glucosa para su metabolismo. La fijacin del Nitrgeno es extremadamente lbil al O2, ya que uno de sus cofactores Fe-Mo s denatura irreversiblemente con Oxgeno. Por esta causa se necesita de la protena Leghemoglobina que fija el O2 y lo encausa para la Fosforilacin Oxidativa permitiendo la produccin de ATP y sirviendo a la vez como una molcula protectora de los efectos txicos del Oxgeno que ayuda a concentrar el Nitrgeno.
XILEMA
FLOEMA
NODULO DE UNA LEGUMONOSA O

CITOPLASMA VEGETAL
LEGHEMOGLOBINA
O
FOTOSINTATO
BACTEROIDE
Utilizacin CARBOHIDRATOS Mg ADP AMINOACIDOS NITROGENASA Mg ATP
e
Transporte de Electrones
NH
3
H 2O
N2
Fig 32 - 10. Ndulo con bacteroide. Fotosintato corresponde a carbohidratos y aminocidos sintetizados en la hoja de la planta y que son transportados por el xilema a los ndulos de la raz.
A continuacin se aprecia el balance general de la reaccin de reduccin del Nitrgeno:
N2 + 10 H+ + 8 e + 16Mg-ATP ----> 2 NH4+ + 16Mg-ADP + 16 Pi + H2
464
COMPLEJO DE LA NITROGENASA Fijacin del Nitrgeno
16 ATP
+ 2NH 4
reductasa reducida 8 e + 16 ATP Dinitrogenasa oxidada
4 CoA SH + 4 Piruvato
8 Ferredoxina oxidada
8 Dinitrogenasa 8 Dinitrogenasa reductasa reducida
8e
8e
8e
Dinitrogenasa reducida
+ 2H
4 C O2 8 Ferredoxina + reducida 4 Acetil SCoA
8 Dinitrogenasa8 Dinitrogenasa reductasa oxidada reductasa oxidada + 16 ATP
N 2
16 ADP + 16 Pi
Fig. 33 - 10. Complejo de la Nitrogenasa. De los 8 electrones que se emplean, 6 son para la fijacin del Nitrgeno y 2 para reducir los dos H+ a Hidrgeno molecular.
La Cadena de reacciones que desemboca en la reduccin del Nitrgeno se aprecia en la figura 33-10. La Dinitrogenasa Reductasa de PM 60kD, es un dmero con un centro redox Fe4-S4 y se puede oxidar y reducir mediante un electrn a la vez. Se le conoce tambin como homodmero Ferro-proteico codifcado por el gen Nif H del bacterioide. La Dinitrogenasa es de PM 240kD y corresponde a un tetrmero con 2 Mo, 32 Fe y 30 S por tetrmero. Se requieren de 8 electrones para el mecanismo de reduccin, 6 para reducir el Nitrgeno (Fig. 34 10), y 2 para reducir el Hidrgeno. Se le conoce como codificada por los genes Nif D y Nif K del bacterioide. Todos los electrones son pasados de manera individual y secuencialmente en la cadena de reacciones. Los niveles de Oxgeno controlan la expresin de los genes correspondientes a la Nitrogenasa, de esta manera cuando el O2 disminuye en su concentracin en el exterior, se activa un sensor transmembrana el cual fosforila y activa a un factor transcripcional en el interior denominado FixJ. Este ltimo induce la transcripcin de los genes nifA y fixK cuyos productos de transcripcin inducen a su vez la transcripcin de los genes involucrados en la formacin del complejo de la Nitrogenasa (Nif). La regulacin de la actividad Nitrogensica tambin depende de los niveles de Amonio, a bajo nivel se estimula y a alto nivel se inhibe. Otro elemento regulador es tambin la concentracin de ADP donde los altos niveles pueden inhibir la actividad del Complejo.
465
La fijacin del Nitrgeno es bastante exergnica - 8 Kcal/mol de N2
N2 + 3H2 -------> 2NH3
/\Go' = - 8,3 Kcal/mol
Sin embargo, la barrera de energa entre sustratos y producto es alta y en condiciones artificiales se requiere de grandes presiones y temperaturas. En la forma biolgica se precisa de tan solo 16 ATPs por mol de N2 a 1 atm de presin. El ATP tiene aqu dos funciones una termodinmica y la otra cataltica, es decir la unin al ATP aumenta el potencial de xido-reduccin de -280 mV a -490 mV, con lo que se aumenta el poder de reduccin o la entrega de electrones.
2e
N N N H
2H+
2e H N H N N H 2 NH 2 2 3 + 2H+ 2H
2e
Fig. 34 - 10. Los 6 electrones reducen a la molcula de Nitrgeno.
El Amonio producido por el Complejo de la Nitrogenasa se integra a los aminocidos de la planta por aquella reaccin de la Glutmico Deshidrogenasa en que el Ac. Alfa-Cetoglutrico, se amina en presencia de NADPH + H para formar Glutmico. El Ac. Glutmico puede an aminarse nuevamente con ATP y Amonio para producir Glutamina. El Ac. Glutmico o la glutamina pueden transferir a su vez el grupo amonio a otros cetocidos por transaminacin en reacciones similares a las descritas en el captulo de sntesis y degradacin de aminocidos. Otro de los aminocidos encargado del transporte de amonio en la planta es el Asprtico que se forma por aminacin del cido Oxaloactico. El Asprtico tambin puede formar el aminocido Asparegina que se emplea como va alternativa para transportar el amonio a otros lugares en la planta. Entre las bacterias no simbiontes que fijan Nitrgeno se encuentran las Azotobacter, Clostridium, la bacteria fotosinttica Rhodospirillum Rubrum y las Cianobacterias como la Anabaena.
466
Volver al inicio 14) FLUORESCENCIA Los procesos que ocurren en la antena durante la Fotosntesis se pueden ilustrar bajo la siguiente aproximacin:
Existen en la actualidad algunas tcnicas para analizar la organizacin y la funcin del aparato Fotosinttico en plantas y algas, que se pueden emplear tanto en el laboratorio como en el terreno para estudiar una serie de parmetros tiles tales como: la senescencia de la fruta, el efecto de los aceptores de electrones artificiales, el estrs de la planta frente a los herbicidas, el efecto del calor, la falta de agua y la mayor o menor concentracin de CO2 en el aire. Los mtodos que se emplean para conocer la influencia de estos factores sobre la planta hacen uso de la medicin de la Fluorescencia emitida por la hoja, bajo distintas condiciones de luz tanto limitante como saturante. Esta particularidad afecta el nmero de trampas fotoqumicas abiertas, (fig35-14) bajo distintas condiciones de luz dando una idea de la actividad fotosinttica de la planta.
T R A M P A S F O T O Q U IM IC A S E X C IT A C IO N F O T O R E A C C IO N
T R A M P A S F O T O Q U IM IC A S C E R R A D A S E X C IT A C IO N F L U O R E S C E N C IA V IA S D E D IS IP A C IO N N O R A D IA N T E S
Fig. 35 10. Vas por las cuales se aprovecha y/o se libera la energa segn se encuentren las trampas fotoqumicas abiertas o cerradas en la antena.
Cuando un fotn de luz es recibido por una molcula de Clorofila, se promueve un electrn a un nivel superior de energa, esta nueva posicin es inestable por lo tanto se relaja pasando a un nivel de menor energa o estado basal. En este momento se produce la liberacin de la energa absorbida que puede seguir distintos caminos(Fig. 36 - 10), como son: a) la transferencia a una trampa fotoqumica abierta la que conducir al excitn a ser transformado en energa qumica til o fotosntesis. b) la disipacin de la energa en la forma de calor. c) la re-emisin de la energa por medio de la transformacin de la energa incidente en energa radiante de una longitud de onda distinta, como es la fluorescencia.
467
Por lo tanto la mayor o menor Fluorescencia producida por la hoja resulta de la competicin entre las distintas vas por llevarse la energa de excitacin capturada por la antena. Parte de la energa se aprovecha por la va fotosinttica que tiene la constante de velocidad kp y la otra parte se disipa por la va del calor que tiene la constante de velocidad kd. Otra fraccin de energa se pierde por fluorescencia (F%) con la constante de velocidad kf. Esta ltima fraccin se relaciona con las distintas constantes de velocidad de seudo-primer orden y se puede expresar como se observa en la Ecuacin 1:
Ecuacin 1 F% =
kf (fluorescencia) --------------------------------------------------------------------kf(fluorescencia) + kp(fotosntesis) + kd(calor)
De esta forma la Fluorescencia depender de los componentes que se observan en la Ecuacin 2:
Ecuacin 2 ( Fv)mx = Fvariable (fluores. est. estable) + qP (Fv) sat + (fraccin de energa que se disipa en la fotosntesis o trabajo til) + + qN (Fv)mx ( fraccin de energa que se disipa por calor)
En la Ecuacin 2, qP y qN son los denominados quenching o factores de extincin de la energa que corresponde a la Fluorescencia por medio de los procesos que ocurren desde la antena misma hacia el sistema colector N o la Fluorescencia que se extingue desde el sistema colector de la antena hacia la cadena de transporte de electrones P, durante la fotosntesis. Mientras ms expedito sea el flujo de energa hacia el sistema colector de la antena y desde all hacia la fotosntesis, qN y qP sern respectivamente menores.
En la misma Ecuacin 2, (Fv)mx o total corresponde a la Fluorescencia mxima, que es igual a la sumatoria de la fluorescencia variable (Fv) o en estado estable, ms la contribucin que hace la fraccin ( qP (Fv)sat) de la fluorescencia que se disipa durante el trabajo fotosinttico, ms (qN (Fv)mx ) o la fraccin de la fluorescencia que se disipa por calor en la misma antena.
Cualquier cambio en la Fluorescencia misma, significa la participacin de las vas competitivas en el empleo til de la energa como lo son la fotosntesis misma y el intil como la disipacin en forma de calor (Fig. 36-14) y que se relacionan con el estado en que se encuentra la planta frente a la intensidad de la luz, humedad, temperatura, etc.
468
Fotosntesis
ENERGIA
Calor
Fluorescencia
Fig. 36 - 10. El flujo de la energa hacia sus distintos procesos puede aumentar o disminuir por la reversibilidad y competicin entre las vas.
Para medir la fluorescencia en la forma ms bsica o elemental se procede a iluminar la hoja de la planta o bien una suspensin de Cloroplastos con una luz con filtro rojo capaz de excitar a la Clorofila, adems de un detector representado por un fotomultiplicador o fotodiodo con un segundo filtro, que permite el paso de la luz re-emitida de longitud de onda mayor que la incidente, es decir mayor de 700nm. Como la luz de la fluorescencia es de electrones que tienen poca energa la longitud de onda que emiten es de ms all del rojo, de esta manera el detector tomar en gran parte la fluorescencia y no la luz empleada para excitar a la Clorofila. Por otro lado para disminuir el efecto anterior provocado por la luz incidente, es tambin posible aplicar luz de 400nm y detectar fluorescencia desde 690 a 700 nm. Sin embargo, la seal detectada depender de la intensidad de la luz incidente empleada para la excitacin y cualquiera luz ambiente que se filtre puede alterar las mediciones. Para mejorar el sistema de medicin a lo anteriormente descrito, es necesario recurrir a un sistema que emplea luz modulada, es decir esta se prende y se apaga en pulsos de alta frecuencia, mientras que la seal de la fluorescencia se mide con un detector calibrado para captar la diferencia entre la luz absorbida con y sin luz modulada. De esta manera se puede obtener la eficiencia relativa de la fluorescencia de la Clorofila como se ver ms adelante en presencia de iluminacin ambiental.
15) FACTORES qP y qN
La extincin de la fluorescencia (Ecuacin 2) o la disipacin de la energa llamada quenching se produce por dos mecanismos principales (Fig. 37 10). El primero de ellos denominado qP o quenching fotosintticos , este ocurre cuando todas las trampas se encuentran abiertas y la fluorescencia es mnima, es decir cuando se aplica luz limitante para que la energa absorbida por la antena abierta sea transferida totalmente al centro de reaccin en la forma de estado estable.
469
qP
T ra n s fe re n c ia d e e n e rg a e n tre lo s c o m p o n e n te s d e la A N T E N A
qN
F
CEN TR O DE R E A C C IO N
CENTR O DE R E A C C IO N
L A E N E R G IA P A S A E N E S T A D O ESTAB LE AL C ENTRO D E R E A C C IO N y S O L O S E D IS IP A C O M O F L U O R E S C E N C IA ( F ) C UAND O Q a SE ENCU EN TRA T O T A L M E N T E R E D U C ID O
L A E N E R G IA S E D IS IP A C O M O F L U O R E S C E N C IA (F ) A N T E S D E E N T R A R A L C E N T R O D E R E A C C IO N
Fig. 37 - 10. Los dos casos por los cuales se disipa la energa como fluorescencia F.
En el caso de que la Plastoquinona (Ca) se encuentre totalmente reducida o cuando el flujo de fotones excede la capacidad de reoxidacin de la Plastoquinona, se tiene la fluorescencia mxima (Fmx), es decir se pierde la energa que no se aprovecha en el proceso de fotosntesis en la forma de fluorescencia. Aunque la fluorescencia mxima (Fmx), tambin se puede obtener por induccin, mediante la presencia de DCMU (Diurn) que inhibe la reduccin del pool de Plastoquinona, elevndose de esta manera la Fluorescencia desde un bajo nivel en estado estable hasta un mximo con DCMU. En este punto kp(fotosntesis) en la Ecuacin 1 es de 0 ya que la produccin de fluorescencia ha aumentado.
P 680 + Q a re d e le c tr n Qa ox P 680 Q b ox.
DCMU
Q b re d
Fig. 38 10. Efecto del Diurno (DCMU).
470
Las tcnicas empleadas para medir la Fluorescencia permiten medir una serie de datos como lo son la fluorescencia mnima (Fo) y la mxima (Fmx) relacionadas con el estado de la planta. El primero de ellos Fo, se obtiene con iluminacin extremadamente dbil de tal manera que se produzca un nivel de fluorescencia aproximado al que se tiene cuando la planta se ha adaptado a la oscuridad, es decir cuando la totalidad de la Plastoquinona Qa se encuentra oxidada. Por otro lado Fmx es la produccin de mxima fluorescencia y se obtiene despus de un pulso saturante de luz o con DCMU, cuando todos los mecanismos de extincin (quenching) se encuentran en cero. A continuacin se procede a emplear luz actnica (ambiental) de la intensidad necesaria para empujar la fotosntesis y pulsos de luz saturantes superimpuestos a intervalos apropiados. Cada pulso saturante hace que Qa se encuentre totalmente reducida y el primero de ellos dar como respuesta una fluorescencia similar a la mxima, Fmx y desde all en adelante descender debido a la extincin o quenching provocado por el componente que toma energa para generar el gradiente de protones o quenching qE, que es un componente de qP. El mismo efecto anterior tambin se puede lograr con luz modulada en cortos destellos de alta intensidad, la que debido al tiempo de relajacin que se toma el PSII, es decir el tiempo que toma en recuperarse antes de adquirir la capacidad de reaccionar nuevamente (debido a que atrapa la energa de excitacin, transfiere los electrones y pasa de reducido a oxidado), si la luz llega antes de que esto ocurra, puede no responder lo que har que aumente la fluorescencia. Ahora si la luz es lo suficientemente fuerte o saturante, todos los centros de reaccin se encontrarn cerrados y el valor de kp (fotosntesis) se aproximar a 0, aumentando la fraccin de energa que se disipa por fluorescencia (kf). En este caso, se evita la disipacin por calor al hacer que los destellos sean de corta duracin, de manera que kd (calor) es tambin igual a 0, ya que esta ltima va de disipacin se activa cuando se aplica ms luz de lo que se emplea para fijar el CO2. La tcnica para alcanzar el efecto anterior se llama light doubling y los periodos de luz son de aproximadamente 1 segundo. Como se dijo anteriormente, los pulsos cortos evitan que se dispare el mecanismo de disipacin de la energa destinada a la fluorescencia en calor. Ms an el nmero de trampas fotosintticas o PSII abiertos depende en general de la intensidad de la luz y la velocidad con que el centro se abre. El equilibrio se alcanza cuando el nmero de centros cerrados es determinado por el balance de la excitacin y la velocidad de recambio de los centros. Mientras ms centros cerrados menos efectiva es la fotosntesis y hay mayor fluorescencia. Si la fluorescencia estado estable es en un momento Ft y la fluorescencia mxima inmediatamente despus de este punto es Fmx, la eficiencia de la fluorescencia F% (Ecuacin 1), ser dada por la Ecuacin 3:
Ecuacin 3 Fmx Ft ( unos centros abiertos otros cerrados o (Todas los centros cerrados) nmero centros cerrados estado estable) F% = --------------------------------------------------------------------------------------------------------Fmx La eficiencia se emplea como ndice de la luz absorbida por el centro formado por la antena del PSII.
471
Volver al inicio
FACTOR
qN
La Fluorescencia se puede extinguir por un proceso no fotosinttico denominado qN y que puede ocurrir cuando se ilumina con alta intensidad a la planta que se encontraba en reposo en la oscuridad, haciendo que la energa de excitacin en la antena se disipe como fluorescencia antes de llegar al centro de reaccin, debido a los mecanismos de proteccin propios de la antena. Este mecanismo consiste en la de-epoxidacin de los carotenos en la antena ( Violaxantina / Zeaxantina) y el reordenamiento de los complejos que capturan la luz en la antena CP24, CP26 y CP29, los que entregan proteccin a la hoja por quenching no fotoqumico o qN. qN se puede dividir en qE, extincin que depende del gradiente de pH en la membrana tilacoides y qI, extincin atribuida a la formacin de zeaxantina en la antena y finalmente qT, extincin o quenching debido a la temperatura.
CICLO DE LAS XANTOFILAS 2 ASCORBATO VIOLAXANTINA 2 NADP +2 H2O
DE EPOXIDACION LUZ SATURANTE pH 5.1
EPOXIDACION BAJA LUZ pH 7.5
2 DEHIDROASCORBATO
ZEAXANTINA
2 NADPH + 2 O2
Fig. 39 10. Ciclo de las Xantfilas para la Violaxantina de la antena en la membrana Tilacoides.
El gradiente de pH percibe el exceso de luz y estimula la emisin de calor para evadir el efecto nocivo de esta condicin. Los cambios asociados al PSII debidos a qE ocurren en la antena cuando aumenta la intensidad de la luz lo que se puede traducir en un aumento del gradiente de pH, seguido por una protonacin de los residuos carboxilos de las subunidades menores del PSII, lo que lleva a la de-epoxidacin de la violaxantina (carotenoide) a zeaxantina ( de amarillo a rojo) por activacin de la enzima Violaxantina De-Epoxidasa (VDE)ubicada en el lmen de la membrana tilacoides. Esto se traduce en
472
una disminucin de la brillantez del PSII y eliminacin de calor asociado a un cambio en la organizacin de las molculas, acercndose a su vez las molculas de Clorofila a las de Xantfila. Posteriormente en la oscuridad la Zeaxantina pasa nuevamente a Violaxantina constituyendo este proceso repetitivo el Ciclo de las Xantfilas en Figuras 3710,10). La disipacin de la energa puede ocurrir mediante el reordenamiento de las Clorofilas que reciben la luz como tambin por el manejo de ciertos pigmentos como son los carotenos ( Ciclo Xantfilas) con lo cual se impide la fotoinhibicin o la fotodestruccin del PSII. En ambos casos la energa se disipa como calor (kd). Estos cambios afectarn a la produccin estado estable de fluorescencia, la que tambin es afectada por cambios en la fotosntesis, pero no a la fluorescencia mxima Fmx. Por lo tanto Fmx sirve de punto de referencia para observar cambios en la disipacin por calor (kd). El punto de referencia que se usa es el valor de Fmx medido despus de la aclimatacin de la hoja a la oscuridad por unos 10min o por 24 hrs. Los cambios en la disipacin del calor pueden ser expresados en la Ecuacin 4:
Ecuacin 4 (Fmx de la hoja adaptada a la oscuridad (o) - (Fmx hoja estado estable (t) NPQ o qN =-------------------------------------------------------------------------------------------------Fmx (t) NPQ : Non photochemical quenching Fmx(o) es la fluorescencia mxima en la hoja adaptada a la oscuridad y Fmx (t) es la fluorescencia mxima en el tiempo t. Si Fmx (t) aumenta se produce un aumento de la extincin de la energa o quenching calrico y disminuye la fluorescencia a causa de este factor.
Beta-Caroteno
OH
HO
Zeaxantina
Fig. 40 10. Carotenoides En general, la Zeaxantina se encuentra relacionada con el mecanismo de defensa frente al estrs producido por la luz en las plantas, ya que el Ciclo de las Xantfilas es una forma de adaptacin producida durante la evolucin que le confiere a la planta resistencia a los cambios climticos estacionales.
ALGUNOS PARMETROS QUE SE PUEDEN MEDIR para observar la eficiencia DE UNA PLANTA bajo distintas condiciones ambientales.
473
Fo es la fluorescencia desplegada por una hoja adaptada a la oscuridad en una luz modulada muy dbil. (Fv) m es la fluorescencia variable mxima que se observa cuando se aplica un pulso saturante de luz actnica. Fv es la fluorescencia variable observada una vez que luz actnica continua se aplica y (Fv) s son los peaks producidos por la fluorescencia producto de los pulsos de luz saturante Durante la induccin Fv disminuye desde Fm ((Fv)m), debido al grado de extincin provocada por el coeficiente de extincin:
Fv = (Fv)m - q(Fv)m
q es el coeficiente de la extincin que vara entre 0 y 1 y equivale a la ecuacin:

q=1 - (1 - qN) (1 - qP) donde: qP =0, cuando Qa se encuentra 100% reducido no hay empleo de la energa y la fluorescencia es mxima y qN =0, cuando no hay gradiente de protones y no se emplea la energa por esta va, por otro lado, q =1 cuando la fluorescencia variable Fv se suprime totalmente.
Despus de cada pulso de luz saturante la fluorescencia se empuja a (Fv)s ya que qP es eliminado ( Fv)s = Fv + qP(Fv)s (Fv)s desciende de un mximo debido a la generacin de un gradiente de protones asociado al qN (Fv)s= (Fv)m - qN(Fv)m Fv = (Fv)m - qN(Fv)m - qP(Fv)s
y finalmente Fv = (1-qN) (1- qP) (Fv)m Donde:
qP
(Fv)s - Fv = ------------------------
474
(Fv)s (Fv)m - (Fv)s qN = ------------------------(Fv)m Fv 1 - qP = ---------------(Fv)s
(Fv)s 1 - qN = --------------(Fv)m El valor de Fv/Fm es considerado como la Eficiencia cuntica mxima de PSII. Fv es la fluorescencia variable que es igual a (Fm - Fo). Fs, es la fluorescencia de la planta adaptada a la luz o seal estado estable con luz limitante. Fm', es la seal cuando Qa se encuentra totalmente reducida en la fotosntesis (detenida) o la produccin de fluorescencia despus de un pulso saturante de luz. Fo', es la seal cuando Qa se encuentra totalmente oxidado con luz de fondo al extremo rojo en la fotosntesis. E es la eficiencia cuntica de PSII. Eficiencia cuntica mxima de PSII o Phi(PSII) Fm - Fo Fv E = ------------------ = ----Fm Fm
E es la eficiencia de la antena de PSII. Eficiencia de la antena Fm - Fo Fv E = ----------------- = ----Fm Fm
Del valor de los parmetros examinados hasta aqu depender, como se dijo al principio el estado de la planta frente a las condiciones ambientales de luz, humedad, temperatura y senescencia.
Volver inicio
al
475
REFERENCIAS Fotosntesis., C.S. Andreo y R.H. Vallejos., Monografa No 30, Secretara General de la Organizacin de los Estados Americanos. Programa Regional de Desarrollo Cientfico y Tecnolgico. Washington, D.C. - 1984. Ribulose-1,5-Biphosphate Carboxilase-Oxygenase., H. M. Miziorko and G.H. Lorimer., Ann.Rew. Biochem. Vol 52, 507-535, 1983. Regulation of Photosynthesis in C3 and C4 Plants: A Molecular Approach. R.T. Furbank and W.C. Taylor ., The Plant Cell, Vol 7, 797-807, 1995. Rubisco Synthesis, Assembly, Mechanism and Regulation. S. Gutteridge and A.A. Gatenby ., The Plant Cell, Vol 7, 809-819, 1995. Clorophyll Biosynthesis. Ditter von Wettstein, S. Gough and C.G. Kannangara, The Plant Cell, Vol 7, 1039-1057, 1995 . Regulation of Light Harvesting in Green Plants. P.Horton, A.V.Ruban and R. G. Walters, Plant. Physiol. 106: 415-420, 1994. Oxidative Stress, http:// www.agronomy.psu.edu/Courses/AGRO518/Oxygen.htm
476
Hctor A. Rocha L. Metabolismo de los Lpidos
479
LPIDOS 1) LOS LIPIDOS 483 2) ACIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS 486 3) TRANSPORTE DE LOS LIPIDOS EN EL ORGANISMO 490 a) CICLO EXOGENO 491 b) CICLO ENDOGENO 493 4) APOPROTENAS 5) DISLIPIDEMIAS 496 497
6) TEJIDOS INVOLUCRADOS EN EL MANEJO DE LOS LIPIDOS 499 7) DEGRADACION DE TRIACILGLICEROLES Y -OXIDACIN DE LOS ACIDOS GRASOS 505 8) OXIDACIN EN LOS PEROXISOMAS 9) 10) - OXIDACIN - OXIDACIN 514 515 516 512
11) FORMACION DE CUERPOS CETONICOS 12) SINTESIS DE CIDOS GRASOS 519
13) ELONGACION E INSATURACION DE LOS ACIDOS GRASOS 525 14) INSATURACIN DE CIDOS GRASOS 525 15) SINTESIS DE TRIACILGLICEROLES 16) SINTESIS DE FOSFOLIPIDOS 528 17) SINTESIS DE ESFINGOLIPIDOS 530 18) DERIVADOS DEL ACIDO ARAQUIDONICO QUE COMPRENDEN A LOS EICOSANOIDES CONOCIDOS COMO PROSTAGLANDINAS, TROMBOXANOS Y LEUCOTRIENOS 532 527
480
19) CONTROL DE LA SINTESIS DE LOS ACIDOS GRASOS 533 20) DIFERENCIA ENTRE SINTESIS Y OXIDACION DE ACIDOS GRASOS 534 21) EL COLESTEROL 535 538
22) CONTROL SOBRE LA HMG-CoA REDUCTASA 23) SNTESIS DEL COLESTEROL 541 545
24) SNTESIS DE LAS SALES BILIARES
25) FENOTIPO DE CINTURA HIPERTRIGLICERIDMICA U OBESIDAD VISCERAL 546
481
1) LOS LIPIDOS. Constituyen una familia amplia y heterognea que cumple funciones mucho ms variadas que los Hidratos de Carbono. Los Lpidos sirven de reservorio de energa, aislante trmico,
482
aislantes de la funcin conductora y ejercen funciones estructurales. Los Triglicridos por ejemplo constituyen el tejido adiposo, mientras que los Fosfolpidos constituyen las membranas biolgicas que rodean a las clulas del organismo y a sus organelos. Por otro lado los Glicoesfingolpidos y Cerebrsidos forman parte de la Mielina, sustancia aislante que se encuentra ampliamente distribuida en el sistema nervioso. Algunos otros como la familia de las Prostaglandinas, actan como hormonas paracrinas o autocrinas. Los lpidos son insolubles en agua y comprenden a todas aquellas molculas que pueden ser extradas de los tejidos mediante solventes orgnicos. As tenemos que entre estos compuestos se pueden encontrar a los triglicridos, fosfolpidos, esfingolpidos, cerebrsidos y ceras (Figs. 1 - 10 y 2 - 10).
= TRIPALMITINA TRIACILGLICEROL (TAG) CEREBROSIDO O ESFINGOSINA AC. PALMITICO H OH HH C CH C H HC H H O CC CH C C H H C H C CC C H CH CH CH CH C H C H HC C HC C H C H CH CH CH CH CH CH H C 2 C 2 2 2 2 2 2H 2 2 2 C 2 2 2 2 2 2H 3 3 22 2 2 2 2H O 2 22 2 2 2H H GLICEROL H C O C C H C H C H CH C H C H C H C H C H CH CH C H CH C H C 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 OH H 2 3 O H H O C C H N C CCH H CH CH CH CH CH CH CH CH O C H HH H HC CC C H CH C HC H C C C C H H C C H C C H C C C H H CH CH CH C H C H 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 22 2 2 2 2 2 2 2 22 H H 2 22 2 2 3 2 2 2 O 3 H OH O AC. OLEICO H H FOSFOLIPIDO (P L) = FOSFATIDIL COLINA
D - GALACTOSA
FOS FATO O O P
GLICEROL HC O
O AC. PALMITICO CERA C C H CH C H CH C H C H CH CH C H CH CH C H CH C H C H 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 O H H CH C H C H CH CH C H CH CH C H CH C H C H H C O C C 2 C 2 CH 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 CH C O CH CH CH O O HC CH

2
3 2
OH H
14
28
O COLINA Ac. PALMITICO CH

2
Alcohol TRIACONTANOL
Fig. 2 - 10. Estructura qumica de un Cerebrsido y de una Cera.

C H N + CH
3 3
C H2
CH
ESFINGOLIPIDO ESFINGOSINA H OH C H C H CH C H CH C H CH C H CH C H CH C H CH C C C H 2 2 2
3 2 2 2 2 2 2 2 2 2
COLINA
H C H C H CH C H CH C H CH CH C
3 2 2 2 2 2 2 2
CH O H 3 H + C CH C H CH C H CH C H CH C N C C H O P O C H C H N CH 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 H H 2 O O CH
AC. OLEICO
Fig. 1 - 10. Algunos compuestos representativos de la familia de los Lpidos.
483
C H3 C H 3 7 1 2 3 4 6 5 8
C H3 9 10 11 12
C H3
C H3 C B D
C H3
13 15 CHO 14 A CH
2
VITAMINA A RETINAL C H3
CH CH 3 3 VITAMINA D C H3 C H3 C H3 C H3 VITAMINA E o - TOCOFEROL C H3 C H3 C H3 C H3 CH COLECALCIFEROL

3
o o
CH 3 CH 3
CH 3
C H3
VITAMINA K 1 - FILOQUINONA
Fig. 3 - 10. Las Vitaminas liposolubles son tambin clasificadas como Lpidos.
Entre las molculas clasificadas como lpidos se encuentran las vitaminas A, D, E y K, (Fig. 3 - 10) que se derivan de la va de los Isoprenos, ampliamente desarrollada en las plantas. Otros de los compuestos considerados como lpidos son de origen esteroidal, siendo el principal de ellos el Colesterol y sus derivados hormonales como la Testosterona, Progesterona y Estradiol, adems de las sales biliares, representadas por los cidos Glicoclico y Tauroclico (Fig. 4a - 10). Por otro lado algunos compuestos lipdicos tienen propiedades fisiolgicas moduladoras de la microcirculacin de los tejidos, as tenemos a las Prostaglandinas consideradas como segundos mensajeros que afectan la musculatura lisa de los capilares junto a otras molculas relacionadas, como son los Tromboxanos (Plaquetas) y Leucotrienos (Leucocitos y Macrfagos). Estos ltimos derivan de los cidos grasos poli-insaturados (Fig. 4b - 10) como el Araquidnico y se encuentran relacionados con la agregacin de plaquetas y el proceso inflamatorio de los tejidos.
484
Por otro lado, entre los lpidos tambin encontramos a las esencias vegetales producidas en la va de los Isoprenos y Terpenos representados por el Citronelal y el Cineol, ambos pertenecientes al genero Eucaliptus. Entre los terpenos tenemos al Pineno del Pinus Radiata y al Limoneno que se encuentra en la cscara del limn (Fig. 4c - 10). A pesar de la clasificacin algo tendenciosa de las molculas denominadas lpidos, es
a)
O H C H
3
C H
H C
3
O H H C
3
C H C
C H
3
C H O O
C H H N O H H O
COOH
A C . GLICOCOLICO TE S TO S TE RONA
O P RO GE S TE RO NA
b)
CO O H C H
3
O C O O O O H O O H
A C. A RA QUIDO NICO E ICO S A TE TRA E NO ICO
Prostaglandina
T romboxano A2
c)
Terpenos Ac c lic os y C c lic os .
CIT RO NE L A L E u ca lip tu s
H C
P INE NO P in o
L IM O NE NO L im n
CINE O L E u ca lip tu s
Fig. 4a - 10 Estructura de los Esteroides Fig. 4b - 10. Estructura de las Prostaglandinas y Tromboxanos. Fig. 4c - 10. Estructura de algunos Terpenos.
posible encontrar un denominador comn mucho ms especfico. En otras palabras, el precursor de todos los lpidos es nada menos que el Acetil-SCoA (CH3-CO-SCoA). Esta molcula consiste en un par de carbones activado por la Coenzima A y cuyo origen puede estar en la Glucosa, los Aminocidos o los mismos cidos Grasos como producto de la -Oxidacin. Es interesante hacer notar que la unin de varias molculas de Acetil-SCoA, activadas como MALONIL-SCoA, es a la vez el punto de partida para aquellas vas que sintetizan los cidos grasos, isoprenos y esteroides. Volver al inicio 2) LOS ACIDOS GRASOS SATURADOS E INSATURADOS.
485
Su estructura qumica est formada por una cola hidrofbica de carcter alqulico de tamao variable ms una cabeza polar con un carboxilo ionizable (pK 4.8), que les entrega a pH fisiolgico el carcter de molculas amfipticas 9o hidrofbico-polares (Fig. Palmitoleico, cis-9-Hexadecanoico, 16:1 5a - 10).
Oleico, cis-9-octadecanoico, 18:19
a)
HC 3 CH HC 3 CH 2 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH CH 2 CH CH 2 CH 2 CH CH 2 CH 2 2 CH 2 CH CH CH 2 2 2 COO CH 2 COO CH 2 CH CH 2 CH 2 CH 2 CH CH CH 2 CH 2 CH 2 2 CH 2 2 CH 2 CH
CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7COOH
CH CH CH CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH 2 2 2
+
H
Ac. LAURICO
CH 2
2 CH
CH 2
CH 2
+
H 2 COO CH
Ac. MIRISTICO
HC 3
CH 2
CH 2
CH 2 CH CH
CH 2
CH 2
+
H 2 COO 2
Ac. PALMITICO
HC 3
CH 2
CH 2
2 CH
CH 2
+ + H
Ac. ESTEARICO
HC 3
CH
CH 2
CH 2
CH 2 CH
CH 2
CH 2
CH 2
CH 2 COO
Ac ARAQUIDICO
b)
11
o
CADENA SATURADA
DOBLE ENLACE CIS 123 o 123 o DOBLE ENLACE TRANS
Fig. 5a - 10.Estructura de los cidos grasos saturados ms comunes. Fig. 5b - 10.Configuracin de los dobles enlaces en cidos grasos insaturados.
Los cidos grasos son las molculas ms comunes entre todos los lpidos y se encuentran en los productos naturales con un nmero par de carbones. Pueden poseer una o varias insaturaciones del tipo CIS en su cola alqulica. Estas producen un ngulo de 30o en la cadena que es caracterstico a todos los compuestos naturales de este tipo. Algunos de los cidos grasos insaturados ms comunes son el Palmitolico y el Olico (Fig. 5b - 10), con solo una insaturacin del tipo CIS (Fig. 6 10). Entre aquellos cidos grasos con ms de una insaturacin se encuentran los denominados esenciales (Fig. 7 - 10), que no pueden ser sintetizados por humanos y deben encontrarse presentes en la dieta. Estos cidos grasos se conocen por los nombres de Linolico [18: 2 (9,12) ], con 18 carbones e insaturaciones en los carbones 9 y 12, otro de ellos es el Linolnico [18 : 3 (6,9,12)], tambin con 18 carbones e insaturaciones en los carbones 6, 9 y 12.
Fig. 6 - 10. Estructura de algunos cidos grasos insaturados.
486
Ambos cidos grasos polinsarturados se encuentran presentes en los aceites vegetales y son a la vez precursores de otro cido graso esencial como el c. Araquidnico [20: 4 (5,8,11,14)], (Fig. 7 - 10), con cuatro insaturaciones. Este ltimo es conocido por ser el precursor directo de las Prostaglandinas. Los cidos grasos poliinsaturados se pueden nombrar comercialmente desde el grupo metilo o carbono distal denominado (Omega) y se acostumbra a decir que el c. Araquidnico es un -6, ya que el primer doble enlace desde el Metilo a Carboxilo queda en el carbono 6 (Tabla I - 10 ). La importancia de la insaturacin de los cidos grasos puede ser fcilmente observada en la constitucin de los fosfolpidos de una bicapa. Estas estructuras cuentan con cidos grasos que les entregan una fluidez y flexibilidad compatible a la temperatura en que el organismo prospera, ya sea del tipo Procarionte o Eucarionte. Las insaturaciones del tipo CIS (fig. 5b10), producen una torsin en la cadena que permite un empaquetamiento separado de las cadenas alqulicas lo cual disminuye las interacciones del tipo hidrofbicas y Van der Waals, produciendo una membrana mucho ms fluida.
LIN OLEIC O cis 18 17 16 15 14 13 12 1 10
LINOLEICO u -6
9 8 7 6 5 4 3 2 1
cis
H C =H CH - CH - CH - CH - CHC - CH H - C =HC - CH -CH - CH - CH - CH - CH - CH - COOH C H C H CH CH CH C C H C2 H C 2O H 2 CH 2 CH C 3 3 22 2 2 H CC HH 2 2C H C H 2 H2 C H 2 C H 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
- LINOLENICO u -3 cis- CH - CH - CH - CH - CH - CH - CH - COOH CH - CH - C = C - CH - C = C cis cis-CH - C = C 3 2 H H 2 H H 2 H H 2 2 2 2 2 2 2

LIN OLEN IC O 18 17 16 15
- LINOLENICO u2 -62 2 2 2 2 2 O CH - CH - CH - CH - CH -C = C - CH - C = C - CH - C = C - CH - CH - CH - CH - COOH 3 2 2 2 2 H H 2 H H 2 H H 2 2 2 2

3 2
C H
CH
H C
H C CH
14
13
12
10
H C
H H C CH C
H C CH C H CH C H CH CH CH C
O H
LIN OLEN IC O
ARAQUIDONICO cis cis u -6 cis CH - CH - CH - CH - CH - C = C - CH - C = C - CH - C = C - CH - C = C - CH - CH - CH - COOH 9 7 13 12 6 10 3 2 18 2 17 2 16 2 H 2 H H1 2 H H8 2 H H 4 2 3 2 2 21 15 H14 5

H
3
C H
CH
CH CH
2
H C
H H C CH CC
2
H H C CH C
2
H C CH
CH C H CH C
2 2 2
O H
Fig. 7 - 10. cidos grasos esenciales del tipo poli-insaturado. De esta forma es posible mantener una mayor movilidad entre las molculas que constituyen una bicapa, especialmente en aquellos organismos que toleran bajas temperaturas como peces, plantas e insectos. En ellos las estructuras se mantienen viables a pesar de la escasa agitacin trmica. Por otro lado, los cidos grasos poliinsaturados cis, son deseables para el organismo humano debido al menor nmero de pasos metablicos que requieren durante su catabolismo y la capacidad de reducir los
Tabla 1 - 10
- 6 (OMEGA-6- Maz, Girasol, Azafrn)
487
CH3 COOH
C18:2 C18 9,12 LINOLEICO
12
CH3 COOH
C20:4 C20 5, 8, 11, 14 ARAQUIDONICO
14 CH3
11
15
12
COOH
C22:5 C22 3, 6, 9, 12, 15 DOCOSAPENTANOICO
- 3 (OMEGA-3 Peces, mariscos, soya, nueces)

(ALA) C18:3 C18 9, 12, 15 LINOLENICO (Derivado de plantas)
CH3 CH3
15
12
COOH
CH3
17
14
11
(EPA) C20:5 C20 5, 8, 11, 14, 17 EICOSAPENTANOICO COOH (Origen marino)
COOH CH3 19 16 13 10 7 4
(DHA) C22:6 C22 4, 7, 10,13,19 DOCOSAHEXANOICO (Origen marino)
depsitos de Colesterol al circular esterificados con ste, debido a que son menos susceptible a depositarse en las paredes de los vasos sanguneos. Cuando los cidos grasos son conjugados pueden ser susceptibles al ataque por compuestos aberrantes del Oxgeno (Superxido O2- y Superhidroxilo OH- ).
488
Los compuestos aberrantes del Oxgeno se producen cuando la reduccin metablica de la molcula O2 ocurre por un nmero impar de electrones. Esta reduccin es imperfecta y conduce a compuestos de una vida media corta, como lo son el Superxido y el Superhidroxilo: +e +e +e +e O2--------> O2- ----------> H2O2-----------> OH- -------> H2O Oxgeno Superxido Perxido de Super Agua Hidrgeno Hidroxilo Estos compuestos al poseer nubes electrnicas impares son capaces de peroxidar y romper las colas alqulicas de los cidos grasos en el lugar de los dobles enlaces. Lo hacen de preferencia en aquellas molculas conjugadas donde los dobles enlaces se encuentran alternados (Fig. 8 - 10).
Oxidacin de Acido Graso con dobles enlaces Conjugados.
Iniciacin
H C R H Ruptura Homoltica H
Iniciacin
H C
H C R C
H C
Radical Peroxi
2
R
H C C
H C O
R
H C C
H C H
Propagacin
O O
H C R C
H C
O H
+
R
H C C
H C O
R
H C C
H C O O H
Radical Peroxi arranca este Protn
Radical Superhidroxilo
Ambos Radicales inician reaccin en cadena con efecto autocataltico
Radical Alcohoxilo
Ruptura Homoltica
Hidroperxido
Fig. 8 - 10. Los cidos grasos poli-insaturados pueden ser atacados por los compuestos aberrantes del Oxgeno.
La formacin de radicales libres puede ocurrir a distintos niveles del metabolismo aerbico. Por ejemplo durante el transporte de Oxgeno por la Hemoglobina, parte del O2 abandona al Fe+2 del grupo HEME oxidndolo a Fe+3 (Metahemoglobina), al llevarse un electrn y convertirse en Superxido O2-. La Hemoglobina oxidada pasa a llamarse ahora Metahemoglobina y solo puede ser reducida nuevamente mediante una reaccin catalizada por la enzima Glutatin Reductasa que se encuentra presente en el eritrocito junto al polipptido denominado Glutatin que cuenta con un grupo reductor -SH destinado a reducir el Fe+3 del grupo Heme y reactivar la molcula nuevamente. En cambio el Superxido recin formado ( O2- ), puede atacar la membrana del eritrocito e inducir la Hemlisis temprana de este, pero enzimas como la Superxido Dismutasa y Catalasa actan de manera concertada para eliminar al compuesto aberrante junto a las Vitaminas C y E ampliamente conocidas por sus propiedades antioxidantes. Superxido Dismutasa O2- + O2- + 2H+ ------> 2H2O2 + O2
489
Catalasa 2H2O2 ---------------->2H2O + O2 Una forma de evitar la peroxidacin de los cidos grasos consiste a recurrir al empleo de insaturaciones cada tres carbones del tipo no conjugadas. Lo que es un tanto impracticable a menos que la dieta sea artificial. Las insaturaciones del tipo TRANS, se encuentran solo en los productos sintticos formados por hidrogenacin cataltica y a pesar de que no son naturales, no se ha demostrado que causen dao al organismo. Volver al inicio . 3) TRANSPORTE DE LOS LIPIDOS EN EL ORGANISMO. Los lpidos se distribuyen por el organismo en forma de lipoprotenas, ya que son insolubles en el plasma acuoso. Las lipoprotenas estn a su vez constituidas de Apoprotenas (Ver Tabla 2 - 10 de las Apoprotenas y fig. 9 10) que se encuentran formadas estructuralmente por un segmento hidroflico y otra hidrofbico.
Densidad gr/ml HDL Naciente 1,18 HDL3 HDL2 HDL1 LDL
1,14
1,10
1,06
1,02
IDL Remanente de Quilomicrn Quilomicrn
1,006
0,95 60 100 140 200 240 280 400 600 800 1000 Dimetro A
Fig. 9 - 10. Lipoprotenas del suero
Esta ltima seccin, la hidrofbica interacta con los lpidos mientras que la parte hidroflica se encuentra en contacto con el medio acuoso del plasma. Las apoprotenas se sintetizan en el hgado y se ensamblan con los lpidos tanto aqu como en el intestino. Sus principales funciones son: 1) Empaquetar lpidos en complejos lipoproticos.
490
2) Activar y modular enzimas hidrolticas endoteliales que degradan a estos lpidos y que posteriormente los dejan listos para su internalizacin. 3) Reconocer receptores en diversos rganos para descargar en ellos a los lpidos que transportan. La distribucin de los Lpidos por el organismo sigue dos ciclos, uno de ellos es el CICLO EXOGENO con los lpidos de la dieta y el otro es el CICLO ENDOGENO con los lpidos sintetizados por el propio organismo. A continuacin se describen ambos: Volver al inicio a) CICLO EXOGENO. Despus de una alimentacin rica en grasas los lpidos saponificados por las sales biliares, se hidrolizan en el intestino por las Lipasas Pancreticas formando a su paso por la pared intestinal los Quilomicrones ( Qm ), (Fig. 10 - 10). Esta asociacin o complejo lipoproteico contiene las apoprotenas Apo B 48 (protena estructural) que favorecen la formacin del Quilomicrn mismo, junto a las apo E (Ver Tabla I de Apoprotenas) que son los factores de reconocimiento para la unin de CETP : Cholesterol Ester Transfer Protein CLAT : Cholesterol Lecitine Acyl Transferase PLTP: Phospholipid Transfer Protein ABC1: ATP Binding Cassette Protein or Transporter SR-B1: Scavenger Receptor-B1 los remanentes del quilomicrn al hgado. A continuacin se encuentran las Apo C2 que activan a la Lipasa Capilar (LPL), para la degradacin del Quilomicrn en los capilares de los tejidos y la Apo A1 que activa a la enzima Lecitina-Colesterol Acil Transferasa (LCAT). Adems, se encuentran aqu las apoprotenas Apo A2 y A4 que acompaan a una gran cantidad de triglicridos, fosfolpidos y colesterol. Los Quilomicrones viajan por el sistema linftico ya que su tamao no les permite atravesar los poros de los capilares sanguneos y posteriormente penetran a la circulacin por la vena subclavia izquierda (ducto torcico), empezando a repartirse hacia los tejidos. De esta manera, pasan al msculo esqueltico, tejido adiposo, corazn y glndula mamaria lactante. En los endotelios capilares de cada uno de estos tejidos, la Lipoprotena Lipasa que ha sido activada por la Apo C2 e inhibida por la Apo E, libera del Quilomicrn hacia los tejidos, cidos grasos y colesterol previa hidrlisis de sus formas esterificadas. Lo que resta de ello, se denomina como remanente de Quilomicrn. Este ltimo es tomado por el hgado mediante receptores especficos que junto a las partculas de Clatrina (Protena internalizadora en la superficie de la membrana) forman las fosas revestidas, que al interaccionar entre s internalizan por endocitosis al remanente de Quilomicrn. En el interior pasar a formar un endosoma que luego de asociarse a un lisosoma hidroliza su contenido liberando los cidos grasos y el colesterol. En aquellos casos donde se observa un plasma lechoso se produce una Hiperquilomicronemia, donde el nivel de los Quilomicrones se eleva por 10-12 hrs despus de ingerir alimento. Esta falla, es parte de las Dislipidemias (Tabla II), nombre genrico por el cual se identifican los trastornos en el manejo de los lpidos.
491
CICLO EXGENO
Formacin de Qm en el RER de las clulas epiteliales
Sales Biliaras
Lpido
Sist. Circulatorio
Entrada por vena subclavia izquierda
Micela
Sist. Linftico
Intestino
Quilomicrn
Triglicrido, Apo B48 ,Colesterol, Apo E Fosfolpido, Apo C2
Apo A1 Activa a
HDL discoidales o Nacientes

Estan formadas por Fosfolpidos, Apo A1,C-1 ,C-2 , E y LCAT de origen intestinal e hgado
LCAT
Tejido Muscular, Adiposo, Corazn y Mamario
Accin de la Lipoprotena Lipasa activada por Apo C2 de la del Qm
Resto de Quilomicrn Colesterol Apo B48 Apo E
Unin al Receptor en el Hepatocito e internalizacin por endocitosis, degradacin lisosmica y reciclaje
Hepatocito
Apo A1 LCAT desde el Hgado
Transferencia de Fosfolpi-dos por PLTP desde Qm y tambin Colesterol desde VLDL. Transferencia de Colesterol desde remanente de Qm e IDL. La enzima LCAT esterifica el Colesterol y se guarda en CE el centro
CICLO ENDGENO
Tejido Muscular, Adiposo, Corazn y Mamario
Accin de la Lipoprotena Lipasa activada por Apo C2 de la VLDL
VLDL
Triglicridos Esteres de Colesterol, Apo B 100,
CE
SR-B1
IDL LDL LDL
HDL2 IDL
Apo B100
Clula No Hepatica
LCAT
CE CE
CE
CETP
TRANSFERENCIA DE ESTERES DE COLESTEROL y Apo E Apoprotenas DESDE LAS HDL POR CETP (PRODUCIDA EN EL HGADO) A LAS LIPOPROTENAS VLDL, IDL Y LDL QUE CONTIENEN Apo B 100 EN INTERCAMBIO POR TAG
Apo E
LDL
Apo B 100 Colesterol
CE Apo C2, E y CE CE A1 con LCAT y CE CE, PLTP LCAT y FORMACIN DE HDL PLTP
CON DISTINTAS DESNSIDADES 3, 2 Y 1. SEGN FORMA Y CONTENIDO DE LPIDOS
ABC1
HDL 3
maduras Apo C1,C2,C3 Apo A1, A2, E RECIBEN COLESTEROL QUE SE ESTERIFICA POR LCAT. CE: COLESTEROL ESTERIFICADO EN EL CENTRO RODEADO DE FOSFOLPIDOS
HDL1
Apo A1, E
CETP
Fig. 10 - 10. Distribucin de los complejos Lipoproteicos en el organismo.
La desaparicin de los Quilomicrones, en general depende de varios factores como lo son: a) la presencia de una LPL activa y sin deficiencias b) la presencia de una HDL con Apo CII y Apo E normales (Ver Tabla I de Apoprotenas) c) La presencia de una Protena Transferidora de Apoprotenas, que posee la HDL y dona a otras lipoprotenas, como lo s el remanente de Quilomicrn y aquellos factores necesarios (Apo E) para mejorar su remocin por el hgado.
492
Por lo tanto si los Quilomicrones no son procesados correctamente, como es el caso en que la Apo CII falla en activar a la LPL o bien falla el receptor del hgado y no reconoce a la Apo E que acompaa al Quilomicrn, este contina circulando y aumenta sus niveles por ms tiempo producindose la Hiperquilomicronemia. Volver inicio b) CICLO ENDOGENO. Los componentes lipdicos internalizados en el ciclo anterior se reagrupan y esterifican volviendo a salir posteriormente del Hgado, junto a los componentes de origen endgeno como los paquetes de VLDL o Lipoprotenas de Muy Baja Densidad (Fig. 10 10 y Tabla I de Apoprotenas) que contienen Apo B 100, C y E. La sntesis de estas Apoprotenas se encuentra regulada por la expresin de la Apo B100, la relacin entre la enzima ACAT y las enzimas hidrolizadoras del Colesterol ms la actividad de la Insulina. La VLDL procede a un nuevo recorrido hacia el tejido adiposo, msculo, corazn y glndula mamaria, donde nuevamente por accin de las enzimas LPL y la LCAT activadas por las correspondientes Apoprotenas hidrolizan los fosfolpidos y steres de colesterol para su internalizacin y posterior esterificacin. De forma similar a la anterior se internalizan los productos de la hidrlisis de los paquetes para dejar un remanente de VLDL denominado IDL o Lipoprotena de Densidad Intermedia. La IDL es rica en colesterol esterificado y la mitad es internalizada por endocitosis en el hgado mediante los receptores de la lipoprotena LDL (Lipoprotena de Baja Densidad), ya que ambas poseen la lipoprotena Apo E y pueden interaccionar con los mismos receptores Apo E afines. El resto de las IDL pasa a transformarse en LDL perdiendo su Apo E, la que es de gran afinidad por los receptores del hgado quedando ahora solo con Apo B 100 que presenta una afinidad menor. Esta ltima es capaz de unirse a receptores perifricos de VLDL nuevamente. Las LDL recin formadas son las que permanecen largo tiempo en circulacin y manejan el 65 a 70% del colesterol transportndolo hacia los tejidos perifricos (Fig. 11 - 10).El principal componente de las LDL es la Apo B100 que se une a los receptores de los tejidos perifricos como son los fibroblastos. Estas clulas tienen receptores que reconocen a la Apo B100 de las LDL y a las Apo E de las HDL1 (Lipoprotenas de Alta Densidad, fraccin 1). Cuando el plasma tiene un color amarillo-anaranjado ocurre una Hipercolesterolemia (otra de las Dislipidemias, Tabla II). En este caso la LPL funciona bien, pero el reciclaje del remanente de la Apolipoprotena VLDL o IDL no, ya que pierde su Apo E. De esta manera aumentan las IDL y LDL, incluso algunos pacientes producen otra Apo E (isoforma) con baja afinidad por los receptores. Un efecto similar ocurre durante el sndrome nefrtico, la Diabetes Mellitus donde se produce la Glicosilacin de las Apoprotenas y en los casos de Alcoholismo donde ocurre la acetilacin de ellas o la falla en su sntesis por el hgado. Por otro lado, la falla gentica de los receptores para estas lipoprotenas en el hgado, tambin impide su internalizacin, de tal manera que los complejos lipoproteicos vuelven a la circulacin y depositan su colesterol en los tejidos perifricos, lo que acarrea la llamada Hipercolesterolemia Familiar (Tabla 3 - 10), enfermedad que se manifiesta por la aparicin de ateroesclerosis a temprana edad. al
493
Las causas por las que se desencadena la Hipercolesterolemia Familiar se pueden atribuir a fallas del receptor en:
Colesterol Protena
H
o oc
o
P
Fosfolpidos
Colesterol esterificado
LDL
Receptores
H o H o
HMG CoA Reductasa

H o
Clatrina 1) Fijacin de la Apo B 100 a los receptores

H o Ho
H o
H o
H o
2) Polimerizacin de las molculas de Clatrina 3) Endocitosis 4) Fusin con Lisosoma, , Hidrlisis de Esteres de Colesterol y Protenas
ACAT Receptores a L D L
H o
5) El Colesterol libre no esterificado inhibe la HMG CoA Reductasa , estimula la Colesterol Acil transferasa e inhibe la sntesis de Receptores.
Fig. 11 - 10. Composicin de la partcula de LDL y su internalizacin en los fibroblastos, donde provoca la inhibicin de la sntesis del Colesterol.
a) Su anclaje a la membrana. b) Falta de unin a las LDL, aunque estn los receptores bien anclados. c) Baja afinidad por las LDL. d) No se internaliza el receptor una vez unido a las LDL. e) Ausencia total del receptor para la unin a las LDL. Otra enfermedad relacionada con los lpidos es la Hipercolesterolemia e Hipertrigliceridemia familiar (tipo I I) (Ver Tabla I I I -10). Donde el Colesterol del plasma aumenta al doble, mientras que los triglicridos de 9 a 10 veces, su principal caracterstica es la existencia de VLDL que contienen Apo B-48, el que se debe encontrar normalmente en los Quilomicrones, ya que se sintetiza en la mucosa intestinal y su presencia anormal en las VLDL sugiere que estas ltimas son en realidad remanentes de Quilomicrn, ya que las VLDLs que salen del hgado solo emplean a las Apo B100. Otra de las Dislipidemias, es la Hipertrigliceridemia, que se caracteriza por una falla en la enzima Lipoprotena Lipasa de los endotelios capilares o bien por una falla a nivel de la Apoprotena (Apo C2) que activa a esta enzima. Por esta razn al no ser degradados e internalizados los lpidos permanecen circulando y los Triglicridos suben sobre los 250 mg/dl en el plasma provocando otras complicaciones, como lo es una Pancreatitis. Las HDL son las lipoprotenas conocidas como buenas, es decir llevan colesterol al hgado para convertirlo en sales biliares, en otras palabras se encargan del transporte reverso. Un nivel elevado de estas lipoprotenas se asocia con longevidad. Tambin se
494
encuentran elevadas en algunas razas, como sucede en el caso de esquimales, cuya dieta es rica en grasas y no presentan mayores problemas de oclusin coronaria. La protena precursora de las HDL es la Apo A1 que proviene del intestino e hgado (Fig. 10 - 11). Esta recibe Fosfolpidos y Colesterol libre formando una partcula discoidal que se encuentra constituida por LCAT que esterifica el colesterol y lo guarda en el centro rodeado de Fosfolpidos. A medida que la enzima LCAT esterifica el colesterol, las HDL toman forma micelar y se separan en varias fracciones. Las fuentes de Colesterol para las HDL son las clulas muertas, los macrfagos, el recambio de membranas y los remanentes de Quilomicrn, VLDL e IDL. De estos paquetes es tambin posible obtener algunas de sus Apoprotenas, como la Apo A1 desde los Qm y las Apo C desde las VLDL. La principal fraccin de las Lipoprotenas de Alta Densidad es la HDL3, formada por el traspaso de Apoprotenas y lpidos de los remanentes de VLDL y Quilomicrones. La HDL3 esta formada por las apoprotenas Apo A1, A2 y las Apo C1, C2 y C3. Este paquete o complejo recibe Colesterol de clulas muertas y macrfagos, que luego se esterifica con LCAT y al mismo tiempo recibe lpidos proveniente de los recambios de membranas por la PLTP (Protena transferidora de Fosfolpidos). Despus de cargada pasar a dar origen a la HDL2, esta ltima fraccin es finalmente atrapada por el hgado, mediante el receptor atrapador B1 (SR-B1). Otra de las fracciones similares a las anteriores es la HDL1 con Apo E, este complejo es rico en steres de colesterol por lo que puede volver al hgado y entregar colesterol, para la sntesis de cidos biliares o hacer transferencia de lpidos y Apoprotenas a las IDL. Sin embargo, su rol principal parece ser el desplazar competitivamente a las LDL de los receptores perifricos para las Apoprotenas B y E, evitando de esta manera la captacin de las LDL. Esto se debe a que el complejo Apo E- HDL1 ocupa los cuatro sitios de unin del receptor destinado a las Apoprotenas B y E que forman parte de cada uno de los cuatro complejos de LDL. En resumen, el Transporte de Colesterol Reverso desde los tejidos perifricos hacia el Hgado, parte con los macrfagos, que han atrapado colesterol y que luego lo ceden al hidrolizar su ster dejndolo como Colesterol libre. Este ltimo es sacado de la clula y transferido por la protena ABC1 o ATP- Binding Cassette Protein, hacia las Apo A1 circulantes constituyendo las HDL nacientes de forma discoidal. Por otro lado, mediante la accin de la LCAT (Lecitina Colesterol Acil Transferasa ), se esterifica el Colesterol libre y se guarda en el centro de la HDL naciente, quedando rodeado por una capa de Fosfolpidos. Ahora pasa a constituir una HDL3 o madura de forma esfrica. Este complejo lipoproteico, puede a su vez ser internalizado en el Hgado por la Protena Scavenger (atrapadora) , la cual acta como receptor (SR-B1). Posteriormente el Colesterol en el Hgado se dirige a formar las sales biliares. Volver inicio al
4) APOPROTENAS TABLA 2 -10
495
APOPROTENAS Apo A-1 Apo A-2 Apo A-4 Apo B48
PMs kDs 29,0
LIPOPROTENA DONDE SE ASOCIA
FUNCION
Apo B100
Apo C-1 Apo C-2 Apo C-3
CETP Protena Transferidora de Colesterol o Apo D Apo E (tiene 34,0 3 alelos con varias isoformas) Apo H 50,0 Apo (a)
Prot. Estructural. Se deriva del gen de la Apo B100 y se obtiene por edicin o recorte del RNA transcrito primario en el epitelio intestinal. Carece del dominio de unin al receptor, presente en la Apo B 100. 513,0 VLDL, IDL y LDL. Prot. Estructural. Se une al receptor de las En mayor LDL. Es una de las protenas ms largas proporcin en LDL. conocidas. Se une con baja afinidad a receptor LDL en el hgado 7,6 Quilomicrones, Activa a LCAT VLDL, IDL y HDL 8,9 Quilomicrones, Activa a la Lipoprotena Lipasa endotelial VLDL, IDL y HDL (LPL) 8,7 Quilomicrones, Inhibe a la Lipoprotena Lipasa endotelial VLDL, IDL y HDL (LPL) o 20,0 HDL Paso de esteres de Colesterol a las HDL
Quilomicrones y en gran proporcin en HDL 17,4 Quilomicrones y en mayor proporcin en HDL 46,0 Quilomicrones y HDL 241,0 Quilomicrones
Activa a la LCAT (Lecitina Colesterol Acil Transferasa) Activa Lipasas Hepticas En Lipoprotenas ricas en TAG
Remanentes de Se une al receptor LDL en el hgado con Quilomicrn, VLDL, alta afinidad. Uno de sus alelos se IDL y HDL encuentra en alta proporcin en personas susceptibles al Alzheimer. Quilomicrones Metabolismo de los TAG Apo (a)- LDL: forma Unida por puente disulfuro a la Apo B100. la Lipoprotena (a) Lleva Colesterol a los sitios de dao vascular. Unida a LDL es asociada a Aterosclerosis y enf. Coronaria.
Las HDL como un todo, poseen gran cantidad de otras lipoprotenas, as tenemos a las Apo A1 que activan LCAT y a las Apo A2, A4, C1 y C2 que activan a la LPLPasa y a la Apo C3 que la inhiben. Tambin cuentan con la Apo D y Apo E que activan la remocin de Qms y VLDLs.
496
La enzima LCAT es otro componente de este paquete y se sabe que las HDL tambin pueden pasar steres de Colesterol a las LDL por medio de una protena lanzadera CETP (CETP: Cholesterol Ester Transfer Protein). Volver al inicio 5) DISLIPIDEMIAS TABLA 3 -10 TIPO Hipercolesterolemia Familiar Tipo I DESORDEN Deficiencia de la enzima Lipoprotena Lipasa (LPL) DEFECTO Falla sntesis LPL o LPL mutada o bien deficiencia de Apo C I I Defectos en los receptores de LDL CARACTERSTICAS Clearance de Qm lento, niveles reducidos de LDL y HDL. Se trata con dieta baja en grasa y carbohidratos, no hay riesgo de enfermedad coronaria Clearance reducido de LDL produce una hipercolesterolemia que lleva a la aterosclerosis y enfermedad coronaria
Hipercolesterolemia Familiar Tipo I I
Disbetaliproproteinemia Familiar Tipo I I I o enfermedad de la eliminacin de los remanentes de VLDL y Qms
Receptores con baja afinidad o baja capacidad de anclaje a la membrana o bien no se internalizan una ves unidos a las Lipoprotenas Deficiencia de Apoprotena E
Apo E anormal. Pacientes con Apo E2, que interacta pobremente con el receptor
Hiperaciltrigliceridemia Familiar o Tipo IV
Exceso de VLDL
Tipo V Familiar
Niveles elevados de Colesterol y
Exceso de lpidos circulando causa Xantomas, Hipercolesterolemia y aterosclerosis en arterias perifricas y coronarias debido a elevados niveles de Qms y VLDLs Elevado nivel de Asociada con Diabetes VLDL asociado Mellitus Tipo II, con intolerancia obesidad, alcoholismo y a la Glucosa e administracin de hiperinsulinemia progestgenos. Se observa un colesterol elevado como resultado del aumento de las VLDL debido a Hiperaciltrigliceridemia motivos Hipercolesterolemia desconocidos Con disminucin de
497
VLDLs Niveles aumentados de HDLs Hiperbetalipoproteinemia Produccin familiar o Tipo I I elevada de LDL y Clearance retardado de TAG y AGs Apo B ligante-defectuoso Afinidad familiar disminuida de LDL por su receptor Hiperalfalipoproteinemia Familiar
Causas genticas
LDLs y HDLs Buena salud y longevidad Asociado a enf. Coronaria
2 mutaciones diferentes Gln por Arg (3500) y Cys por Arg (3531)
Deficiencia Familiar de LCAT
Ausencia de LCAT
Enf. De Wolman
Deficiencia de la Triacilglicerol Lipasa Heptica liberada por Heparina
Falla en el Lisosoma la Hidrolasa de esteres de Colesterol Falla o esta ausente la TAG-Lipasa
Aumento dramtico de LDL, no se afectan las HDL, VLDL y TAG plasmticos. Producen Hipercolesterolemia y enf. Coronaria prematura Las HDL no Clearance reducido de pueden capturar LDL que conduce a Colesterol sin hipercolesterolemia con LCAT aterosclerosis y enf, coronaria Afecta metabolismo de LDLs Acumulacin de HDL ricas en TAG y de remanentes de VLDL o IDLs Xantomas y enf. coronaria
La falla de algunas de las Apoprotenas como la disponibilidad de la E o la C, las Lipoprotenas Lipasas, la Lecitina Colesterol Acil Transferasa, por nombrar algunas provocan las enfermedades conocidas como Dislipidemias, en que el control y proporcin en que circulan las Lipoprotenas se encuentra afectado. En la siguiente Tabla se pueden observarlas caractersticas de algunas de ellas. Recientemente se le ha atribuido importancia a la Lipoprotena a (Lp a), que presenta una estructura compleja consistente en un ncleo de LDL unido covalentemente a una Apoliprotena (a). Esta ltima presenta un dominio similar a una Proteasa y otro dominio parecido al Plasmingeno. La Lipoprotena (a), es producida en el hgado y sus elevados niveles (mayores de 0,3 gr/lt) se asocian con la enfermedad coronaria y aterosclerosis. Ocurre que la Apolipoprotena (a) que se encuentra asociada a ella, es capaz de competir con el Plasmingeno para la unin a la Fibrina, as inhibe la disolucin de los cogulos o Fibrinolsis, adems puede unirse a sitios especficos del endotelio capilar estimulando el crecimiento de la musculatura lisa y con ello contribuye a ocluir los capilares y arterias. Por lo tanto, se la ha asociado con infartos repentinos, en aquellas personas jvenes y que hacen ejercicio.
498
Volver inicio 6) TEJIDOS INVOLUCRADOS EN EL MANEJO DE LOS LIPIDOS.
al
A continuacin analizaremos el rol de los tejidos involucrados en el manejo de los lpidos, como son el tejido adiposo como reservorio, el msculo como efector de la energa extrada a los lpidos por oxidacin y el hgado como rgano sintetizador de lpidos (Fig. 12 10). Los cidos grasos son aportados a los tejidos en forma de Triacilglicerol mediante las lipoprotenas del plasma e hidrolizados en cidos grasos libres por medio de la Lipoprotena Lipasa Capilar, la que a su vez es activada por una de las lipoprotenas del complejo antes de entrar al adipocito. Una vez en su interior, se esterifican nuevamente para formar los TAG de almacenamiento con Glicerol-3-Fosfato proveniente de la Gliclisis.
CEREBRO
GLICEROL
ADIPOCITO
ACS . GRASOS ALBUMINA
MUSCULO
TAG CTC
GLICOLISIS
ACS. GRASOS
GLICEROL 3- P
- OXIDACION
GLICOLISIS
CTC
VLDL
GLUCOSA VLDL HIGADO
GLUCOSA CUERPOS CETONICOS
GLUCOSA CUERPOS CETONICOS
Qm
Q m : Quilomicrones V L D L : Lipoprotenas muy baja densidad C T C : Ciclo Tricarbox'ilico T A G : Tri Acil Glicerol Vena Subclavia izquierda
ESTA VIA OCURRE SOLO EN AYUNAS
SISTEMA LINFATICO Qm INTESTINO
EL ADIPOCITO CARECE DE GLICEROL QUINASA Y NO EMPLEA GLICEROL ENDOGENO
Fig. 12 - 10. Distribucin de los Lpidos desde el Hgado a los tejidos perifricos.
499
Los lpidos almacenados en el tejido adiposo no solo provienen de la dieta, sino que pueden
Glucosa
Triacil Gliceroles y Fosfolpidos
La Glucosa puede formar Acetil - SCoA que es el precursor de los Lpidos y tambien formar Glicerol - 3 - P necesario para TAG y PL.
Glicerol - 3 - P
Acido Graso activado
Acido Graso
Esteroides
Piruvato
-Oxidacin
Malonil - SCoA Acetil - SCoA Lanzadera Citrato-Malato Citrato AOA Citrato Isocitrato Colesterol
Acetil - SCoA
CTC
Malato
Cuerpos Cetonicos
AOA Malato
-Cetoglutarato
Fumarato
Succinil - SCoA
Fig. 13 - 10. La glucosa participa en la sntesis de Triacilgliceroles por medio del Glicerol-P de la Gliclisis y el Acetil-SCoA.
haber sido generados por distintos precursores. Uno de ellos lo constituyen los Hidratos de Carbono u otros precursores de origen proteico, ya que los aminocidos son tambin capaces de transformar su esqueleto hidrocarbonado en lpidos despus de remover el amonio de su estructura. Esta ltima va se incrementa en los casos de ayuno prolongado. Los adipocitos estn constituidos por una gran vacuola central con un ncleo perifrico y solo unas pocas mitocondrias. Su funcin principal es la de almacenar Triglicridos (TAG), para lo cual recurren a la Gliclisis como fuente de energa y como productora de Glicerol3-Fosfato para la sntesis de los TAGs, (Fig. 13 - 10). Los adipocitos no poseen la enzima Glicerol Quinasa por lo tanto extraen el Glicerol-3-Fosfasto por medio de la reduccin de un intermediario glicoltico, como es la Fosfo-Dihidroxicetona.
500
La degradacin de los TAG de almacenamiento en el Adipocito ocurre por un mecanismo de regulacin en cascada donde intervienen los niveles de epinefrina y glucagn, como agentes lipolticos y la insulina como agente antilipoltico que descompone el AMPc en 5AMP. Se emplea en este mecanismo la Adenil Ciclasa, el segundo mensajero AMPc y una Protena Quinasa que activa a la TAG Lipasa por fosforilacin, en conjunto con las Diacil Glicerol Lipasa (DAG) y la Mono Acil Glicerol Lipasa (MAG). Una vez liberados los cidos grasos de los TAG, estos pueden salir a la circulacin y unirse a la Seroalbmina, para dirigirse al msculo donde se oxidarn. Por su parte el Glicerol liberado de los TAG, pasar al hgado donde ser oxidado posteriormente por la va Glicoltica o bien podr convertirse en Glucosa por Glucognesis. El msculo es el lugar donde los cidos grasos s oxdan durante el metabolismo aerbico y se transforman finalmente en CO2 y H2O. La fibra muscular roja es la responsable de la contraccin sostenida y ocupa cidos grasos como su principal combustible y secundariamente Glucosa, ya que las enzimas del Ciclo Tricarboxlico estn aumentadas aqu drsticamente en comparacin con los niveles encontrados en las fibras musculares blancas. Uno de los requerimientos para que entre el Acetil-SCoA proveniente de la -Oxidacin al CTC es el aporte de intermediarios al Ciclo Tricarboxlico, mediante las reacciones anapleriticas. De esta manera se puede contar con un nivel de Oxaloacetato adecuado para formar Citrato, ya que la presencia de solo Acetil-SCoA no aporta intermediarios de al Ciclo como lo hacen los Aminocidos y la Glucosa. En humanos el principal rgano encargado de la sntesis de los lpidos es el hgado, donde los equivalentes reductores se obtienen por medio de la Va de las Pentosas. El tejido adiposo, la glndula mamaria y la corteza adrenal tambin cuentan con esta va para obtener NADPH. La Ribulosa-5-Fosfato, como producto de la Va de las Pentosas debe volver a la va Glicoltica por medio de una serie de reacciones destinadas a evitar su acumulacin, (Fig. 14 - 10). El NADPH no solo se necesita para la sntesis de cidos grasos sino que tambin para la sntesis de Colesterol.
V a d e la s P e n t o s a s o V a d e l F o s f o g lu c o n a t o C c lic a c o m o p r o d u c t o r a d e N A D P H e n la G l n d u la M a m a r ia , T e jid o A d ip o s o y C o r t e x A d r e n a l.
6 G lu c o s a - 6 - P + 12 N A D P + 6 H 2O 6 R ib u lo s a - 5 - P 6 R ib u lo s a - 5 - P 4 F ru c tos a - 6 - P + 6 CO2 + 12 N AD PH + 12 H
+ 2 G lic e r a ld e h id o - 3 - P
G lic e r a ld e h id o - 3 - P
D i - h id r o x i - C e t o n a - P
G lic e r a ld e h id o - 3 - P F r u c to s a - 1 , 6 - b i - P
+ D i - h id r o xi - C e t o n a - P + H 2O
F r u c to s a - 1 , 6 - b i - P F ru c tos a - 6 - P + Pi
5 F ru c tos a - 6 - P G lu c o s a - 6 P + 12 N AD P + 7 H 2O 6 CO2
5 G lu c o s a - 6 - P + 12 N AD PH + 12 H + P i
Fig. 14 - 10.La Va de las Pentosas produce NADPH y su producto la Ribulosa-5-P pasa luego a la Va Glicoltica.
501
Un tejido de excepcin es el Tejido Graso Pardo que se encuentra en los animales que hibernan o se encuentran estresados por el fro. Tambin se le encuentra en los recin nacidos incluyendo a los humanos. Tiene una gran cantidad de mitocondrias y de all su color debido a los citocromos presentes en ellas. El tejido graso pardo no solo sirve para aislacin trmica, sino que produce una gran cantidad de calor debido a que la oxidacin de los cidos grasos no est acoplada a la sntesis de ATP. La especialidad de este tejido, es en realidad la produccin de calor ya que en animales como los osos durante su periodo de hibernacin, la temperatura se mantienen a 34oC, por lo que es posible una rpida recuperacin a 37oC ante la presencia de algn peligro (Fig. 15 - 10). En la mitocondria del tejido graso pardo existe un sistema que permite la regulacin del paso de los protones. Este ocurre desde el espacio intermembrana (donde se acumulan por las sucesivas reacciones de oxidacin de las Coenzimas de la Cadena de Transporte de Electrones) a la matriz mitocondrial, por medio de una protena de 32kD, la que no se encuentra acoplada a la sntesis de ATP como ocurre en la mitocondria normal donde se le halla unida a la ATP Sintasa. Esta protena transportadora se encuentra aqu regulada por los niveles de GDP presentes y sucede que a menor cantidad de GDP mayor paso de protones y mayor produccin de calor por la Cadena de Transporte de Electrones ( Ver Captulo 12).
SISTEMA TERMOGENICO CORTOCIRCUITO DEL SISTEMA QUIMIOSMOTICO EN EL TEJIDO GRASO PARDO La energa destinada a la sntesis de ATP se pierde por calor ACS. GRASOS H+
GRADIENTE QUIMIOSMOTICO
H+
H+
H+ H + H + CTE
H+
H+
MEMB. EXTERNA H+ H+ + H H+ MEMB. INTERNA H+
NADH + H
FADH
2
H+
H+ H
H+ GDP GDP H+
Entrada de los sint la sntesis de ATP
PROTEINA REGULADORA DE LA ENTRADA DE H+
CTC
MATRIZ MITOCONDRIAL
- OXIDACION
La unin de GDP inhibe conductancia de los l t
Fig. 15 - 10. El gradiente de protones se colapsa produciendo solamente calor y no ATP. El cortocircuito de los protones se encuentra regulado por la Termogenina.
Se puede concluir que las funciones de los distintos tejidos involucrados en el metabolismo de los Lpidos son las siguientes:
502
a) Hgado: recibe remanentes de Quilomicrn y almacena Triglicridos. Obtiene energa por -Oxidacin y puede mandar Acetil-SCoA al citoplasma para la sntesis de cidos grasos endgenos por la cido Graso Sintasa. Forma Cuerpos Cetnicos cuando el Oxaloacetato es deficiente durante la inanicin, ya que se dirige a Malato para ir a la Gluconeognesis. En situaciones normales puede ir a la Gluconeognesis con Lactato, Piruvato, Alanina, y aminocidos Gluconeognicos. En especial con Glicerol del tejido adiposo,. El hgado mismo se puede mantener con Cetocidos derivados de los aminocidos deaminados por Transaminacin o deaminacin oxidativa, que entran al Ciclo Tricarboxlico. Sintetiza tambin lipoprotenas para el transporte de lpidos. Sintetiza Colesterol y sales Biliares, almacena vitaminas Liposolubles. b) Msculo: Emplea para obtener energa en la forma de ATP a los siguientes sustratos: Glucosa, cidos Grasos y Cuerpos Cetnicos. El corazn es un gran consumidor de Acetoacetato , uno de los Cuerpos cetnicos en casos de ayuno o inanicin. En las fibras aerbicas y en el corazn (msculos aerbicos), la -Oxidacin de los cidos grasos se encuentra estrechamente acoplada a la cadena de transporte de Electrones y mnimas cantidades (microgramos) de NAD y FAD producen oxidacin de gramos de cidos grasos. El Corazn mismo emplea cidos grasos, Acetoacetato, lactato y piruvato, aunque es capaz de almacenar algo de Glicgeno. c) Tejido Adiposo (Tabla 4 10): Almacena TAG y necesita de Glucosa para obtener Fosfo-Dihidroxicetona que por una posterior reduccin con NADH pasa a GlicerolFosfato. Este ltimo se emplea en la sntesis de los TAG. Libera cidos grasos que se unen a la Albmina durante la inanicin, el ejercicio y el estrs. Tabla 4 - 10 Regulacin Hormonal de la cascada que conduce a la liplisis en el Tejido Adiposo Liberacin Rpida Epinefrina Norepinefrina Glucagn ACTH Secretina Vasopresina Liberacin Lenta Glucocorticoides Hormona del crecimiento Inhibidores Insulina
d) Cerebro o tejido nervioso. Emplea Glucosa aerbicamente y cuerpos cetnicos en ayuno o inanicin para obtener su energa. 20% del Oxgeno consumido en estado de reposo es ocupado por el cerebro para mantener el Potencial Transmembrana. Este depende a su vez de la concentracin de K+ (dentro de la clula) y Na+ (fuera de esta), mientras que el ATP producido por la Gliclisis aerbica, se gasta en mantener esta separacin de iones y su proporcin a travs de las membranas por las enzimas Na+, K+ ATP asas.
e) La Glndula Mamaria Lactante.
503
Parte de los lpidos de la leche son aportados por el organismo mediante el empleo de las Lipoprotenas transportadoras como Quilomicrones (de la dieta) y VLDLs (sntesis en el hgado) y otros son sintetizados por la misma glndula mamaria (sntesis de novo en clulas epiteliales), es decir a partir de Glucosa. La cual es imprescindible en la sntesis de los componentes de la leche. La Glucosa tambin es una fuente de Lactosa, disacrido formado por Galactosa y Glucosa. Para su conversin se emplea la reaccin de la UDP-Glucosa (Fig. 16 10). La va parte con la reaccin desde Glucosa a Glucosa-1-P y de Glucosa-1-P a Glucosa-6-P, posteriormente se activa de Glucosa-6-P a UDP-Glucosa y una vez activada con una epimerasa, se invierte el grupo en posicin 4 para formar la UDP-Galactosa la que se une a otra Glucosa. La lactosa se acumula en el aparato de Golgi.
GLICGENO + PI GLUCOSA + ATP
GLUCOSA 1 P GLUCOSA-6-P UTP UDP - GLUCOSA EPIMERASA (en carbono 4) UDP- GALACTOSA UDP LACTOSA
Fig. 16 -10. Transformacin de Glucosa en Galactosa
GLUCOSA
Los compuestos que se deben tener en la leche son triglicridos, lactosa y protenas. Para ello se requiere de una constante previsin de energa que en un 90% proviene de la Mitocondria en la forma de ATP. Otra va predominante lo constituye la Va de las Pentosas, que a partir de Glucosa produce Pentosas y NADPH. Esta ltima es la principal coenzima para la sntesis de los cidos grasos y en su produccin se emplea aqu ms Glucosa que la misma Gliclisis. Otra fuente de NADPH lo constituye la Enzima Mlica que transforma Malato en Piruvato con salida de un CO2. La enzima marcapaso de la sntesis de los cidos grasos es en este caso la Acetil-SCoA Carboxilasa que produce Malonil-SCoA a partir de Acetil-SCoA. En el Retculo Endoplsmico Liso de las clulas alveolares, a partir de cidos grasos y Glicerol se produce el ensamble de los triglicridos. Posteriormente coalecen en gotas mayores que se dirigen al pice de la clula donde se agrupan y forman una protuberancia, que sale por exocitosis, rodeada de una membrana que a su vez tiene fosfolpidos y
504
colesterol. Esta membrana evita que continen creciendo los glbulos en gotas cada vez mayores por adicin de ellos y se conviertan en elementos difciles de secretar. Los lpidos en la leche humana constituyen solo un 4% y en su mayora son triglicridos. 20% de ellos son de cadena de tamao medio (12: 0, 14: 0 o 16: 0) sintetizados en la misma glndula mamaria y el resto son derivados de los aportes del plasma (dieta, hgado). Volver inicio 7) DEGRADACION DE TRIACILGLICEROLES Y -OXIDACIN DE LOS ACIDOS GRASOS. Se proceder a describir de manera integrada la degradacin de los Triacilgliceroles desde una vacuola presente en el tejido adiposo hasta su oxidacin en el Msculo o en el Hgado. La Epinefrina, Norepinefrina, la Adrenocorticotropina y el Glucagn estimulan sus receptores en la superficie del Adipocito activando una cadena de amplificaciones en cascada donde intervienen la protena G, la Adenil Ciclasa y la formacin de AMPc. El nivel de AMPc es disminuido por la Insulina que inhibe la Liplisis. Este segundo mensajero activar luego a la Protena Quinasa y esta ser capaz de fosforilar a la Lipoprotena Lipasa, la que actuar hidrolizando secuencialmente los cidos grasos de un Triacilglicerol (Fig. 17 - 10). al
AMPLIFICACION EN CASCADA DE LA DEGRADACION DE TRIACILGLICEROLES (TAG). MEMB. CITOPLASMATICA
R G
ATP PROT. QUINASA
AC
AMPc AMPc
R C
inact.
R +
ATP
act. FOSFORILACION P ADP
TGL
TAG
VESICULA CON TAG
DAG + AGL
MAG + AGL
DAG MAG
Glicerol + AGL
Fig. 17 - 10. Cascada de amplificacin para la activacin de la Triacilglicerol Lipasa.
Se puede observar en la Figura 17 - 10, que la enzima Triacil Glicerol Lipasa (TGL) esta sometida a un estricto control por modificacin covalente o por el mecanismo de Fosforilacin-Defosforilacin. Una vez que el cido graso libre sale del tejido adiposo circula unido a una protena que es el mayor constituyente del plasma y se conoce como Seroalbmina. Por otro lado, como el
505
tejido adiposo carece de la enzima Glicerol Quinasa, el Glicerol libre puede ser esterificado nuevamente o viaja al Hgado donde pasa a Glicerol-Fosfato y a Fosfo-Dihidrxicetona integrndose entonces a la Gliclisis. El cido graso libre en el citoplasma del Hepatocito, sufre la activacin es decir, se lo lleva a un nivel de energa superior donde puede ser manejada su estructura para alargarla en el Retculo Endoplsmico Rugoso u oxidarla y extraer la energa total de su molcula en el interior de la Mitocondria. La activacin se lleva a cabo por medio de la enzima Acil-CoASintasa, con un gasto de energa equivalente a dos ATPs. Acil-SCoA-Sintasa CH3(CH2)nCOOH + ATP + CoA-SH---->CH3(CH2)nCO-S-CoA + AMP + PPi La reaccin hasta aqu es reversible y solo cuando se rompe el PPi por accin de una Pirofosfatasa se hace irreversible y exergnica: PPi---------> 2Pi
TRANSPORTADOR CARNITINA
ACTIVACION
O C H ( CH )
3 2 14
CAT 1 CAT 2 TLC
: Carnitina Acil Transferasa 1 : Carnitina Acil Transferasa 2 : Translocasa MEMB. INT.

CARNITINA
O CH O CH
3 3
MEMB. EXT.
CARNITINA
CH CH
3 3
C O
O
2
CH
ATP AMP PP i
Co A SH
CH OH
CH
CH
CH OH
CH
CH
CH
CAT 1
O
2 14
TLC
CAT 2
O CH ( CH )
3 2 14
C H ( CH )
3
C O S CoA
C O S CoA
PALMITOIL - S - CoA
PALMITOIL CARNITINA
Co A SH
PALMITOIL - S - CoA
Co A SH
ENZIMA CAT 1 INHIBIDA POR MALONIL - S - CoA CITOPLASMA ESPACIO INTERMEMBRANA
OXIDACION MATRIZ MITOCONDRIAL
Fig. 18 - 10.Transporte de los cs. Grasos al interior de la Mitocondria.
Una vez activado el cido graso, este puede dirigirse a la mitocondria donde sufrir Oxidacin. El transporte al interior de la mitocondria se produce por medio de una molcula denominada Carnitina (Fig. 18 - 10). Aquellos cidos grasos con cadenas menores a diez carbones, no necesitan de este sistema de transporte y pasan fcilmente la membrana interna de la mitocondria, ya que la membrana externa es permeable para todos, pero la membrana interna es ms selectiva y todos los
506
cidos grasos de ms de diez carbones deben emplear el sistema del transportador Carnitina. Aquellos cidos grasos de mayor tamao sufrirn una oxidacin previa en los Peroxisomas para pasar posteriormente a ser degradados en la Mitocondria. Para entrar a la Mitocondria se emplean tres enzimas que se denominan CAT 1 o Carnitina Acil Transferasa 1 (Fig. 19 - 10), la que une la Carnitina al cido graso desplazando a la Coenzima A exgena, la segunda enzima es la Translocasa que pasa el complejo de cido Graso-Carnitina a travs de la membrana y finalmente la Carnitina Acil Transferasa 2, que retira la Carnitina para otro ciclo y a la vez restaura la activacin previa del c. Graso con la CoASH endgena.
Memb. Ext. Memb. Int.
Mitocondria
- Oxidacin
O ( CH2 ) CH2 CH2 C
CH3
12
S Co A
CARNITINA
Co A S C O CH2 CH2 ( CH2 ) CH3 12
CARNITINA CAT 1 CAT 2
FAD FADH 2 H O C H C S Co A
(CTE)
PALMITOIL CARNITINA
TLC
PALMITOIL CARNITINA
CH3 ( CH2 )
12
H2O
OH
CoASH
CoASH
O C H C S Co A
CH3
( CH2 ) 12
C H
NAD NADH + H O C CH3 ( CH2 ) O 12 CH C S Co A 2 CoASH O C ( CH2 ) 12 S Co A O CH3 C S Co A
(CTE)
CH3
CICLO TRICARBOXILICO (CTC) 8 CH3

C
Co A
CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES (CTE)
Fig. 19 - 10.Oxidacin de los c. Grasos al interior de la Mitocondria.
El cido graso activado en el interior de la mitocondria, dispone de un alto nivel de coenzimas NAD y FAD oxidadas. Estas procedern a retirar sucesivamente los protones del cido graso mediante un procedimiento denominado, -Oxidacin (Fig. 18 - 10). Esta serie de reacciones
507
consisten en una oxidacin con FAD, hidratacin y una nueva oxidacin, pero esta vez con NAD, para rematar con una tilisis empleando CoASH. De esta manera se cortan sucesivas unidades de dos carbonos, desde el grupo carboxilo inicial hasta el final de la cadena alqulica. En el cido graso intacto los carbones que se oxidan sern siempre los . Un cido graso de 16 carbones producir 8 molculas de Acetil-S-CoA y uno de 18 carbones dar 9 molculas de Acetil-S-CoA La primera reaccin de oxidacin ocurre con la enzima Acil-CoA-Deshidrogenasa que emplea FAD como coenzima en vez de NAD, de esta manera la reaccin se hace ms exergnica o es mayormente favorecida por su potencial de xido reduccin. Acil CoA-Deshidrogenasa H CH3(CH2)n - CH2 - CH2 CO S - CoA + FAD ---->CH3(CH2)n C = C CO S - CoA + H FADH2 Trans -2Acil-S-CoA La segunda reaccin, es una Hidratacin donde entra un OH al carbono y un Hidrgeno al carbono . La enzima que cataliza este paso es una Enoil-SCoA Hidrasa. Enoil-SCoA Hidrasa. H OH CH3(CH2)n C = C CO - SCoA + H2O------>CH3(CH2)n C - C CO S - CoA H H -L-OH - Acil-S-CoA A continuacin ocurre otra reaccin de Oxidacin con la Coenzima NAD y la enzima -LHidroxi o 3-L-Hidroxi Acil-SCoA Deshidrogenasa en la que se forma el grupo ceto en el carbono Beta de la Ceto Acil-S-CoA.
-L-Hidroxi Acil-SCoA Deshidrogenasa OH CH3(CH2)n C - C CO S - CoA + NAD----------> CH3(CH2)n - CO - CH2 CO H S - CoA + NADH + H Aceto Acetil-SCoA
Finalmente, en una reaccin catalizada por la enzima Tiolasa se rompe el enlace - por Tilisis y se libera un Acetil-S-CoA. TIOLASA CH3(CH2)n - CO - CH2 CO S - CoA + CoASH-------> CH3(CH2)n - CO S - CoA + CH3 - CO - SCoA El cido graso activado a perdido hasta aqu solo dos carbones y tendr que entrar a sucesivas vueltas antes de oxidarse en su totalidad. Si tiene 16 carbones dar 7 vueltas y si tiene 20 carbones dar 9 vueltas. Por lo tanto el cido palmtico de 16 carbones al oxidarse completamente producir 8 molculas de Acetil-S-CoA, 7 molculas de (NADH + H) y 7 molculas de FADH2:
508
CH3-(CH2)14-CO- S - CoA +7CoASH + 7NAD + 7FAD + 7 H2O ------> 8CH3COS-CoA+7NADH+7H+7FADH2

17 16 15 14 13 12 1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH 2 2 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 C O S CoA 2 2 2 2 2 2 2 3
NAD + FAD NADH + H + FADH 17 CH 3 16 CH 2 15 C O S CoA
6 NAD + 6 FAD
+ 6 CoASH
6 NADH + 6 H + 6 FADH
+ 6HO 2
C H C O S CoA 3
C O + ATP
2
ADP + P i D - Metil - Malonil SCoA
Propionil SCoA Carboxilasa COOH TPP

CH CH 3 C O S CoA
C O OH
L - Metil - Malonil SCoA Racemasa
L - Metil - Malonil SCoA
CH 3
CH C O S CoA
C O OH CH CH C O S CoA
Metil Malonil SCoA Mutasa B 12
Succinil - SCoA
CTC
Fig. 20 - 10. La Oxidacin de cidos grasos impares produce un intermediario de tres carbones que se transforma en uno de cuatro carbones y entra al Ciclo Tricarboxlico.
En el caso de que un cido graso tenga un nmero impar de carbones (Fig. 20 10), dejar al final un compuesto de tres carbones o Propionil-SCoA, que por medio de una metilacin y reordenamiento (Ver Captulo Vitaminas, B12) se transformar en Succinil-SCoA de cuatro carbones y podr ser oxidado como intermediario del Ciclo Tricarboxlico. cidos grasos insaturados con doble enlace entre carbonos - o entre carbonos C3 y C4 (Fig. 21 - 10), harn uso de una Isomerasa para trasladar el doble enlace a los carbonos - o C2 y C3, quedando listos para entrar a la etapa de Hidratacin durante la -Oxidacin.
509
Las Isomerasas cambian la posicin de los dobles enlaces del lugar inadecuado carbonos 3,4 al lugar adecuado o carbonos 2,3.
3
4 2 3
,
4 H CH 3 CH 2 C
,
3 H C CH 2 1
3
Ruptura por la Oxidacin

Enoil - SCoA ISOMERASA 4
CH CH 3 H 2 H C C O - SCoA 1
C O - SCoA
CH
- OXIDACION
Fig. 21 - 10. Las isomerasas cambian de posicin al doble enlace, desde la posicin 3,4 a la 2,3.
Aquellos cidos grasos que poseen un grupo D-OH (Fig. 22 - 10), pueden transformarlo en un L-OH, cambiando de configuracin por medio de una Epimerasa y de esta manera proseguir con las reacciones restantes de la -Oxidacin.
Ac. Grasos poli - insaturados con 2 cis - enoil SCoA producen solo D - 3 - OH - acil SCoA , que por medio de una EPIMERASA lo convierten a L - 3 - OH - Acil SCoA H H R CH C C C 2 2 O SCoA H 3 - OH - Acil SCoA Epimerasa OH
R C H C CH C 2 2 SCoA OH D - 3 - OH - acil SCoA
O R C H C CH C 2 2 SCoA L- 3 - OH - acil SCoA
cis - enoil SCoA
Fig. 22 - 10. Cuando existe un doble enlace en posicin cis en vez de trans, se forma un D-OH que posteriormente pasa a L-OH, por accin de la EPIMERASA para continuar con la -Oxidacin.
A continuacin en Tabla 2 -10 se observa la oxidacin de un c. Graso poli-insaturado (Araquidnico) con las enzimas Enoil-SCoA Isomerasa y 2,4 Dienoil-SCoA Reductasa: Tabla 2 - 10
510
6 5
) Araquidonil-CoA (20:4 Un ciclo de beta-Oxidacin
5,8,11,14
3 4 2 1
6 5
) 3,6,9,12-Octadecatetraenoil-CoA (18:4 CH3-CO-S-CoA Enoil SCo A Isomerasa (dobles enlaces de cis en trans)
4 32 1 3,6,9,12 5 4 3
2,6,9,12
) 2,6,9,12-Octadecatetraenoil-CoA (18:4 Un ciclo de -Oxidacin sin FAD y con Hidratasa trans
8 7
4,7,10-Hexadecatrienoil-CoA (16:3 Acil-SCoA Deshidrogenasa
FAD FADH2
5
CH3-CO-S-CoA
4,7,10
5 4 3
2 1
2,4,7,10
2,4,7,10-Hexadecatetraenoil-CoA (16:4
2,4 Dienoil-SCoA Reductasa NADPH + H NADP
5 4 3
3,7,10-Hexadecatrienoil-CoA (16:3
3,7,10
Enoil-SCoA Isomerasa (transforma cis en trans)
5 4
2
2,7,10
2,7,10-Hexadecatrienoil-CoA (16:3 ) Un ciclo de - Oxidacin sin FAD y con Hidratasa trans
3,6-Dodecadienoil-CoA (12:2
3,6
Volver inicio
al
511
8) OXIDACIN EN LOS PEROXISOMAS Los Peroxisomas se encuentran en las clulas Eucariticas tanto de plantas como animales. Son organelos donde se llevan a cabo funciones especficas y cada clula puede tener cientos de ellos. Son especialmente abundantes y de mayor tamao en las clulas del hgado y rin. Se identifican principalmente por la presencia de Catalasa, la enzima que descompone H2O2. Algunas de las reacciones que ocurren en los Lisosomas son de sntesis y otras son de degradacin, as tenemos que se encuentran involucrados en la sntesis de sales biliares, colesterol, plasmalgenos, cido docosahexanoico y los procesos de degradacin como la oxidacin de los cidos grasos de cadena muy larga, el c. Fitnico (fig. 25 10), c. Pipeclico y las Prostaglandinas. En general, estos proceso se llevan a cabo por una interaccin coordinada entre los Peroxisomas y otros organelos. Los cidos grasos de cadena muy larga se degradan en conjunto con la Mitocondria al igual que el cido Fitnico. Por otro lado los precursores de los Plasmalgenos, se sintetizan en los Peroxisomas y se terminan de hacer en el Retculo Endoplsmico de la clula. En lo que aqu nos concierne, los Peroxisomas son capaces de -Oxidar cs. Grasos de cadena larga y muy larga o mayores de 26 Cs), ya sea saturados o insaturados e incluso cs grasos dicarboxlicos productos de la Oxidacin tipo (fig. 24 -10). En cambio la Mitocondria oxida cs grasos de cadena corta ( menos de 10 carbones que entran sin necesidad del transportador Carnitina), cs grasos de cadena media ( 12, 14 y 16 Cs) y an las cadenas largas (26Cs).
Fig.
ACTIVACIN DEL CIDO GRASO EN EL PEROXISOMA CON LA CoASH 1/2O2 + H2O CATALASA H2O2
CH3 - (CH2)n - CH2 - CH2 CO S - CoA

FAD OXIDACIN POR UNA FLAVO OXIDASA FADH2
O2
CH3(CH2)n - CH = CH CO S - CoA Cis -2- Acil-S-CoA
RESTO DE LAS REACCIONES SON SIMILARES A LA -OXIDACION 23-10. Formacin de Perxido de Hidrgeno como subproducto de la Oxidacin de un cido graso de cadena larga.
Por otro lado, en los Peroxisomas se pueden oxidar las cadenas laterales de los Eicosanoides, que son precursores de las Prostaglandinas (regulacin del AMPc en los tejidos), Tromboxanos (involucradas en la coagulacin de la sangre) y Leucotrienos (implicadas en la contraccin muscular).
512
En los Peroxisomas incluso existe la Oxidacin de cadenas dicarboxlicas (fig. 23 10) que son los productos de la oxidacin tipo que ocurre en el Retculo Endoplsmico de la clula. En los Peroxisomas el cido graso que ha sido activado mediante CoASH es oxidado a Enoil-SCoA empleando FAD y pasando los protones directamente al O2 por una Oxidasa que produce H2O2, el cual para evitar su toxicidad, debe ser convertido rpidamente en agua por una Catalasa. El resto de las reacciones son similares en ambos organelos, sin embargo las enzimas para ambas vas metablicas se encuentran codificadas por distintos genes en el ncleo de la clula. Como toda labor compleja es susceptible a un error, en el Peroxisoma ocurren una serie de trastornos que se expresan finalmente como enfermedades. Estas se deben a defectos, ya sea en el ensamblaje del Peroxisoma, defectos en procesos multienzimticos y defectos en tan solo en una enzima que se encuentra ligada a una cadena de reacciones. La primera de ellas es extremadamente rara (1/ 150.000) y es autosmica recesiva, no tiene cura. Se caracteriza por presentar organelos fantasmas, es decir vacos o con muy pocas o ninguna funcin en su interior. Por otro lado los Lisosomas pueden ser incluso normales, pero su nmero es muy reducido para llevar a cabo sus funciones adecuadamente. En el segundo tipo, se encuentran ausentes varias de las enzimas, sin embargo cuenta con la Catalasa, lo que indica que la prdida de funciones no es global como en el caso anterior. En el ltimo caso solo una funcin del Lisosoma es defectuosa, sin embargo puede ser tan severa como en el primero de ellos. Por ejemplo, puede fallar una de las enzimas que degradan a los cidos grasos de cadena muy larga, produciendo un trastorno debido a la acumulacin de estos cidos en el tejido nervioso, debido a la falla en el metabolismo de la Mielina y a su vez en la inervacin de las Glndulas Adrenales.
Volver inicio
al
9)
-OXIDACIN
513
Cuando la Oxidacin es del tipo , significa que ocurre en el extremo distal o la cola del cido graso. Aqu participan NADP, citocromo P450 y el Retculo Endoplsmico que produce H2O2. Este ltimo es rpidamente descompuesto por la Catalasa debido a su toxicidad. El cido graso puede ser oxidado parcialmente y luego es completado en la Mitocondria (Fig. 24 10).
- Oxidacin
CH 3 (CH 2)
10
O C
450
Citocromo P ONADPH+H +O 2 Oxidasa de funcin mixta en el Retculo Endoplsmico NADP + H 2O 2 O HO - CH (CH 2) 10 C ONAD Alcohol Deshidrogenasa NADH + H O O H C (CH 2) 10 C O NAD Aldehido Deshidrogenasa NADH + H O O H O C (CH 2) 10 C O - Oxidacin acorta ambos lados
O
-
O C (CH 2) 2 C O-
O O C (CH 2) 10 C
O O
-
c. Succnico al CTC
Fig. 24-10. Oxidacin de los cidos grasos en el extremo distal.
Adipato a la - Oxidacin
Este tipo de oxidacin ocurre en aquellas drogas que tienen una cadena alqulica. De esta manera se hacen ms polares lo que facilita su excrecin. Volver inicio al
514
10) -OXIDACIN cidos grasos ramificados (Fig. 25, 26-10) como el Fitol componente de la Clorofila, aparecen en la dieta como derivados del mundo vegetal y en especial como producto de la accin metablica que ocurre en los animales rumiantes. As tenemos que en el c. Fitnico presente en la mantequilla, leche y carne de rumiantes se encuentra un grupo 3 Metilo que bloquea la etapa de Deshidrogenacin del grupo OH por la Hidroxiacil-SCoA Deshidrogenasa en el Peroxisoma, por lo tanto se debe recurrir a una -Oxidacin.
G r u p o M e t ilo e n p o s ic i n 3
O c . F it n ic o
Fig. 25-10. El c. Fitnico es un derivado de los vegetales
Los primeros dos pasos de la Oxidacin son de activacin a Fitanoil-SCoA mediante la enzima Acil-SCoA Sintasa empleando ATP, seguida de Hidroxilacin a - HidroxifitanoilSCoA empleando -Cetoglutarato que pasa a Succinato por medio de la enzima FitanoilSCoA Hidroxilasa. Posteriormente hay varios pasos en disputa que llevan a obtener el c. Pristnico (Fig. 2610) con salida de CO2. El c Pristnico es finalmente oxidado en los Peroxisomas.
G r u p o M e t ilo e n p o s ic i n 2 O-
c . P r is t n ic o
Fig. 26-10. El c. Pristnico entra para ser oxidado por los Peroxisomas
Cuando una persona carece de la enzima -Oxidante (la Hidrolasa del c. Fitnico en los Peroxisomas), se acumulan grandes cantidades de c. Fitnico en los tejidos y en el suero sufriendo la enfermedad de Refsum. Sus sntomas son retinitis pigmentosa, ataxia cerebelar y neuropata perifrica. Por lo tanto, en estos casos se deben eliminar de la dieta los productos de vacuno. Volver inicio al
515
11) FORMACION DE CUERPOS CETONICOS. En situaciones de ayuno o ejercicio prolongado disminuye el transporte de glucosa hacia el interior del hgado y ocurre que la concentracin de Glucosa baja de los 90 mg %. Sin embargo, para paliar esta merma de combustible se recurre a los cidos grasos y a la Oxidacin, esto lleva a producir una acumulacin de Acetil-SCoA en el interior de la mitocondria del hgado, ya que esta molcula no puede entrar con la velocidad necesaria al Ciclo Tricarboxlico por falta de cido Oxaloactico. Este ltimo proviene del Piruvato que a se deriva de la Glucosa que se encuentra en bajos niveles. Como resultado el Acetil-SCoA, se acumula y se invierte la reaccin perteneciente a la ltima etapa de la -Oxidacin de los cidos grasos, catalizada por la enzima Tiolasa. De esta manera se produce el compuesto Cetoacetil-SCoA que se encuentra formado por la unin de dos molculas de Acetil-SCoA. Luego, a partir de este compuesto ms otra molcula de Acetil-SCoA se genera por una reaccin catalizada por la enzima Hidroximetilglutaril-CoA Sintasa (HMG-CoA) el Hidroxi, -Metil-Glutaril-SCoA. Esta molcula se descompone luego por la accin de la enzima HMG-CoA Liasa en c. Acetoactico y nuevamente en Acetil-SCoA. El c. Acetoactico por reaccin no enzimtica puede perder el carboxilo transformndose en Acetona o puede ser posteriormente reducido con NADH en c. -Hidroxibutrico por medio
FORMACION DE LOS CUERPOS CETONICOS EN EL HIGADO

LAS SIGUIENTES REACCIONES OCURREN EN LA MATRIZ MITOCONDRIAL TIOLASA CH 3 CO C H 2 C O - S - CoA C O - S - CoA SINTASA CoASH CH 3 C O - S - CoA + CH 3 C O - S - CoA
-OXIDACION
3 H M G Co A
CH
EXCESO DE ACETIL - S Co A
COO CH HO C CH 2 CH 2 3
H M G Co A LIASA CUERPO CETONICO CH 3 CH 3 C O - S - CoA CO CH 2 COOH
CO
CUERPO CETONICO CH CO CH 3 3
COO
AC. ACETOACETICO
ESPONTANEA NADH + H NAD - HIDROXI - BUTIRATO DESHIDROGENASA
ACETONA
- Hidroxi - Metil- Glutaril - S Co A
CUERPO CETONICO HO CH 3 C CH 2 COOH
-- HIDROXI -- BUTIRATO
Fig. 27 - 10. Formacin de cuerpos cetnicos en la mitocondria del hgado.
de la enzima -L-Hidroxi o 3-Hidroxibutirato Deshidrogenasa. Esta cadena de reacciones
516
entrega como productos finales -Hidroxibutirato, Acetoacetato y Acetona (Fig. 27 - 10). Todos ellos pueden difundir al sistema circulatorio y ser llevados a los rganos perifricos. De los tres cuerpos cetnicos, la acetona es difcil de metabolizar y produce el olor tpico de las personas en ayunas, tanto en la orina como en el aliento. Mientras que el D-hidroxibutirato puede ser oxidado en los tejidos perifricos por una D--Hidroxibutirato Deshidrogenasa. El Acetoacetato obtenido por esta reaccin es luego activado empleando Succinil-SCoA, (Fig. 28 - 10) por la enzima Cetoacil CoA Transferasa, propia del msculo y que no se encuentra en la mitocondria heptica. A continuacin en la forma de Acetoacetil-SCoA, la molcula se rompe por medio de la enzima Tiolasa. El Acetil-SCoA que se produce entra ahora al Ciclo Tricarboxlico del
Empleo de los cuerpos cetnicos como combustible en las Mitocondrias del msculo caerdiaco, esqueltico y tejido nervioso
COO SUCCINIL - S -CoA CH 2 CH 2 C O - S - CoA COO CH 2 SUCCINICO CH 2 COO FUMARICO
CUERPO CETONICO
SANGRE
CH CO 3
CH
COOH
AC. ACETOACETICO
- HIDROXI -- BUTIRATO DESHIDROGENASA
C H C O C H C O - S - CoA MALICO 3 2 CETO ACIL -S-CoA TRANSFERASA CoA - SH TIOLASA OXALOACETICO
NADH + H NAD
CUERPO CETONICO
C H C O S -- CoA 3
SANGRE
HO CH C CH COOH 3 2
-- HIDROXI -- BUTIRATO
CICLO TRICARBOXILICO
Fig. 28 - 10. Empleo de los cuerpos cetnicos como combustible en los rganos perifricos. La Cetoacil-SCoA Transferasa no se encuentra presente en el hgado, pero s en msculo y tejido nervioso.
msculo o del Cerebro. Por otro lado, el c. Acetoactico tambin puede ser activado con ATP y CoASH por la enzima Tioquinasa Cetoactica: TIOQUINASA CETOACETICA CH3 CO - CH2 - COO + ATP + CoASH--->CH3 CO - CH2 CO S - CoA+ AMP +PPi Finalmente, el Acetoacetil-SCoA es transformado en Acetil-SCoA por la Tiolasa Mitocondrial y llevado al Ciclo Tricarboxlico como combustible en el msculo esqueltico, msculo cardaco y cerebro En el caso de que no se disponga de Oxaloacetato,
517
permanecern los cuerpos cetnicos circulando con el consiguiente problema de pH hasta ser excretados. En las personas afectadas por la Diabetes Mellitus, la falta de Insulina hace que las clulas no sean permeables a la Glucosa y al no contar con este sustrato como aporte de energa, el organismo recurre a los lpidos y a la -Oxidacin. De esta manera se produce una gran acumulacin de Acetil-SCoA produciendo Cuerpos Cetnicos en las Mitocondrias del Hgado. Similar efecto puede tener una dieta con un gran contenido de grasas y baja en protenas. A continuacin se muestra en la Figura 29 - 10 el metabolismo general de los cuerpos cetnicos. El Acetil-SCoA formado en el Hgado puede provenir de los aminocidos que entran al CTC o a la -Oxidacin de los cidos grasos cuando los niveles de Glucosa son bajos o esta no entra al hepatocito por falta de Insulina. Luego, se producen los Cuerpos Cetnicos en la Mitocondria del Hepatocito y viajan por la sangre al Msculo y Cerebro, donde se activan por la Succinil-SCoA. A continuacin entran al CTC como Acetil-SCoA y forman Citrato, siempre que exista c. Oxaloactico obtenido por Gluconeognesis.
FORMACION Y DESTINO DE LOS CUERPOS CETONICOS
HIGADO
MITOCONDRIA
- HIDROXI BUTIRATO ACETOACETATO ACETILSCoA - OXIDACION ACILSCoA TAG CARNITINA ACILSCoA MALONILSCoA GLUCOSA
SANGRE
- HIDROXI BUTIRATO ACETOACETATO
MUSCULO , CEREBRO
CITOPLASMA MITOCONDRIA
- HIDROXI BUTIRATO ACETOACETATO ACETOACETILSCoA ACILSCoA
CITOPLASMA
VLDL
+
PIRUVATO ACETILSCoA CITRATO AOA MALATO PIRUVATO CITRATO Estimula a la Acetil-SCoA Carboxilasa MALONIL-SCoA Inhibe la entrada de Acil-SCoA por CAT I
CTC +
ACETILSCoA CITRATO AOA MALATO
Fig. 29 - 10. Los cuerpos cetnicos necesitan de Glucosa Gluconeognica como fuente de Oxaloacetato, para ser consumidos en la periferia.
En los animales rumiantes ocurre que en Invierno la mala calidad del pasto bajo en celulosa, no permite un nivel adecuado de c. Propinico para satisfacer la demanda de glucosa por la ubre y se produce Cetosis (Ver Captulo 9 del CTC). Volver inicio al
518
12) SINTESIS DE CIDOS GRASOS La sntesis de lpidos ocurre a nivel del citoplasma a diferencia de la oxidacin. Ambas vas ocurren en compartimentos diferentes para protegerse de un cortocircuito o un ciclo ftil, ya que no existe regulacin cruzada por enzimas alostricas como ocurre entre la Gliclisis y la Gluconeognesis, donde los activadores de una va son los inhibidores de la otra asegurndose con esto la independencia entre ambas. Cuando el Ciclo Tricarboxlico se encuentra inhibido por exceso de ATP, se acumula Citrato el que se elimina al exterior de la mitocondria. Este ltimo se descompone enzimticamente y da origen a Acetil-SCoA y c. Oxaloactico. El Acetil-SCoA transportado por la lanzadera Citrato, ser luego el precursor de la sntesis de los lpidos, pues podr pasar tanto a la va de la sntesis de los cidos grasos como a la va de la sntesis del colesterol (Fig.30 - 10).
Transformacin de Hidratos de Carbono en Lpidos Citoplasma Hidratos de Carbono

Piruvato Deshidrogenasa
Matriz Mitocondrial
Citoplasma Sntesis de cidos Grasos o Colesterol
Piruvato
Piruvato
AcetilSCoA Oxaloactico CTC Citrato
AcetilSCoA Citrato Liasa + ATP Oxaloactico +ADP + P Malato

NADP Citrato
Piruvato
Piruvato
Enzima Mlica
NADPH + H
Fig. 30 - 10.Transporte de Acetil-SCoA desde el interior de la Mitocondria hacia el citoplasma por la lanzadera Citrato.
519
La sntesis de los cidos grasos se llevar a cabo en dos etapas, primero ser la Carboxilacin con Biotina del Acetil-SCoA por medio del Complejo enzimtico Acetil-SCoA Carboxilasa, para formar una molcula con mayor energa como el Malonil-SCoA y luego la accin del segundo complejo enzimtico formado por la cido Graso Sintasa. La Acetil CoA Carboxilasa tiene un peso molecular de 225.kD y tres actividades enzimticas como son: Biotina Carboxilasa, Carboxil Transferasa y la protena Biotina Transportadora de Carboxilos, BCCP: Biotina Carboxilasa BCCP + HCO3- + ATP---> BCCP--COO- + ADP + P Carboxil Transferasa BCCP - COO- + CH3 - COSCoA---> BCCP + -OOC - CH2 - COSCoA BCCP = Protena transportadora de carboxilos- Biotina Por el mecanismo anterior se carga de energa a la molcula de Acetil-SCoA como MalonilSCoA con gasto de un ATP, de esta manera las reacciones posteriores sern exergnicas. Por otro lado la cido Graso Sintasa, tiene un peso molecular de 265 kD y es un homodmero en que cada subunidad tiene la Protena Transportadora de Acilos y 7 actividades enzimticas como son: Acetil Transacilasa, Malonil Transacilasa, -CetoacilPTA-Reductasa, - Hidroxiacil-PTA Deshidrasa, Enoil-PTA-Reductasa, Cetoacil-PTA Transferasa y Tioesterasa (Fig. 31 - 10). Cada una de las reacciones esta multiplicada por dos, ya que el complejo enzimtico es doble: (1) Acetil TransAcilasa CH3COS - CoA + Enz- SH-->CH3COS- Enz + CoA-SH (2) Malonil TransAcilasa HOOC- CH2COS- CoA + PTA-SH--->HOOC- CH2COS- PTA + CoA-SH (3) - Cetoacil PTA Reductasa CH3COS-Enz + HOOC- CH2COS- PTA-->CH3COCH2COS - PTA + CO2 + Enz-SH (4) -D-Hidroxiacil-PTA Deshidrasa CH3COCH2- PTA + NADPH + H-->CH3CHOHCH2COS - PTA + H2O (5) Enoil PTA Reductasa CH3CH = CHCOS- PTA + NADPH + H-->CH3CH2CH2COS- PTA + NADP+ (6) Cetoacil PTA Transferasa CH3CH2CH2COS - PTA + Enz- SH---> CH3CH2CH2COS Enz + PTA-SH (7) Tioesterasa CH3-(CH2)14- COS - PTA + H2O---->CH3 - (CH2)14 - COOH + PTA-SH
520
La sntesis del c. graso Palmtico se puede resumir con la reaccin del balance general: 7 CO2 + 7 Acetil - S- CoA + 7 ATP ---> 7 Malonil S - CoA + 7 ADP + 7 P Acetil-S-CoA + 7 Malonil-S-CoA + 14 NADPH + 14 H -->Palmitoil-S-CoA + 7CO2 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------8Acetil-S-CoA + 14NADPH + 14H + 7ATP--->Palmitoil-S-CoA + 14NADP + 7ADP + 7P
521
SINTESIS DE AC. PALMITICO POR EL COMPLEJO ACIDO GRASO SINTASA.

CH3 C=O CH2 C=O CH3 H C CH2 C=O OH CH3 C C H H CH3 CH2 CH2 C=O
COO CH3 C=O CH3 C=O CH2 C=O
SH
cys
S H
pant
S H
pant
2
cys
CH3 - CO - S - CoA
COO CH2 CO - S - CoA
S
cys
S
pant
2 CO2
cys
SH
cys
S
pant
SH
S
pant
C=O
cys
2 NADPH
cys
cys
2 H2O
cys
SH
cys
S
pant
2 NADPH
cys
S H
cys
S
pant
pant
pant
cys
pant
pant
pant
pant
pant
cys
SH
S H
SH
S
C=O CH3
S
C=O CH2 COO
S
C=O CH3
C=O
SH
S
C=O CH2 H C CH3 CH3 CH2 CH2 C=O CH2 C=O OH
SH
S
C=O C H C H CH3 CH3 CH2 CH2 COO CH2
S H
S
C=O CH2 CH2 CH3
SH
CH2 C=O CH3
Se repiten
Reacciones de 2 a 7 CH3 ( CH 2 ) 4 C=O

SH
cys
CH3 CH2 CH2 C=O CH2 C=O
7
CH3 CH2 CH2 C=O
COO CH2 CO - S - CoA
CH3 ( CH 2 ) 4 C=O
S
cys
5 veces
C=O C=O
S
pant
S H
pant
S H
cys
S
pant
SH
S
pant cys
2 NADPH 2 H2O 2 NADPH

cys
cys
2 CO2
S
cys
S
pant
2
cys
S
cys
S H
pant
pant
cys
pant
cys
pant
pant
pant
pant
cys
SH
8
2 H2O
SH
C=O ( CH 2 ) 4 CH3
C=O ( CH 2 ) 4 CH3
S
C=O CH2 C=O CH2 CH2 CH3
SH
S
C=O CH2 C=O CH2 CH2 CH3
S H
S
C=O CH2 COO
SH
S
C=O CH2 CH2 CH3
C=O
CH2 CH2 CH3
2 CH (CH) COOH
3
14
Fig. 31 - 10. Sntesis de cidos Grasos.
522
La siguiente tabla indica que la cantidad necesaria de molculas de Malonil-SCoA para la sntesis equivale a 7, mientras que se eliminan al mismo tiempo 7 molculas de CO2 con liberacin de energa: Acetil-SCoA + Malonil-SCoA = CetoAcil-S-PTA + CO2 2+3= 4+1 4+3= 6+1 6+3= 8+1 8 + 3 = 10 + 1 10 + 3 = 12 + 1 12 + 3 = 14 + 1 14 + 3 = 16 + 1 La sntesis del cido graso se lleva a cabo desde la cola alqulica hacia el grupo carboxilo, pasando los dos carbones iniciales del Acetil-SCoA a formar parte de los carbones 15 y 16 del c. Palmtico. La oxidacin del cido graso en cambio se lleva acabo desde la cabeza a la cola siendo los carbones 1 y 2, los primeros en salir como Acetil-S-CoA y al segundo ciclo de oxidacin saldrn los carbonos 3 y 4 (Fig. 32 - 10).
SINTESIS De la cola a la cabeza

16 15 14 13 12 1 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
Cola
CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH CH COOH 3 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Ac Palmtico - OXIDACION D e la cabeza a la cola
Cabeza
Fig. 32 - 10. Direccin de la Sntesis y la Oxidacin en un cido graso.
En la Figura 33 - 10 se observa una visin simplificada de la sntesis de los cidos grasos, donde se indica el origen intramitocondrial del Citrato que se descompone como portador de Acetil-SCoA.
523
HIGADO
MATRIZ MITOCONDRIAL CITOPLASMA HS
Cys
- CETOACIL - REDUCTASA NADPH + H NADP H O CH

3
HS
Cys
O CH CO2 CH
3
O
2
O C C S HO
2
P TA
PTA
C CH
C S O
H DESHIDRATASA
Cys
C S O
P TA
ACETIL TRANSFERASA MALONIL TRANSFERASA H CH

3
HS
Cys
H C
O C S
OOC CH
PTA
C S
NADPH + H HS
Cys P TA
PIRUVATO
HS O O OC C H CH3 CO S - CoA
ENOIL REDUCTASA
NADP HS
Cys
O CH S Co A ADP + P O O CO2 + ATP S Co A C H

3 3
P TA
C H CH
2
C S
ACETIL SCoA Carboxilasa
C H CH
2
CH
CITRATO AC. OXALOACETICO CITRATO
C S
Cys
O OO C C H
2
PTA
C S
AC. OXALOACETICO MALATO PIRUVATO PIRUVATO
CH3 - (CH2)14 - coo
TIOESTERASA SUELTA EL PALMITATO AL FINAL DE LA SNTESIS
Fig. 33 - 10. Sntesis de cidos Grasos.
La Oxidacin de los cidos grasos se regula a diferentes niveles, los cuales a su vez se controlan hormonalmente. La Triacilglicerol Lipasa del tejido adiposo es regulada por fosforilacin con intervencin del Glucagn, sin embargo su actividad es baja cuando los niveles de Insulina son altos. A su vez los elevados niveles de Malonil-SCoA inhiben alostricamente a CAT-1 (Carnitina Acil Transferasa I), lo que evita la -Oxidacin. Adems, la CoASH debe encontrarse disponible para que ocurra -Oxidacin ya que es un sustrato para la reaccin de la Tiolasa. La sntesis de los cidos grasos depende de la disponibilidad de sustrato o grupos acetilos como Acetil-SCoA presentes en el citoplasma. Su paso desde Citrato se encuentra regulado por la actividad de la lanzadera (antiport) Citrato-Malato, cuya actividad es a su vez disminuida por Palmitoil-SCoA, adems la concentracin de Citrato en la Mitocondria tambin afecta su transporte. La enzima Acetil-SCoA Carboxilasa es una enzima clave para la sntesis de cs grasos, se encuentra activada Alostricamente por Citrato y covalentemente por fosforilacin. Por otro lado, se inhibe alostricamente por Palmitoil-SCoA y covalentemente por defosforilacin. Volver al inicio
524
13) ELONGACION E INSATURACIN DE LOS ACIDOS GRASOS. El principal cido graso sintetizado es el Palmtico de 16 carbones el que puede elongarse o insaturarse en el Retculo Endoplsmico Liso o en la Mitocondria del Hgado. En estos organelos se encuentra la molcula de Malonil-SCoA con un conjunto distinto de enzimas que actan sobre el c. Palmtico para formar el Estearol-SCoA (Fig. 34 - 10) de 18 carbones mediante las reacciones de Adicin de dos carbonos activados en la forma de Malonil-SCoA, Reduccin, Deshidratacin y nueva etapa de Reduccin para formar el Estearol-SCoA.
Elongacion de cs. Grasos

COO Retculo Endoplsmico C H ( C H ) C O SCoA 2 14 3 Palmitoil SCoA 16 Cs Mitocondria Saturados e Insaturados de 12 a 16 carbones Elongacin por adicin de Acetil - SCoA Inversin de la -Oxidacin empleando NADPH por FADH 2 Malonil - SCoA CH 2 C O SCoA C H ( C H ) C O SCoA 2 16 3 NADP + C O 2 CoASH Estearoil SCoA 18 Cs
NADPH + H
Fig. 34 - 10. Elongacin de cidos grasos en el RETICULO ENDOPLASMICO LISO y la MITOCONDRIA.
Volver inicio
al
14) INSATURACION DE LOS ACIDOS GRASOS A su vez el cido Palmtico, puede insaturarse para formar el Palmitoleato 16:1 cis (Delta, 9) y el cido Esterico se puede insaturar en c. Oleico 18:1 cis (Delta, 9) por la cido Graso Desaturasa que emplea O2 y NADP, ubicada en la parte luminal del Retculo Endoplsmico Liso (Fig. 35 - 10). El paso de Oleato 18: 1( 9) a Linoleato 18: 2 ( 9,12) y de este a -
525
Linolenato 18: 3 (9,12,15) ocurre solo en las plantas ya que los animales no poseen este sistema Desaturasa. Ambos cidos grasos anteriores Linoleato 18:2 ( 9,12) y Linolenato 18:3 ( 9,12,15) son esenciales para los animales y son producidos solamente por las plantas y deben encontrarse en la dieta humana. El cido graso Linoleico 18:2 ( 9,12) mantiene el estado fluido de las bicapas en las membranas y tambin se le encuentra en las Lipoprotenas y Triacilgliceroles de almacenamiento. Tambin es precursor del cido Araquidnico, que dar origen a las Prostaglandinas y Tromboxanos.
Elongacin e Insaturacin de los Acidos Grasos

Malonil SCoA ES NECESARIO PARA LA C H3 - (CH2)14 - CO SCoA Palmitoil-SCoA (C16)
ELONGACIN EN 2 Cs
NADPH Retculo Endoplsmico Liso HGADO NADP
C H3 - (CH2)16 - CO SCoA Estearoil-SCoA (C18)
Fe+ 2 Cyt b 5
Complejo DESATURASA NADPH + H OLEICO (9) C18:1 El paso de Oleico (18:1) a Linoleico (18:2) no se encuentra presente en animales PLANTAS LINOLEICO C 18: 2
( 9, 12 )
O 2 HO
2
Fe + 3 H C H( C H )
3 2
C ( C H ) C O - SCoA 2 7 Oleoil - SCoA C C 18 : 1

( 9)
- LINOLENICO C 18 : 3
( 6, 9, 12 )
+C
HOMO - LINOLENICO C20 : 3

(8, 11, 14 )
Desaturacin en posicin 6 con NADP y O2
Alargamiento en 2 Cs
Desaturacin en posicin 5 con NADP y O2
El paso de Linolieco (18:2) a Araquidnico (20:4) ocurre en animales
ARAQUIDONICO C 20 : 4
( 5, 8, 11, 14 )
Fig. 35 - 10. Insaturacin de los cidos Grasos. significa el carbn de la insaturacin.
Volver inicio
al
526
15) SINTESIS DE TRIACIL GLICEROLES. Los TAG se sintetizan en el retculo endoplsmico (RE) del hgado y tejido adiposo por el complejo de la Triacilglicerol Sintasa (Fig. 36 - 10). Los cidos grasos pueden ser de origen exgeno o endgeno y son tomados por la enzima Acil-CoA Sintasa que se encuentra en la membrana del RE para ser activados con CoASH y luego esterificados con Glicerol-Fosfato, mediante la enzima Acil-CoA Transferasa formando el cido Fosfatdico. El Glicerol-Fosfato proviene de la reduccin de la Dihidroxicetona-Fosfato de la Gliclisis y de la fosforilacin del Glicerol. El cido Fosfatdico sufre la hidrlisis del grupo Fosfato por medio de la enzima Fosfatidato Fosfatasa y a continuacin se le introduce otro cido graso en su grupo hidroxilo remanente por accin de otra Aciltransferasa formando el Triacilglicerol. En el intestino se produce la sntesis en el RE, pero a partir del 2-Monoacilglicerol: 2-Monoacilglicerol + Acil-SCoA ----> 1,2 diacilglicerol 1,2 diacilglicerol + Acil-SCoA ----> 1,2,3 triacilglicerol El TAG puede ser posteriormente liberado al citoplasma en los adipocitos y formar gotas de aceite o al interior del RE en el hgado para salir como VLDL, mientras que en el intestino se empaca en los Qm, para salir luego a la circulacin.
SC oA
22
C O OH OH
P P
CH CH CH 2 2 O O C O C O
CH CH CH 2 2
OH
CH CH CH 2 2 O O C O C O CH CH CH 2 2 O O O C O C OC O
2 CoA SH
A ciltran sferasa
Fosfatasa
A ciltran sferasa
Fig. 36 - 10. La sntesis de los TAG en el RE de Hepatocitos y Adipocitos.
527
Volver inicio 16) SINTESIS DE FOSFOLIPIDOS
al
Se produce en el RE de los hepatocitos y posee varias rutas, una de ellas consiste en la activacin del c. Fosfatdico con CTP para formar la Citidina-Difosfo-Diacilglicerol (Fig. 37 10), formndose Pirofosfato el cul se hidroliza eventualmente haciendo la reaccin exergnica. El cido Fosfatdico activado por CTP reacciona con la Serina para formar luego la FosfatidilSerina. Es tambin posible en otras especies la formacin de Fosfatidil Etanolamina por descarboxilacin de la Serina y posteriormente por metilacin del Nitrgeno de la Serina la formacin de la Fosfatidil Colina (Fig. 37 - 10)
_ COO H
NH 2
P
O CTP CH CH CH 2 2
PPi
N C O O
CH CH N
Fosfatidil Serina
+ C NH 3 CH 2 O
CH 2
Serina C M P
CH CH CH 2 2
P
O
CH CH CH 2 2
Ac. Fosfatdico C D P - Diacilglicerol
+ HC N CH H C CH 2 O H
CH 3
HO
OH
H
CO 2
Fosfatidil Colina
+ H C NH 3 Fosfatidil CH 2 3 C H Etanolamina 3 O
P
O CH CH CH 2 2
P
O CH CH CH 2 2
Fig. 37 - 10. Formacin de los Fosfolpidos.
En general en mamferos la sntesis de Fosfatidil Colina ocurre de la siguiente manera: ATP CTP
528
Colina--------> Fosfatidil
Colina
Fosfato---------->
CDP-Colina
-------->
CDP-Colina
-------->
+ PPi + 1,2 Diacilglicerol Colina ATP CTP Etanolamina----->Etanolamina Fosfato------> CDP-Etanolamina ------> CDP-Etanolamina +1,2Diacilglicerol -------> Fosfatidil Colina La Colina proviene de la dieta y es considerada como un candidato a vitamina. Esta se Fosforila por medio del ATP y la enzima Colina Quinasa formando la Colina Fosfato. La que sufre una activacin por medio de CTP y la enzima CTP-Colina Fosfato Citidiltransferasa formando CDP-Colina y Pirofosfato que al hidrolizarse hace la reaccin exergnica. A continuacin la CDP-Colina mediante la accin de la 1,2 Diacilglicerol Colina Fosfotransferasa se une al 1,2 Diacilglicerol formando la Fosfatidilcolina. La Fosfatidil Colina puede ser sintetizada por reacciones similares a la anterior.
Volver inicio
al
529
17) SINTESIS DE ESFINGOLIPIDOS Al igual que los Fosfolpidos tienen una cabeza polar y una cola apolar, la diferencia se encuentra en que no tienen Glicerol, pero s otro tipo de alcohol como la Esfingosina. Esta ltima (Fig. 38 - 10), constituye el compuesto principal de los esfingolpidos y se obtiene o sintetiza de la siguiente manera. Primero se une el Palmitoil-SCoA a la Serina para formar Dehidroesfinganina, esta ltima es luego reducida con NADPH a Dihidroesfingosina y posteriormente oxidada o insaturada con FAD a Esfingosina. Este alcohol puede esterificarse con otro cido graso como Acil-SCoA para formar la Ceramida. Este compuesto es un intermediario comn de Glicolpidos como Ganglisidos y Cerebrsidos, as como tambin de la Esfingomielina. Los Cerebrsidos como monosacridos de ceramida son parte de la membrana en las clulas del sistema nervioso central, mientras que los Ganglisidos considerados como oligosacridos de ceramida con cido Silico son receptores de la superficie celular en el reconocimiento entre las clulas.
CH OH 2 C O S CoA ( CH CH 2 )14 3 H CH OH 2 C NH H 3 + H CO 2 C C ( CH NH O 2 ) 14 NADP 3 NADPH H H CH OH 2 C C ( CH + CH NH 3 H H CH OH 2 C C C H FADH 2 C NH 3
O H FAD 2 )14 3
OH H
COO SERINA
Palmitoil - SCoA
CH 3
Esfingosina
2 ) 12 3 R O C S Co A
Dehidroesfinganina
Dihidroesfingosina
( CH CH
Azucares activados
UDP - Galactosa H H
CH OH 2 C C C H C ( CH NH OH H
O C R
GANGLIOSIDOS
CEREBROSIDOS
UDP CDP - Colina
N Acil Esfingosina
ESFINGOMIELINA
CMP
CERAMIDA
2 ) 12 3
CH
Fig. 38 - 10. Sntesis de Esfingolpidos.
Composicin de los Esfingolpidos importantes en la constitucin de la Mielina: Esfingosina Ceramida = Serina + c. Graso = Esfingosina + c. Graso
530
Esfingomielina = Esfingosina + c. Graso + Colina = Ceramida + Colina Cerebrsidos = Esfingosina + c. Graso + Galactosa = Ceramida + Galactosa Ganglisidos = Esfingosina + c. Graso + Glucosa + Galactosa + c. Silico = Ceramida + Glucosa + Galactosa + c. Silico Los esfingolpidos, se encuentran tambin involucrados en la determinacin de los grupos sanguneos como los antgenos A, B y O en la superficie de los Eritrocitos. Existen algunas enfermedades relacionadas con el metabolismo de los Esfingolpidos (en nios antes de los 8 aos) y se deben a alteraciones en los Lisosomas, as tenemos a la enfermedad de Niemann-Pick (autosmica recesiva) producida por la falla de la Esfingomielinasa cida, caracterizada por desrdenes nerviosos y cerebrales debido a la acumulacin de subproductos de la Esfingomielina en cerebro, bazo, hgado y pulmones debido al recambio normal de las clulas. En otras variantes de la enfermedad se produce acumulacin de Colesterol, proveniente del recambio normal de las membranas celulares. Otra de estas enfermedades es la de Gaucher caracterizada por anormalidades hematolgicas, hiperesplenomegalia, lesiones en los huesos y pigmentacin. Se debe en parte a la falla de una Glucocerebrosidasa de los lisosomas. En general estas enfermedades se deben a la falla en la funcin del Lisosoma involucrado en la degradacin de la parte de hidrato de carbono en aquellos esfingolpidos como los ganglisidos. Otra enfermedad es la incapacidad de producir por una falla enzimtica, la cantidad suficiente de surfactante pulmonar cuyo principal componente es la Dipalmitoil Lecitina. Esto sucede como al tercer mes despus de nacido, que es donde se produce el sndrome causado por una disminucin del intercambio de gases durante la respiracin.
Volver inicio
al
531
18) DERIVADOS DEL ACIDO ARAQUIDONICO QUE COMPRENDEN A LOS EICOSANOIDES CONOCIDOS COMO PROSTAGLANDINAS, TROMBOXANOS Y LEUCOTRIENOS. Las Prostaglandinas se encuentran en todos los tejidos en bajas concentraciones (10-6 o 1012 M) y tienen variados efectos fisiolgicos, ya sea en la misma clula (Paracrinos) donde se sintetizaron y tambin a corta distancia de esta. Algunos de sus efectos comprenden el control de la contraccin y relajacin de la musculatura lisa, el control del flujo sanguneo renal, efectos vasodilatadores o vasoconstrictores en el sistema circulatorio, aumento de la motilidad intestinal, etc. El precursor de las Prostaglandinas se encuentra en las membranas plasmticas formando parte de los Fosfolpidos estructurales y se denomina cido esencial Araquidnico. La Fosfolipasa A2 se activa por ciertos factores hormonales o fsicos que perturban la membrana celular y que inducen la produccin de segundos mensajeros como el AMPc o el Ca+2, ante los cuales hidroliza al cido Araquidnico o Eicosatetranoico (C20:4 5,8,11,14) constitutivo de los Fosfolpidos estructurales. El c. Araquidnico se conoce tambin por su numeracin desde el ltimo carbono de su cola que forma un grupo Metilo y se denomina carbn (Omega). De esta manera tenemos el - 3 o c. Linolnico C 18:3 ( 6, 9, 12) y el - 6 o c. Linoleico C 18:2 ( 9,12 ). Este cido graso esencial se puede adquirir directamente de la dieta o de otros cidos grasos esenciales como el cido Linolnico (C18:3 6,9,12)o el cido Linoleico (C18:2 9,12) que se encuentran en los aceites vegetales. Estos cidos sufren en el organismo a nivel del RE, dos insaturaciones consecutivas ms una elongacin a 20 carbonos para dar origen al cido Araquidnico y al cido Eicosapentanoico, este ltimo tambin se le puede encontrar en los aceites de pescado. El cido Araquidnico, es luego tomado por el sistema enzimtico de la Prostaglandina Sintasa en el Retculo Endoplsmico, donde se encuentra la enzima Ciclooxigenasa. Esta ltima cataliza la entrada de Oxgeno y la ciclacin de la cadena de carbonos en la regin del doble enlace, exactamente en las posiciones 8 y 1. De esta manera se sintetiza la Prostaglandina PGG2 y posteriormente la Prostaglandina PGH2, desde donde se deriva una nueva serie de Prostaglandinas y los Tromboxanos. Los Tromboxanos se encuentran en las plaquetas y son sintetizados por la Tromboxano Sintasa a partir de PGH2, su efecto es la constriccin de los vasos sanguneos y la agregacin de las plaquetas (Fig. 39 - 10). Ambos eventos favorecen la formacin del cogulo, sin embargo el medicamento Aspirina bloquea su sntesis al unirse a una Serina del sitio activo de la enzima Tromboxano Sintasa, por lo que inhibe la coagulacin de la sangre. Los Leucotrienos se encuentran en los Leucocitos y su precursor es tambin el cido Araquidnico. Se caracterizan por tener un doble enlace conjugado formando un trieno (Leucotrieno) y se encuentran en el bazo, corazn, pulmones y cerebro. Su efecto es la vasoconstriccin vascular y bronquial. Estas molculas son capaces de inducir estados de isquemia con graves consecuencias en algunas patologas, como la oclusin coronaria y el
532
asma bronquial. Otra de sus funciones consiste en servir de agente quimiotctico durante los procesos inflamatorios.
COOH Ac. LINOLENICO 6
a: b: c:
Endoperxido D - Isomerasa Endoperxido E - Isomerasa Endoperxido F - Reductasa
Desaturasa Elongacin + 2 Cs 5 Desaturasa
COOH 5 - Lipoxigenasa OOH
Ac. ARAQUIDONICO Ciclooxigenasa

O COOH O OOH CH 3
COOH
Ac. 5 - HIDROPEROXIEICOSATETRAEN Deshidratasa

O COOH CH 3
PROSTAGLANDINA G 2
HO COOH O OH C H3
O OH O COOH CH 3 OH
LEUCOTRIENO A 4 Hidrolasa
CH
PROSTAGLANDINA D 2
HO COOH O OH CH 3
a:
b: c:
HO
PROSTAGLANDINA H 2 Tromboxano Sintasa

O O OH COOH
COOH OH
LEUCOTRIENO B 4
COOH
PROSTAGLANDINA E 2
HO OH
CH
TXA2
PROSTAGLANDINA F 2
TROMBOXANOS
Fig. 39 - 10. Vas para la Sntesis de las Prostaglandinas, Tromboxanos y Leucotrienos denominados como Eicosanoides. Volver inicio 19) CONTROL DE LA SINTESIS DE LOS ACIDOS GRASOS. La Insulina estimula la sntesis de estos complejos multienzimticos a largo plazo, pero a corto plazo tenemos que Citrato y Acetil-SCoA activan alostricamente a la Acetil-SCoA Carboxilasa o Malonil-SCoA Sintasa, estimulando la polimerizacin del protmero inactivo, mientras que los Acil-SCoA la depolimerizan, en otras palabras el Palmitioil-SCoA inhibe su sntesis . Tambin parece ser estimulada por fosforilacin mediante una Protena Quinasa activada por AMPc. al
533
La cido Graso Sintasa a su vez puede ser regulada por los niveles de NADPH, ya que el aumento de su concentracin estimula al complejo multienzimtico en su sntesis. Similar cosa ocurre con la hormona Insulina que aumenta el nmero de copias de la AGS, aumentando concomitantemente la sntesis de palmitato. Una vez sintetizado el cido Palmtico este puede viajar como AG desde el Hgado a los msculos en la seroalbmina o como TAG en una VLDL, para ser oxidado o dirigirse al tejido adiposo para su almacenamiento. La formacin de un Triacilglicerol se lleva acabo al activar el cido graso nuevamente como un AcilCoA derivado. Este ltimo junto con el Glicerolfosfato dar origen a un Triacilglicerol. El Malonil-SCoA que se forma previo a la sntesis de los cidos grasos en el citoplasma por el complejo multienzimtico en el hgado, ejerce un efecto inhibitorio en la Carnitina Acil Transferasa 1 (CAT 1), que transporta cidos grasos al interior de la mitocondria. De esta manera se evita que la sntesis y la oxidacin sean simultaneas. Volver al inicio 20) DIFERENCIAS ENTRE SINTESIS Y OXIDACION DE LOS ACIDOS GRASOS. a) La oxidacin de los cidos grasos se lleva a cabo en la mitocondria, mientras que la sntesis ocurre en el citoplasma. b) La oxidacin ocurre por activacin del cido graso por unin a la Coenzima A, mientras que la sntesis ocurre con los precursores unidos a la Protena Transportadora de Acilos (PTA) que depende del Complejo de la cido Graso Sintasa. Sin embargo, ambas molculas poseen c. Pantotnico y un grupo tiol donde se unen los acilos. c) La oxidacin emplea primero FAD y luego NAD como coenzimas oxidantes en el interior de la mitocondria. La reduccin durante la sntesis emplea NADPH proveniente de la Va de las Pentosas o de la enzima Mlica. d) La oxidacin produce el Trans -2-Enoil intermediario junto al L-OH derivado y la sntesis el D-OH derivado junto al Cis - 2 intermediario. e) En la sntesis se activa el precursor Acetil-S-CoA mediante carboxilacin con biotina para formar malonil-S-CoA, el CO2 se pierde posteriormente. En la degradacin se activa el cido graso con gasto de ATP y unin a la Coenzima A. f) Los cidos grasos se degradan de la cabeza a la cola, es decir la oxidacin ocurre siempre en el carbono o bien en el carbono 2, 4, 6, 8, etc., ya que a la segunda vuelta el primitivo carbono 4 pasa a ser el y as sucesivamente. Mientras que la sntesis procede de la cola a la cabeza, en otras palabras la primeras molcula adicionada, es el Acetilo y despus se adicionan los malonilos. Por lo tanto para un cido graso de 16 carbonos, entran primero los de la cola 16 y 15, para luego entrar el 14 y 13 y as sucesivamente se completa hasta el carboxilo nmero 1. g) La degradacin ocurre en ayuno o durante el ejercicio muscular aerbico, mientras que la sntesis ocurre despus de una ingesta de carbohidratos. h) El cido palmtico produce 131 ATPs durante la oxidacin, menos los dos ATPs empleados en su activacin. En la sntesis del mismo aminocido se emplean 7 ATPs para producir 7 Malonil-S-CoA que entregarn 14 carbonos al Acetil-S-CoA y formar nuevamente el c. Palmtico.
534
Volver inicio
al
535
21) EL COLESTEROL CARCTERSTICAS GENERALES El 80% del Colesterol se encuentra asociado a membranas celulares, donde ejecuta la funcin de mantener a la membrana en su forma funcional ptima, es decir en un estado intermedio no muy fluido (desordenado) ni muy cristalino (ordenado). El resto del Colesterol se distribuye en clulas especializadas como precursor de hormonas Esteroidales. A su vez, parte del Colesterol es reciclado como una sal biliar componente de la bilis y es secretado al intestino, donde parte es excretada y parte es reabsorbida. Esta ltima etapa, es la razn por la que se hace difcil de eliminar. En realidad no existe una va especializada en la degradacin del Colesterol a CO2 y Agua. El Colesterol es una molcula cclica difcil de destruir. Incluso los Macrfagos no pueden degradarlo y su acumulacin provoca la formacin de clulas espumosas que dan origen a los Ateromas. En una persona normal, el total de colesterol debe ser de 140 gr mientras que los niveles plasmticos normales debern encontrarse entre los 180 a 220 mg por lt. Aproximadamente, la sntesis endgena de Colesterol diario alcanza a 1,5 gr y el aportado por la dieta es de alrededor de 0,3 gr. El Colesterol no es sintetizado por las bacterias y en el caso de los insectos, estos emplean fuentes externas para llegar a producir el esteroide denominado Ecdysona, que acta como una hormona que se encuentra involucrada en los procesos de la metamorfosis.
HORMONAS ESTEROIDALES Y SALES BILIARES MEMEBRANAS CELULAS
DIETA 0,3 gr/da
Inh. por Retroalimentacin negativa Control de la Expresin Gnica (Sistema SCREP/SCAP reducen RNAm para HMGReductase) Modificacin covalente por Fosforilacin (inactiva) /Defosforilacin (activa) Velocidad de Degradacin Enzimtica (Poli ubiquitinacin/ Proteosoma)
COLESTEROL
SNTESIS ENDGENA 1 gr/da
1) HMG CoA Reductasa (Dominio sensible a esteroles)
2) Acil - SCoA: Colesterol Acil Transferasa (ACAT). 3) Regulacin del Colesterol en el plasma y clula va Inh. del N de Receptores de LDL 4) Transporte reverso por HDL Fig. 40 -10. Distribucin y control del Colesterol.
536
En humanos el Colesterol es principalmente manejado por las lipoprotenas denominadas LDL y HDL. Cada vez que las LDL se enfrentan a un fibroblasto ocurre una serie de mecanismos, observado en la figura 41-10. Los receptores presentes en la membrana interaccionan con las apoprotenas de las LDL, que junto con las molculas de Clatrina ubicadas en la superficie de la membrana, permiten la internalizacin por endocitosis. La Apo B 100 es considerada una apoprotena estructural, pero tiene una dbil afinidad por los receptores que normalmente reciben a la Apo E. En el interior, la vescula se funde con un lisosoma pasando a hidrolizar los steres de colesterol, mientras que las apoprotenas se descomponen en sus aminocidos. El colesterol libre a su vez produce tres efectos: 1 Inhibe la sntesis endgena de Colesterol por medio del control sobre la HMG-CoA Reductasa. 2 Estimula la enzima ACAT o Acil-SCoA: Colesterol Acil Transferasa, destinada a esterificar Colesterol para su almacenamiento en el Retculo Endoplsmico 3 Inhibe el nmero de receptores LDL de la superficie del fibroblasto.
537
Receptores de LDL Memb. plasmtica
LDL
Esteres de Colesterol Apo prot. B100
Protenas receptoras
Fosa recubierta Vescula recubierta
+
Aparato de Golgi
Sntesis de Receptores LDL DNA
Sntesis de Colesterol
Endosoma
Vescula reciclada
HMG-CoA Reductasa RNA

Ribosomas Retculo Endoplsmico
Lisosoma Aminocidos
Inhibicin Inhibicin Exceso de Colesterol Activacin

Esteroides de membrana, hormonas y sales bili
Colesterol ACAT
Protenas Receptores
Almacenamiento de steres de Colesterol
Fig. 41 10. Control intracelular de los niveles de Colesterol
Volver al inicio
538
21) CONTROL SOBRE LA HMG-CoA REDUCTASA.

La enzima reguladora de la sntesis del Colesterol puede ser afectada tanto en su actividad como en sus niveles disponibles por una serie de mecanismos (fig. 40-10), entre lo cuales tenemos: a) Inhibicin alostrica mediante retroalimentacin negativa de los mismos esteroides junto al cido Mevalnico. b) Modificacin covalente (fig. 42 10), que incluye fosforilacin-defosforilacin. Adems, otras enzimas de la sntesis tambin son sometidas a control de esta misma forma. La forma FOSFO de la HMGCoA reductasa, es la inactiva, mientras que la forma DEFOSFO es la activa. El mecanismo cuenta con una Protena Quinasa dependiente de AMPc como enzima fosforiladora o inactivadora y una Fosfatasa que es la enzima activadora. Ocurre que Epinefrina y Glucagn estimulan las Fosforilaciones y por consiguiente la inactividad de la enzima, mientras que Insulina estimula las defosforilaciones mediante disminucin del nivel de AMPc y por consiguiente pone en actividad a la enzima. c) Control de la expresin de los genes (fig. 43 10) que codifican a la HMG Reductasa por medio de un sistema formado por protenas transmembranas del Retculo Endoplsmico, denominadas SCAP-SREBP. Ambas protenas se unen por los Ct. Una de ellas posee un dominio sensor de Colesterol (SCAP) y la otra (SREBP) libera una secuencia denominada b-HLH que acta como factor de transcripcin desde su lado Nt, cuando actan sobre ella dos proteasas. Estos factores de transcripcin estimulan encadena una serie de genes involucrados en la sntesis de Colesterol y Triglicridos y Fosfolpidos. d) Degradacin de la enzima marcapaso HMG CoA reductasa. Cuando existe una mayor concentracin de Colesterol en el citoplasma se activa la enzima Ligasa de Ubiquitina, que marca a la enzima HMG-CoA Reductasa mediante la unin de un pptido de 7,6 kDs denominado Ubiquitina. Este pptido junto a la unin sucesiva de varios de ellos, hace que la enzima sea reconocida por el Proteosoma o complejo multienzimtico, destinado a la hidrlisis de las protenas. De esta manera el nmero de copias de la enzima disminuye hasta disminuir la sntesis endgena de Colesterol.
539
EPINEFRINA GLUCAGN INSULINA
AMPc
Inhibidor Fosfoprotena Fosfatasa (INACTIVO)

ATP P
OH
AMPc
PKA
ADP
Fosfoprotena Fosfatasa Inhibidor Fosfoprotena Fosfatasa (ACTIVO) Pi Pi
AMPK, HMGRK o Reductasa Kinasa ( inactiva )

ATP
OH
HMG-CoA Reductasa Fosfatasa Inhibida Pi
HMG-CoA Reductasa (inactiva) OH HMG-CoA Reductasa (activa)
ProteAMPKK o na P Reductasa Kinasa FosfaKinasa tasa 2C ADP ADP AMPK, HMGRK o Pi Reductasa Kinasa ( activa ) ATP
HMG-CoA
Fig. 42-10. Regulacin de la HMG-CoA reductasa por modificacin covalente
Mevalonato
Colesterol
540
SREBP : SCAP : WD 40 : bHLH :
STEROL REGULARORY PROTEIN BINDING ELEMENT SREBP CLEAVAGE ACTIVATING PROTEIN Ct DE SCAP CON 4 MOTIVOS REPETIDOS Y QUE SE UNE A CT DE SREBP FACTOR DE TRANSCRIPCIN CONSTITUIDO POR EL MOTIVO Nt- BETA HELIX - VUELTA HELIX SIP Y S2P: PROTEASAS PRESENTES EN EL GOLGI
LADO CITOPLASMATICO DEL R.E. WD 40 Ct bHLH Ct Reg.
NCLEO bHLH
SCAP
SREBP
ESTEROLES
Exceso de Esteroles impide la unin de SCAP con SREBP y su presentacin a S1P en el Golgi
LUMEN DEL R.E. GOLGI WD 40 Ct
Bajo Colesterol, permite la asociacin de SCAP con SREBP para ser presentado a S1P primero en el Golgi y posteriormente a S2P que libera bHLH que parte al Ncleo a promover la transcripcin de Receptores de LDL
SCAP
bHLH
SREBP
bHLH
S1P
Proteasa luminal del Golgi que es inhibida por alto nivel de Esteroles
S2P
Proteasa transmembrana que libra bHLH
Fig. 43 10. Sistema SREB/SCAP de regulacin de la expresin
541
Volver inicio
al
542
23) SINTESIS DEL COLESTEROL. El Colesterol se sintetiza en el citoplasma y microsomas del hgado, intestino y corteza suprarrenal, adems, puede ser sintetizado en aquellos otros rganos destinados a la sntesis de testosterona (testculos) y estradiol (ovarios). Fuera de las hormonas esteroidales el Colesterol ejerce su efecto en la fluidez de las membranas celulares y es eliminado finalmente en las heces al ser secretado como una sal biliar al intestino. No existe va catablica del colesterol que lo oxide a CO2 y agua, por lo tanto su acumulacin est sujeta a una serie de trastornos provocados en la salud de las personas. La va destinada a la sntesis del colesterol parte desde Acetil-SCoA como precursor y logra formar en una primera etapa los Isoprenos ( 2-metil butadieno). Estos compuestos son poliinsaturados y poseen 5 tomos de carbono que se adicionan entre s generando nuevas molculas de mayor tamao. Son de extremada importancia en las plantas, donde dan origen a vitaminas, esencias vegetales e incluso al caucho. El precursor Acetil-S-CoA, puede ser originado por los Hidratos de Carbono, Aminocidos y la Beta-oxidacin de los cidos Grasos. En la primera etapa de la sntesis del Colesterol, 3 molculas de Acetil SCoA generan el 3OH-3-Metil-Gluataril-SCoA el que mediante una reduccin con dos molculas de NADPH da origen al cido Mevalnico, un compuesto de 5 carbones (Fig. 40 - 10). Esta reaccin es catalizada por la enzima HMGCoA Reductasa o enzima marcapaso. El cido Mevalnico en la segunda etapa es activado por tres molculas de ATP y pierde un CO2 dando origen a la unidad Isoprnica soluble Isopentenilpirofosfato (IPP), que an puede isomerizar a Dimetilalil Pirofosfato (DMAPP). La sntesis del Colesterol es totalmente distinta a la sntesis de los cidos grasos, donde el precursor Acetil-S-CoA acumula energa en la forma de de Malonil-SCoA gastando un ATP/ Malonil-SCoA para hacer la adicin sucesiva de molculas exergnica. En el caso particular del IPP, este cuenta con 5 tomos de carbono y es soluble por los fosfatos adems de encontrarse en un estado activado que le permite en una tercera etapa condensarse sobre s mismo 6 veces para dar origen al Escualeno, que posteriormente en un cuarto paso que cuenta con sucesivas etapas de oxidacin y descarboxilacin se convierte en Lanosterol, precursor directo del Colesterol de 27 tomos de carbono (Fig. 40 10 y 41 - 10) despus de una quinta etapa que incluye varias reacciones. El IPP en las plantas, es tambin precursor de los terpenos cclicos, entre los cuales se encuentran las esencias vegetales como el Limoneno (cscara del limn), Cineol (eucaliptus), Longifoleno, Pineno (pino) y otros terpenos acclicos como el Citronelal (eucaliptus). El IPP es tambin precursor de los compuestos Carotenodeos como la Vitamina A y las otras vitaminas liposolubles D, E y K, junto a las hormonas vegetales entre las que se encuentran las Auxinas, Giberelinas y Citocininas.
543
H M G- C oA S i n t a s a
H M G- C oA R e d u c t a s a
T io la s a
2CH3 C O S CoA C oA S H CH3 C O
H C 2
C C
CH3
D e s c a rb o x ila s a
COO CO2 + P i
COO COO CH3 C O S CoA 2 NADPH + 2 H CH2 CH2 M e v a l o C H 2 C S C oA CH3 C OH CH3 C OH n a to CH2 O CH2 C oA S H 2 N A D P C o A S C CH2 OH C oA S H O ATP 3 -O H -3 -M e til-G lu ta ril-S C o A ADP ATP ADP O CH3 COO
-
H
C
O O P O O
O P O
CH2 O CH3 C O P O O CH2 O O O CH2 O P O P O O
CH2 C OH CH2 O O CH2 O P O P O O O
ATP ADP CH3
COOCH2 C OH CH2 CH2 O O P O O P-
IP P IP P
P- P-
M e v a lo n a to
M e v a lo n a to
Is o m e ra s a
H H C
CH C CH3 CH3 O O P O O O P O
G P P O H H C
CH C CH3 CH3 O O
O P P
CH3 CH3
D M A P P O
CH2 C CH3
T ra n s fe ra s a
CH3
O P O P O O
T ra n s fe ra s a
PP i
IP P
P P i O P P
CH3
F P P P P i
CH3
D M A P P
+
H
HC
H H
C O
O O
P O P O
CH3
CH3
D M A P P
IP P
G P P
F P P
Fig. 44 - 10.Sntesis de los Esteroides.
544
E s c u a le n o
L a n o s te ro l
C o le s te ro l
HMG CoA R e d u c ta s a
(- )
Fig. 45 - 10. Sntesis final del Colesterol.
Primera Etapa: Varias Enzimas 3 Acetil-SCoA + 2NADPH+H+H2O------------------------>AC. MEVALONICO+2NADP+3CoASH (2 C ) (6C) Segunda Etapa: Mevalonato Quinasa AC. MEVALONICO + 3 ATP----------------------------------> ISOPENTENIL-PP+Pi+3ADP+CO2 (6C) (5C) Isomerasa ISOPENTENIL-PP <-----------------> DIMETILALIL-PP ( IPP ) ( DMAPP ) Tercera Etapa: Isoprenil Transferasa IPP + DMAPP-------------------------------------> GERANIL-PP + PPi (5C)(5C) ( 10 C , GPP ) Prenil Transferasa GPP + IPP-------------------------------------> FARNESIL-PP ( 10 C ) ( 5 C ) ( 15 C , FPP )
545
Escualeno Sintasa FPP + FPP + NADPH + H ----------------------------------> ESCUALENO +2 PPi ( 15 C ) ( 15 C ) ( 30 C ) Cuarta Etapa Escualeno Monoxigenasa y Ciclasa ESCUALENO + 1/2 O2 ------------------------------------------------------> LANOSTEROL ( 30 C ) ( 30 C ) Varias Enzimas LANOSTEROL ---------------------------------------------> COLESTEROL + HCOOH+2CO2 ( 30 C ) ( 27 C , C27 H46 O )
Volver inicio
al
546
24) SNTESIS DE LAS SALES BILIARES La sntesis de los cidos biliares ocurre en el hgado a partir de Colesterol para llegar al c. Quinodeoxiclico y c. Clico (fig. 42-10), ambos se conjugan con Taurina y Glicina. para dar origen al c. Tauroclico y Glicoclico. Ambos son secretados desde los canalculos biliares a la vescula y posteriormente al intestino, donde despus de emulsificar a las grasas se elimina la Taurina y la Glicina para ser reabsorbidos nuevamente. Debido a este tipo de recirculacin enteroheptica (fig. 43 10), es difcil eliminar los niveles de Colesterol, excepto cuando la estada intestinal es acortada por accin de algunos compuestos que actan como resinas que no se absorben, pero s unen sales biliares y las arrastran, promoviendo una rpida evacuacin por acortamiento del tiempo dedicado a la absorcin intestinal.
COLESTEROL
HO
o o
C Q U IN O D E O X IC L IC O
HO HO OH
o o
C . C L IC O
HO OH SCoA
HO
C O L IL - S C o A
HO
OH G L IC IN A
T A U R IN A CoASH HO HN SO3
-
CoASH O HN HO
o o
HO
OH
HO
OH
C . T A U R O C L IC O
C G L I C O C L IC O
Fig. 46 10. Resumen de la Sntesis de los cidos Biliares a partir de Colesterol
547
HIGADO
CIRCULACIN SISTMICA
COLESTEROL
CS. CLICOQUINODEOXICLICO CONJUGACIN CON TAURINA Y GLICINA 95% 5%
CIRCULACIN PORTAL
VESCULA
90% DUODENO ILEON 10% HECES
Fig. 47 10. Circulacin de los cidos Biliares.
La sangre venosa va desde el Ilen a la vena Porta y desde all a los canales sinusoidales del Hgado. Los Hepatocitos toman nuevamente los cidos biliares desde la sangre sinusoidal y son nuevamente secretados a los canalculos. Volver inicio al
25) FENOTIPO DE CINTURA HIPERTRIGLICERIDMICA U OBESIDAD VISCERAL En la actualidad se ha observado la presencia de tres factores asociados con esta caracterstica y consisten en: a) Hiperinsulinemia o resistencia a la Insulina conocida como Diabetes Tipo 2. b) La Presencia de Hiperapoliprotena B o alto nivel de LDL c) Hipertensin. Todos estos factores conducen a la Aterognesis o enfermedad cardiovascular.
548
La Hipertensin daa el Endotelio capilar liberndose factores quimiotcticos que atraen a los macrfagos. Estos ltimos ingieren el Colesterol y como no lo pueden degradar se transforman en clulas espumosas cuya agrupacin dar origen al Ateroma.
REFERENCIAS
549
Sterol Biosynthesis. , G.J. Schroepfer,Jr. Ann.Rew.Biochim. ,Vol 50,585-621,1981. Sterol Biosynthesis., G.J. Schroepfer,Jr. Ann.Rew.Biochim. ,Vol 51,555-585,1982. Fatty Acid Synthesis and its Regulation., J.J. Wakil , J.K. Stoops and V.C. Joshi., Ann.Rew. Biochem. Vol 52, 537-579, 1983 http://www.rpi.edu/dept/bcbp/molbiochem/MBWeb/mb2/part1/fasynthesis.htm http://www.mednote.co.kr/BOKnote/lipsynth.html http://www.ohsu.edu/cliniweb/D10/D10.516.532.html http://www.kcl.ac.uk/kis/schools/life_sciences/life_sci/Lipo2/index.htm
550
550
Hector Rocha L. Metabolismo de los Aminocidos
AMINOCIDOS 1 1) SINTESIS Y OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS 554.
2) SINTESIS EN MICROORGANISMOS Y PLANTAS DE LOS AMINOACIDOS ESENCIALES Y SU OXIDACION EN HUMANOS 555 3) SINTESIS DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS COMO VALINA, LEUCINA E ISOLEUCINA 557 4) OXIDACIN DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS 559 5) SINTESIS Y OXIDACION DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS AROMATICOS COMO FENILALANINA, TIROSINA Y TRIPTOFANO 561 6) OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS AROMATICOS 563 7) SINTESIS Y OXIDACION DE METIONINA Y TREONINA 567 a) Sntesis de Metionina y Treonina 567 b) Oxidacin de Metionina y Treonina en Humanos 569 8) SINTESIS DE LISINA, ARGININA E HISTIDINA 573 a) Sntesis de Lisina 573 b) Sntesis de Arginina e Histidina 575 c) Oxidacin de Lisina 578 d) Oxidacin de Arginina e Histidina en Humanos
579
9) METABOLISMO DE LOS AMINOACIDOS NO ESENCIALES 354 a) METABOLISMO DE LA ALANINA, PROLINA, GLUTAMICO Y GLUTAMINA 581 b) METABOLISMO DE LA GLICINA Y SERINA 581 c) METABOLISMO DE LA TIROSINA 587 d) METABOLISMO DE LA CISTEINA 587 10) MANEJO DEL AMONIO 587 11) TRANSPORTE DEL AMONIO POR LOS AMINOACIDOS GLUTAMICO, GLUTAMINA Y ALANINA 593
551
AMINOACIDOS 2 12) ENTRADA DE LOS AMINOACIDOS AL CICLO TRICARBOXILICO 594 13) CICLO DE LA UREA 596 14) FALLAS EN EL CICLO DE LA UREA 597 599 599 603
15) REGULACIN DEL CICLO DE LA UREA
16) CONTROL DEL AMONIO DURANTE LA INANICION
17) APNDICE MALNUTRICIN PROTEICO ENERGTICA
552
1) SINTESIS Y OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS. De los 20 aminocidos presentes en los Eucariontes, 10 de ellos no pueden ser sintetizados en la especie humana, como son los ramificados Valina, Leucina, Isoleucina y aquellos
553
que poseen anillos aromticos como Fenilalanina y Triptfano. Tampoco es posible dentro del metabolismo incorporar Azufre libre a la estructura de algunos de ellos por lo que se requiere de Metionina en la dieta. Los aminocidos esenciales son necesarios al igual que las vitaminas y algunos de los cidos grasos poli-insaturados (linoleico, linolnico). Los otros 10 restantes no esenciales, aunque no menos tiles que los primeros pueden ser manejados por el metabolismo humano. Los aminocidos esenciales se pueden clasificar como:
Hidrofbicos ramificados
Valina Leucina Isoleucina Fenilalanina Triptfano
Hidrofbicos con anillos cclicos
Hidrofbico que porta Azufre para incorporarlo a la Serina y producir Cistena
Metionina
Polares sin carga
Treonina Lisina Arginina* Histidina No se encuentran
Polares con carga positiva
Polares de carga negativa

*
Arginina es esencial solo en lactantes que no han madurado a plenitud el Ciclo de la Urea en el Hgado. Los aminocidos tanto esenciales como no esenciales pueden ser precursores de casi todos los compuestos que necesita el metabolismo intermediario, de esta manera se encuentran entre ellos los aminocidos Glucognicos que podrn transformarse en Glucosa, mientras que otros aminocidos sern los Cetognicos, cuyo esqueleto hidrocarbonado puede dar origen a los cidos Grasos y compuestos relacionados. Los aminocidos son tambin precursores de otras molculas importantes para el organismo como son los Neurotransmisores, Grupos Prostticos (Heme) y las Bases Nitrogenadas de los cidos Nucleicos. El principal problema del metabolismo aminoacdico es la eliminacin del amonio para aquellos aminocidos que no se emplean en la sntesis de protenas o en la generacin de aminas metablicas y grupos prostticos. Los aminocidos que por circunstancias especiales del metabolismo se destinan a transformarse en energa, glucosa o cidos grasos, aportarn solamente su esqueleto hidrocarbonado, previa eliminacin del Nitrgeno. Por ejemplo, el aminocido Glutmico y su relacionado la Glutamina, aunque no esenciales son fundamentales para el transporte del Nitrgeno que viaja en la forma de los grupos -Amino
554
(-NH2) o Amido (- CO-NH2), desde los distintos tejidos hacia el Hgado, para la formacin de Urea como producto de deshecho. Uno de los motivos que ha impulsado el conocimiento detallado de las vas metablicas en los aminocidos, es la existencia de "los errores congnitos del metabolismo". Estos errores se caracterizan por ser enfermedades moleculares recesivas (no la sufren los heterozigotos) y poco comunes. Las alteraciones metablicas que caracterizan estas enfermedades ocurren por la acumulacin de intermediarios catablicos, como consecuencia de fallas en las reacciones enzimticas por causas que se pueden enumerar como: ausencia de la enzima, un cambio de su cintica o bien una mala regulacin del funcionamiento de las enzimas involucradas en las reacciones de oxidacin de los aminocidos. Las consecuencias de estas fallas se traducen en aminoacidemias y/o aminoacidurias, que tienen un efecto nocivo al organismo alterando el pH de la sangre y causando toxicidad al sistema nervioso central. Ocurre en estas enfermedades que los genes que codifican para las enzimas deficientes pueden estar presentes, pero no se expresan o bien se expresan, pero la enzima no es funcional por alguna mutacin o bien, no es posible controlar su actividad enzimtica. En algunos casos puede ocurrir que los genes no estn presentes del todo o solo lo estn parcialmente a causa de alguna delecin en su estructura. Ocurre tambin que muchas de estas enfermedades son clnicamente similares, pero molecularmente distintas. Volver al inicio 2) SINTESIS EN MICROORGANISMOS Y PLANTAS DE LOS AMINOACIDOS ESENCIALES Y SU OXIDACION EN HUMANOS. El estudio de la sntesis de los aminocidos es extremadamente complejo por la cantidad de isoenzimas presentes y los compartimientos donde se lleva a cabo. De esta manera, la aproximacin estilo bioqumica clsica, que consiste en homogenizar y estudiar los intermediarios no es exitosa, ya que se mezclaran las isoenzimas de los distintos compartimientos. La nica solucin hasta ahora ha consistido en recurrir a la generacin de microorganismos mutantes. Especialmente aquellos con enzimas defectuosas o ausentes en distintas etapas de las vas metablicas que conducen a la sntesis de algn compuesto. Dichas tcnicas se basan en la administracin de los posibles intermediarios de estas vas, ms los experimentos de conjugacin (traspaso de material gentico) entre las distintas estirpes bacterianas, para as lograr la sntesis completa de un determinado aminocido. De esta forma se ha podido estudiar cada una de las etapas relacionadas con la sntesis de un aminocido en especial. Lisina y Treonina son los aminocidos esenciales que se encuentran en menor proporcin en los cereales, de tal manera que se ha investigado ampliamente la forma de aumentar su produccin. Otros aminocidos como los aromticos, son de importancia tanto en bacterias como en plantas. En estas ltimas, la misma va de sntesis produce tambin c. Siqumico, compuesto cclico esencial para la fabricacin de los elementos estructurales leosos (Lignina). El Triptfano es uno de los aminocidos aromticos esenciales que requiere de una mayor cantidad de energa para su sntesis. En los animales, este aminocido es necesario para la sntesis del neurotransmisor Serotonina y la Amina conocida como cido Nicotnico o bien denominada en la actualidad como Niacina, precursor de la coenzima NAD. Los tres aminocidos esenciales del tipo ramificado Valina, Leucina e Isoleucina se sintetizan en los Cloroplastos de todas las plantas, principalmente en aquellos tejidos que se encuentran en crecimiento y sus vas biosintticas han sido lo suficientemente estudiadas en
555
la actualidad. El Nitrgeno es tomado por las plantas en la forma de Nitrato y reducido a la forma de Amonio por la Nitrato y Nitrito Reductasa. Este amonio es posteriormente ingresado a los esqueletos hidrocarbonados para formar los aminocidos. Por otro lado, los aminocidos no esenciales como lo son Glutmico, Glutamina, Asprtico y Asparegina en animales, se emplean en la planta para transportar el Nitrgeno hacia las distintas necesidades metablicas como se ver posteriormente en un Captulo posterior destinado a ello.
Volver inicio
al
3) SINTESIS DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS COMO VALINA, LEUCINA E ISOLEUCINA.
556
SINTESIS DE AAS. HIDROFOBICOS ALQUILICOS

OH H O CH 3 C
Acetil -- SCoA
CH COOH 2 COOH CH 3
PIRUVATO
COOH
CH 3
C H
C NH
COOH 2
Adicin de Piruvato O
CH 3
TREONINA
HO C Adicin + Cetoisovalerico HC HC 3
CH 3 COOH
Thr Deaminasa
-Isopropil Malico
COOH
C C OH
CH CH C COOH 3 2
Deshidratacin
HC
-Aceto Lctico
Adicin de Piruvato
-Cetobutrico
OH
C COOH HC HC 3 CH 3
Reduccin
CHH 3 CH 3 C C COOH OH O H
CH CH C COOH 3 2 C O CH 3
-Aceto- - OH Butrico
Hidratacin
Reduccin
-Isopropil Maleico
C COOH COOH CH 3
Reordena miento
,-Di-Hidroxi CetoisovalricoC H3
H CH 3 CH C 2 C COOH
H C
OH O H
Reordena CH 3 COOH
,-Dihidroxi--Metilvalrico Reordenamiento
H HN 2
HC HC 3
miento -Cetoisovalrico
CH 3
CH
-OH -Carboxi Isocaproico
C C H O
3 C COOH
CH CH C 2 3
OH O
Transami nacin
CH 3 CHH 3 C C H NH 2 COOH
Transami nacin
CH H 3 CH CH C 3 2 H C NH
-Ceto--Metil Valrico
C
H CH
COOH O
C
HC H
COOH
Transami nacin
CH 3
COOH 2
HC HC 3
H C C H3 HC 3
VALINA
ISOLEUCINA
LEUCINA
-Ceto Isocaproico
Fig 1 - 12. Sntesis de Valina, Leucina e Isoleucina.
Los aminocidos hidrofbicos esenciales como Valina, Leucina e Isoleucina (Fig. 1 - 12), se sintetizan a partir del PIRUVATO. En el caso de la Valina y la Isoleucina, un Acetaldehdo activado con Tiamina Pirofosfato (TPP) es entregado a los cetocidos Pirvico y -Cetobutrico para extender su estructura, seguido de una reduccin y reordenamiento de los grupos tanto Hidroxi como Metilo, formndose de esta manera los -cetocidos correspondientes, para ser luego Transaminados y convertidos en aminocidos. La sntesis de la Leucina empieza con la
557
adicin de Acetil-SCoA sobre el cetocido -Cetoisovalrico, para formar as el c. Isopropilmlico, posteriormente ocurre una reaccin similar a la catalizada por la cisAconitasa del CTC con una Deshidratacin-Hidratacin y subsecuente reordenamiento en la posicin del OH, para facilitar la salida del CO2 y formar as el c. -Cetoisocaproico, el que finalmente por medio de una Transaminacin da origen a la Leucina.
Volver inicio
al
4) OXIDACIN DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS RAMIFICADOS.
558
Isoleucina, Leucina y Valina (Fig. 2 - 12), son degradados principalmente en el msculo y en su primera reaccin es eliminado el amonio por Transaminacin. El grupo amino es cargado en el cetocido -Cetoglutrico para formar Ac. Glutmico que transportar el amonio al Ciclo de la Urea. Los Cetocidos restantes sufren enseguida una Descarboxilacin oxidativa, con una activacin mediante la CoASH. Posteriormente, son insaturados por una oxidacin del tipo -, con la subsecuente formacin de un doble enlace entre estos dos carbonos. En el caso de la Leucina se introduce un nuevo carboxilo, con la ayuda de la Biotina, para luego continuar al igual que la Isoleucina y la Valina, con una insaturacin e hidratacin,
CONVERSION DE LOS AAS ALQUILICOS HIDRFOBICOS A PRECURSORES E INTERMEDIARIOS DEL CICLO TRICARBOXILICO
CH 3 CH 2 CH CH 3 C 2 COOH S CoA S CoA S CoA S CoA C CH 3 CH CH 3 H C CH H C C OH C CH O 3 C C 3 CH 3 H C C O CH CH 3 CH CH 2 CH
CH3 CO-SCoA
CH
1
2 CH 3 O
CH CH CH
CH 3 CH 2 O
O O
NH
COOH
ISOLEUCINA
-Ceto -Metil Valrico
-Metilbutiril- SCoA Tiglil ScoA -Metil -OH O H -Metil Glutaril ScoA Acetoacetil - SCoA
S CoA
Carboxilacin CH 3 CH CH 3 2 NH C 2 COOH CH 3 CH
Propionil SCoA
CH 2 COOH CH 2 HO C COOH CH3
1
3
CH 3 CH
3
CH 3
CH
3 CH 3
CH
CH
CH3 CO-SCoA
6
CH 2
CH
CH
2 O
CH
2 O
CH
CH
7
O C CH 3 CH 2 C O O
2
C S CoA C S CoA O
5
C S CoA O
CH
C S CoA
COOH
LEUCINA
-Cetoisocaproico Isovaleril-SCoA -Metil Crotonil -Metil Glutaconil -SCoA -SCoA
Glutaconil OH -SCoA
HO
Ac. Aceto actico
CH
9
CH 3
CH 3 CH CH
1
3
CH
3 CH 3 O
CH 2 C CH 3
CH 2 CH
OH
CH 2 3 C H
OH
CHO CH CH 3
O C CH
CH
CH
CH
CH
SCoA
CH 3
CH
NH 2
COOH
COOH
COOH COOH
COOH
S CoA
S CoA
S CoA
VALINA
c. -Ceto Ac. Isovalrico
Isobutiril-SCoA
Metacril-SCoA -OH -OH Semialdehdo Isobutiril-SCoA Isobutrico Metlmalnico
Metil MalonilSCoA
Fig. 2 - 12. Los aminocidos Valina, Leucina e Isoleucina forman intermediarios del CTC.
similar a la que ocurre en la -Oxidacin de los cidos Grasos. Los Hidroxiderivados que se
559
forman en esta etapa, se oxidan posteriormente a sus correspondientes cetocidos. Estos ltimos se rompen generando productos que son aceptados como intermediarios del CTC. Otros compuestos como la Propionil-SCoA y la Metil-Malonil-SCoA, forman despus de algunos reordenamientos Succinil-SCoA para entrar finalmente al CTC. Tabla 1 - 12 Nombre 1 Cetoaciduria de aminocidos con residuos ramificados Falla la Enzima
2 3
4 5 6 7 8 9
-Cetocido Descarboxilasa y/o la -Cetocid Deshidrogenasa de cadena ramificada con solo actividad residual. Val, Leu, Ile en la orina. Orina olor a mermelada -Cetocido Descarboxilasa inactiva, ocurre de arce y presencia de -Cetocidosen pob. Mediterranea, retardo fsico y mental Acidemia y/o Aciduria Isovalrica, Isovaleril-SCoA Deshidrogenasa Isovaleraturia, Isovaleremia Olor a pi sudado -Metil Crotonil Glicinuria -Metil Crotonil-SCoA Carboxilasa Atrofia muscular Holocarboxilasa Sintasa. -Metil Crotonil Glicinuria Cetoacidosis Aciduria -Metil Glutacnica -Metil Gluataconil Hidrasa Aciduria -Hidroxi -Metilglutrica Aciduria -Metil--Hidroxi-Butrica Cetoacidosis y vmito Hipervalinemia -Hidroxi -Metilglutaril-SCoA Liasa -Cetotiolasa
Valina Transaminasa
Isoleucina produce ambos, Acetil-SCoA y Propionil-SCoA, siendo tanto Cetognico como Glucognico, mientras que Leucina produce Acetil-SCoA y c. Acetoactico siendo en ambos casos Cetognico. Finalmente Valina produce Metil-Malonil-SCoA que pasa a Propionil-SCoA, este ltimo se integra al CTC como Succinil-SCoA y ser Glucognico. El metabolismo de estos aminocidos produce NAD y FAD reducido que sern capaces de producir ATP. En la Tabla 1 - 12, se pueden observar las enfermedades producidas al fallar algunas de las enzimas normalmente presentes en estas vas metablicas. Debido a ello se produce la acumulacin de ciertos intermediarios, ya sea en la sangre y/o en la orina. Cuando la descarboxilacin oxidativa por la -Cetocido Descarboxilasa se encuentra parcial (1) o totalmente (2) bloqueada, aparecen los tres aminocidos ramificados y sus cetocidos en distintas concentraciones tanto en la sangre como en la orina. Durante el bloqueo total se produce orina con "olor a mermelada de arce" y la aparicin de sntomas neurolgicos en los recin nacidos al cabo de unos das. La Acidemia y/o Aciduria Isovalrica (3) o "sndrome de los pies sudorosos" es otra de estas enfermedades, donde la reaccin catalizada por la Isovaleril-SCoA Deshidrogenasa est bloqueada y se forma el compuesto txico denominado c. Isovalrico, como producto de la hidrlisis del intermediario acumulado Isovaleril-SCoA. La enfermedad aparece en la
560
niez y se trata con Glicina para que reaccione con el Isovaleril-SCoA acumulado, mediante la enzima Glicina-N-Acilasa, ya que de esta manera se forma un compuesto no txico como la Isovaleril-Glicina que puede ser excretado sin inconveniente. En la -Metil-Crotonilglicinuria (4) y (5), falla una de las dos o ambas enzimas -MetilCrotonil-SCoA Carboxilasa y/o Propionil-SCoA Carboxilasa e incluso en algunos casos la Piruvato Carboxilasa. Los pacientes responden bien a las dosis de BIOTINA. Finalmente se encuentra la Hipervalinemia (9) que involucra a la enzima Valina Transaminasa y es caracterizada por altos niveles de Valina en la sangre y orina, pero no de Leucina o Isoleucina. Volver al inicio
5) SINTESIS Y OXIDACION DE AMINOACIDOS CON RESIDUOS AROMATICOS COMO FENILALANINA, TIROSINA Y TRIPTOFANO. Entre los aminocidos aromticos tenemos a la Fenilalanina, Tirosina (No esencial, pero involucrado en la sntesis) y Triptfano. La determinacin de la va metablica para la sntesis de estos aminocidos se logr con mutantes bacterianos auxotrficos, que necesitan de los tres aminocidos aromticos para crecer, ya que cada uno de ellos falla en una reaccin parcial distinta conducente a la sntesis de uno de los aminocidos. Todos los mutantes al crecer en conjunto logran sintetizar los aminocidos, pero individualmente catalizan solo algunas etapas de cada va metablica, por ejemplo: Mutante X: A------------>B D-----------> Aminocido M Mutante Y: B---------->C D-----------> Aminocido M Mutante Z: C -----------> D------------>Aminocido M Total: A------------->B---------->C-----------> D------------>Aminocido M
En este ejemplo los tres mutantes necesitan del aminocido M para crecer, ya que individualmente no lo fabrican, sin embargo, si se adiciona el intermediario D sern capaces de sintetizarlo. Mediante este mtodo se descubri al cido Sikmico o Siqumico, que es el principal intermediario de la sntesis de los aminocidos aromticos. En los microorganismos el 90% de la maquinaria esta comprometida con la sntesis de protenas, mientras que en las plantas solo el 20% del carbn fijado pasa por la sntesis de tan solo el cido Siqumico, que no es tan solo el precursor de los aminocidos aromticos, sino que es una va alterna para la fabricacin de compuestos anillados como el heteropolmero Lignina. Este ltimo se encuentra en la parte leosa de la planta junto a los pigmentos y los compuestos anti-insectos. La sntesis empieza por un Fosfoenol Piruvato que se une a la Eritrosa-4-P (Figs. 3 - 12 y 4 12), para formar un compuesto de 7 carbones que posteriormente se cicla y da origen al c. 5- Deshidroqunico. Este se convierte posteriormente en c. Sikmico, el que va fosforilacin con Fosfoenol Piruvato (PEP), pasa a Corsmico, desde donde la va se ramifica. Una de las ramas conduce al c. Antranlico y por lo tanto a Triptfano, mientras que la otra conduce al c. Prefnico. Este ltimo se aromatiza por deshidrogenacin y descarboxilacin simultanea para dar el c. p-OH-Fenilpirvico que formar finalmente la Tirosina. La otra forma de aromatizarse es por descarboxilacin y deshidratacin para as formar Fenil Pirvico que por transaminacin producir Fenilalanina y esta ltima por Hidroxilacin se transformar en Tirosina.
561
La va que conduce a Triptfano empieza con el cido Antranlico que reacciona con la Ribosa activa como 5-P-Ribosil-1-PP, de donde toma sus carbones para formar el N-(5-PRibosil)-Antranilato. Posteriormente el anillo de la Ribosa se abre, pierde un CO2 formando el Indol-3-Glicerol-P, que por la accin de la enzima Triptfano Sintasa permite la entrada de Serina, saliendo el Gliceraldehido-3-P y quedando sintetizado el aminocido Triptfano. Este aminocido es
COO O C H H C C CH 2 O OH OH O O O H O COO C O H O H H CH O 2 HC 2 OH OH O 2 O O H C O C OH OH OH
H+
HO C CH2 H C OH O OH O COO
H+
COO
+
P
H+
COO
C CH
P O
+ H Ac.
CH C C CH
Sikmico
OH
Fosfo - Enol Piruvato (PEP)
Eritrosa - 4 - P
Ac. 5-Deshidro Ac. Dehidroqunico H+ Sikmico COO H + (PEP)

CH 2 C COO O P O O CH 2 C COO
COO C CH 2 O HOO
Ac. 3 -Deoxi Arabino O Heptulosonico -7 - P

O C H2 C COO COO
COO
H+
O OH
HO OH
OH
Ac. Fenil Pirvico

OH
Ac. Prefnico
OH
Ac. Corsmico
COO
Ac. 5 - P - Sikmico
ac. 3 Enoil - 5 - P- Piruvilsikmico
Fenil Alanina
C CH 2
O O NH 2 COO O CH
COO
HN
FIGURA SIGUIENTE
Tirosina
Ac. P - OH - Fenil
OH
P O
2 O
H+
Pirvico
Ac. Antranilico
HO OH
Fig. 3 - 12. Sntesis del cido Sikmico (Siqumico) como precursor de la Fenilalanina, Tirosina y Triptfano.
precursor de los Indoles y Auxinas que intervienen en el desarrollo de la planta e incluso de algunos Indol-Alcaloides como la Vinblastina y la Vincristina que se emplean como drogas anticncer.
562
1 - ( O - Carboxifenilamino ) - 1 - Deoxirribulosa - 5 - P OH OH OH C C N H C O
Indol - 3 - Glicerol - P H C N H H C O CH O P O 2 O Serina Gliceraldehido - 3- P H C N H H + NH 3 C H -C OO
C OO
C CH O P O 2 O H H
OH OH
Tript[ofano
Fig. 4 - 12.Continuacin de la Sntesis de los aminocidos aromticos.
Volver inicio 6) OXIDACION DE LOS AMINOACIDOS AROMATICOS.
al
La oxidacin de la Fenilalanina y Tirosina, es una de las vas ms estudiadas ya que en ella ocurren varias deficiencias enzimticas que acarrean enfermedades metablicas (Fig. 5 12). La primera reaccin es catalizada por la Fenilalanina Hidroxilasa unida a Citocromo P450, que introduce un Hidroxilo en el anillo bencnico en la posicin para (orto, meta, para). De esta manera se forma el aminocido Tirosina que no es esencial a menos que la enzima que cataliza esta reaccin sea defectuosa. La Tirosina es luego convertida a Melanina por medio de la Dopa y la Dopaquinona como intermediarios. El bloqueo de alguna de las etapas de esta va produce Albinismo. La Tirosina es tambin precursora de neurotransmisores como la Dopamina y la Norepinefrina, causando enfermedades con graves sntomas neurolgicos cuando alguna etapa de esta va se encuentra defectuosa. Una de las mayores vas de oxidacin de la Tirosina incluye la formacin del c. p-OHFenilpirvico que se oxida a c. Homogentsico, el que se rompe finalmente en Fumarato y Acetoacetato (Fig. 5 - 12). Entre las mltiples enfermedades metablicas (Hiperfenilalaninemias) producidas por las fallas enzimticas de esta va se encuentra la clsicamente denominada Fenil Cetonuria, Tabla 2 - 12. La enzima Fenilalanina Hidroxilasa (1), al ser incapaz de incapaz de actuar en esta etapa conduce a la acumulacin de Fenilalanina. Esta ltima por transaminacin con -Cetoglutarato genera elevados niveles del Ac. Fenilpirvico, el que aparece en la orina. Este cido es txico a nivel del Sistema Nervioso Central.
563
OH OH
O O
Melanina Dopa DHBReductasa 5

CH CH NH 2 COOH 2 CH CH 2 NH 2
Dopaquinona
COOH
THB
DHB
OH OH OH O O
4
C HC CH 2 HC C CH 2 CH
2
HC
COOH
CH 3 CH C CH 2 COOH
HC CH CH 2 CH NH 2 COOH CH 2 CH NH 2 COOH 2 CH OH C O COOH
O HOOC 2 COOH
COOH
CH 2 COOH
HOOC
CH
COOH
Fenil a lanina
Tirosina c. P-OH c. HomogenFenil pirvico tsico
c. Malomil c. Fumaril acetoactico acetoactico
c. Fumrico
c. Aceto actico
THB
OH
OH OH OH
OH OH
DHB
CH 2 CH NH 2
CH 2 CH 2 NH 2
CH CH 2
OH
Nor epi Dopamina

NH 2
COOH
Dopa
nefrina
Fig. 5 - 12. La Fenilalanina es un precursor de otros productos como la Tirosina, Melanina y los Neurotransmisores.
564
565
Tabla 2 - 12 NOMBRE 1 2 Tirosinemia 3 Tirosinosis 4 Alcaptonuria 5 Albinismo Homogentisato Dioxigenasa Presencia de c. Homogentsico en la orina Conjunto de fallas enzimticas que pueden ser Tirosinasas - o +, cuando alguna otra enzima de la va es defectuosa p-Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa Probable Fumarilacetoacetasa o la Tirosina Transaminasa Fenilcetonuria o Hiperfenilalaninemia Falla en la Enzima Fenilalanina Hidroxilasa o su Cofactor L-Eritro- 5,6,7,8 - Tetrahidrobiopterina
Otra enfermedad clnicamente similar a la anterior (1), ocurre por deficiencias enzimticas en la sntesis del cofactor Tetrahidrobiopterina (THB), empleado por esta misma enzima (Fig. 5 - 12). Este cofactor interviene en la reaccin conducente a la Hidroxilacin del Triptfano. Su falta acarrea deficiencias en la sntesis de neurotransmisores como Dopamina, Norepinefrina y Serotonina, ms la acumulacin de Fenilalanina. Esta ltima al igual que en la falla de la enzima Fenilalanina Hidroxilasa, hace disminuir por Transaminacin los niveles de -Cetoglutarato necesarios para que el Ciclo Tricarboxlico se complete. Esto ocurre especialmente a nivel del tejido nervioso, lo que a su vez provoca dao neurolgico por falta de ATP, que no desaparece al disminuir la administracin de Fenilalanina. Adems, el cido Fenilpirvico producido por la transaminacin del exceso de Fenilalanina que no puede ser hidroxilada, se reduce a Fenil-lactato y luego es oxidado a Fenilacetato, dando un olor especial a la orina (olor a ratn). Por otro lado, el cofactor THB (Tetrahidrobiopterina) que pasa a DHB (Dihidrobiopterina) durante la reaccin de hidroxilacin de la Fenilalanina a Tirosina es posible recuperarlo posteriormente, al ser reducido por NADPH a DHB por medio de la enzima Dihidrobiopterina Reductasa. Esta ltima enzima, puede ser tambin otra causa de falla impidiendo la reduccin del cofactor y desencadenando la Fenilcetonuria. Otra de estas enfermedades es la Tirosinemia hepatorenal (2), que se caracteriza por mostrar una baja actividad de la p-Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa o la Fumarilacetoacetasa. Las Tirosinemias (2) y Tirosinosis (3), pueden agruparse en varios tipos de enfermedades con sntomas interconectados entre s. Ejemplo de ello son la falla de la Tirosina Transaminasa del citosol, pero no de la Mitocondria. La Tirosinosis por probable falla en la enzima p-Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa (3) conduce a una elevada excrecin de Ac. pHidroxifenilpirvico. Los pacientes pueden ser clnicamente normales, aunque en la mayora de los casos esta enfermedad es detectada secundariamente a otras.
566
1
NH CH CH 2 N COO H N H O 2 C
NH 2 CH CH COO 2
O C
NH
O C
NH
CH CH COO 2
CH CH COO 2
CHO
N H
Triptfano
Triptofano Pirrolasa
N - Formil Cinurenina
O C
CInurenina
OH
3 -- O H Cinurenina Alani -na Acetil SCoA

H
NH 2 OHC C H C H C H C COO
COO H
COO
N HOO N H H OH H
Semialdehido 2 - Amino Mucnico

OH OHC C H C H C H C COO
2 - Acroleil - 3 - Amino Fumarico

H OHC C H C H C H O
Ac. 3 - O H _ Antranlico
H H C H H C H O
COO
OHC C H
COO
2 - O H - Muconico
Oxalocrotonico
-Cetoadipico
O CH 3 C CH 2 C O SCoA
CO +
2 O
H O O C C H C H C H C S CoA
2
H O O C C H C H C H C S CoA
2 2 2
Acetoacetil SCoA
C H C H C H C S CoA 3
Glutaconil - SCoA
Glutaril - SCoA
Crotonil - SCoA
Fig. 6 - 12. Oxidacin del Triptfano.
La Alcaptonuria (4), se caracteriza por la falla de la Homogentisato Dioxigenasa y excrecin urinaria de Ac. Homogentsico que se torna negro en contacto con el aire (orina negra). El Albinismo (5), presenta cerca de seis tipos diferentes, en que lo nico en comn es la falta de melanina o la sntesis defectuosa de este pigmento. La forma clsica se puede atribuir a que la va metablica carece de Tirosinasa y pueden sorpresivamente existir casos del tipo Tirosinasa positivo, donde la cantidad de melanina es muy baja o bien ocurre que la melanina esta mal ensamblada. Ms an existen casos en que se ha detectado la presencia de otros pigmentos de color amarillo, etc. La oxidacin del Triptfano empieza con la Triptfano Pirrolasa (1), (Fig. 6 - 12). Esta enzima cataliza la ruptura del anillo para formar la N-Formil Cinurenina con O2. Cuando su actividad es deficiente, se produce un gran aumento de la concentracin de Triptfano en la sangre y a la vez una gran excrecin del aminocido en la orina junto a una baja excrecin de Cinurenina. El nombre del defecto es Triptofanuria y provoca retardo mental. La N-
567
Formil-Cinurenina despus de la eliminacin del grupo formilo y subsecuente oxidacin se transforma en la 3-OH-Kinurenina, la que se descompone eliminando Alanina que pasar a formar Acetil-SCoA, quedando solo el c. 3-OH-Antranlico. Despus de una segunda oxidacin con O2 y eliminacin de CO2 se rompe el segundo anillo, para formar el Semialdehdo 2-Amino Mucnico que a travs de sucesivas oxidaciones y descarboxilaciones formar el Acetoacetil-SCoA, quedando listo para la entrada al CTC despus de pasar a Acetil-SCoA (Fig. 6 - 12). Volver al inicio 7) SINTESIS Y OXIDACION DE METIONINA Y TREONINA. a) SINTESIS DE METIONINA Y TREONINA. Ambos aminocidos provienen del c. Oxaloactico que en los microorganismos y plantas pasa a formar el c. Asprtico (Fig 7 - 12). Este ltimo se transformar en los aminocidos Metionina y Treonina, por medio de una serie de reacciones que consisten en la activacin del grupo -Carboxilo del Asprtico con un Fosfato para luego reducirlo con NADPH en un aldehdo y a continuacin en un Alcohol, formando la Homoserina.
O CH 3 CH OH HC NH 2 Treonina Sintasa CH CH HC 2 O P OH O 2
2 NH
COOH
COOH Ac. Homoserino Fosfrico O C CH HC
Treonina Transaminacin
COOH CH C 2 O
ADP ATP
CH 2 O H CH2 NH 2
Activacin
COOH O C 2 NH CH O O
NADPH
NADPH
H 2 NH
CH HC
P OH
COOH Ac. Oxaloactico
COOH Ac. Asprtico CH 3 Cobalamina CH SH
O 2 HC NH 2 COOH -Aspartil - P
HC 2
COOH -Semialdehido Asprtico Succinil - SCoA CoASH Fumrico
COOH
Homoserina
O CH 2 O C CH 2 CH 2
2 2 H C NH2 CH COOH
CH
CH
2 CH2
CH CH
C H2 CH NH 2
HC NH 2 COOH Cobalamina Homocisteina
2 HC NH 2 Piruvato COOH Cistationina
CH HC
COOH
2 NH
COOH Cistena O -- Succinil Homoserina
2 COOH
Metionina
+ Amonio
Fig. 7 - 12. La Homoserina es un precursor comn en la sntesis de la Treonina y la Metionina.
568
Este aminocido es clave para la formacin de Metionina y Treonina. La va hacia la Treonina (Fig. 7 - 12), consiste en la activacin con Fosfato del grupo -alcohoxi, para luego ser hidrolizado por la Treonina Sintasa. Esta peculiar enzima, elimina el Fosfato y deja un intermediario con una insaturacin entre los carbones y , donde entra el hidrgeno de una molcula de agua reduciendo el carbono a Metilo (CH3). Luego, la insaturacin se isomeriza a los carbones y entrando en este ltimo un Hidroxilo que deja al carbono como alcohoxi en el aminocido Treonina. La otra va alternativa donde se produce la sntesis de la Metionina, empieza desde Homoserina (Fig 7 - 12), la que al activarse en el carbono -alcohoxi con Succinil-SCoA forma O-Succinilhomoserina. Esta molcula en la siguiente etapa elimina c. Fumrico y se carga con el aminocido Cistena, que despus de liberar su esqueleto hidrocarbonado como Piruvato ms Amonio, deja solamente al azufre pasando a ser denominado como Homocistena. Este ltimo intermediario al aceptar un metilo en el Azufre por medio de la Metil-Cobalamina en mamferos y la N5-Metilen-Tetrahidrofolato en bacterias, sintetizar finalmente a la Metionina. El azufre es lo nico que aporta la Cistena, ya que el esqueleto hidrocarbonado de la Metionina proviene de la Homoserina. Volver inicio al
569
b) OXIDACION DE METIONINA Y TREONINA EN HUMANOS. La Metionina es activada por ATP mediante la enzima Metionina Adenosil Transferasa (1) para formar S-Adenosil-Metionina (Fig. 8 - 12), esta molcula en una segunda reaccin entrega su grupo Metilo de alta energa a otra molcula receptora (X - CH3) en una reaccin catalizada por una MetilTransferasa, para quedar como S-Adenosil-Homocistena. Este intermediario mediante hidrlisis se convierte en Homocistena. Esta molcula es un punto de ramificacin que permite volver nuevamente a Metionina, al aceptar un Metilo de la MetilCobalamina (B12) en la reaccin catalizada por la Metionina Sintasa (2), o bien puede continuar por la otra va donde entra una Serina, para unirse y formar la Cistationina, mediante la reaccin catalizada por la enzima Cistationina--Sintasa (2). La Cistationina a su vez se descompone, por la enzima Cistationina--Liasa (3) para formar Cistena, c. Cetobutrico y Amonio. El azufre pas de la Metionina a la Serina para formar la Cistena, mientras que el esqueleto hidrocarbonado de la Metionina se convirti en c. -Cetobutrico. Aunque la Cistena no es un aminocido esencial se encuentra involucrado en el metabolismo de la Metionina. La va se dirige en uno u otro sentido dependiendo de la disponibilidad de Metionina y Cistena. A continuacin el otro producto de la reaccin, el c. -Cetobutrico, sufre una descarboxilacin oxidativa final que lo lleva hasta Propionil-SCoA. Este ltimo bajo al accin de las enzimas que carboxilan y reordenan como son la Propionil-SCoA Carboxilasa (4), la L-Metil Malonil-SCoA Racemasa y la Metil Malonil-SCoA Mutasa ms B12, producen el compuesto Succinil-SCoA, que s puede entrar al Ciclo Tricarboxlico (Fig. 8 - 12).
570
1
COOH
H H C N H C N H HC N H H H C NH 2 2 2 2 H2O Adenosina C H C H CH X-CH 2 CH ATP 2 Serina 2 X-H 3 2 CH CH CH 2 CH 2 2 2 Adenina Adenina H S CH 2 S CH2 S S
COOH
COOH
2
COOH
COOH C NH 2 CH 2 CH 2 S C H2 C HN H 2 COOH Cistationina
3
H S C H2 CHNH 2 COOH CISTE INA
C H3 METIONINA
CH
O
H OH OH S - Adenosil H Hom ocisteina
Hom ocisteina
S - Adenosil H Metionina
H OH OH
2 Cobalamina
COOH CH CH C 2 2 SCoA CH 3
Cobalamina 4
NH 4+
5
HOOC
CH
3 SCoA CH CH 3 2 C O Propionil - SCoA SCoA CH CH C 3 2 O COOH
CH C 2 O
Metil - M alonil - SCoA
-Ceto butrico
O Succinil - SCoA
Fig. 8 - 12. La S-Adenosil Homocistena es un intermediario comn en el metabolismo de la Metionina y Cistena.
571
Tabla 3 - 12, se pueden observar algunos de los trastornos que acarrean las fallas en el metabolismo de los aminocidos azufrados. Tabla 3 12 Nombre 1 Hipermetioninemia Falla en la Enzima Metionina Adenosil Transferasa (Hgado) Puede ser asintomtico o puede estar asociada a otras enfermedades metablicas Cistationina--Sintasa o Metionina Sintasa o su cofactor Metil Cobalamina Tambin falla afinidad de la enzima por su cofactor - Cistationasa y se produce Cistationemia Propionil-SCoA Carboxilasa y presencia de Cetoacidosis Metil-Malonil-SCoA Mutasa con severa Cetoacidosis
Homocisteinuria Retardo mental Cistationuria Acidemia Propinica Aciduria Metil Malnica
3 4 5
En la realidad existen varias causas para la Homocisteinuria (2), donde la Homocistena se encuentra en alta concentracin en la sangre y orina. La primera o ms comn es por falla de la Cistationina--Sintasa, la Metionina de la sangre se encuentra elevada y los niveles de Cistena aparecen como bajos. La segunda es por deficiencia en la Metionina Sintasa y una tercera causa se debe a una falla en la absorcin de la Cobalamina. La Cistationuria (3), en cambio se caracteriza por una falla en la Cistationasa--Liasa en la conversin de Cistationina a Cistena y -Cetobutirato, la que parece ser asimptomtica. La Aciduria propinica (4), se caracteriza por una falla a nivel de la enzima PropionilCarboxilasa. Esta enfermedad es de carcter severo con formacin de derivados del Ac. Propinico como 3-Hidroxipropionato y 2-Metil-Citrato que aparecen en la orina. Aciduria Metil Malnica (5), se caracteriza por la aparicin de acidemia, aciduria y homocisteinuria asociada a defectos en la absorcin de la vitamina B12, que interviene en el reordenamiento del Metil-Malonil-SCoA para formar el Succinil-SCoA y entrar al Ciclo Tricarboxlico. Esta enfermedad se encuentra tambin relacionada con defectos en el paso de Homocistena a Metionina. En el caso de la Treonina existen al menos dos vas para la degradacin de este aminocido (Fig. 9 - 12). Una es mediante la ruptura en dos conpuestos como el Acetaldehido y la formacin de Glicina. El Acetaldehido se activa posteriormente formando Acetil-SCoA y la Glicina adquiere un grupo Alcohoxi transformandose en Serina, que por deshidratacin origina c. Pirvico y finalmente Acetil-SCoA. La otra va ocurre cuando la Treonina se convierte en - Cetobutrico y despus de una descarboxilacin oxidativa genera Propionil-SCoA, que a continuacin sufre una Carboxilacin, Isomerizacin y Reordenamiento con la participacin de la Metil-Cobalamina. Al igual que en los cidos grasos impares, formar el intermediario Succinil-SCoA del CTC.
572
3 C O C H3 CH OH CH NH 2 COOH H Acetaldehido C H3 C O S CoA NH CH 2 CH OH CH NH 2 C OOH C H3 C O C OOH Ac. PIRUVICO
CH
TREONINA
ACETIL- SCoA
2 C OOH
GLICINA
Treonina Deshidrasa PALP
SERINA
MetilC H3 CoASH CH 2 C O C OOH -Cetobutirato CO 2 C H3 Cobalamina CH 2 C O SCoA Propionil - SCoA
3 CH 2 CH 2 C O SCoA
CH
Succinil - SCoA
Fig 9 -12. La Treonina es precursor de otros aminocidos como Glicina y Serina, sin embargo se degrada en un intermediario del CTC como la Succinil-SCoA.
Solo una enfermedad molecular se ha detectado en estas vas y consiste en la Hipertreoninemia, caracterizada por elevados niveles de Treonina en la orina y la sangre. No se ha detectado an la enzima responsable.
Volver inicio
al
573
8) SINTESIS DE LISINA, ARGININA E HISTIDINA. a) SINTESIS DE LISINA. La sntesis de Lisina emplea como precursores al Piruvato y al Semialdehido Asprtico en bacterias y plantas para dar origen a la via del c. Diaminopimlico, mientras que en los hongos se emplea el -Cetoglutarato, como precursor de la va del c. Aminoadpico (Fig. 10 - 12).
PIRUVATO
SEMIALDEHIDO ASPARTICO
- CETOGLUTARATO
C O OH
BACTERIAS
HOOC N COOH
AC. 2,3 - Dihidropicolnoco
C O OH CH 2 CH 2
HONGOS
CH 2 CH 2 CH 2
Ac. Homoctrico
H O C C OO H CH 2
H N CH 2 C O OH
L - LISINA
HOOC N
COOH
AC. Tetrahidropicolnico
C O OH SACAROPINA C OO H CH 2 CH 2
C OOH HN CH 2 CH 23
COOH CH 2 CH 2
N - Succinil L , L , , -
Homo -Isoctrico
-SEMIALDEHIDO AMNOADIPICO
( )
H C C OO H HO CH C OO H -AMINOADIPICO
CH NH C
C O O H O Diaminopimlico C OOH COOH HN CH 2 CH 2 3 CH 2
C O OH CH 2 CH 2 H C C O OH O C C O OH O
C O OH CH 2 CH 2 CH 2 C C O OH -Cetoadpico
( )
Ac. Oxaloglutrico
CH NH 2 COOH
L , L, , Diaminopimlico
(C H 2)3
CH NH 2 COOH
L - LISINA
Fig. 10 - 11. Sntesis de la Lisina en Bacterias y Hongos.
574
La va del Ac. Diaminopimlico parte con la condensacin aldlica entre el Piruvato y el Aldehido-Asprtico para formar intermediarios cclicos como el c. Tetrahidropicolnico, este ltimo se activa con Succinil-SCoA para formar el c. N-Succinil-L, L- ,-Diaminopimlico. En la siguiente reaccin se libera el c. Succnico formando ahora el c. L,L- ,Diaminopimlico, que despus de una isomerizacin y eliminacin de CO2 produce Lisina. La otra va en hongos empieza con -Cetoglutarato y Acetil-SCoA para formar cido Homoisoctrico que por reordenamiento y descarboxilacin llegar a formar el Ac. Cetoadpico. A continuacin sufre una transaminacin y reduccin para formar el Semialdehido -Aminoadpico. Este ltimo sufre la aminacin del carbono psilon(), por el Glutamato con posterior salida del -Cetoglutarato para quedar finalmente el aminocido Lisina.
Volver al inicio
575
b) SINTESIS DE ARGININA E HISTIDINA.

La Arginina se produce en el Ciclo de la Urea en adultos y no es considerada esencial en esta etapa de la vida como lo es en lactantes. En el Ciclo de la UREA, la Arginina se descompone para formar Urea y Ornitina por la Arginasa y debido a su rpida ruptura no existe un excedente para ser empleado en la sntesis de protenas en los lactantes. De esta manera la Ornitina (Fig. 11 - 12) puede ser la precursora de la Arginina en bacterias, ya que no cuentan con la enzima Arginasa que descompone a la Arginina como ocurre en el Ciclo de la Urea (Fig. 26 - 12). La sntesis de la Ornitina puede empezar con c. Glutmico y Acetil-SCoA para formar el c. N-Acetilglutmico el que se activa con ATP en el -carboxilo para sufrir luego una reduccin y dar origen al Semialdehido N-Acetil Glutmico. Este ltimo por transaminacin y desacetilacin forma la Ornitina.
CH COOH CH CH 2 H C NH 2 2 C
3 O COOH CH CH 2 H C NH 2 CH C 3 O
O C CH CH H C O
O P O 2 2 NH CH C O
O C CH CH 3 O H C H
SCoA Acetil - SCoA
2 2 NH CH C 3 O
COOH
COOH N - Acetilglutmico COOH
COOH N - Acetil
COOH
GLUTAMICO
- Glutamil - P
C O CH POH 3 CH CH H C 2 2 2 NH 2 NH 2
Semialdehido
N - Acetilglutmico NH C 2 O Carbamil - P NH 2 CH CH CH H C NH
NH HC NH CH CH 2 CH H C 2
CH
+ NH
2 Fumrico 2
NH
CH2 C H COOH
H C NH NH CH CH CH 2 2
NH CH CH CH Asp H C 2 2 2 NH
2 2 2
CH C
3 O
NH
COOH 2 ORNITINA
COOH
NH 2
2 NH 2
COOH
H C
COOH Citrulina
COOH
N - Acetil Ornitina
ARGININA
Arginino Succinato
Fig. 11 - 12. Transformacin del aminocido Glutmico en la Arginina.
Las reacciones a continuacin de la Ornitina son tambin comunes al Ciclo de la Urea (Fig. 26 - 12). En este caso la Ornitina puede reaccionar con el compuesto de alta energa Carbamil-P para cargarse con un carbn y un grupo amino, dando origen a la Citrulina que al recibir el otro amino del c. Asprtico cuyo esqueleto hidrocarbonado sale como c fumrico, dar origen finalmente a la Arginina.
576
1 N - ( 5' - Fosforibosil ) - ATP HOP 2 3 O C H2
N - ( 5' - Fosforibosil ) - AMP OH CONH H N C OH OH OH OPOH 3 N H N CH N N RIBOSA - P 2
PRPP
O
1
NH 2
+
ATP HO OH
N N N O C H2
-
H C O
-
OH C
OPOP OPO H O O O C H 2 C
HO N H H C CH C C H C C H 2 Histidinol CH H N H C C N C H 2 NH 2 C H COOH H C N H C 2 2 H C C H NH 2 N H H C CH N H H C N H
OH CONH N H H C CH CH C N H O OPOH 3 H C H C N OH H C OH OPOH 3 OH C H C H OPOH 3 2 2 2 Gln H 2 C H C O OH C N H N CH N N 2
C H C C C H 2
NH
OH
OPOH 3 2
Histidinol - P
Imidazol Acetol - P
Imidazol Glicerol P CONH 2 N
N - ( 5' - P - D - Ribulosil ) Formimino - 5 - Amino - 1 ( 5'' - Fosforibosil) -4 Carboxamida
HISTIDINA
H N 2
Fig 12 - 12. Sntesis de Histidina.
577
Histidina en cambio (Fig.12 - 12), es sintetizada por medio de una serie de complicados pasos y por una va que forma precursores para la sntesis de las Purinas en sus etapas iniciales.
Se parte de una Ribosa activada como la 5-P-Ribosil-1-Pirofosfato, la que se une a la Adenina del ATP por la accin de la enzima Fosforibosil-Pirofosfato-ATP Fosforilasa. Despus de la eliminacin del anillo 1-fosforibosil-4-carboxamida-5-amino imidazol queda el Imidazol glicerol-P que por transaminacin, defosforilacin y oxidacin da origen al aminocido Histidina, (Figs. 12 - 12 y 13 - 12).
H N H P e rte n e c e n a l e s q u e le to H id ro c a rb o n a d o d e la R ib o s a a c t iv a d a H C C C N C C H 2 N H 2 H
C a rb o n o y N it r g e n o d e la A d e n in a
N itr g e n o d e la G lu t a m in a
COOH
Fig. 13 -12. Origen de los Carbonos y Nitrgenos de la Histidina.
Volver al inicio
578
c) OXIDACION DE LISINA.
De los seis carbonos de la Lisina (Fig. 14 - 12), dos se pierden en descarboxilaciones y los cuatro restantes terminan como Acetoacetil-SCoA.
-Cetobutirato
NH 2 NH CH 2 1 CH 2 CH 2 CH 2 2 CH NH C OOH Sacaropina 2 Ac. 1 - Piperidino 2 - Carboxlico Ac. Pipeclico 6 Ac. - Piperidina 2 - Carboxlico CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH NH C OOH C OOH CH CH 2 CH 2 C OOH N C OOH N C OOH 3 N C OOH 4
LISINA
2
H C OOH CH C CH C 3 O 2 O CH CH CH C O 3 CH CH CH C O S CoA S CoA Glutaconil - SCoA Crotonil -S -CoA - Cetoadpico - Aminoadpico 2 5 C OOH CH CH CH C 2 2 2 O C OOH CH 2 CH 2 CH 2 C O C OOH C CH 2 CH 2 CH 2 2 O
CH 2 CH 2 CH 2 CH NH C OOH Semialdehido - Aminoadpico 2
CH NH C OOH
S CoA
S CoA
C OOH
Aceto Acetil-SCoA
Glutaril - S -CoA
Fig 14 - 12. Degradacin de la Lisina
Existe el problema de que algunas de las transformaciones de esta va metablica degradativa no son muy bien entendidas an. La degradacin ocurre a travs de la Sacaropina y el -6-Piperidina-2-Carboxlico, en equilibrio con su forma abierta que se denomina Semialdehido--aminoadpico, esta molcula formar posteriormente el c. aminoadpico. Otra alternativa a la anterior consiste en pasar por el compuesto Ac.Pipeclico. El Aminoadpico se convierte por medio del -Cetoadipato en Glutaril-SCoA y luego en Glutaconil-SCoA para llegar a Crotonil-SCoA y terminar como Acetoacetil-SCoA. Algunas de las alteraciones metablicas en la va degradativa de la Lisina se pueden observar en la Tabla 4 - 12.
579
Las Hiperlisinemias (1) pueden ser persistentes por falla en la Lisina--Cetoglutarato Reductasa que cataliza la formacin de Sacaropina, mientras que los otros casos pueden ocurrir por la falla en la enzima Sacaropina Deshidrogenasa que cataliza el paso de Sacaropina a Glutamato y -Aminoadpico--Semialdehdo.
Tabla 4 12 NOMBRE 1 Hiperlisinemia 2 Hiperlisinemia 3 Acidemia Pipeclica 4 Sacaropinuria 5 Aciduria Glutrica Glutaril-SCoA Deshidrogenasa Sacaropina Deshidrogenasa Desconocida Lisina Deshidrogenasa FALLA EN LA ENZIMA Lisina--Cetoglutarato Reductasa junto a la Sacaropina Deshidrogenasa y Oxidoreductasa
La otra enzima es la Sacaropina Oxidoreductasa que cataliza el paso de Sacaropina a Cetoglutarato y Lisina. Algunas de estas enfermedades se asocian a retardo mental, mientras que otras no. Las Hiperlisinemias del tipo peridico no tienen una enzima definida como su causal y se caracterizan por episodios de coma. La Sacaropinuria (4), se caracteriza porque las enzimas pueden ser total o parcialmente defectuosas como la Sacaropina Deshidrogenasa y la Lisina-Alfa-Cetoglutarato Reductasa. Esta enfermedad presenta un severo retardo mental. Aciduria Glutrica (5), ocurre por falla en la Glutaril-SCoA Deshidrogenasa en algunos casos y en otros por falla de la Acil-SCoA Deshidrogenasa que probablemente sintetiza un componente necesario para la primera enzima.
Volver al inicio
d) OXIDACION DE ARGININA E HISTIDINA EN HUMANOS.

La Arginina por medio de la Arginasa produce Urea y Ornitina en el Hgado, la Ornitina es luego transaminada con c. -Cetoglutrico y formar el c. -Semialdehido-Glutmico. Este ltimo puede ir a la sntesis de Prolina o por oxidacin genera finalmente el c. Glutmico (Fig. 15 - 12). Los aminocidos Arginina, Ornitina y Prolina son glucognicos. La deficiencia en la enzima Arginasa provoca la Hiperargininemia (1)*, que se caracteriza por retardo mental y convulsiones (Tabla 5 - 12). La Histidina rompe su anillo para formar el Ac. N- Formiminoglutmico el que posteriormente entrega al c. Tetrahidroflico su grupo Formimino para quedar como c. glutmico. Este ltimo por transaminacin origina el intermediario del CTC, -Cetoglutrico.
580
El bloqueo del paso de Histidina a c. Urocnico provoca una Histidinemia (1), este defecto
NH 2 CH C H C OOH 2 2 N NH HISTIDINA N H2 C NH N H2 ARGININA CH 2 C H2 CH 2 H N C COOH 2 H ARGINASA N H2 C H2 1 C H2 C H ORNITINA 2 H N C COOH 2 H
1
N
H C C COOH NH H Urocanico
Urea
CH C H C OOH 2 2 NH Ac. 4 - Imidazolona 5 - Propinico C OOH PROLINA
O C H C H2 Ac. Semialdehido CH 2 Glutmico H N C COOH 2 H
HN FH 4
CH N C H C H CH C OOH 2 2 Ac. N - Formimino H Glutmico
Deshidrogenasa
NH HOOC CH C H CH C OOH 2 2Ac. GLUTAMICO
N 5 Formimino - F H 4
Fig. 15 - 12.La Histidina y la Arginina forman el c. Glutmico como uno de los productos de degradacin.
ocurre cuando la enzima Histidasa no es detectable en los pacientes. El paso de c. Urocnico a c.Imidazolonapropinico, es catalizado por la Urocanasa (2), que al fallar o no estar presente acarrea en algunos casos retardo mental.
La presencia de c. Formiminoglutmico en la orina (3), es un defecto primario provocado por el bloqueo del paso desde c. formiminoglutmico a c. glutmico debido a la ausencia o falla en la enzima Formimino Glutmico Transferasa.
Tabla 5 12
581
1* 1 2 3
NOMBRE Hiperargininemia Histidinemia Aciduria urocnica Aciduria forminoglutmica
FALLA EN LA ENZIMA Arginasa Histidasa Urocanasa y produce en algunos casos retardo mental Formino Glutmico Transferasa
Volver inicio
al
9) METABOLISMO DE LOS AMINOACIDOS NO ESENCIALES
Los aminocidos no esenciales se dividen en:
Hidrofbicos
Polares sin carga
Polares de negativa
Glutmico Asprtico
carga Polares de carga positiva

No existentes
Alanina Prolina
Glicina Serina Cistena Tirosina Glutamina Asparegina
a) METABOLISMO DE LA ALANINA, PROLINA, GLUTAMICO Y GLUTAMINA.

La Alanina se puede sintetizar a partir de Piruvato mediante una reaccin de Transaminacin. En esta reaccin se emplea la vitamina B6 o Piridoxina (Fig 16 - 12), que forma el cofactor Piridoxal-P y se abrevia como PALP. El c. Glutmico es el donador del grupo amonio y se transforma en el Cetocido -Cetoglutrico.
582
CH 3 H C NH 2
COOH CH
GPT
COOH PALP CH 3 C O CH
CH C O K eq ( = ) 1 COOH
COOH
CH H C NH 2
COOH
COOH
Alanina
Ac. -- Cetoglutrico Cetoglutrico
Ac . Pirvico
Ac. Glutmico
GOT
COOH CH CH H C NH 2 COOH PALP COOH CH O K eq ( = ) 1 COOH COOH H C NH COOH CH
CH C
+
2
CH C O
COOH
COOH
Ac. Glutmico
Ac. Oxaloactico
Ac. Asprtico
Ac. - Cetoglutrico Ac.
COOH CH CH 2 C NH 2 COOH COOH
GPPT
PALP CH 2 O
COOH CH
CH C O K eq ( = ) 1
CH H C NH 2
COOH
COOH
Fenilalanina
Ac. - Cetoglutrico
Ac.
Ac. Fenil Pirvico
Ac. Glutmico
Fig. 16 - 12. Diferentes reacciones de Transaminacin con PALP, que pueden ocurrir en uno u otro sentido segn la proporcin de productos y sustratos.
Varios otros aminocidos pueden sufrir la misma reaccin de Transaminacin (Fig. 16 -12) y entre ellos se encuentran Valina, Isoleucina, Fenilalanina, Triptfano, Glutmico, Asprtico, Cistena, Asparegina y Tirosina. El metabolismo degradativo de la Alanina es bastante simple y ocurre por medio de una reaccin de transaminacin donde forma c. Pirvico. Este ltimo puede entrar al Ciclo Tricarboxlico como Acetil-SCoA y oxidarse totalmente despus de pasar por el complejo de la Piruvato Deshidrogenasa donde sufre una descarboxilacin oxidativa parcial. Existen algunos casos de Hiperalaninemias provocadas por fallas en el complejo multienzimtico de la Piruvato Deshidrogenasa que forma Acetil-SCoA a partir de Piruvato. A consecuencias de este error se acumula Piruvato que proviene de la transaminacin de la Alanina en una reaccin que puede ir en ambos sentidos segn la concentracin de sustratos y productos. Las deficiencias enzimticas del complejo ocurren a nivel de las enzimas Piruvato Descarboxilasa o Dihidrolipoil Deshidrogenasa. Otra causa por la que ocurre Hiperalaninemia, se produce cuando falla la enzima que sintetiza c. Oxaloactico a partir de Piruvato y que se denomina Piruvato Carboxilasa. Esta reaccin es considerada como anaplertica, es decir enriquece el CTC con el intermediario
583
c. Oxaloactico (Fig. 17-12). Por lo visto anteriormente cualquiera acumulacin de Piruvato puede ser causal de Hiperalaninemia.
Alanina
Alfa - CetoglutCetoglut rico
Transaminasa
A TP + CO O
Glutmico
CH C COO 3
COO 2 ADP CH 2 O
C COO
Piruvato
Ac. Oxaloactico
Fig. 17 - 12. Reaccin de la Piruvato Carboxilasa.
La Prolina se sintetiza a partir del c Glutmico, mediante la inversin de la va degradativa

COOH CH CH 2 O C CH CH 2 H C H 2 2 NH 2 N COOH H N COOH
2 H C NH COOH
COOH
Ac. Glutmico
Semialdehido - Glutmico
Ac.
Pirolino 5 Carboxlico
Prolina
Fig. 18 - 12. El Glutmico y la Prolina se interconvierten entre s.
de la misma Prolina (Fig. 18 - 12). En la primera reaccin se forma el Semialdehido Glutmico, el que se cicla con su grupo -Amino para formar el -1-Pirrolino-5-Carboxilato. Este ltimo por reduccin forma la Prolina. Durante el metabolismo degradativo de la Prolina pueden ocurrir algunas enfermedades metablicas como se puede observar en la Figura 19 - 12.
584
NH 2 2 C H2 C H2 C NH H CH
2 COOH
H COOH C H2 C H2 H C NH 2 COOH
ORNITINA
O
2
N COOH
CH 2 CH2 H C NH 2 COOH 1
H N
COOH
PROLINA
Pirrolino 5 Carbox[ilico
A c.
AC. GLUTAMICO
- Semialdehido
Glutmico
COLAGENO
COOH CH OH CH2 H C NH 2 COOH A c.
3*
H N
4
COOH
H N
COOH
Ac. 4 - OH - Glutmico
HO HO 1 Pirrolino - 3 - OH - 5 -Carboxlico 4 - OH - Prolina
Fig. 19 - 12. La Prolina y la Ornitina provienen del Glutmico.
Es interesante hacer notar que la Prolina, Ornitina, Glutamato y Glutamina se pueden interconvertir metablicamente. La Ornitina por Transaminacin puede formar el compuesto cclico -1-Pirrolino-5-Carboxilato, el que a su vez se puede oxidar a Glutmico o tambin puede ser reducido a Prolina (Fig. 19 - 12). El aminocido Glutmico puede ser sintetizado a partir del Cetocido -Cetoglutarato, intermediario del CTC mediante una reduccin con NADPH + H y NH4+, para formar el aminocido, en una reaccin catalizada por la enzima regulatoria GLUTAMICO DESHIDROGENASA. Dicha enzima oxida con NAD y reduce con NADPH. La presencia de AMP modula a la enzima para que forme -Cetoglutrico mientras que la presencia de ATP modula hacia la formacin del c. Glutmico. La Glutamina se formar a su vez por aminacin del aminocido Glutmico con gasto de ATP. Los aminocidos como Alanina, Glutmico y Glutamina estn encargados de colectar el amonio desde los msculos y transportarlo al Hgado. Entre las enfermedades asociadas al metabolismo de la Prolina encontramos a las Hiperprolinemias en la Tabla 6 - 12, las que se manifiestan por hiperprolinurias del tipo I (1) y II (2), denominadas as por la variedad de sntomas existentes sin embargo, las principales fallas detectadas son a nivel de las enzimas Prolina Oxidasa (1) en el Tipo I y la -1-Pirrolina-5-Carboxilato Deshidrogenasa (3), ms la -1-Pirrolina-3-Hidroxi-5-
585
Carboxilato Deshidrogenasa en el Tipo II (3)*. Hiperornitinemia (2), se produce por falla de la enzima Ornitina--Cetocido Transaminasa, caracterizada por elevados niveles de Ornitina y bajos niveles de Lisina en la orina. Por otro lado las Hidroxiprolinemias (4 ), caracterizadas por la acumulacin de 4OH-Prolina obtenida del colgeno, se produce cuando falla la Hidroxiprolina Oxidasa (4), que se manifiesta con o sin retardo mental, (Tabla 6 -12).
Tabla 6 12 NOMBRE 1 2 3 3* Hiperprolinemia Tipo I Elevada Prolina en Orina y Sangre Hiperornitinemia . Se produce Degeneracin Coroidoretinal Hiperornitinemia Hiperprolinemia Tipo II FALLA LA ENZIMA Prolina Oxidasa Ornitina--Cetocido Transaminasa
Hidroxiprolinemia
1-Pirrolina-5-Carboxilato Deshidrogenasa solamente 1-Pirrolina -5- Carboxilato Deshidrogenasa y la -1-Pirrolina-3Hidroxi-5-Carboxilico Deshidrogenasa Hidroxiprolina Oxidasa
La acumulacin del c. -1-Pirrolino-3-OH-5-Carboxlico puede ocurrir tambin por una falla del metabolismo de la OH-Prolina del colgeno, a nivel de la -1Pirrolino-3-OH-5-Carboxilato Deshidrogenasa (3)* y parece ser asintomtica.
Volver inicio
al
b) METABOLISMO DE LA GLICINA Y SERINA. Glicina y Serina tienen un metabolismo en conjunto ya que ambos aminocidos derivan originalmente de un intermediario de la Gliclisis, que es el c. 3-P- Glicrico (Fig. 20 - 12). Este precursor es sucesivamente oxidado y transaminado para formar la 3 P-Serina que finalmente por hidrlisis del Fosfato formar la Serina. La Glicina se sintetiza desde la Serina por solo un paso en que se carga el c. Tetrahidroflico con la Serina para dar N5, N10 - Metilen Tetrahidroflico, dejando a la Glicina como producto. La Serina misma se puede descomponer a Pirvico por accin de una Serina Deshidratasa liberando Amonio. La Glicina por otro lado, se descompone en la mitocondria del Hgado, al cargar al c. FH4 como N5, N10-Metilen-FH4 y el resto se descompone en CO2 y Amonio. Esta reaccin puede funcionar en ambos sentidos y tambin puede ser empleada para sintetizar Glicina. La enzima que carga el grupo Metilen y descompone a la Glicina (Glicina Sintasa) es suceptible de fallar en algunos casos provocando una Hiperglicinemia, Hiperglicinuria y retardo mental, ya que la Glicina es tambin un neurotransmisor a nivel del Sistema Nervioso Central. La Glicina se emplea en la sntesis de nucletidos de Purina, grupos Heme, Glutatin, Serina y Creatina. N5,N10- Mutilen- FH4 producido en el paso de Ser a
586
Gly y en la degradacin de la Gly a CO2 y Amonio es necesario para la metilacin de dUMP a dTMP en la sntesis de los nucletidos. Su falta produce anemia megaloblstica.
GLICOLISIS
TIMIDILATO SINTASA
dUMP
dTMP
OH O P OH O CH 2 C OH COOH O
OH P OH O CH 2 C O COOH O
OH P OH O CH 2 H C NH H O
FH 4
10 5 N Metilen F H N 4 H H C NH Serina OH-Metil Transferasa COOH 2
2 COOH
2 H C N H2 COOH
CH
c. 3 - P Glicrico c. 3-P-OH- Pirvico 3-P-Serina
SERINA
FH 4 + NAD
GLICINA
CTC
CH 3 C O COOH
+ + NH 4
Serina Deshidratasa
Glicina Sintasa
c. Pirvico
5 10 N N Metilen F H 4 + NADH + H
CO 2 + + NH 4
Fig 20 - 12. La Glicina y Serina provienen de intermediarios de la Gliclisis.
Volver al inicio
c) METABOLISMO DE LA TIROSINA.
587
La Tirosina no es un aminocido esencial, pero proviene de uno de ellos como lo es Fenilalanina. Esta reaccin es catalizada por la enzima Fenil-Alanina Hidroxilasa. La degradacin de la Fenilalanina se examin anteriormente en este captulo. Volver al inicio
d) METABOLISMO DE LA CISTEINA.
La Cistena proviene de otro aminocido esencial como la Metionina al igual que la Tirosina proviene de la Fenilalanina, sin embargo tambin se requiere de la presencia de la Serina en su sntesis la que pondr el esqueleto hidrocarbonado y el amonio, mientras que la Metionina aportar solo el azufre, (Fig. 8 - 12).
Transam inasa Cetocido A m inocido ercapto Piruvato - M R
Trans-sulfurasa SH R S SH Tioderivado
CISTEINA
NH
H S CH C 2 Cistena O xidasa
COOH O Transam inasa A m inocido CH C O
2 S CH CH COOH 2 S CH CH COOH 2 NH 2
H S CH CH COOH 2 NH 2
H O S CH CH COOH 2 2 NH Cetocido 2 A c. Cistena- Sulfnico
COOH + SO 2
CISTEINA CISTINA
A c . Pirvico
Fig. 21 - 12. Ambas vas degradan la Cistina y Cistena.
En la figura 21 - 12, se puede apreciar la existencia de dos vas para degradar a la Cistina y Cistena. La primera hace uso de una Transaminasa y una Trans-Sulfurasa para llegar a Piruvato, mientras que la segunda produce el intermediario Cisteino-Sulfnico que por medio de una transminacin entrega Pirvico y SO2. Volver al inicio
10) MANEJO DEL AMONIO.
El Amonio es una molcula capaz de producir neurotoxicidad y alcalosis en el organismo ya que se encuentra en dos formas. Parcialmente disuelto en el agua como un gas (NH3), donde es capaz de atravesar facilmente membranas como la Barrera Hemato Enceflica por su estructura hidrofbica y como un compuesto inico soluble en agua
588
(NH4+) que altera el pH de la sangre. La concentracin normal de Amonio en el suero debe ser mantenida entre 20 y 40 mM, ya que sobre los 400mM es txica. Por lo tanto, para disminuir su efecto, el Amonio debe circular como aminocido (Alanina, Glutmico y Glutamina). El Amonio es aportado a la circulacin por la accin de la Glutmico Deshidrogenasa, ms la accin de distintas Glutaminasas de origen intestinal y renal. La deaminacin de las Purinas y Pirimidinas (degradacin de cidos nucleicos), junto a la reaccin por la cual se degrada la Glicina con NAD y THF4 (Ac. Tetrahidro Flico), son otra fuente de Amonio. Otras reacciones que contribuyen con Amonio son las catalizadas por las L y D Aminocido-Oxidasas en los Peroxisomas. La falta de los peroxisomas o de la enzima L- aminocido Oxidasa en ellos, puede causar tanto una Hiperaminoacidemia como una Hiperaminoaciduria acarreando un dao neuronal. Aproximadamente el 20% del Nitrgeno se puede eliminar como Amonio por el Rin y es trado aqu por el aminocido Glutamina, mientras que cerca del 80% del Nitrgeno se elimina como Urea, la que se forma en el Hgado a partir de los aminocidos Glutmico y Asprtico, para ser posteriormente filtrada y concentrada en el Rin. As, el pH de la Orina se mantiene normalmente entre 4 y 8. En la Tabla 7 12, se aprecian algunos valores para los distintos catabolitos que extraen el Nitrgeno del organismo como lo son Urea, Amonio, Creatinina y Ac. Urico. TABLA 7 - 12
Catabolitos en la Orina
grs / 24hrs
% Total
UREA
30,0
86,0
NH4+
0,7
2,8
Creatinina Ac. Urico
1,0 - 1,8
4-5
0,5 - 1,0
2-3
La toxicidad del Amonio se debe a que puede reaccionar con un compuesto del Ciclo Tricarboxlico disminuyendo el nivel de los intermediarios y por consecuencia la produccin de ATP. El intermediario es el Cetocido -Cetoglutrico que puede formar por Aminacin Reductiva (Fig. 23 - 12) el aminocido Glutmico o el in Glutamato. Esta reaccin emplea NADPH y es catalizada por la enzima Glutamato Deshidrogenasa de Keq cercana a 1, por lo tanto depende de la concentracin de los reactivos y productos para ir en uno u otro sentido:
Glutamato Deshidrogenasa
589
-Cetoglutrico + NADH + H + NH4 (NADPH)
Aminacin reductiva Deaminacin Oxidativa
Glutmico + NAD (NADP)
Por lo tanto el Ciclo Triacarboxlico del Cerebro, ante el exceso de Amonio sufre la merma de uno de sus intermediarios y no puede regenerar el ac Oxaloactico al completar una vuelta, ya que el cetocido -Cetoglutrico previo al Oxaloactico, se escapa de las sucesivas reacciones oxidativas al interactuar con el Amonio y producir el aminocido Glutmico. A este problema se agrega la perdida de otros intermediarios que tambin se dirigen a la generacin de neurotransmisores, como lo son el Cetocido Oxaloacetato y el mismo - Cetoglutarato, ambos son conocidos precursores de neurotransmisores, como el aminocido Asprtico y el par Glutmico/Glutamina. Este efecto adverso trae como consecuencia una disminucin de la formacin de NADH y FADH2 en el Ciclo Tricarboxlico, con la consiguiente merma de ATP en la mitocondria y posteriormente se afecta la comunicacin inter-neuronal, por lo que el paciente entra en estado de coma. Otra de las formas por la que se produce dao al tejido nervioso, consiste en la disminucin de los niveles del Neurotransmisor -Aminobutrico (GABA), que acta como inhibidor de la actividad cerebral y cuyo precursor es el Ac. Glutmico. Ms an, al dejar el cerebro con un exceso de Glutamina debido a la aminacin del - Cetoglutarato y posteriormente del Glutmico por la reaccin con exceso de Amonio, se intercambia la Glutamina que abandona el tejido nervioso por Triptfano. Este ltimo es un precursor del neurotransmisor Serotonina cuyos niveles aumentan fuera de lo normal y es a la vez un ndice de los trastornos producidos por el coma heptico.
MUSCULO
CEREBRO
GLUCOSA PIRUVATO Piruvato Carboxilasa Oxaloacetato Acetil-SCoA Neurotransmisores
Protena Muscular
El CTC se encuentra cortado NH4+
NH4+
-Cetoglutarato Aminacin
Glutamato
Glutamina Sintasa
Glutamina
Triptfano
Fig. 22-12. El CTC se detiene ya que no puede completar el ciclo por prdida de uno de sus intermediarios.
En la Figura 22 - 12, se pueden apreciar las sucesivas reacciones donde interviene el Amonio y el Cetocido Cetoglutrico. Una forma de paliar el dao producido por la Hiperamonemia al Ciclo Tricarboxlico del SNC, consiste en suministrar un exceso de Glucosa, para as obtener por Glicolsis un
590
elevado nivel de Piruvato. Este ltimo puede ser carboxilado por la reaccin Anaplertica de la Piruvato Carboxilasa mediante CO2, y ATP para as pasar posteriormente a Oxaloacetato. De esta manera se reconstituyen los niveles (Fig. 22 - 11), disminudos de Oxaloacetato, debido al secuestro del Cetoglutrico por el Amonio libre. Otra manera de tratar este problema consiste en detoxificar el Amonio clnicamente, por medio de un tratamiento con Ac. Benzoico. Este ltimo forma Benzoil-SCoA de la siguiente manera: Ac. Benzoico + CoASH + ATP AMP +PP + Benzoil-SCoA
El Benzoil-SCoA reacciona con la Glicina, que incluye Amonio en su estructura para formar finalmente Benzoil-Glicina o c. Hiprico que se elimina finalmente en la orina.
Benzoil-SCoA + Glicina
Benzoil-Glicina
Orina
Normalmente el Amonio que llega al Hgado, proviene en parte del tubo digestivo por la degradacin bacteriana de las protenas de la dieta y desde los tejidos transportado por el aminocido Glutmico.
G lutm ico Dehidrogenasa
+ 4 NADH + H NAD C O O H D eam inacin O xidativa C H 2 C H 2 C O Aminacin C O O H R eductiva NADPH + H NADP - Cetoglutrico + N H C O O H 2 C H 2 HC N H C H N H+ 4 ATP P i ADP C C H O NH 2
C TC
C H2
2 C O O H
Glutam ina Sintasa
H C
2 N H 2 C O O H
N H
Ac. GLUTAM ICO
Enzim a alostric a
Gluta minasa
GLUTAM IN A
Carga del Am onio
Descarga de Am onio
Ac. GLUTAM ICO
-C etoglutrico
GLUTAM INA Ac. GLUTAM ICO O C C H H C B acteria N H + 4 ATP Pi ADP N H 2
C TC
Glutm ico Oxaloactico Transam inasa Ac. Oxaloactic o GOT
C O O H CH 2 C O C O O H
C O O H PALP C H2 H C N H Anim ales
2 C O O H
2 N H 2 C O O H
ASP AR TIC O
ASP AREG IN A
Fig. 23 - 12. Carga y descarga de Amonio.

Este aminocido hace acopio del Amonio desde los tejidos perifricos donde su Cetocido -Cetoglutrico (Fig. 23 - 12), se carga con Amonio proveniente de otros aminocidos, por medio de las reacciones de Transaminacin (excepto de Treonina y Lisina). Junto a estas se encuentran las aminaciones reducticvas que emplean NADPH con la Glutmico Deshidrogensa. Aqu se capta directamente el Amonio libre,
591
generando un determinado nivel de c. Glutmico y posteriormente con otra molcula de Amonio se carga hasta Glutamina, mediante la enzima Glutamina Sintasa. Entre las Transaminaciones ms comunes por las que se carga Amonio al Cetocido Cetoglutrico, se encuentran las reacciones catalizadas por las enzimas GOT, Glutmico Oxaloactico Transaminasa y GPT, Glutmico Pirvico Transaminasa: GOT Glutmico + Oxaloacetato -Cetoglutarato + Asprtico GPT Glutmico + Piruvato -Cetoglutarato + Alanina Estas reacciones pueden dirigirse en uno u otro sentido dependiendo de la concentracin de los intermediarios. Posteriormente el Glutmico y la Glutamina en el Hgado se descargan por medio de las reacciones de hidrlisis y Deaminacin Oxidativa catalizadas por las enzimas denominadas Glutaminasa y Glutamato Deshidrogenasa respectivamente (Fig. 23 12). Esta ltima ahora emplea NAD en el otro sentido y es alostricamente activada por ADP, GDP e inhibida por ATP y GTP. En este caso la reaccin sirve de manera anaplertica al Ciclo Tricarboxlico es decir, cuando la carga energtica de este se encuentra baja, se introduce el intermediario -Cetoglutrico desde el Glutmico y se libera a la vez Amonio el que entra al Ciclo de la Urea en el Hgado. El Cetocido Oxaloactico es tambin intermediario del CTC y puede cargarse con amonio por Transaminacin con Glutmico formando el c. Asprtico. Este aminocido puede recibir an otro amonio desde la Glutamina con el gasto de un ATP, para as formar la Asparegina. La enzima que cataliza esta reaccin es la Asparegina Sintasa (Fig. 23 - 12). En bacterias el aminocido Asprtico se puede cargar con amonio mediante un mecanismo de reaccin que emplea directamente Amonio y la energa de un ATP para formar la Asparegina. Como se ha visto el c. -Cetoglutrico, el c. Glutmico y la Glutamina son de crucial importancia en el metabolismo intermediario, (Figs. 22 - 12 y 23 - 12), ya que son los colectores primarios del amonio proveniente de la degradacin de los aminocidos ramificados en el msculo. Estos compuestos se dirigen bajo la forma de Glutamina al hgado para eliminar el Amonio mediante el Ciclo de la Urea. El Glutmico tambin colecta Amonio en el cerebro y lo lleva al hgado. Por otro lado puede ocurrir que el mismo aminocido Glutmico se cargue con un amonio extra en los tejidos perifricos tales como Cerebro y Msculo, pasando a ser ahora el aminocido Glutamina. Este aminocido es el resultado de la reaccin catalizada por la enzima Glutamina Sintasa, con gasto de un ATP que se degrada a AMP y PPi. A la vez parte de la Glutamina se puede emplear en la reaccin catalizada por la Asparegina Sintasa para suplir las necesidades de Asparegina en los tejidos:
Glutmico + NH4 + ATP
Glutamina Sintasa Glutamina + AMP + PPi Asparegina Sintasa Glutamato + Asparegina + AMP + PP
Aspartato + Glutamina + ATP
592
Otra parte de la Glutamina de distintos orgenes, viaja al Hgado donde se unir a otro "pool" de Glutamina sintetizado all, para dirigirse finalmente al Rin. La Glutamina es el aminocido de mayor concentracin en la sangre. La Glutamina al llegar Rin se desamina por la accin de la enzima Glutaminasa, que emplea una molcula de H2O y el Amonio producido, pasa ahora a tamponar hidrogeniones. Sin embargo, se ha visto que otro in bsico para tamponar sera el HCO3, que se forma en el hgado y se emplea en la va de entrada al Ciclo de la Urea, as que mientras ms Urea se forma menos -HCO3 habr disponible para tamponar.
MUSCULO
Aminoacidos Ramificados Val, Leu, Ile
Sangre
HIGADO
Sangre
CEREBRO
Glucosa
Alani na Alanina Alanina - CG Glutamina
- CG
CTC
- CG
Glutarato NH + 4
Glutmico Piruvato
NH + 4
NH
+ 4
Glutmico Glutamina CETOACIDOS Glutamina

NH + 4
Piruvato Glutmico
+ NH 4
- CG GLUCOSA
AOA
CTC
- CG = = - Cetoglutrico AOA = Ac. Oxaloactico
=
- CG Asprtico
Ciclo de la Urea
Glutamina
Glutamina
Fig. 24 - 12.Por Transaminacin de intermediarios del CTC y aminacin con gasto de ATP se obtienen los aminocidos Glutamina y Asparegina.
La Creatina - Fosfato como almacenadora de energa en el msculo es otra va por la cual se elimina Nitrgeno. La Creatina despus de donar su energa y Fosfato al ADP para formar ATP en la reaccin catalizada por la Creatina Kinasa, se cicla para formar la Creatinina que se filtra en el Rin. El test de Creatinina o el Clearance rate constituye el ndice de funcionamiento renal. Su formacin ocurre de la siguiente manera:
Arginina + Glicina Guanidinoacetatato Donador de carbono S-Adenosilmetionina + Guanidinoacetato Creatina-P +ADP ATP + Creatina Creatina Creatinina(Ciclada) Orina
Creatina
593
Volver inicio
al
11) TRANSPORTE DEL AMONIO POR LOS AMINOACIDOS GLUTAMICO, GLUTAMINA Y ALANINA
Los aminocidos de cadena ramificada Val, Leu e Ile transaminan de preferencia con Cetoglutrico en el msculo (Fig. 24 - 12), para formar c. Glutmico que puede transformarse en Glutamina y pasar a la sangre o entregar el Amonio al Piruvato que proviene de la Oxidacin de la Glucosa para formar Alanina y tambin pasar a la sangre. En el hgado la Glutamina se deamina hasta c. -Cetoglutrico y la Alanina transamina con el para formar Piruvato nuevamente. El cido Glutmico recin formado por transaminacin con la Alanina entrega su amonio en el interior de la mitocondria al Ciclo de la Urea por deaminacin oxidativa o bien transamina en el citoplasma con el c. Oxaloactico y forma c. Asprtico que entrega finalmente su amonio a las reacciones del Ciclo de la Urea que ocurren en el citoplasma. La Glutamina tambin puede donar su Amonio por hidrlisis en el rin donde se le emplear en la mantencin del pH.
Volver inicio
al
12) ENTRADA DE LOS AMINOACIDOS AL CICLO TRICARBOXILICO.

En la Figura 25 - 12 se recopilan las vas de entrada de los aminocidos al CTC, donde los aminocidos como Lisina, Triptfano, Fenilalanina, Tirosina y Leucina entran directamente al
594
CTC como Acetil-SCoA, mientras que Treonina, Glicina, Serina ms Cistena y Alanina pueden formar Piruvato y entrar tambin como Acetil-SCoA. Los aminocidos como Arginina, Prolina, Glutamina y c.Glutmico entran al CTC como AlfaCetoglutarato en tanto que Metionina, Isoleucina y Valina entran como el intermediario Succinil-SCoA.
FENILALANINA LISINA TRIPTOFANO LEUCINA
TREONINA
TIROSINA
GLICINA
GLUTARIL - SCoA
AC. ACETOACETICO
CISTEINA
SERINA
ALANINA
ACETOACETIL - SCoA ACETIL - SCoA ARGININA PROLINA ISOLEUCINA -SEMIALDEHIDO GLUTAMICO VALINA GLUTAMICO
PIRUVATO METIONINA -CETO - BUTIRICO
PROPIONIL - SCoA METILMALONIL - SCoA
GLUTAMINA -CETOGLUTARICO SUCCINIL -- SCoA
Fig. 25 - 12. Productos finales en que se degradan los aminocidos.
Aquellos aminocidos que forman Acetil-SCoA, (Fig. 26 - 12), pueden ser llamados CETOGENICOS o precursores de Lpidos, ya que el Citrato puede salir de la mitocondria y descomponerse nuevamente en Oxaloactico y Acetil-SCoA. Este ltimo entra a la sntesis de los cidos grasos activado en la forma de Malonil-SCoA. Todos los aminocidos que formen compuestos como -Cetoglutarato, Succinil-SCoA, Fumarato y c. Oxaloactico, sern GLUCONEOGENICOS, debido a que contribuyen con su esqueleto hidrocarbonado a la formacin del intermediario Malato que puede salir de la Mitocondria y va Oxaloacetato formar Fosfo-enol-Piruvato para entrar a la Gluconeognesis (Fig. 26 - 12). El hgado tiene una baja capacidad de oxidacin de aminocidos y su funcin primaria es la sntesis de los Hidratos de Carbono, cidos Grasos y Cuerpos Cetnicos a partir de aminocidos. En otras palabras el hgado transforma a los aminocidos en combustibles ms aceptables al resto de los tejidos desechando el amonio.
595
Alanina Cistena Glicina Serina Treonina PIRUVATO Aspartato Asparegina

CO2 + ATP Biotina
Isoleucina Leucina Triptfano
Fenilalanina Tirosina Leucina Lisina Triptfano Arginina Histidina Glutamina Prolina
ACETOACETIL - SCoA CIDOS GRASOS ACETIL - SCoA CITRATO ISOCITRATO
OXALOACETATO GLUCOSA MALATO
Glutamico
-CETOGLUTARATO
SUCCINATO SUCCINIL - SCoA Isoleucina Metionina Valina
FUMARATO Tirosina Fenilalanina
Fig. 26 - 12. Entrada de los aminocidos como intermediarios del CTC.
Volver inicio
al
596
13) CICLO DE LA UREA.

La forma como se elimina el Amonio en un organismo depende de la disponibilidad de agua que halla encontrado durante el proceso evolutivo. As tenemos que los peces del tipo Telesteo (con esqueleto), son primariamente amonotlicos mientras que los Elasmobranqueos cartilaginosos, como la manta raya y su pariente el tiburn, son ureotlicos ya que ocupan la urea con propsitos de osmoregulacin en el medio salino interno. Por otro lado los anfibios durante su etapa juvenil en el agua son primariamente Amonotelicos y cuando pasan a vivir en la tierra como la rana adulta son Ureotlicos. Los precursores de los vertebrados terrestres como el pez primitivo Celecanto y los peces pulmonados son Ureotlicos. Los reptiles del presente y los pjaros son Uricotlicos, ya que no es una ventaja selectiva el correr o volar sorpresivamente con el peso adicional de una vejiga llena de lquido, sin embargo, marsupiales y animales placentados han mantenido el Ureotelismo como la principal va de excrecin de amonio. El Ciclo de la Urea (Fig. 27 - 12), ocurre en el Hgado y una parte se lleva a cabo en la Mitocondria, mientras que la otra ocurre en el Citoplasma. Las reacciones del Ciclo consisten en una serie de reacciones destinadas a producir UREA, las que son impulsadas por el equivalente al gasto de cuatro molculas de ATP a ADP + Pi. Dos de los ATPs se hidrolizan al interior de la mitocondria, favoreciendo la unin del Amonio como producto de la deaminacin oxidativa del c Glutmico a una molcula de CO2. De esta manera se forma un compuesto de alta energa denominado Carbamil-Fosfato. El otro ATP, se hidroliza a AMP y PP (la hidrlisis posterior del PP equivale a un ATP extra) en el citoplasma produciendo la energa para la incorporacin del Amonio aportado por el c. Asprtico al Ciclo de la Urea. La estequiometra de la reaccin es la siguiente:
CO2 + NH4+ + 3 ATP + c. Aspartico + 2H2O (NH2)2CO + 2ADP + 2Pi + AMP + PPi + Fumarato UREA PPi 2 Pi
Dentro de las reacciones del Ciclo, la ms txica es aquella donde se maneja el Amonio libre en el interior de la mitocondria, lugar que se encuentra rodeado por dos membranas. Su toxicidad se debe a que el compuesto se encuentra en equilibrio como NH4+/NH3, donde NH3 es el gas disuelto. Durante una necrosis heptica este gas disuelto es capaz de difundir hidrofbicamente por las membranas, pasar al sistema circulatorio y actuar a nivel del cerebro invirtiendo la reaccin de la Glutmico Deshidrogenasa para formar c. Glutmico a expensas del Alfa-Cetoglutarato del CTC en las neuronas (Ver Captulo del CTC). Como la nica fuente de compuestos de dos y cuatro carbones para el CTC es la glucosa, se produce en el cerebro una merma de la funcin oxidativa en el Ciclo y este puede cesar de producir coenzimas reducidas y subsecuentemente de ATP en la Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilacin Oxidativa. De esta manera se provoca un dficit de ATP, que se traduce en falta de comunicacin celular entre neuronas y finalmente se establece el Coma Heptico.
597
Volver inicio 14) FALLAS EN EL CICLO DE LA UREA
al
En el Ciclo de la Urea existen 5 enzimas como se observa en la Figura 27 - 12 y desafortunadamente una enfermedad por cada enzima. Todas estas fallas metablicas se caracterizan por retardo mental e hiperamonemia. Las enzimas del Ciclo se encuentran numeradas en la Figura 27 - 12 y corresponden a: 1) Carbamil-P-Sintasa, su falla produce Hiperamonemia. 2) Ornitina Transcarbamilasa, su falla produce Hiperamonemia. 3) Arginino Succinato Sintasa, su falla produce Citrulinemia. 4) Arginino Succinasa, su falla produce Aciduria Argininosuccnica. 5) Arginasa, su falla produce Hiperarginemia. Una falla total de una enzima resulta en fallecimiento del recin nacido. La enzima ms importante del Ciclo es la Carbamil-P Sintasa, su falla se caracteriza por ataxia, convulsiones, letargo, el recin nacido no se amamanta bien y eventualmente sufre de coma y fallece. En algunos casos se producen estas enfermedades en adultos y acarrea hiperactividad, hepatomegalia y rechazo de comidas con alto contenido de protenas. En general el tratamiento consiste en reemplazar los intermediarios que faltan del Ciclo, reducir las protenas de la dieta y eliminar el exceso de Amonio. La induccin de la acidez del Colon promueve la eliminacin de Amonio en las heces. Tambin se emplean algunos compuestos como Benzoato de sodio y Fenil- Lactato de Sodio para unirse a Glicina y Glutamina respectivamente que ya que son los aminocidos que transportan amonio. Los suplementos dietarios de arginina y citrulina, tambin ayudan a la produccin de Urea por el Ciclo. El mantener a la Urea soluble requiere de agua y debido a esto los mamferos deben echar mano a sus reservas para mantener una solucin acuosa en la vejiga. En el caso de que una persona se alimente exclusivamente de protenas se producirn grandes cantidades de Amonio, por la deaminacin de los aminocidos Gluconeognicos y Cetognicos que debern abastecer con su esqueleto hidrocarbonado, la formacin de intermediarios del Ciclo Tricarboxlico en el hgado. Estos a su vez mantendrn la concentracin de Malato como precursor de Glucosa y la de Citrato como precursor de los cidos grasos. El exceso de amonio es este caso puede conducir a una hiperamonemia, la que es txica al cerebro como ya se ha visto. Adems, es posible que se produzca un cuadro de deshidratacin debido al agua metablica ocupada para mantener soluble la solucin de Urea en la vejiga. En estos casos se perfunde al paciente con glucosa y se restablece el pH de la sangre. De esta manera se provee de Oxaloactico va Piruvato al Ciclo Tricarboxlico para reponer la merma causada por la salida del Cetocido Cetoglutrico, en la forma de c. Glutmico al reaccionar con el Amonio libre. Por otro lado el c. Fumrico que sale del Ciclo de la Urea debe pasar a Malato en el citoplasma, luego entrar a la mitocondria y convertirse en c. Oxaloactico, que junto con el otro c. Oxaloactico del CTC, formarn por transaminacin con Glutmico el c. Asprtico, este puede entrar nuevamente al Ciclo de la Urea. Si el Fumarato no se recicla de esta manera se inhibe el Ciclo de la Urea.
Volver inicio
al
598
MATRIZ MITOCONDRIAL MEMB. INT. MEMB. EXT.

NH CH HN 2 2 2 2 2 NH
CITOPLASMA
O C NH 2 NH C NH CH CH 2 CH H C 2 2 2 NH N H 2 COOH HC CH
+ NH
3
C O2 ATP
UREA
1)
O HN 2 C O
2ADP O P O O
Pi
CH CH H C
FUMARICO
COOH
COOH
5)
CARBAMIL - P
2)
NH 2 O
ORNITINA
COOH
ARGININA
COOH NH NH 2 O C N H NH CH CH 2 2 2 NH ATP CH 2 2 2 NH CH C H COOH 2
Pi
C NH CH CH CH H C
4)
C 2 2 2 NH NH CH CH 2 CH HC
ARGININO SUCCINICO
2
3)
H C
COOH
COOH COOH CH H C 2 NH
CITRULINA
COOH 2
CITRULINA
PPi
AMP
COOH
ASPARTICO
Fig. 27 - 12. Ciclo de la Urea.
599
15) REGULACIN DEL CICLO DE LA UREA.

Este Ciclo parece tener dos tipos de regulaciones: a) Una rpida que depende de los niveles de N-Acetil Glutamato sobre la enzima Carbamil-P-Sintasa I (CPS I). Existe otra enzima CPS II en el citoplasma que se emplea en la sntesis de las Pirimidinas. El N-Acetil Glutamato es un modulador alostrico que a su vez depende de los niveles de Acetil-SCoA y Glutamato, junto a la enzima N-AcetilGlutamato Sintasa que cataliza su sntesis. Esta ltima responde a los distintos niveles de Arginina para su activacin alostrica. b) Una regulacin lenta que en base al aporte proteico de la dieta. Cuando la dieta es rica en protenas los genes que codifican para las enzimas del ciclo se activan y aumentan los niveles de estas unas 20 veces, lo que tambin ocurre en casos de inanicin cuando se consume protena de la masa muscular y los esqueletos hidrocarbonados de los aminocidos son destinados a Glucosa y cs. Grasos.
Volver inicio
al
600
16) CONTROL DEL AMONIO DURANTE LA INANICION

Durante un periodo de inanicin lo primero que se ocupa como sustrato es la Glucosa proveniente del Glicgeno heptico, pero antes de que esta se agote empieza el proceso de Gluconeognesis empleando como sustrato los Aminocidos que han sido liberados por degradacin muscular (fig. 28 - 11). Por otro lado se emplea tambin el Glicerol obtenido por la degradacin de las grasas durante la Liplisis y el Lactato, proveniente de la oxidacin anaerbica del msculo y los eritrocitos. La Gluconeognesis a partir de Glicerol en el Hgado es baja en un principio, pero aumenta con la liplisis de las grasas en los adipocitos. El mayor precursor de la Gluconeognesis en el Hgado es en este caso la Alanina y a medida que la inanicin se prolonga, llega la Glutamina al Rin. All se convertir en el precursor mayoritario de la Glucosa (Fig. 28 - 11). Este cambio de la Gluconeognesis desde el Hgado al Rin permite regular el balance cido - bsico.
CEREBRO
G lucosa
M sculo
Alanina Hgado
G lutamina Alanina Urea
Intestino
G lucosa
Aminocidos
C uerpos C etnicos R in
N H 4 + y C uerpos C etnicos
Fig. 28 -12. Destino de Glutamina y Alanina producidos por el msculo durante la inanicin.
601
Durante la inanicin el msculo libera aminocidos por degradacin de protenas tisulares y cerca del 50% de estos aminocidos corresponden a Glutamina y Alanina, como productos de las sucesivas reacciones metablicas internas. Alanina se dirige al Hgado y es Glucognico, mientras que su amonio va al Ciclo de la Urea. Glutamina abastece de energa al intestino que debido al proceso de la descamacin intestinal, necesita de sustrato para la multiplicacin y crecimiento celular del borde en cepillo. En el intestino la Glutamina produce indirectamente Alanina al metabolizarce. Esta ltima se dirige posteriormente al hgado para la Gluconeognesis y elimina su Amonio como Urea. A medida que la inanicin contina se producen Cuerpos Cetnicos, que se eliminan en la orina para mantener el equilibrio cido-base junto con el Amonio que proviene de la Glutamina, mientras que su esqueleto hidrocarbonado o Cetocido se usa para la Gluconeognesis en el mismo rin. El cambio del destino de la Glutamina desde el intestino al rin es para conservar el balance cido-base y neutralizar los cuerpos cetnicos con Amonio.
CONTENIDO DE METABOLITOS PRECURSORES DE LA GLUCOSA

200
Hgado gm/24hr
Glicgeno
Aminocido
Glicerol
Lactato y Piruvato 25 0 25 Lactato y Piruvato Glicerol
Rin gm/24hr
Aminocido 50 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Das de Ayuno
Fig. 29 - 12. Nivel de los precursores de la Glucosa en el Hgado y en el Rin durante los das de ayuno.
En la Figura 29 - 12, se observa un grfico del contenido de Metabolitos precursores de Glucosa tanto en el Hgado como en el Rin, expresados en gramos por 24 hrs versus los das de ayuno. En el Hgado se observa como disminuye el contenido de Glicgeno para mantener la Glicemia y al mismo tiempo, empieza paulatinamente la Gluconeognesis a partir de los Aminocidos la cual alcanza su mximo a los dos das. Posteriormente Glicerol y Lactato se convierten en la nica fuente viable de Glucosa. A medida que la inanicin progresa el problema se traslada al Rin disminuyendo la Gluconeognesis Heptica y aumentando de importancia la Gluconeognesis del Rin
602
como resultado del balance cido-base mantenido entre los Cuerpos Cetnicos y el Amonio de los aminocidos cuyo esqueleto Hidrocarbonado entra al CTC para formar Ac. Mlico precursor de Glucosa. Se empieza con Alanina y se contina con Glutamina que pasa a ser el precursor gluconeognico ms importante a la semana de inanicin.
UREA
Excrecin diaria de Nitrgeno Urinario
Otros Compuestos
Amonio Ac. Urico

Dieta normal -7 0 Creatinina
Das de Ayuno
7 14 das
Fig. 30 - 12. Aumento de la excrecin del Nitrgeno durante la inanicin
En la Figura 30 - 12, se observa en un grfico de Excrecin diaria de Nitrgeno Urinario versus los das antes y despus del ayuno. Durante la dieta normal se elimina principalmente Urea con una pequea contribucin del Amonio y c. Urico del metabolismo de las Purinas ms la Creatina proveniente del msculo. Durante el ayuno o inanicin la concentracin total del Nitrgeno excretado disminuye y aparece la necesidad de conservar nitrgeno, as que durante la primera etapa baja la cantidad de Urea secretada, pero a la semana de ayuno aumenta dentro de la cantidad total el nitrgeno proveniente de otros compuestos como Amonio debido a la Gluconeognesis del Rin sin embargo, los niveles de Ac. Urico y Creatinina permanecen constantes.
Volver inicio
al
17) APNDICE
603
Malnutricin ProteicoEnergtica (PEM) KWASHIORKOR: Enf. del nio desplazado, deficiencia en protena, pero no en Carbohidrato Se conoce como enf. del nio destetado con pobre alimentacin, no recibe protenas Apata MARASMICO:
Deficiencia en ambas Protena y Carbohidrato (casi inanicin).
Alerta, tiene hambre
Cara de Luna
Apariencia de cabeza grande Sin grasa en el cuerpo, prdida de msculo y grasa en las extremidades. La ltima grasa que se pierde es de las mejillas. Hipotona Sin edema, aspecto desecado y/o extremadamente delgado
Grasa subcutnea
Edematoso, hinchado debido a la Hipoalbuminemia
Hgado graso, corazn de mayor tamao que el normal
Sin Hgado graso
Pelo rojizo o sin pigmento Falla en el crecimiento, la respuesta inmune, reparacin y produccin de hormonas y enzimas junto a diarrea crnica y malabsorcin Datos del laboratorio: Baja conc. de Albmina Baja conc. de Glucosa Cetonuria Baja conc. AAS en el plasma Niveles diminuidos de K+ y Mg++ Bajo Colesterol
Sin cambios en el pelo
Marcada falla en el crecimiento, menos del 60% para edad y sexo
No recibe pecho de su madre. Baja inmunidad por clulas T Constipado o diarrea con mucus
604
KWASHIORKOR
Una dieta con exceso de carbohidrato y bajo contenido proteico conduce a una sntesis disminuida de protena por el hgado e intestino. La Hipoalbuminemia cusa un edema y la falta de la sntesis de las Apoprotenas que forman las VLDL o regin de las -Lipoprotenas, produce un hgado graso. La secrecin de Insulina se estimula para luego reducirse. La movilizacin de grasa y aminocidos desde el msculo se reducen de tal manera que menos aminocido como sustrato se encuentra disponible para el hgado. El hgado se adapta aumentando de nivel las AA Cintazas y la formacin de urea disminuye, conservando nitrgeno y disminuyendo la perdida en la orina. Sin embargo, la sntesis reducida de protenas se impone y bajan los niveles de Albmina junto a la presin onctica y se produce el edema.
MARSMICO
Glicgeno del hgado se agota en pocas horas y la prot. muscular se emplea va Gluconeognesis, para mantener el nivel de Glucosa en el plasma. TAG del tejido graso se rompen en cs. Grasos que proveen energa para el resto de los tejidos, excepto tej. nervioso. Si se prolonga el periodo sin alimento, ya cerca de la Inanicin los cidos grasos se oxidan casi totalmente a Cuerpos Cetnicos que pueden ser usados por el Cerebro, Corazn y Msculo como energa. Se elevan el Cortisol y la Hormona del Crecimiento y disminuyen la Insulina y secrecin de la Tiroides. Debido a que los aminocidos son transportados desde el msculo al Hgado para proveer de sustrato para la sntesis de protenas, los niveles de protenas plasmticas disminuyen menos en Marasmicos que en Kwashiorkor.
KWASHIORKOR
MARSMICO
605
Volver inicio
al
606
REFERENCIAS.
A Survey of Inborn Errors of Aminoacid Metabolism and transport in Man., D.Wellner and A. Meister Ann. Rew. Biochem. ,Vol 50, 911-968, 1981. Regulation of Lysine and Threonine Synthesis., G. Galili The Plant Cell, Vol 7, 899-906, 1995 The Shikimate Pathway: Early Steps in the Biosynthesis of Aromatic Compounds. K.M. Herrmann The Plant Cell, Vol 7, 907-919, 1995 Metabolism. Protein & Nitrogen Homeostasis http://www.zonehome.com/met/metProtNit.htm Nitrogen metabolism Index http:// web.upstate.edu/schmittm/NitMet2/Index.html Nitrogen Metabolism and the Urea Cycle http://web.indstate.edu/thcme/mwking/nitrogen-metabolism.html
607
Hctor Rocha L. Cadena de Transporte de Electrones y Fosforilacin Oxidativa
CTE 606
1) COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES 609 2) GRADIENTE ELECTROQUIMICO 614 3) COMPLEJO I O COMPLEJO NADH DESHIDROGENASA 618 4) COMPLEJO II O COMPLEJO SUCCINATO DESHIDROGENASA 621 5) COMPLEJO III O COMPLEJO CITOCROMO bc1 623 6) COMPLEJO IV O COMPLEJO CITOCROMO OXIDASA 627 7) COMPLEJO V O COMPLEJO ATP SINTASA 632 8) CONSUMO DE OXGENO POR LA MITOCONDRIA 9) ELGENOMA MITOCONDRIAL 638 10) ADAPTACION AL FRIO 638 11) DISFUNCIN MITOCONDRIAL 639 12) APOPTOSIS 640 13) ROL METABOLICO DE LOS ORGANOS 642 a) Hgado 643 b) Tejido Adiposo 644 c) Msculo esqueltico 644 d) Corazn 645 e) Cerebro 646 f) Riones 646 f) Intestino Delgado 646 636
14) DIRECCIN EN QUE SE TRASLADAN LOS PRINCIPALES METABOLITOS EN EL ESTADO ALIMENTADO Y DURANTE LA INANICIN 647 15) PRINCIPALES ENZIMAS REGULADORAS DEL METABOLISMO INTERMEDIARIO JUNTO A SUS MODULADORES 648
607
1) COMPONENTES DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES.
608
La Cadena de Transporte de Electrones (C.T.E.) se encuentra en la membrana interna de la Mitocondria y tiene por objeto reoxidar las coenzimas reducidas. Estas a su vez, provienen de la oxidacin de los sustratos en las vas degradativas y son portadoras de los protones removidos a los sustratos. Estos mismos se emplearn para generar el llamado Gradiente Quimiosmtico o Electroqumico, que ocurre entre la matriz mitocondrial y el espacio intermembrana con el fin de generar posteriormente energa qumica como ATP y energa trmica. La membrana interna de la mitocondria separa dichos espacios y se encuentra
CARDIOLIPINA
Se encuentra en una gran proporcin en la Mitocondria
O CH CH O CH 2 2 O O C O C O CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 3 3 P O O CH 2 CH O H CH 2 O O P O O CH CH CH 2 O O O C O C CH 2 CH 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 2 2 CH CH 3 2
Fig. 1 - 13.La Cardiolipina colabora en la Cadena de Transporte de Electrones interaccionando con el Citocromo C.
formada por tan solo un 30% de fosfolpidos, entre los que se encuentra la Cardiolipina (Fig. 1 - 13), considerada como integrante del sistema transportador de electrones. El otro 70% corresponde a las distintas protenas que se encuentran presentes en la membrana interna y que dan origen a los complejos proteicos multimoleculares responsables tanto de la Cadena de Transporte Electrnico (CTE) como los procesos de Fosforilacin Oxidativa (FO) y Transporte Intermembrana. La CTE misma esta formada por cuatro complejos multienzimticos (Tabla 1 - 13), que se pueden describir brevemente a continuacin: Tabla 1 13 Componentes de la Cadena de Transporte de Electrones Complejos Nmero de Subunidades 609 Grupos Prostticos P.M. kD
I II
NADH Deshidrogenasa Succinato Deshidrogenasa III Coenzima Q Citocromo C Oxido - Reductasa Citocromo C IV Citocromo Oxidasa
26 4 10 1 6 -13
FMN, Fe-S FAD, Fe-S Heme, Fe-S Heme Heme, Cu A, Cu B
850 140 250 13 160
El Complejo I o NADH Deshidrogenasa tiene por funcin oxidar las coenzimas del tipo NADH + H, que se producen en algunas de las reacciones al interior de la mitocondria. Entre estas reacciones tenemos a las distintas etapas de la -Oxidacin de los cidos Grasos, el Ciclo Tricarboxlico y la reaccin catalizada por la enzima Glutmico Deshidrogenasa (Fig. 2 - 13). Otra parte de sus funciones consiste en enviar los protones extrados a las Coenzimas, al espacio intermembrana de la mitocondria para creacin de un gradiente, mientras que los electrones son transportados a la etapa siguiente de la Cadena. El Complejo II o Succinato Deshidrogenasa, recibe los FADH2 aportados por la oxidacin de los substratos reducidos en el metabolismo intermediario. Especialmente la reaccin de Succnico a Fumrico perteneciente al CTC, que es la nica reaccin del Ciclo donde la enzima est unida fsicamente a la membrana interna de la mitocondria (Fig. 2 - 13). Entre los Complejos I , I I y I I I se encuentra la Coenzima Q. Debido a su tamao, potencial de xido-reduccin, estructura qumica (Quinona) y su cola hidrofbica es capaz de moverse llevando protones y electrones al Complejo I I I. El Complejo III o Coenzima q-Citocromo C-Oxido-Reductasa, hace acopio de los electrones del primero y los protones y electrones del segundo ms los protones que provienen de la enzima Acil-S-CoA Deshidrogenasa, durante la primera etapa de la Oxidacin de los cidos grasos, ms los protones que provienen de la lanzadera Glicerol Fosfato Deshidrogenasa. En el complejo III tambin se transportan protones al espacio intermembrana y solo los electrones se dirigen al Complejo IV. El Complejo IV o Citocromo Oxidasa, recibe electrones de forma secuencial de cada uno de los Complejos anteriores y a la vez transporta protones desde el interior al espacio intermembrana. Es capaz de formar agua metablica en su lado interno aprovechando los protones internalizados por el sistema de la ATP Sintasa o Complejo V. El Complejo V, que no aparece en la Tabla 1-11, tiene por funcin permitir la entrada hacia la matriz mitocondrial de los protones acumulados por los Complejos anteriores en el espacio intermembrana. La energa que se desprende de este proceso se ocupa en la sntesis de ATP por medio de una ATP Sintasa denominada Fo F1 ATPasa. La forma bsica como se describe la cadena de transporte de electrones es la misma desde 1963 (Fig. 2 - 13), y como es lgico de suponer en la actualidad se han identificado sus componentes de una forma mucho ms detallada.
610
En general se puede apreciar que los protones aportados por las coenzimas reducidas se emplean para generar un gradiente en el espacio intermembrana de la mitocondria, mediante los complejos I, III y IV. Debido a ello, se genera una mayor concentracin de protones en este espacio comparado al de la matriz mitocondrial (Fig. 3 - 13). Este gradiente cuando trata de igualar concentracin y carga, genera la energa para la sntesis de ATP.
Representacion de la Cadena Respiratoria en 1963.

Glutamato - Hidroxiacil - CoA - Hidroxibutirato Isocitrato Malato Prolina Piruvato Lipoato Fp NAD Acil - CoA
Flavoprotena
Succinato (Fe) FAD 1 (Fe) FMN
FPTE
Transferidora de Electrones
[b, Q]
c1
(Cu) a, a3
- Cetoglutarato
FAD2 - Glicerofosfato
FAD3
Colina
Se puede observar la entrada de elementos reductores transferidos por las Deshidrogenasas, junto a los grupos prostticos (Fe) y (Cu)
Fig. 2 - 13. Las Coenzimas reducidas provenientes de diferentes reacciones de oxidacin entregan sus protones a la C.T.E. oxidndose. FPTE, es por Flavo protena Transportadora de Electrones.
En la Figura 3 - 13, se puede observa la forma actualizada de la Cadena de Transporte de Electrones y del Sistema a cargo de la Fosforilacin Oxidativa. Los componentes de la Cadena de Transporte de Electrones se desarrollaron despus que apareci la vida en la Tierra, ya que hubo de esperar la aparicin y evolucin de los primeros organismos fotosintticos que emplearon H2S y el in Fe +2 , ya que el O2 no se encontraba libre. Es muy probables que los sistemas con cadena de transporte reductora en las plantas (CO2 + H2O -------- Glucosa) y oxidativa en los animales (Glucosa + O2 ---------- CO2 + H2O) evolucionaran a la par complementndose el uno con el otro. Para obtener energa es posible juntar dos elementos opuestos de la Tabla Peridica, uno de ellos debe tender a donar electrones (Electronegativo) como lo hace el Oxgeno y el otro debe captar electrones como lo hace el Hidrgeno (Electropositivo). Ambos producen H2O y energa, sin embargo en los sistemas biolgicos debemos reemplazar uno de ellos por algo similar, como lo son aquellas Coenzimas reducidas NADH, FADH2 y NADPH. Estas han extrado los protones de los sustratos como Hidratos de Carbono, Aminocidos y Lpidos mediante su oxidacin.
611
Secuencia de Reacciones
H +
II
Succi nato
Succinato Deshidrogensa FAD Fe S QH
afuera
Fp2
H +
QH e
b 562
III CoQ-Cit C
Oxidoreductasa Q e
Fe S c1
IV
Citocromo Oxidasa
Cu A
QH
a
3 Cu B
b 566
NADH Deshidrogensa N A D H F M N Fe S
e QH QH H + H +
O 2
Fp1
adentro
H H +
cs. Grasos
Glicerol-P
Fig 3 - 13. Transporte de electrones entre los complejos de la Cadena. En el Complejo III se puede observar el Ciclo Q. Solo los Complejos I, III y IV pasarn protones al espacio intermembrana.
Las Coenzimas debern a su vez, entregar los protones al Oxgeno por medio de una serie de reacciones compatibles con las estructuras biolgicas, es decir de manera escalonada ( Ver Tabla de Potenciales Redox 2 - 11), liberando la energa paulatinamente y no en una sola reaccin como ocurre durante una combustin. En esta ltima se produce demasiada energa en corto tiempo en un lugar puntual, lo que es incompatible con la vida. Aqu se requiere de un flujo de electrones entre dos extremos que se lleva a cabo mediante sucesivos escalones. La cantidad de energa liberada ser la misma que en una combustin, pero en un sistema biolgico la energa se acoplar a la sntesis de otras molculas o bien la generacin de gradientes de concentracin o por ltimo podr ser se liberada como calor radiante. En base a lo anterior los componentes de la Cadena de Transporte de Electrones se pueden agrupar midiendo la tendencia que tienen para donar electrones en un sistema lo cual estar dado por su Potencial Redox, que depende de la siguiente ecuacin: G = - n F E = - n F ( E aceptor de electrones E donador de electrones) n: N de electrones en la transferencia F: Constante de Faraday = 26.032 cal/mol x volt E: Potencial Redox a pH 7 y 25C Tomando en cuenta el primero y ltimo par Redox de la CTE (Tabla 2 11), podemos calcular la cantidad total de energa liberada por esta: NAD + 2H + 2e O2 +2H + 2e NADH + H H2O - 0,32 volt + 0,82 volt
Tabla 2 11 POTENCIALES REDOX DE LA CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES. 612
Oxidante O2 2H+ NAD+ NADP+ FMN (unido a enzima) FAD CoQ Citocromo b (+3) Citocromo c1(+3) Citocromo c (+3) Citocromo a (+3) O2 + H2O Citocromo a3 (+3) O2 + 2H+
Reductor O2 (Superxido) H2 NADH + H+ NADPH + H+ FMNH2 (unido a enzima) FADH2 CoQH2 Citocromo b (+2) Citocromo c1(+2) Citocromo c (+2) Citocromo a (+2) H2O2 ( Perxido de Hidrgeno) Citocromo a3 (+2) H2O
N de E electrones (volt) 1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 2 1 2 0,60 0,42 0,32 0,32 0,30
- 0,22 + 0,04 + 0,07 + 0,23 + 0,25 + 0,29 + 0,30 + 0,55 + 0,82
La primera reaccin es ms electronegativa (- 0,32 volt) que la segunda, luego tender a donar electrones y protones por lo tanto se deber invertir, mientras que la segunda reaccin es electropositiva, acepta electrones y se encuentra en la disposicin adecuada: NADH + H NAD + 2H + 2e + 0,32 volt O2 + 2H + 2e H2O + 0,82 volt ----------------------------------------------------------------------------------NADH + H + O2 + 2H NAD + H2O + 1,12 volt La energa total liberada por la Cadena de Transporte de Electrones ser: G = - n F E = 2 x 26032 x (+ 0,82 ( - 0,32) ) = 58.311,7 Cal/mol Sin embargo, la produccin de energa alcanza a solo 3 ATPs, lo que indica que existe una fraccin de energa que se disipa como calor y no se almacena en una molcula qumica. Volver al inicio
613
Citosol
Esp. Inter Memb.
+ H
+ H H+
III
Glicerol - 3 - P
P D H - Cetona
Glicerol - 3 - P Deshidrogenasa
FAD
+ H
QH
H+
Cit C 1
+ + H
+ H H +
IV
Cyt C
+ +
QH2 Cit b 561

Fe - S FMN Fe - S FAD
Q Q H
QH2 2
Fe - S FAD FAD
Cit b 562
Cit a Cu a 4e
Cit a 3 Cu a
3
H H
QH
H
NADH
NAD
I
Matriz Mitocondrial
Succinato
Fumarato FPTE
O+ 4H +
2
2 HO 2
+ H + H
II
FAD
+ H + H + H
H
O C SCoA Acil - CoA Deshidrogenasa
O C SCoA
F1
+ H
Fo
A T P asa
Fig. 4 - 13.Visin general de los distintos complejos que dan origen a la C.T.E. y al flujo de electrones y protones que originan la Fosforilacin Oxidativa.
606
2) GRADIENTE ELECTROQUIMICO.
El gradiente electroqumico que se forma a ambos lados de la membrana mitocondrial interna en la figura general 4 - 13, es uno de concentracin y carga. Este puede ser descrito por la ecuacin (1 - 13):
G = 2.3 R T lg C2/C1 + z F (V2 - V1) (A) (B)
(1-13)
La parte (A) de la ecuacin describe la energa que depende solo del gradiente de concentracin:
Espacio intermembrana C2 o pH2 H+ H+ H+ H+ H+ H+ C1 o pH1 H+ H+ Membrana Mitocondrial interna

La energa debido a la concentracin de protones a ambos lados de la membrana esta dada por:
A = 2.3 R T lg C2/C1
que tambin se puede expresar como:
A = - 2.3 R T(pH2 - pH1)

La otra parte (B) de la ecuacin 1 - 13, describe la energa que se produce a consecuencias del gradiente de potencial o voltaje a ambos lados de la membrana interna debido a la carga de los protones:
Espacio Intermembrana ++++++++++++
V2
Membrana mitocondrial interna --------------V1

Este ltimo efecto se debe a que la bicapa es aislante y acta como un condensador acumulando carga en su superficie, cuya energa esta dada por la siguiente ecuacin:
B = z F (V2 -V1)
donde z = + 1 o carga del protn F = Constante de Faraday o 23062 cal/mol volt La parte (A) de la ecuacin mide el cambio de energa libre cuando la concentracin C pasa de C1 a C2 ( C2 > C1 ) y se establece el gradiente de concentracin de protones. La parte (B) mide el cambio de energa libre al pasar de V1 = 0 cuando el soluto no tiene carga, a V2 = V2 o cuando el soluto s tiene carga, como sucede con los protones que son capaces de generar
un potencial de membrana. Esto se debe a que la carga + es mayor hacia el espacio intermembrana que al interior o matriz mitocondrial donde es menor. Cuando el sistema tiende al equilibrio (G = 0), tenemos que la energa libre total del sistema tiende a 0 y si consideramos que - log H+ = pH, la diferencia de potencial entre ambos lados de la membrana estar dada por la Ecuacin de Nernst (Ec. 2 - 13), adaptada a la Teora Quimiosmtica:
G = A - B G = 0 A = B y se tiene que: 2.3 R T (pH2 - pH1) -------------------(2 - 13) zF V= - 60 (pH2 - pH1)
V=
Como la diferencia de pH es de 1.4, siendo en el espacio intermembrana el pH ms bajo o cido que en la matriz mitocondrial. La parte (A) de la ecuacin (1 - 11), empuja a los protones a la matriz mitocondrial mientras que el otro gradiente (B), que es de potencial favorece la mantencin del gradiente de pH, es decir empuja a los protones hacia el espacio intermembrana. Por lo tanto ambos se oponen y cuando alcanzan el equilibrio el potencial de membrana o la diferencia de potencial entre ambos lados ser de 60mV calculados por la ecuacin 2 - 13. Nunca la concentracin alcanzar valores iguales a ambos lados, pues al gradiente de concentracin se opone al de voltaje y hay que considerar que no son equilibrios estticos, sino que dinmicos, ya que los protones son aportados al espacio intermembrana y a su vez son capaces de fluir hacia el interior por medio del Complejo V o FoF1ATPasa (ATP Sintasa). En resumen se trata de un gradiente del tipo Estado Estable que fluye por medio de su acoplamiento a la energa de las reacciones exergnicas de oxidacin que ocurren en cada etapa de la Cadena de Transporte de Electrones. La fuerza protn-motora F del gradiente electroqumico est expresada en mV y consiste en la contribucin del potencial de membrana conocido como Vm, que es de 140 mV menos la contribucin del gradiente de protones que es de 60mv multiplicados por la diferencia de pH (pH2-pH1) lo que corresponde a: F = Vm - 60(pH2 - pH1) F = 140 - 60 ( -1.4) Como el pH intermembrana es 1.4 veces ms bajo que el de adentro, el total equivale a una fuerza protn motora de 224mV o 5.2 Kcal/mol de protones. La unidad de pH entonces produce una diferencia de potencial de 60 mV. Posteriormente estos protones, al tratar de equilibrarse en el sistema entran a la matriz mitocondrial movidos por la fuerza protn-motora pasando a travs de los canales inicos formados por el Complejo V o FoF1ATPasa. Las innumerables copias de esta Complejo V se encuentran ubicadas en las Crestas mitocondriales. Una vez en la matriz mitocondrial los protones ya no intervienen en la
606
ecuacin de equilibrio por intervenir en la formacin de agua mediante la accin del Complejo IV(Citocromo Oxidasa). Por lo tanto los protones entran a la matriz mitocondrial a travs de las ATP Sintasa (FoF1ATPasa) a causa de la fuerza protn-motora tratando de igualar el potencial quimiosmtico. La energa de este gradiente es atrapada en la sntesis de ATP mediante el proceso denominado Fosforilacin Oxidativa (P.O.). Las reacciones que producen energa mueven los protones hacia fuera (espacio intermembrana) y las reacciones que consumen energa (Complejo V) se acoplan a los protones que entran nuevamente, para as sintetizar ATP (Fig. 5 - 13).
Espacio Intermembrana
2 H+ 2H + c 2 H+
Bicapa I Q III IV
Fo
Matriz Mitocondrial
Cadena de Transporte de Electrones Complejo II no envia protones a travez de la membrana.
II
ADP + P
F1
A T P Sintasa
Fosforilacin Oxidativa
2 H+ ATP + H2 O
Fig. 5 - 13. Flujo de protones en los distintos complejos de la CTE. Solo los complejos I, III y IV transportan protones desde las coenzimas de la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.
Los protones que han alcanzado el interior se unen al Oxgeno para formar agua en una reaccin catalizada por el Complejo IV. De esta manera se mantiene siempre el gradiente a pesar del flujo de los protones al interior.
La transferencia de energa en el metabolismo intermediario comienza desde el substrato a las coenzimas reducidas, luego de las coenzimas reducidas al gradiente quimiosmtico y posteriormente desde este a las molculas de ATP. Esta energa ser posteriormente empleada en el anabolismo o cualquiera otra funcin que lo demande.
La matriz mitocondrial a su vez, posee toda la maquinaria para producir coenzimas reducidas, ya que aqu ocurren los principales procesos oxidativos como la -Oxidacin de los cidos grasos, el Ciclo Tricarboxlico y la oxidacin de algunos aminocidos.
607
La membrana externa de la mitocondria posee grandes poros y tolera el paso de polipptidos de 5kD. Su composicin enzimtica es similar a la del Retculo Endoplsmico lo que determinara un posible origen comn. Todas las reacciones de la C.T.E. son exergnicas aunque algunas ms que otras, (Fig. 6 13).
Perfil Energtico de la C.T.E.
, E o - 0,4
- 0,2 - 0,0 + 0,2 + 0,4 + 0,6 + 0,8
Energa
NADH + H
FADH 2 2e ATP Co E Q Cit b 2e Cit c ATP 1 Cit c Cit a 2e ATP O 2
0 10 20 30 40 50
Kcal
c son las tres reacciones ms exergnicas capaces de producir un flujo de protones y electro -
nes equivalentes a tres ATP s.
Fig 6 - 13. Perfil de energa en la C.T.E., donde todas las reacciones son exergnicas.
En general existen tres lugares donde se produce el flujo de protones desde la membrana interna hacia el espacio intermembrana y que se denominan en la Figura 6 - 13 por las letras a, b y c, que corresponden a los Complejos I, III y IV. Estos lugares se han determinado por el estudio de los niveles de P/O (Cuociente Fsforo/Oxgeno) bajo la accin de distintos inhibidores. Se estudia el consumo de Oxgeno con inhibidores que actan a distintos niveles de la cadena. Aunque siempre se ha postulado la transferencia lineal de elementos reductores desde la regin ms electronegativa a la ms electropositiva de la cadena, se observa que algunos componentes parecen desplazarse en ambas direcciones, lo que se comprueba en el caso de la Coenzima Q o Ubiquinona. Esta ltima forma un grupo de molculas mviles que convergen equivalentes reductores desde varias Deshidrogenasas de la Cadena (Complejos I y II) hacia el sistema de los Citocromos (Fig. 7 - 13). El mismo Citocromo C parece migrar en uno y otro sentido al estar unido por las cargas de la Cardiolipina al lado externo de la membrana interna, lo que le permite navegar o moverse en la superficie externa de la bicapa en ambas direcciones para traer electrones al Complejo IV.
608
Ms an, la composicin de los Complejos no es totalmente discreta y se sospecha que tienden a superponerse algunas de sus funciones.
UBIQUINONA O COENZIMA Q . Molcula hidrofbica transportadora de protones y electrones
La cola isoprnica le permite navegar por los fosfolpidos

CH 3 O CH 3 O e CH 3 O CH 3 O + H + e CH 3 O CH 3 O
O
CH2
O
CH 3 CH 2 10 Ubiquinona 3
O
CH2 CH C CH H 2 10 Semiquinona CH CH
HO
OH
CH 2 CH C CH H
COLA ISO PRENICA
CH C CH H
3 3
CH 3 CH 3
2 10
Quinona reducida o
Hidroquinona
Fig. 7 - 13. Distintos estados de reduccin en la molcula de Ubiquinona, Quinona o Coenzima Q.
Despus de la descripcin general de la Cadena de Transporte de Electrones se proceder a la descripcin individual de cada uno de estos Complejos. Volver al inicio
3) COMPLEJO I o Complejo NADH Deshidrogenasa.

Recibe protones desde varias Deshidrogenasas entre las cuales se encuentran las LHidroxiacil Deshidrogenasas de la -Oxidacin de los cidos Grasos, la Piruvato Deshidrogenasa, la Glutmico Deshidrogenasa, la Isocitrato Deshidrogenasa, la Cetogutarato Deshidrogenasa y la Malato Deshidrogenasa del C.T.C. El complejo I est formado por al menos 25 polipptidos (Fig. 8 - 13), de los cuales alrededor de 16 son de carcter hidrofbico y se encuentran en asociacin con fosfolpidos. Otros 6 son protenas Ferro-Sulfuradas con PMs de 75, 49, 30, 18, 15 y 13 kD. Los ltimos tres corresponden a la Flavoprotena NADH-Deshidrogenasa con PMs de 51, 24 y 9 kD ms un grupo prosttico FMN. El complejo posee mltiples centros Fe S, que han sido detectados por anlisis qumico y ESR (Electrn Spin Resonance, tcnica espectroscpica que somete a un fuerte campo magntico ms la irradiacin con microondas para crear y excitar orbitales midiendo la energa que estos desprenden cuando retornan a su estado basal), aunque no todos los centros ferrosulfurados parecen ser igualmente funcionales se han denominado como:
609
N - 1a y N - 1b con dos centros binucleares (2Fe - 2S) y los N - 2, N - 3, N - 4 y N - 5 con 4 centros tetranucleares (4 Fe - 4 S). Sus respectivos Potenciales Redox se encuentran aproximadamente desde los -380 mV a los -260mV (Fig. 9 - 13).
P.M. = 700 - 900 kD delComplejo Grupos = 1FM Prostticos NCentro F e S Hidrofbicos Polipptidos ( 25 ) ( 16 ) Hidroflicos (9)
[ 2Fe - 2 S] [ 4Fe - 4 S]
Composicin I
Centros Binucleares Centros Tetranucleares
[ 2Fe - 2 S] [ 4Fe - 4 S]
Centros FerroSulfurados
N - 1a
N - 1b N-3
Prts. Ferro - Sulfuradas
3 [ 2Fe - 2
S] [ 4Fe - 4 S]( 6 )
Ferro - Flavo Prts. [ 2Fe - 2 S]
75 kD 49 30 18 15 13
N-2
N-4 N-5
Otros Componentes
Ubiquinona [ 4Fe - 4 S] = Fosfolpidos (3) Prta.Estabilizadora de Ubiquinona

NADH 49k 30k
2Fe 2S 2Fe 2S
FM I 51 II 24 III 9
Disposicin de las unidades delComposicin delComplejo I
Matriz Mitocondrial
75K
Bicapa
Citoplasma Flujo de equivalentes Reductores
51k
FMN N - 34Fe -
4S
9k
2Fe 2S 2Fe 2S 2Fe 2S
24 N - 1b k
13k
N-4
4Fe 4S
N-2 4Fe 4S
Bicapa
N A D H /N A D
FMN
N - 1a
N - 1b N - 3
N-4 N-5
N-2 QH
Fig. 8 13 El nmero de polipptidos y su disposicin en el Complejo I de la C.T.E. aparecen junto a la secuencia con que fluyen los electrones.
La Ubiquinona parece tambin formar parte de este Complejo en asociacin con una protena estabilizadora llamada QPn, que estabilizara a la Ubisemiquinona formada al atrapar un protn. La Ubiquinona parece ser un centro de acopio para protones que vienen de los Complejos I y II. Las enzimas que aportan elementos reductores en este caso son la Glutmico Deshidrogenasa, Isocitrato Deshidrogenasa, -Cetoglutarato Deshidrogenasa, Malato Deshidrogenasa, L-OH-Acil-SCoA Deshidrogenasa entre otras. El flujo de protones en el Complejo I, se puede ordenar sobre la base de los potenciales redox y ocurre de la siguiente manera:
610
N - 1b NADH---> FMN ---> N - 1a ---> N - 3 ---> N - 2 ---> QH ---> Q N - 4 (PQn) N-5 Centros Ferro-Sulfurados mono, bi, tetra y pentanucleares Los componentes N son los grupos Ferro-Sulfurados y la QH es la Ubiquinona estabilizada con su protena. Este flujo de electrones es tambin acompaado por un flujo de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana. Si uno se pregunta que coenzima es mejor reductora, NADH o NADPH?. Encuentra que sus potenciales Redox son similares, adems los NADPH del citoplasma y los de la Mitocondria son de distintas fuentes y dependen de distintas reacciones, no as las NADH cuyos elementos reductores (H+) son llevados al interior por transportadores. No hay comunicacin directa entre los NADPH de la Mitocondria y Citosol. Sin embargo, existen Deshidrogenasas que funcionan con solo uno de ellos y no con ambos a excepcin de la Glutmico Deshidrogenasa. Los sustratos que reaccionan con NADP tienen un potencial redox algo ms negativo (son mejores reductores) que los que reaccionan con NAD. Por otro lado, la Glutmico Deshidrogenasa oxida con NAD y reduce con NADPH. As, en el interior de la Mitocondria, la razn NADPH/NADP (casi 100% reducida) se encuentra en una proporcin 500 veces mayor que la razn NADH/NAD (solo 30% reducida) a pesar de la equivalencia de sus potenciales redox. Probablemente esto se deba a su acoplamiento con la CTE y Fox.
NADH + NADP + 2H (afuera) ----- NADPH + NAD + 2H (adentro) NADPH + NAD+ + 2H+(adentro) <------ NADP+ + NADH + 2H+(afuera)
Como explicacin de lo anterior se ha encontrado que existe una reaccin acoplada a la translocacin de protones transmembrana que cataliza la transferencia de equivalentes reductores desde NAD(H) a NADP(H). Este proceso ocurre en la mitocondria animal y en
Centros Mono , Bi y Tetranucleares de las Protenas Ferro - Sulfuradas en la Cadena de Transporte de Electrone
s Cys
Cys S Fe S Cys
Cys
Cys S Fe
S Fe S
S Cys Cys
S Cys
Mononuclear
Las Cistenas pertenecen a la cadena polipptidica.
Binuclear
S Fe S Fe S Fe S S S
Cys
Cys S
Cys
Cys
Fe
Tetranuclear
Fig 9 - 13. Centros activos de las protenas Ferrosulfuradas.
611
bacterias. La fuerza del gradiente a ambos lados de la membrana altera la afinidad de una enzima transmembrana de 97 kD, sin grupos prostticos denominada como Transhidrogenasa. Esta ltima dependiendo de la concentracin de sustratos acelera la velocidad de transferencia de equivalentes reductores ( Protones y electrones) desde NADH a NADP y cambia el equilibrio de la reaccin hacia el NADPH con entrada de protones. En la direccin inversa la Transhidrogenacin va desde NADPH a NAD y es acompaada de la salida de los protones y cooperacin a la formacin del gradiente electroqumico, bombeando el paso de dos protones a travs de la membrana interna de la mitocondria hacia el espacio intermembrana Esta Transhidrogenasa funciona de manera similar a la ATP sintasa y cruza la membrana interna.
Adems de la Transhidrogenasa aqu descrita, existen otras enzimas mitocondriales que dependen de los niveles de NADPH/NAD y presentan Isoformas que funcionan para una y otra coenzima como la Isocitrato Deshidrogenasa o la Malato Deshidrogenasa, que tambin pueden funcionar como Transhidrogenasas sin estar acopladas al gradiente electroqumico. La funcin que se preserva o mejora con este sistema, no est clara an y puede ser que la relacin NADPH/NAD sirva para regular el nivel de Amonio (ya que la liberacin de Amonio es una reaccin que ocurre en la matriz mitocondrial y pertenece al Ciclo de la Urea que ocurre en el Hgado, ver Captulo de Metabolismo de los Aminocidos) mediante la Glutmico Deshidrogenasa, de la siguiente manera: Glu + NAD+ ----------- -Cetoglutarato + NH4+ + NADH + H Glu + NADP+ <---------- -Cetoglutarato + NH4+ + NADPH + H De otra manera, puede ser que acte como una contribucin extra a la Cadena de Transporte de Electrones y ayude a la formacin del gradiente para obtener una mayor cantidad de ATP. Mejorando as el rendimiento de los complejos transportadores de protones hacia el espacio intermembrana, como lo hacen el I, III y IV. La activacin que ocurre dependiendo de los niveles de ADP, de la ATP Sintasa puede mejorar el flujo de protones hacia este espacio para incrementar el gradiente y la entrada posterior mediante el Complejo V o ATP sintasa. Volver al inicio
612
4) COMPLEJO II o Complejo Succinato Deshidrogenasa.

El complejo II cataliza el paso de electrones desde el Succinato a la Ubiquinona y tiene un peso molecular de 130 kD (Fig. 10 - 13). Este centro esta formado por cuatro polipptidos acompaados de un FAD y aproximadamente 8 centros Fe - S. La enzima Succinato Deshidrogenasa pertenece al Ciclo Tricarboxlico y esta formada por una subunidad de 70 kD que corresponde al lugar de unin del FAD y dos centros Binoculares S1 y S2 con 2[2Fe - 2S] y la subunidad de 27 kD o protena Ferrosulfurada con un centro tetranuclear [4Fe - 4S] denominado S3. Los otros dos pptidos corresponden uno de ellos al Citocromo b con un peso molecular de 15.5 kD que acta tambin como centro de unin a la membrana de la Succinato Deshidrogenasa y el otro de 13.5 kD contiene al Heme del citocromo b 562. Otro componente en estudio es la Protena Q encontrada tambin en el complejo I, esta es capaz de combinarse con la Succinato Deshidrogenasa y transformarla en Succinato Q Reductasa. No est claro si tiene la misma identidad que el Citocromo b. La Acil-SCoA Deshidrogenasa que cataliza el primer paso de la Beta Oxidacin de los cidos Grasos transfiere electrones a la Ubiquinona sin pasar por el Complejo II, estos electrones van desde el FADH2 a la Flavoprotena Transferidora de Electrones (FPTE) y desde aqu a la FPTE-UQ Oxidorreductasa con FMN que luego pasa los electrones a la Ubiquinona.
Complejo II
Succinato : Ubiquinona Oxidoreductasa P M. = 97 kD Grupos Prost'eticos = F A D y centros Fe - S FAD 2 Centros Binucleares
S1 y S2 27 kD 15.5 kD 13.5 kD
560 2 [2Fe -2S]
Succino Polipptidos = (4 ) Deshidrogenasa (SUDHasa)
Flavoprt. Prt. Ferro Sulfurada
70 kD
S3 un centro Tetranuclear [4Fe - 4S ]
Prot. de unin a memebrana de la SUDHasa Citocromo b
Flujo de elementos reductores : Succinato FAD S-1 S-2 S-3 . QH ( Q Ps ) Q
Fig. 10 - 13.Nmero de polipptidos, disposicin y secuencia del transporte de electrones en el Complejo II.
Por otro lado la Glicerol-3P-Deshidrogenasa es una Flavoprotena localizada en la cara externa de la membrana interna de la mitocondria y emplea FADH2, conduciendo electrones directamente a la Ubiquinona. El aporte de elementos reductores hacia el Complejo II se puede observar en las siguientes reacciones: a) Desde el CTC tenemos a la Succinato Deshidrogenasa como: FAD SUCCINATO----> S - 1 -------> S - 3 -----> QH ----> Q S-2 (QPs) Centros Binucleares y Tetranucleares Ferro-Sulfurados Los elementos S corresponden a los centros Ferro-Sulfurados funcionales a lo largo de la cadena. b) Flujo de elementos reductores hacia la Ubiquinona de parte de la primera reaccin de la cido Graso Deshidrogenasa: Acil-SCoA FPTE - Q Deshidrogenasa Oxido - Reductasa Acido Graso ---> FAD ---> FPTE (FAD) --->Fe - S(FAD) ---->Q c) Flujo de elementos reductores desde la Lanzadera Glicerol-3-P-Deshidrogenasa: Glicerol-3P Deshidrogenasa Glicerol-3P -----> FAD -------------> Q Volver al inicio
5) COMPLEJO III o Complejo Citocromo bc1, tambin llamado Ubiquinona Citocromo c Oxidorreductasa.
El Complejo III o Citocromos bc1 cuya composicin se puede observar en la figura 11-13, est formado por tres centros redox. Uno de ellos es el Citocromo b formado por una protena transmembrana con dos grupos Heme conectados en serie (Fig. 11 - 13). El Citocromo b560 de aproximadamente + 40 mV ubicado hacia el centro de la membrana y el Citocromo b566 de - 90 mV ubicado hacia el exterior o espacio intermembrana. La protena del Citocromo b posee 8 hlices que atraviesan la membrana ms una hlice amfiptica dirigida hacia el espacio intermembrana (Fig. 13 - 13). A continuacin tenemos la protena Ferrosulfurada (+280mV) llamada tambin protena de Rieske, con un grupo binuclear 2Fe-2S unido no covalentemente a un centro tipo bolsillo hidrofbico. La protena Ferrosulfurada tiene en su estructura un dominio hidrofbico y otro hidroflico.
606
Los Citocromos son protenas encargadas de la transferencia exclusiva de electrones mediante un tomo de Fe + 2 en un grupo prosttico Heme (Fig. 11 - 13). Los Citocromos forman parte de los Complejos que se encuentran en la membrana interna de la mitocondria y se dividen en tres grupos, los a, b y c que no solo difieren en su espectro de absorcin sino que en la forma de unin a los grupos Heme. Los a y b tienen el grupo unido no covalentemente y son protenas integrales de la membrana, mientras que los c tienen el grupo unido por puentes disulfuro de las Cistenas y la protena se encuentra unida electrostticamente a los Fosfolpidos (Cardiolipina) de la parte externa de la membrana interna de la mitocondria. El ltimo de los centros redox es el Citocromo C1, que consiste en una protena integral, anclada por una hlice hidrofbica cerca de su Ct a la membrana y tiene 31kD, encontrndose asociado a otro polipptido de 14 kD. Se une fcilmente al Citocromo c y le transfiere sus electrones.
Ubiquinol : Citocromo C Oxido Reductasa Grupos Prostticos = Heme

45,5 44 42 31
Complejo I I I
kD
Prts. Estructurales Citocromo b con dos Hemes Citocromo c 1 o f b 562 y b 566 2S]
y Centros Fe - S P M. Monmero = Dmero = 250 kD 440 kD =
Polipptidos ( 10 )
24,5 15 9 7,8 4,8 3
Prt. Ferro - Sulfurada
1 centro binuclear [2Fe -
Disposicin Complejo III

Espacio Intermembrana
Fe - S C1 b, b C1 b ,b Fe - S
Bicapa
Bicapa
45
45 50
45 50
45
Matriz Mitocondrial
Fig. 11 - 13. Nmero de polipptidos y disposicin del Complejo III junto al Ciclo Q donde la Ubiquinona pasa protones y transfiere electrones.
607
La Ubiquinona en el ciclo Q (Fig. 11 - 13), es reducida por la Deshidrogenasa en el lado de la matriz mitocondrial formando Ubiquinol o QH2 que al no tener carga es translocado o migra por lo ancho de la membrana hidrofbica hacia el lado del citoplasma o espacio intermembrana, para donar aqu un electrn hacia uno de los centros de bajo potencial representado por la protena Ferrosulfurada ms el Citocromo C1 y liberar uno de sus dos protones. La Quinona al quedar como Ubisemiquinona o QH con carga negativa, se convierte en una molcula fuertemente reductora [- 240 mV] y entrega el otro electrn al otro centro de bajo potencial representado por los Citocromos b562 y b566. La Ubisemiquinona queda entonces como Quinona Q, sin carga y nuevamente vuelve al lado de la matriz mitocondrial para recibir el electrn transportado por medio de ambos Citocromos b formando nuevamente en este lado Ubisemiquinona (QH). Esta recibir nuevamente otros dos protones desde la matriz para ser llevados hacia el espacio intermembrana. El grupo Heme del Citocromo b retiene la carga, mientras que la Ubiquinona reducida atraviesa la membrana.
S C H 3 C ys S N N Fe N N
C ys C H3 C H C H 2
C H C H 3
H C H C 3 H C 3
C H 3 C H 2
H C 2 C H C O O 2
H C N H C 3
N Fe N N
C H 3 C H 2 C H C O O 2
C H 3
C H2 C H 2
C O O
C H 3
C H2 C H 2
C O O
HEME C P R E S E N T E E N C IT O C R O M O C
C H3 C H C H 2
P R O T O P O R F IR IN A I X P R E S E N T E E N C IT O C R O M O B
O H
C H 3 H C 2 H C N H C 3 N Fe N N C H 2 C H3
HEME A PRESENTE EN C IT O C R O M O A
C H C O O 2
C H3
C H3
C H3
C O L A D E H ID R O X I E T IL F A R N E S IL
C H O
C H2 C H 2
C O O
Fig. 12 - 13.Grupos Heme presentes en los Citocromos.
En resumen, a medida que una molcula de Ubiquinol es oxidada a Ubiquinona dos molculas de Citocromo c se reducen y dos protones del lado de la matriz ms dos protones previos en el QH2 son transportados hacia el espacio intermembrana. En total cuatro protones para permitir un flujo de dos electrones. El ciclo Q es desafortunadamente el sitio que produce ms radicales libres , ya que el radical semiquinona ( Q ) se forma durante el proceso del transporte de electrones y puede transferir un electrn al O2 para formar el Superxido. Del total del O2, el 1 o 2% es capaz
608
de formar este tipo de Oxgeno aberrante. Por otro lado esta capacidad negativa disminuye cuando la CTE funciona desacoplada a la produccin de ATP y se produce tan solo calor. En estas condiciones el O2 se consume rpidamente y la concentracin disponible para la formacin del Superxido disminuye. Como contrapartida a la produccin de Superxido, se encuentran algunas enzimas como la Superxido Dismutasa, que toma al Superxido y lo convierte en H2O2 tambin daino y la Catalasa que a continuacin transforma el H2O2 en H2O. Por otro lado se encuentra la enzima Glutatin Peroxidasa (requiere Selenio), que tambin destruye radicales libres con el empleo de Glutatin. Otros compuestos denominados Peroxiredoxinas, son capaces de capturar perxidos descomponindolos. Similar actividad tienen los ascorbatos, piruvato, flavonoides, carotenoides y el Glutatin mismo que los reducen. Los radicales libres intervienen en la edad, enfermedades coronarias, cncer, Alzheimer, respuesta inflamatoria, enfermedades autoinmune, SIDA, etc. El flujo de los electrones ocurre de la siguiente manera:
H+
HOOC Fe S b566 b560 COOH COOH 2 +H Fe S NH 2 C1
NH
NH
Fig 13 - 13. Las -Hlices del Complejo III sirven de soporte a los Citocromos y al Heme.
QH2 + 2Citc.b ox + 2H(matriz)-->QH2 + 2Cytc1 red + 4H(intermemb.)

Otro de los componentes es el Citocromo C que migran entre la Citocromo C Reductasa y la Oxidasa o complejos III y IV por difusin lateral. Encara la superficie de la membrana hacia el citoplasma y es una protena soluble que se mueve en un ambiente hidroflico. Volver al inicio
609
6) COMPLEJO IV o Complejo de la Citocromo Oxidasa.

Este complejo esta formado por al menos 14 polipptidos (fig. 14-13), de los cuales las Subunidades I y II (fig. 15-13), son estrictamente necesarias para la transferencia de electrones, paso de protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana y la
C o m plejo IV
Ferrocitocrom o c : O xgeno O xido - R eductasa P M . = 162 - 180 kD monmero
G rupos = H eme a y a3 con C ua y C ua3. P rostticos 56 kD O rigen M itocondrial 26

29 P olipptidos = 17 12
C o m p lejo IV C it. c +2 Fe e C it. c + 3 Fe
D mero
E sp. Inter m em brana
26 K
(8 )
5.5 4.9
10
C it. c
5.5 K
12 K
<
C o m p lejo III
10 K 29 K 17 K
56 K
M atriz
M itocondrial
Fig. 14 - 13. Nmero de polipptidos que forman el Complejo IV y sus pesos moleculares. Transferencia de un electrn a la vez por el Citocromo c desde Complejo III a Complejo IV. En este ltimo se indica la disposicin de los polipptidos con sus respectivos pesos moleculares.
reduccin del Oxgeno. Los otros polipptidos constituyentes del Complejo IV, ejercen supuestamente un papel de regulacin sobre los dos primeros. Ambas Subunidades I y II del Complejo IV, estn ubicados en la membrana interna de la mitocondria y tienen numerosas hlices que atraviesan a la membrana en uno y otro sentido. Por lo tanto para proteger el sistema que maneja la reduccin del Oxgeno, es necesario evitar la formacin de productos nocivos como Superxidos, iones Oxhidrilos y Perxidos de Hidrgeno, aportando los electrones secuencialmente (ver ms adelante). Como el Complejo IV tambin bombea protones hacia el espacio intermembrana, por cada molcula de Oxgeno reducido se dispone de 8 protones de la matriz mitocondrial, 4 se depositan en el espacio intermembrana y los otros 4 se emplean para formar agua en el centro binuclear de la Citocromo Oxidasa ( Heme a3 + CuB). El mecanismo de transferencia de electrones entre ambos complejos y la reduccin del O2, se ha descrito de la siguiente manera:
C it o c r o m o C O x id a s a
C ito c C
e Cu A e
C e n tr o H e m e a
C e n tr o b in u c le a r con H em e a3 y Cu B
E s p a c io In t e r m e m b r a n a
Fe e Fe Cu B
S u b u n id a d II
S u b u n id a d
I H
+
M a triz m it o c o n d r i a l
Fig. 15 - 13. Flujo de los electrones y disposicin de las subunidades I y II de la Citocromo Oxidasa. La subunidad I tiene dos grupos heme, el Heme a y el centro binuclear con Heme a3 y Cu B. Este ltimo es el lugar donde se reduce el O2. La captacin de protones en la matriz mitocondriales encuentra acoplada a la reduccin del O2.
El Citocromo C reducido como Fe+ 2, llega al Complejo IV para unirse al sitio de baja afinidad provocando al mismo tiempo la salida de otro Citocromo C oxidado como Fe+ 3, perteneciente al sitio de alta afinidad del Complejo IV. Este ltimo viaja en sentido opuesto, es decir hacia el Complejo III para ser reducido nuevamente (fig. 14-13). Una vez que se le ha entregado el primer electrn al Complejo IV, se repite el proceso tres veces para se formen dos molculas de agua. El Citocromo C es retenido electrostticamente a la bicapa por la Cardiolipina (Lpido polar) y a los residuos acdicos del Complejo IV. El electrn transferido desde el Citocromo C llega al Cu A de la Subunidad II y desde all, migra al grupo Heme a de la Subunidad I para alcanzar finalmente al centro binuclear de esta ltima subunidad. Ahora, la forma oxidada de este centro binuclear (Heme a3 con Fe +3 y centro Cu +2), recibe al primer electrn y se reduce parcialmente a Heme a3 con Fe +3 y centro Cu +1. A continuacin con la llegada del segundo electrn se reducen ambos componentes a Heme a3 con Fe+2 y centro Cu +1. En este estado se produce la unin del Oxgeno formndose el compuesto Heme a3 con Fe+2 - O2 y centro Cu +1. Este complejo puede seguir dos caminos, uno de ellos consiste en formar los intermediarios Peroxi, donde el primero de ellos es Heme a3 con Fe +3 O- O- y con centro Cu +2 , mientras que el segundo se produce despus de entrar el tercer electrn, para quedar con la forma Heme a3 con Fe +3- O- - O- y centro Cu +1 . El otro camino de la derecha (fig. 15-13) asume que la unin O O ya no existe y que el siguiente electrn es aportado por un anillo de porfirina o un residuo de aminocido dando una serie de 4 compuestos posibles. Sin embargo, al final ambas vas forman estructuras reconocidas como el oxoferrilo (con formacin de agua) y el hidroxiferrilo. Este ltimo se forma despus de la protonacin y ltima reduccin o entrada de un electrn al tomo de Oxgeno unido al hierro en el Oxoferrilo. Finalmente se libera agua y se regenera el estado oxidado inicial.
606
Fe
+2
C u +1
O2 2H+ Fe
+2
e
+3 +1
O2
Cu
+1
H2O Fe Cu
P o r fir in a + 1
Fe e Fe
+3
+3
O -- O P E R O X ID O
C u +2
Fe
+4
= O -2 C u + 2 o = O -2 C u + 2 o = O -2 C u + 3 o = O -2 C u + 2 e
C u +2 Fe
+3
e O -- O P E R O X ID O
R e s id u o + 1
Fe C u +1
S e rom pe e l p e r x id o
+4
H2O H
+
Fe
+4
2H+ H2O e, H+
Fe Fe
+4
+5
Fe
+3
OH
Cu
+2
-2
C u +2
H ID R O X IF E R R IL O
O X O F E R R IL O
Fig. 15 - 13. Reaccin detallada del centro binuclear en la subunidad I de la Citocromo Oxidasa involucrada en la reduccin del Oxgeno.
El paso de los protones al espacio intermembrana desde la matriz mitocondrial parece ser promovido por el potencial redox transitorio de la reaccin de reduccin del Oxgeno. Este produce una variacin de la densidad electrnica a lo largo de los residuos de aminocidos (Histidina, Lisina y Asprtico) de la Subunidad I, de esta manera el H+ persigue a la nube electrnica que se desplaza de residuo en residuo a lo largo del ancho de la membrana para salir finalmente al espacio externo. Por otro lado este flujo de protones parece ser ayudado por los cambios conformacionales de la protena misma, que pareciera desplazar a los residuos de un punto a otro para as tomar y soltar protones empleando la energa producida por la reduccin del oxgeno. El Oxgeno es tan complicado de reducir debido a que posee una serie de particularidades negativas atribuidas a su nube electrnica ms externa, que lo relacionan con el envejecimiento, artritis y cncer. Sin embargo, es un elemento esencial para la mayora de los seres vivos (excepto anaerbicos estrictos y sistemas de vida hidrotermales basados en el Azufre), donde acta como aceptor final de protones y electrones durante la oxidacin de metabolitos. El grupo bimetlico o binuclear que se encuentra en la subunidad I, con el grupo Heme a3 (Fe) y el Cu B tienen por funcin retener al Oxgeno en este lugar, mientras se reduce electrn por electrn ya que si lo deja salir en cualquiera etapa intermedia podra dar origen a un Superxido (O2-) cuando la reduccin es con solo un electrn, o bien a un Perxido de Hidrgeno (H2O2), cuando la reduccin es con dos electrones y finalmente con tres electrones, dara origen al radical Hidroxilo (HO. ), que es un fuerte oxidante. Ver figura 17 13. La molcula de Oxgeno atmosfrico (O2) al tener dos electrones no apareados con el mismo espn paralelo en su capa externa, puede ser considerada como un biradical (Radical, es una
607
molcula con un electrn desapareado en su capa ms externa). De esta manera, solo puede reducirse aceptando un electrn con espn opuesto a la vez. Este efecto, hace difcil la reaccin con molculas orgnicas que tengan ambos electrones apareados con espines opuestos. Por lo tanto, la activacin del Oxgeno puede ocurrir mediante dos mecanismos (Fig. 17 - 13), uno de ellos implica: a) la absorcin de suficiente energa para invertir el spin b) la reduccin monovalente electrn por electrn. a) La forma basal del Oxgeno se conoce como triplete, al mostrar tres bandas en el espectro obtenido por EPR debido a su espn paralelo ( EPR por Electrn Paramagnetic Resonance: tcnica que somete los electrones a un campo magntico y microondas a la vez para hacer resonar los electrones y detectar la energa que estos despiden al retornar a su estado basal). En el caso de que la forma basal absorba energa para invertir el espn de uno de los dos electrones formar el estado denominado singlete (una banda), donde ambos electrones tienen espn opuesto. Esta forma activada, puede participar en reducciones divalentes con molculas orgnicas. De esta manera se pueden aparear dos pares de electrones con espn opuesto: + Energa + Oxgeno basal Espn paralelo Oxgeno singlete Forma energtica Oxgeno Compuesto Org. Singlete Reduccin del Oxgeno por compuesto Orgnico
OO:
Singlete Espn opuesto +7,6 .O-O. e
Superxido .O-O: e - 21,7 Perxido de Hidrgeno Radical Hidroxilo .O-O:H Radical Perhidroxilo
+22
H:O-O:H e - 8,8
Triplete basal Espn paralelo Energa Libre Kcal/mol
H: O. + H:O:H e H:O:H - 53,7
Fig. 17 - 13. Energa necesaria para la formacin de las distintas especies reactivas del Oxgeno.
b) La otra va reductiva es secuencial, electrn por electrn y el primer compuesto que se forma a partir del biradical conocido como Oxgeno atmosfrico basal, es el Superxido. Este ltimo puede actuar como oxidante o como reductor y es altamente txico al organismo.
608
Al protonarse forma el radical Perhidroxilo ( .OO:H ), siendo este un poderoso oxidante que afortunadamente se encuentra en bajsimas concentraciones a pH fisiolgico. La reduccin del Superxido por un segundo electrn produce Perxido de Hidrgeno, el cual no es un radical libre ya que todos sus electrones se encuentran apareados, sin embargo al descomponerse en presencia de un metal, recibe un electrn de este y se produce el radical Hidroxilo, considerado como l ms fuerte agente oxidante frente a todo tipo de molculas orgnicas. Por ltimo al adicionar un cuarto electrn al Oxgeno, se genera la molcula de Agua con todos los electrones apareados. Es por estas dificultades que algunos sistemas biolgicos tratan de reducir el Oxgeno con dos o con cuatro electrones para mantener a los intermediarios txicos al mnimo. Cuando llega a formarse el Perxido de Hidrgeno, se elimina mediante la enzima Catalasa, mientras que el Superxido se elimina con la enzima Superxido Dismutasa.
Catalasa 2H2O2 H2O + O2 Superxido Dismutasa O2- + O2- + 2H+ H2O2 + O2
Otros compuestos que defienden de estos productos aberrantes del Oxgeno, son las Vitaminas E (Tocoferol), A (Licopeno y Retinol) y C (c. Ascrbico). Todos ellos protegen de la peroxidacin e inestabilidad a las membranas celulares, en especial a los cidos grasos poli-insaturados. Volver al inicio
609
7) COMPLEJO V o Complejo ATP Sintasa.

Este complejo esta representado por la ATP Sintasa donde se lleva a cabo la Fosforilacin Oxidativa y se le encuentra presente tanto en la Mitocondria como en los Cloroplastos y las Bacterias. Esta formado principalmente por dos sectores que tienen la forma de una pera invertida (fig. 18a-11), uno de ellos es el sector Fo, conocido por unirse a la Oligomicina (o) y forma el canal inico por donde translocan los protones. El otro sector es el F1, donde se encuentra la parte ms ancha de la pera, que as emplea la energa del gradiente quimiosmtico generado por los Complejos I, III y IV en el almacenamiento de energa qumica, como ATP. Cuando el sector F1 se encuentra desacoplado solo se logra hidrolizar ATP actuando en forma reversa como una ATPasa.
a)
b)
3 H+
ATP
1
Unin de ADP y Pi ATP

1
F1 ATPas
? ?
AD P Pi Sint. de ATP
HO 2
Fo
ATP
2
ATP
1
AT P
3 H+
Rotacin id de pord el flujo o t en 120
Fig 18a - 13. Subunidades de la ATP Sintasa. Fig 18b - 13. Mecanismo de accin de la ATP Sintasa.
En organismos primitivos, este sistema actuaba expulsando iones con el ATP generado por las vas anaerbicas y posteriormente al crearse un medio externo demasiado cido, se empez a permitir la entrada de protones con acoplamiento a la sntesis de ATP. El probable mecanismo para la sntesis de ATP se muestra en las figuras 18a - 13 y 18b 13. El componente F1 o la parte redonda de la pera comprende 5 subunidades, entre ellas tenemos a la de 56kD, de 53kD, de 33kD, de 16kD y de 11kD. El arreglo en que
se encuentran es 2, 2, 2, 2, 2 o tambin puede ser 3, 3, , y . El sitio cataltico est en la unidad mientras que la unidad , est involucrada en la unin del complejo al componente Fo. El sector Fo es extremadamente hidrofbico hacia el exterior en contacto con las membranas y por su interior, donde circulan los protones, que se encuentra especialmente constituido por un proteolpido de PM 5,6kD. Este posee 6 copias, ms otros pptidos de PM 13kD y la Protena que confiere Sensibilidad a la Oligomicina (PSO), que es un compuesto bloqueador del paso de protones. El proteolpido con sus seis copias forma un circulo hidrofbico que delimita un segmento central hidroflico el que interacciona con la protena PSO o con la subunidad F1. El compuesto denominado Diciclohexil Carbodiimida, interviene inhibiendo la translocacin de protones ya que se une a un residuo Glu (polar, de carga negativa) perteneciente al crculo central de pequeos polipptidos de carcter hidrofbico. La sntesis de ATP puede ser descrita mediante la siguiente hiptesis que se encuentra actualmente en boga y es representada en la figura 18b - 13: Los cambios conformacionales que sufre la subunidad , para modular la afinidad de un sitio tres veces, sera impulsada por el gradiente quimiosmtico. En este caso algunos residuos esenciales para el sitio, como los aminocidos Asp y Glu (polares) estaran protonados dependiendo del paso de los protones impulsados por el gradiente quimiosmtico.
B a cte ria
p H = 7 p H = 8
H+ F o F 1
AT P AD P + P O2 N A D H
N AD
H O 2
M e m b ra n P la sm a tica
H + + H H+ + H
+ F o F 1
M ito co n d ria
M e m b ra n In te rn a
+ H
+ H
N A D
M e m b ra n a E xte rn a
A T P AD P + P
+ H
O 2 N A D H
H O 2
C lo ro p la sto
p H = 5 p H = 8 p H = 7 M e m b ra n In te rn a
M a triz
+ H
M e m b ra n a E xte rn a
N A D P
H O 2
O2
N A D P H
AT P AD P + P
H+ CF o CF 1
H+ H
N A D P
E stro m a T ila co ide
+ H
H 2 2 O O
N A D P H
Fig 19 - 13. Similar disposicin de los complejos involucrados en la Fosforilacin Oxidativa entre los organelos de clulas superiores y una bacteria.
El sitio activo de las subunidades puede encontrarse con tres afinidades diferentes para la unin a los substratos y al producto. De esta manera el ADP y el Pi se unen a un sitio dbil o laxo, para luego experimentar un cambio con alta afinidad o sitio tenso. En este momento se forma el ATP para luego pasar nuevamente a la etapa laxa de poca afinidad en la que se
606
suelta el ATP recin formado, mientras que otra molcula de ADP y Pi se unen nuevamente al sitio de baja afinidad. La entrada de ADP y la salida de ATP hacia la mitocondria esta a cargo de una protena transportadora de PM 40kD. El intercambio se realiza sobre la base de la diferencia de potencial elctrico que ocurre a travs de la membrana. La transportacin de ATP puede ser inhibida por una toxina de naturaleza glucosdica de nombre Atractilsido y por la toxina de las Pseudomonas denominada c. Bongcrcico.
En general la Cadena de Transporte de Electrones se puede considerar como una serie alternada de transportadores de hidrgeno y de electrones. Los que forman ciclos redox individuales para llevar protones a travs de la membrana.
La Ubiquinona cumple un papel primordial en el transporte de protones ya que se le encuentra asociada a los complejos I, III y posiblemente el II, junto a su protena estabilizadora QPn. En la figura 19 - 13, se puede observar la direccin de los gradientes de protones en Bacteria, Mitocondria y Cloroplasto, junto a la presencia de las ATP Sintasas que estn dispuestas de la forma en que pueden obtener energa del gradiente para transformarla a energa qumica al sintetizar ATP. Algunos de los principales compuestos que se han empleado para el estudio del comportamiento de la Cadena de Transporte de Electrones, son los desacopladores e inhibidores. Estos compuestos se han utilizado para separar el funcionamiento de la Cadena de Transporte de Electrones en sus distintos Complejos as como para estudiar la integracin con el proceso de Fosforilacin Oxidativa. Ambos procesos se pueden inhibir en conjunto o por separado al desacoplarlos. As tenemos a: a) Inhibidores de la cadena respiratoria: a) Cianuro, H2S, CO, Azida de Na que bloquean la Citocromo Oxidasa o Complejo IV. Antimicina A bloquea en el Complejo III, entre citocromo b y citocromo c. TTFA (Thenoyl Trifluoro Acetona) bloquea a la Succinato Deshidrogenasa en el Complejo II. No tiene efecto en la oxidacin de sustratos con NADH o ascorbato con TMPD. b) Inhibidores de la Fosforilacin: Impiden el consumo de Oxgeno despus de agregar ADP, pero no tienen efecto en el consumo de Oxgeno estimulado por desacopladores. Se encuentran aqu Oligomicina que se une a un polipptido en la base de la ATP sintasa en la subunidad Fo y no deja pasar los protones. TCCD c) Agentes desacopladores e Ionforos: Cortan la relacin entre la Cadena de Transporte de Electrones y la Fosforilacin Oxidativa, de hecho producen poros por los cuales entran los protones sin ejercer trabajo o sintetizar ATP., se encuentran formados por molculas amfipticas que se diluyen en las bicapas fosfolipdicas. Forman tneles aislantes de los iones cuando estos pasan por las bicapas. En su mayora son sintticos o producidos por microorganismos (Valinomicina, ionforo) e incluso existe una protena de estas caractersticas encargada de la termognesis en el tejido adiposo pardo (Termogenina inh. GTP, activada por Sist. Nerv. Simptico). As tenemos al DNP por Dinitro Fenol, CCCP por Carbonyl Cianuro m-Cloro Fenil Hidrazona, Valinomicina, cortocircuita la membrana permitiendo el paso del K+ hasta igualar cargas a ambos lados.
607
d) Inhibidores del Transporte, evitan la entrada de ADP y P o bien la salida de ATP, como lo es el Atractilsido que inhibe la importacin de ADP al unirse a la superficie externa del transportador. El c. Bongcrcico, es otro de ellos que se une al lado interno del transportador de ADP. El Mersalil (diurtico en base a mercurio), inhibe transportadores de Fosfato y Dicarboxilato. e)
Inhibidores del CTC: Bloquean una o ms de las enzimas del CTC como Arsenito y Aminoiodoacetato.
Volver al
inicio
CONSUMO DE OXGENO POR LA MITOCONDRIA.

Cuando se dispone de una suspensin de Mitocondrias aisladas en un medio isotnico (para evitar shock osmtico) en presencia de Pi, ADP ms un sustrato permeable como Succinato, es posible medir con un electrodo de Oxgeno la desaparicin de ste. La Mitocondria lo ocupa para deshacerse de los protones y transformarlo en agua metablica. De esta manera s a demostrado que el ADP, en presencia de Succinato, estimula el consumo de O2 produciendo una rpida formacin de H2O y ATP.
Consumo de Oxgeno (mM) 0,3 Consumo de O2
ADP
b c no es paralela a la parte a ya que las ATPasas contaminantes producen ADP que an estimula el consumo de O2
Oxgeno consumido 3 4
0,2
0,1
ADP agotado
0,0
Tiempo (minutos)
Fig.20 13. Grfico del consumo de O2 versus tiempo
La relacin entre b y c del grfico (fig. 20-13), es el ndice de Control Respiratorio ( ICR = b/c) y se relaciona con el grado de acoplamiento que existe entre respiracin en la CTE y el grado de fosforilacin en la sntesis del ATP. El ICR vara de 3 a 10 dependiendo de la calidad de la preparacin y del sustrato empleado.
608
En este grfico es posible medir la relacin entre ATP sintetizado y Oxgeno consumido o la conocida relacin de P/O. Para ello se agrega una cantidad conocida de ADP y se mide el O2 cuyo consumo hay sido estimulado en b. A continuacin se sustrae la respiracin basal c, debido al acoplamiento imperfecto y reciclaje del ATP. Luego el cambio de concentracin del O2 detectado por el electrodo, se multiplica por el volumen del recipiente para relacionarlo con la cantidad de ADP agregado. Disminucin de la concentracin de O2 por el grfico = 0,135mM, Volumen de la cmara = 2,5ml tomos de Oxgeno consumido en el estado b = 0,135 x 2 x 2,5 = 0,68 micro tomos Factor 2 es por la molcula biatmica = O2 ADP agregado en la cantidad de 20 microlitros de una solucin 50 mM = ATP formado = 1 micromol en total. Luego : P:O = P/O = (ATP formado) / (Oxgeno consumido) = 1,48 para la oxidacin del Succinato Aquellas reacciones que emplean NAD entregan valores mayores de la razn P/O (2,5) comparado al Succinato (1,5). Esto indica que los electrones de compuestos con poca capacidad reductora ( cuyo potencial redox no es lo suficientemente negativo) como Succinato, Acil-SCoA y Glicerol-P
. Consumo de Oxgeno (mM) 0,3 Consumo de O2 normal Oxgeno consumido en presencia de un desacoplado 0 1 DNP: Dinitro fenol FCCP :p-Trifluorometoxi Carbonil Cianuro Fenilhidrazona CCCP: m-Cloro Carbonil Ci F ilhid Desacoplador Cualquiera de ellos: DNP, FCCP y CCCP
ADP
0,2
0,1
El O2 se consume rpidamente con o sin presencia de ADP, ya que la Mitocondria no hace trabajo de sntesis. Su energa se pierde como calor 2 3 4 Tiempo (minutos)
0,0
Fig. 21 13. Consumo de Oxgeno frente a un desacoplador.
entran en una parte intermedia de la Cadena de Transporte de Electrones, pasando por alto el primer sitio de acoplamiento del Complejo I donde se genera energa por el paso de protones al espacio intermembrana para formar luego ATP en la ATP sintasa. Existe una diferencia entre los valores tericos y los prcticos del P/O tanto para el NAD conocido como 3 y el FAD conocido como 2.
609
Los desacopladores (fig. 21 13) al producir poros o abrir canales en la membrana interna de la Mitocondria, cortan la regulacin por el ADP y la Cadena, considerada como una acumulacin de reacciones exergnicas procede espontneamente sin hacer trabajo. Es decir, todos los protones que pasan por los Complejos I, III y IV al espacio intermembrana no se acumulan generando un gradiente con energa potencial, ya que vuelven nuevamente a la matriz entrando fcilmente por los poros y no por la ATP Sintasa. Una vez en la matriz mitocondrial son tomados por la Citocromo Oxidasa y empleados en la reduccin secuencial del Oxgeno para formar agua metablica en gran cantidad. Volver al inicio
9 ) EL GENOMA MITOCONDRIAL.
Esta compuesto por 16.569 pb ( 16.6kb) y fue secuenciado en 1981, tiene 37 genes de los cuales 13 codifican para polipptidos. Constituyen cerca del 0,5% del total del DNA de la clula. No tiene intrones y es muy denso. Solo pequeos espacios entre los genes. Entre sus genes se encuentran las 7 subunidades del Complejo I de la CTE, 1 subunidad del complejo III, 3 subunidades del Complejo IV y dos subunidades del Complejo V. En especial polipptidos hidrofbicos que interaccionan entre s, adems son insolubles y de difcil transporte por la clula. El resto del DNA codifica para 2 subunidades de los ribosomas y 22 tipos de RNAt distintos propios de la Mitocondria. El resto de las subunidades y enzimas como DNA polimerasas, RNA polimerasas y las dems protenas necesarias de los ribosomas son sintetizadas por el material gentico del ncleo en el citoplasma y luego importadas a la mitocondria. En estos lugares la membrana externa se pega con la interna y la protena que va a entrar, con un grupo de aminocidos de su Nt de carga +, se pliega como una .hlice amfiptica, dejando los aminocidos hidrofbicos en la superficie. Otras protenas receptoras a lo largo de la membrana ayudan a la entrada de las protenas de importacin. Parece ser que la diferencia de carga en las membranas ayuda a la importacin de las protenas. Posteriormente una proteasa puede o no actuar en la protena para cortar la seal y descubrir una segunda, segn sea al sitio que se dirige. En un huevo fertilizado la gran mayora de las Mitocondrias proviene del Oocito y no del espermio, esto niega los beneficios de la recombinacin trados por la reproduccin sexual. Suponiendo este tipo de herencia maternal y la poca variabilidad del DNA mitocondrial, ha sido posible trazar los orgenes de la raza humana en un grupo de mujeres estrechamente relacionadas o bien hermanas, que vivieron en frica 200,000 aos atrs. Volver al inicio
610
10) ADAPTACIN AL FRO.

Aquellos mamferos que viven en un rgimen fro poseen un tejido especial que les permite liberar caloras sin temblar (Ver Captulo 8). Este es el tejido graso pardo rico en mitocondrias que poseen una gran cantidad de invaginaciones membranosas y un citoplasma con muchas vesculas de grasa en vez de una sola. Este tejido responde a la Noradrenalina de los nervios Simpticos, la que se une a muchos -Receptores, activando a la conocida Adenil Ciclasa que a su vez activa en cadena a la Lipasa, para liberar cidos grasos que entran a la va de la -Oxidacin en la mitocondria. La Oligomicina no controla la respiracin en la Mitocondria ya que la FoF1 ATPasa no se encuentra activa. Sin embargo, se ha encontrado la presencia de una protena desacopladora que es activada por GDP y cidos grasos libres, los que a su vez responden a la secrecin de la Noradrenalina. La hormona Tiroxina acta como desacoplador al igual que el Dinitrofenol. En otras palabras, en la mitocondria se propicia la oxidacin para liberar energa calrica por medio de la Cadena de Transporte de Electrones desacoplada, en respuesta a una secrecin hormonal. Volver al inicio
11) DISFUNCIN MITOCONDRIAL

Las mitocondrias son tambin capaces de sufrir disfunciones que alteran su capacidad metablica y entre ellas encontramos al MELAS o Mitochondrial Encephalomyopathy, Lactic Acidosis and Strokelike episodes. Este es un desorden neuromuscular causado por mitocondrias defectuosas que se traduce en dolores de cabeza, convulsiones y demencia progresiva. Sus primeros indicios son desordenes gastrointestinales en nios menores de 10 aos que pueden conducir a una obstruccin intestinal con distensin abdominal y vmitos. Se ha encontrado en los pacientes una mutacin de Adenina por Guanina en la posicin 3243, que corresponde al RNA de transferencia de la Leucina (RNAt - Leu) en el cromosoma mitocondrial. En este tipo de familias se recomienda un estudio gentico junto a la determinacin de los niveles de cido Lctico y Piruvato en el suero a sus distintos integrantes, ya que es posible que se encuentren por sobre los niveles normales debido a la falla en el metabolismo aerbico y exacerbacin del anaerbico, que afecta principalmente a la musculatura lisa del intestino causando obstruccin o estrangulacin intestinal. Uno de los tratamientos es laparatoma, descompresin intestinal y administracin de fluidos libres de lactato y altos niveles de Coenzima Q 10. Volver al inicio
12) APOPTOSIS
La muerte celular programada o Apoptosis (Fig. 22 -13), es un proceso que se emplea para eliminar clulas daadas, superfluas, infectadas o envejecidas en organismos pluricelulares. De esta manera el organismo, se deshace de las estructuras celulares superfluas mediante el efecto de las Caspasas, familia de proteasas dependientes de Cistena. Estas proenzimas se especializan en hidrolizar uniones peptdicas, especialmente aquellas donde se encuentra presente el aminocido Asprtico (Aspasas: nombre original). Las Caspasas se activan unas con otras en cascada para formar un complejo de mltiples subunidades llamado Apoptosoma. Este complejo se logra formar debido a las seales proapoptoticas que llegan a la Mitocondria. Entre estas seales tenemos a la Protena Activadora del Poro o BAX y la Protena antiapopttica Bcl2. Otros factores desencadenadores de la Apoptosis son los ROS celulares (Reactive Oxygen Species o Radicales libres), el dao por luz UV y algunos otros no identificados an. Todos los factores apoptticos provocan en la Mitocondria una permeabilizacin de la membrana externa e interna por abertura del Poro denominado PTP (Poro de Transicin de Permeabilidad).
ROS Celulares Dao por UV Seales Apoptticas H+ H+ I II III Cit C IV

Matriz mitocondrial
H+
Espacio intermembrana
H+ H+ Bax
Influjo de Protones
Bcl2
ATP
PTP
Cit C Apaf
dATP/ATP
Destruccin Celular Caspasa 3 ejecutadora
Caspasa 9
Activacin en cascadfa de Caspasas
Fig. 22-13. Apoptosis en la Mitocondria
Dicho Poro (PTP) abarca ambas membranas y a consecuencias de ello se produce un cortocircuito, es decir se cae el Potencial transmembrana o , debido a la entrada masiva de protones a la matriz mitocondrial y a su vez se produce la liberacin hacia el citoplasma del componente de la CTE denominado Citocromo C (este ltimo transporta electrones individualmente al Complejo III y IV) y ATP. El Citocromo C junto a la presencia de dATP o ATP en el citoplasma induce la oligomerizacin de las Caspasas
606
reclutando a procaspasa 9 para formar el Apoptosoma. Al unirse la Caspasa 9 holoenzima, esta ltima corta y activa a las Caspasas del Apoptosoma que se encuentra formado por 7 molculas Apaf 1 y un nmero similar del Dmero de las Caspasas 9. Apaf 1es una protena modular con tres dominios: 1) Regin Nt -- CARD que recluta a Procaspasa 9 2) La regin homloga CED4 que promueve la Oligomerizacin y 3) Regin Ct-- Regulatoria con repeticiones Trp/Asp, que parece ser el dominio que responde a Citocromo C. El Apoptosoma activa posteriormente a la Procaspasa 3 a Caspasa 3, que es la que ejecuta la accin consistente en destruir la clula al fragmentar las estructuras del ncleo celular.
Volver al inicio
13) ROL METABOLICO DE LOS ORGANOS En la siguiente Tabla se observan los principales metabolitos del metabolismo intermediario:
Compuesto Glucosa
Importancia
Caractersticas
Triglicridos
Lactato
Alanina
Glutamina
Se almacena como Se almacena poco, Glicgeno y es la principal principalmente Hgado, fuente de energa Msculo y otros tejidos Mayor energa por peso Se hidroliza para formar que el Glicgeno (2,5 cidos grasos y Glicerol veces) Producto de la Gliclisis Se recicla en Glucosa por anaerbica de la fibra el Hgado en el Ciclo de muscular blanca Cori. Principal aminocido que Se relaciona se libera durante la estructuralmente con Inanicin Piruvato (Transaminacin) y Lactato (Reduccin con NADH+H) Principal aminocido en la Se le relaciona sangre estructuralmente con Glutamato (principal aminocido del metabolismo, que tambin es un neurotransmisor) Y -Cetoglutarato (Aminacin y 607
Acetoacetato
Se produce durante el ayuno y la inanicin. Su acumulacin produce Acidosis y trastornos metablicos
Desaminacin) Se emplea como fuente de energa por el Cerebro, Msculo esqueltico y Corazn durante la inanicin
A continuacin analizaremos el papel de cada uno de los rganos durante el metabolismo intermediario:
La especie animal se alimenta de manera intermitente, sin embargo sus clulas se encuentran constantemente produciendo energa, ya sea sintetizando o degradando estructuras, manteniendo el equilibrio osmtico en las membranas, conectndose unas a otras y en un sin nmero de procesos relacionados con el metabolismo intermediario. Por lo tanto cada ser vivo debe contar con tejidos de almacenamiento de energa en molculas qumicas, como son los Lpidos en el tejido adiposo, el Glicgeno en el hgado y msculos, las Protenas cuyos aminocidos se guardan como estructuras proteicas en la Albmina del sistema circulatorio y aquellas protenas que constituyen la estructura del msculo. Por otro lado tenemos diversos tejidos destinados a gastar energa y emplean una gran cantidad de ATP, para trasladarnos de un lugar a otro, relacionarnos con nuestro ambiente, filtrar los subproductos, etc. Para mantener a todos los sistemas aqu nombrados se requiere de un aporte constante de molculas a la clula misma que se obtiene mediante la constancia del medio interno u Homeostasis. De esta Forma es posible mantener una concentracin adecuada en la sangre de los distintos sustratos que requiere el metabolismo celular. Para ello debemos contar con un sistema que posea sensores, que nos permitan conocer los niveles de sustratos circulantes y de efectores representados por hormonas que por medio de finos moduladores como son las enzimas, procedan a estimular ya sea la degradacin o sntesis de sustratos para mantener el nivel circulante.
a) HIGADO
El hgado pesa alrededor de 2 a 3% del peso corporal y se encuentra mayormente constituido por el hepatocito o clula parenquimal heptica de origen epitelial. Es el intermediario entre el tracto intestinal y la circulacin, ya que recibe una gran parte de los metabolitos, excepto los lpidos por medio de la sangre venosa que proviene desde los intestinos por la vena porta y solo una pequea porcin de sangre oxigenada arterial por
608
medio de la arteria heptica. A su vez la sangre lo abandona por las venas hepticas que se conectan con la cava inferior. Su energa proviene principalmente de la oxidacin de los cidos grasos. El hgado se encuentra relacionado con el pncreas ya que responde a la Insulina y Glucagn, presentando gran capacidad de adaptacin a los flujos metablicos dependiendo de la presencia o ausencia de metabolitos regulando su flujo, por lo que su contenido de Glicgeno, protena y lpido cambian constantemente, para as mantener la homeostasis. En 24 hrs. de ayuno puede disminuir totalmente su contenido de Glicgeno al igual que al sostener un trote por cerca de 14 Km, segn el tamao de la persona. Por otro lado se puede adaptar en un da o dos a una dieta exclusiva de protenas. Por ejemplo en un da el hgado de un adulto tpico exporta 180 gramos de Glucosa, 14 gramos de Albmina y 100 gramos de Triglicrido. En el hgado se sintetizan cidos grasos a partir del Acetil-SCoA proveniente de la Glucosa ms los NADPH+H provenientes de la va alternativa de la Pentosa-P. Los que salen a circulacin como VLDL que reparten los lpidos endgenos por el organismo. por otro lado los lpidos exgenos llegan al hgado como los restos de Quilomicrn desde la periferia despus de haber salido desde el intestino por el sistema linftico. Los lpidos se absorben a nivel del intestino a la altura del Duodeno y Jejuno. Solo los lpidos de cadena corta como los que vienen en la leche, pasan directamente al sistema portal y desde all van hacia el hgado al igual que la Glucosa y los Aminocidos que entran directamente al hgado va vena porta.
Volver al inicio b) TEJIDO ADIPOSO

Los lpidos constituyen el 21% del peso corporal normalmente y se encuentran distribuidos bajo la piel, en el abdomen, alrededor de los vasos internos, en los msculos esquelticos y en la glndula mamaria. Existen dos tipos de clulas adiposas o adipocitos. Las blancas formadas por clulas que ocupan todo su citoplasma con una vacuola llena de Triglicridos que desplaza al ncleo y retculo endoplsmico hacia la periferia, mientras que las pardas presentan gotas dispersas en el citoplasma y gran cantidad de mitocondrias que le dan el color caf-rojizo. Este ltimo tejido se encuentra adaptado a la produccin de calor (termognesis) y no ATP, ya que oxida los cidos grasos hasta CO2 y H2O. Los lpidos constituyen una fuente de energa anhidra altamente reducida, mientras que los Hidratos de Carbono deben guardarse en un medio acuoso y tienen oxgeno en su estructura, por lo que se encuentran parcialmente oxidados y contienen bastante menos energa por igual peso. Los adipocitos no poseen la enzima Glicerol-Quinasa y no pueden formar Glicerol-P para constituir los Triglicridos, as que deben recurrir al Glicerol-P producido por la Gliclisis. Es decir el adipocito vive de Gliclisis y no oxida, ni sintetiza cidos grasos, solo sintetiza y degrada Triacilgliceroles, adems puede liberar Glicerol a la sangre el que s metaboliza en la Gliclisis del hgado. Al organismo se liberan tambin cidos grasos, estos ltimos se unen a la protena Albmina circulando como un complejo cido GrasoAlbmina en direccin al tejido muscular, hgado, etc.
609
Al tejido adiposo llegan los Quilomicrones del intestino y las VLDL desde el hgado trayendo principalmente Triglicridos los que se degradan por la accin de la enzima Lipoprotena Lipasa (LPL) que se encuentra en el endotelio capilar. Volver al inicio
c) MUSCULO ESQUELTICO
Las fibras musculares se encuentran divididas en tres tipos, las de contraccin rpida de metabolismo glicoltico y que dejan como subproducto c. Lctico. Se emplean para los movimientos explosivos de alta intensidad, las de contraccin rpida oxidativas y glicolticas, oxidan la Glucosa hasta CO2 y H2O, mientras que las de contraccin lenta oxidan los cidos grasos tambin hasta CO2 y H2O. Las fibras anaerbicas producen solo 2 ATPs por molcula de Glucosa y dejan c. Lctico como subproducto el cual pasa a la sangre y se dirige al hgado para ser nuevamente transformado en Glucosa, gastando 6 ATPs y constituyendo el llamado Ciclo de Cori, ya que vuelve al msculo para restaurar los niveles de Glicgeno. Por otro lado la fibra que oxida aerbicamente la Glucosa produce 36 ATPs por molcula y aquella que oxida aerbicamente cidos grasos como el Palmtico de 16 carbones, produce 129 ATPs netos. El tejido muscular sirve como depsito de glicgeno, que no sale a circulacin ya que carece de la enzima Glucosa-6-Fosfatasa que hidroliza la Glucosa-6-P, de esta manera toda glucosa que entra al msculo se deposita como Glicgeno de reserva o bien se emplea en oxidacin anaerbica o aerbica. Debido a la cantidad de masa muscular se almacena cerca de 4 veces ms Glicgeno que el hgado y ayuda a este ltimo a mantener la homeostasis. El msculo al contar con sus propias reservas de glicgeno disminuye el trabajo del hgado, sin embargo despus de un trote de unos 14 Km es posible que el msculo agote sus reservas internas de Glicgeno y necesite de aquel que se encuentra en el hgado. El msculo puede ser usado como un almacn de protenas, ya que en casos de inanicin extrema las protenas del msculo empleadas en la contraccin, se degradan y emplean sus aminocidos especialmente Alanina y Glutamina que son procesados en el hgado e intestino como precursores de glucosa para mantener la homeostasis. Volver al inicio
d) CORAZN
Es un tejido muscular altamente aerbico (emplea 15% del Oxgeno) con muchas mitocondrias, que emplea como sustrato cs. Grasos y Cuerpos Cetnicos, tambin puede dar cuenta del c. Lctico o del Piruvato que lleguen desde la musculatura esqueltica. Durante la inanicin se protege del dao tisular almacenando algo de Glicgeno y lo emplea solo en bajsimas cantidades a diferencia del corazn de los reptiles que puede permanecer horas latiendo, sin ms provisin que el Glicgeno guardado en los tejidos, que se degrada en Glucosa la cual es oxidada anaerbicamente. El tejido cardaco no contribuye a la homeostasis, solo emplea combustible para bombear sangre. A diferencia de los msculos esquelticos el Corazn no se cansa, ya que permanece aerbico haciendo correr al Ciclo Tricarboxlico todo el tiempo y no existe una disminucin
610
de la -Cetoglutarato Deshidrogenasa causada por un aumento del nivel de NADH/NAD. El corazn emplea cidos grasos eficientemente por medio de la -Oxidacin en la Mitocondria y produce Acetil-SCoA que se dirige al Ciclo Tricarboxlico y las NADH y FADH2 producidos por este, van a la Cadena de Transporte de Electrones, donde los protones generan un gradiente electroqumico para posteriormente producir ATP por medio de la Fosforilacin Oxidativa. Aqu no se produce lactato, solo CO2 y H2O. Volver al inicio
e) CEREBRO
La Barrera Hemato Enceflica impide el paso de Qm, VLDLs y cidos Grasos unidos a Albmina. Depende de nutrientes solubles en agua como Glucosa y durante la inanicin de Cuerpos Cetnicos. Emplea 20% o ms del oxgeno en oxidar Glucosa hasta CO2 y H2O.El ATP producido se emplea en mantener gradientes de potencial transmembrana abasteciendo a la enzima Na, K ATPasa. No guarda Glicgeno (solo una nfima cantidad), ni cidos grasos como combustible. Sin embargo, acepta Cuerpos Cetnicos los que para activarse a Acetoacetil-SCoA, necesitan del intermediario del Ciclo Tricarboxlico conocido como Succinil-SCoA y la enzima Succinil-SCoA: Acetotransferasa, seguida de la accin de la enzima Tiolasa corta y los convierte en Acetil-SCoA. Esta ltima molcula necesita de un compuesto de 4 carbones para entrar al Ciclo Tricarboxlico, que se denomina Oxaloacetato y proviene de la Carboxilacin con ATP y Biotina del Piruvato que a su vez se deriva de la Glucosa, obtenida en este caso de inanicin del proceso denominado Gluconeognesis. Una baja de los niveles de glucosa desde 70 o 90 mg% provoca mareos y se contina es posible caer en estado de coma. Igual cosa sucede cuando los niveles de Amonio en un hgado cirrtico sobrepasan los niveles normales, pasando este la barrera hematoenceflica y capturando el -Cetoglutarato del Ciclo Tricarboxlico, con lo cual este no se cierra y disminuye la produccin de ATP. Por otro lado los eritrocitos constituyen otro tipo de clula que necesitan exclusivamente de glucosa, ya que no tienen mitocondrias.
f) RIONES
Volver al inicio Su principal funcin es la eliminacin de catabolitos y la conservacin de metabolitos, que en casos patolgicos se pueden confundir. En los diabticos es necesario eliminar Glucosa y Cuerpos Cetnicos junto con Amonio para neutralizar o mantener el equilibrio c.-base. Durante la inanicin prolongada es capas de llevar a cabo Gluconeognesis a partir de aminocidos que provienen del msculo y a la vez se deshace del amonio neutralizando a los Cuerpos Cetnicos. Para mantener su propio metabolismo el rin emplea lpidos y cuerpos cetnicos como fuente de energa.
g) INTESTINO DELGADO
Absorcin De lo ingerido va vena porta y sistema linftico. Durante la inanicin interviene en el paso de Glutamina a Glucosa.
611
Volver al inicio
14) DIRECCIN EN QUE SE TRASLADAN LOS PRINCIPALES METABOLITOS EN EL ESTADO ALIMENTADO Y DURANTE LA INANICIN. METABOLITOS ALIMENTADO DESDE Intestinos Intestinos Intestinos Intestinos Intestinos e Hgado Eritrocitos y Miocitos Poco disponible Poco disponible Poco disponible INANICIN DESDE Hgado Msculo Msculo Muy poco disponible Muy poco disponible Eritrocitos y Msculo Adipocitos
HACIA Cualquiera parte Cualquiera parte Cualquiera parte Cualquiera parte Cualquiera parte Hgado y Corazn No aplicable
HACIA Cerebro (principalmente) Hgado Intestino No aplicable No aplicable Hgado Mayora de los tejidos Hgado Mayora de los Tejidos
GLUCOSA ALANINA GLUTAMINA OTROS AMINOCIDOS TRIGLICRIDOS LACTATO ACIDOS GRASOS LIBRES GLICEROL CUERPOS CETNICOS
No aplicable No aplicable
Adipocitos Hgado
15) PRINCIPALES ENZIMAS REGULADORAS DEL METABOLISMO INTERMEDIARIO JUNTO A SUS MODULADORES
612
ENZIMA
Va metablica
Tipo de regulacin
Modificacin Covalente
Activadores e Inductores
Ca++
Inhibidores y Represores
ATP, NADH y Acetil-SCoA
1. Piruvato Deshidrogenasa
Gliclisis Aerbica
2. Piruvato Carboxilasa 3. Piruvato Kinasa
Gluconeognes is y Lipognesis Gliclisis
Alostrico Alostrica modificacin covalente Expresin Gnica Expresin Gnica Expresin Gnica, Modificacin covalente y alostrica Expresin Gnica y alostrica Expresin Gnica alostrica Modificacin covalente Modificacin covalente expresin gnica expresin gnica alostrico
Acetil-SCoA Fructosa -1,6bifosfato Corticoesteroid es, AMPc insulina Insulina, ??? citrato
Alanina, ATP y AMPc insulina Corticoesteroid es Corticoesteroid es, AMPc, Palmitoil-SCoA
4. PEPCK (PEP Carboxiquinasa) 5. ATP: Citrato Liasa 6. Acetil-SCoA Carboxilasa
Gluconeognes is lipognesis Lipognesis
7. Fosfofructoquinas a 8. Fructosa-1,6bifosfatasa 9. Triglicrido lipasa 10. - Glicero fosfato acil Transferasa 11 enzima "mlica" 12. c. Graso Sintasa 13. Isocitrato dehidrogenasa (NAD-linked) 14. Oxoglutarato dehidrogenasa (
gliclisis
Insulina, AMP, Corticoesteroid Fructosa-2,6-bi es ATP, citrato P corticoesteroide s ATP, citrate AMPc insulina AMP, F-2,6-bisP AMPc
Gluconeognes is liplisis lipognesis
lipognesis lipognesis Ciclo de Krebs
insulina insulina ADP, calcio
Corticoesteroid es Corticoesteroid es ATP, NADH. NADPH -
Ciclo de Krebs
alostrico
Ca
613
Alfacetoglutarato deshidrogenasa) 15. Glutamato deshidrogenasa 16. Carbamil Fosfato sintasa 17. Glicgeno Fosforilasa 18. Glicgeno sintasa 19. Glucoquinasa (Hgado, pncreas con clulas 20. Glucose-6phosphatase (liver only) 21. HMG-CoA reductasa excrecin de nitrgeno excrecin de nitrgeno glicgeno n de glicgeno sntesis de glicgeno control de glucosa en la sangre cont. glucosa en la sangre sntesis de colesterol Ciclo de Krebs expresin gnica y alostrico modificacin covalente, alostrica modificacin covalente, alostrica expresin gnica alostrico N-Acetil glutamato AMPc, calcio, 5'AMP Glucosa-6fosfato insulina ATP, GTP -
AMPc, calcio
cortisol, AMPc
expresin gnica expresin gnica
cortisol, AMPc
insulina
insulina, tiroxina
Glucagn, cortisol, colesterol
Volver al inicio
REFERENCIAS
Proton-Translocating Cytochrome Complexes. , M.Wikstrom ,Kraband and M.Saraste., Ann.Rew. Biochem. ,Vol. 50, 623-625,1981. Enzimology of Oxygen., Bo G. Malmstrom., Ann.Rew. Biochem.,Vol 51, 21-59, 1982.
614
Proton ATPases: Structure and Mechanism., L.M.Amzel and P.L. Pedersen Ann.Rew.Biochem., Vol 52, 824-855,1983 The Mitocondrial Electron Transport and Oxidative Phosphorylation System., Y. Hatefi., Ann. Rew. Biochem. Vol 53, 1015-1069,1984 Reactive Oxygen Intermediates in Biochemistry., A.Naqui,B.Chance and E. Cardenas Ann. Rew. Biochem.,Vol 55,1986 El Acoplamiento de las Mitocondrias. R. Durand., Mundo Cientfico, No 57, 376-385,1986 Oxidative Stress, http://www.agronomy.psui.edu/Courses/AGRO518/Oxygen.htm The mechanism of proton pumping by cytochrome c oxidase. Michel, H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12819-12824 (1998) Cytochrome c Oxidase: Catalytic Cycle and Mechanisms of Proton Pumping-A Discussion. Michel, H. Biochemistry, 38, 15129-15140 (1999)
615
Hctor Rocha L. DNA
DNA 1 1) ACIDOS NUCLEICOS 656 658 661
2) LAS BASES NITROGENADAS
3) SINTESIS DE LAS BASES NITROGENADAS a) Sntesis de las Purinas 661 b) Biosntesis de las Pirimidinas 664
4) DIFERENCIAS ENTRE LA SINTESIS DE PURINAS Y PIRIMIDINAS 667 5) NUCLETIDOS 667
6) REGULACIN DE LA SNTESIS DE LAS BASES NITROGENADAS 7) VIAS DE RESCATE DE LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS 8) DEGRADACION DE LAS BASES NITROGENADAS 675
676
9) ALGUNOS TRASTORNOS EN EL METABOLISMO DE LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS 679 10) DNA 684
a) Estructura primaria 684 b) Estructura secundaria 684 c) Estructura terciaria 685 d) DNA tipo B 686 e) DNA tipo-A 686 f) DNA tipo-Z 686 11) DNA CRUCIFORME 688
12) DNA PRESENTE EN MITOCONDRIAS, CLOROPLASTOS Y DNA VIRAL 688 13) PROPIEDADES DEL DNA a) En solucin 691 b) Temperatura 691 c) Hibridizacin 691 d) Absorcin de luz 692 e) Reparacin 692 f) Daos que puede experimentar g) Mutaciones 694 h) Daos por luz UV 696 691
693
653
Hctor Rocha L. DNA
DNA 2 14) REPLICACION DEL DNA a) iniciacin 701 b) elongacin 702 c) terminacin 703 15) RNA 704 706 706 698
16) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE RNA Y DNA EN EUCARIOTES 17) TRANSCRIPCION DEL DNA EN PROCARIONTES Y EUCARIONTES 18) PROCESAMIENTO DEL TRANSCRITO PRIMARIO O RNAhn 19) RNAr 20) RNAt 717 718 721 722 714
21) LOS RIBOSOMAS
22) SINTESIS DE PROTEINAS
23) PROCESAMIENTO DE LAS PROTEINAS RECIEN SINTETIZADAS 24) ALGUNAS CARACTERISTICAS DEL GENOMA HUMANO 25) DESARROLLOS POSTERIORES 732 728
726
654
Hctor Rocha L. DNA
1) ACIDOS NUCLEICOS. En los captulos precedentes se describi el metabolismo de los carbohidratos, los lpidos y los aminocidos. Corresponde ahor, el estudio de los Acidos Nucleicos tanto DNA como
655
Hctor Rocha L. DNA
RNA, para completar as el concepto que involucra la dinmica de las macromolculas biolgicas. En este caso especfico nos referirmos a la capacidad para guardar, mantener y pasar la informacin, adaptndola al medio externo por medio de su descendencia. El Acido Desoxirribonucleico o Deoxiribonucleico (ADN: castellano, DNA: ingls), se encuentra protegido en el ncleo de la clula eucarionte, por una estrecha interaccin con ciertas protenas ricas en Lys y Arg (bsicas) denominadas histonas. Mientras que en los organelos, como la mitocondria de la clula animal y el cloroplasto de la clula vegetal, se le encuentra desnudo, es decir, sin histonas. En esta misma, forma se le encuentra en procariontes, que no poseen ncleo y donde el DNA exciste en la forma de un cromosoma circular. Por otro lado, es tambin posible encontrarlo al interior de las bacterias en la forma de uno o varios DNAs circulares llamados plasmidos o plasmidios. Estos ltimos pueden reproducirse de forma independiente al cromosoma principal. Porotro lado, las partculas virales tienen su cido nucleico como DNA o RNA, el cual se encuentra protegido por una envoltura o cpside. El DNA es donde radica la herencia, ya que todas las protenas se encuentran codificadas en l. Esto significa que una tira lineal de DNA, no solo guarda la informacin de la estructura primaria de las protenas, sino que tambin se encuentran implcitas sus interacciones espaciales. El DNA en s, esta formado por una doble hebra de polideoxiribonucleotidos. A su vez cada hebra est formada por la unin entre los Deoxiribonucletidos mediante enlaces fosfodiester. La interaccin que mantiene juntas ambas hebras depende de los enlaces hidrgeno, entre las bases nitrogenadas pertenecientes a los Deoxiribonucletidos de cada hebra. A su vez las bases de cada una de las hebras, se apilan unas sobre ejerciendo interaccin hidrofbica entre ellas. El DNA, posee distintas estructuras espaciales o estructuras promedio, que pueden variar de un tipo al otro dependiendo del grado de hidratacin y la identidad de las bases alternadas en ambas hebras. De esta manera su grado de torsin puede ser levgiro o dextrgiro, con distintos anchos y sus formas se denominan tipo A, B, C, D, T y Z. Los procesos en que se encuentran involucrados los cidos nucleicos en la clula son bastante variados e incluyen la Replicacin misma de la molcula de DNA, la Transcripcin de su mensaje a otra hebra, esta vez formada de polirribonucletidos o RNA y la Traduccin de este mensaje lineal a una secuencia aminoacdica que adquirir una estructura tridimensional en una protena. Otro de los cidos nucleicos es el RNA, que es capaz de presentar las ms variadas funciones estando constituido tan solo una hebra de Poliribonucletidos. Esta hebra se puede plegar y aparear consigo misma, alcanzando una determinada estructura espacial con varios bucles, sin llegar nunca a la forma helicoidal como el DNA, debido a la presencia del grupo OH en la posicin 2 de la Ribosa. Una de las principales funciones del RNA, es hacer de molcula intermediaria (RNAm) entre la informacin contenida en el DNA y el punto de ensamblaje de las protenas, donde la informacin se traduce en las cadenas polipetdicas de secuencia especfica. Entre sus otras funciones, se encuentra la transferencia de aminocidos a los puntos de ensamblaje proteico en los poliribosomas (RNAt) y, adems su capacidad de actuar como un heteropolmero estructural en el ribosoma mismo (RNAr). Aqu interviene en el reconocimiento y la fijacin del RNA mensajero al Ribosoma. Nuevas funciones del RNA han sido descritas ltimamente y entre ellas se encuentra la actividad enzimtica del RNA mismo, representada por las Ribozimas o enzimas polimerizantes de nucletidos formadas por secciones de RNA no codificante, denominadas Intrones y que pertenecen al transcrito primario o RNA Heteronuclear (RNAhn) conocido como RNA naciente o recin transcrito del gen en los Eucariontes.
656
Hctor Rocha L. DNA
Entre otras funciones del RNA, se le atribuye la propiedad de actuar como catalizador de la formacin del enlace peptdico durante la sntesis de protenas en el Ribosoma. Una de sus sus facultades es el control de la expresin de los genes en Eucariontes, la que estara mediada a su vez por genes que solo se expresan como RNA y no protenas. Estas secuencias seran capaces de aparearse con el UNAM, para evitar su lectura por los ribosomas. Otro de estos mecanismos mediados por el RNA, ocurrira mediante el apareamiento o hibridizacin con la hebra con sentido del DNA, para as impedir su lectura por la RNA polimerasa y la expresin de determinados genes. Volver inicio al
2) LAS BASES NITROGENADAS. As como los aminocidos son los ladrillos o heteromonmeros que forman una protena, los nucletidos son los heteromonmeros que estructuran a un polinucletido de DNA o RNA. La secuencia y orden de las bases nitrogenada entregan la identidad a las secuencias de los
657
Hctor Rocha L. DNA
cidos nucleicos. La sntesis de las bases nitrogenadas ocurre "de novo", lo que significa a partir de cero, ya que se emplean los aminocidos como precursores, Fig. 1-14.
PRECURSORES E IDENTIDAD DE LAS BASES NITROGENADAS PURINAS Asp CO 2
6
ADENINA NH 2 6 C 5 N C C 4 7 N GUANINA O C HN C C N N CH
10
7
1
5
CH8
2 HC N 3
10
N H 9
C HN 2
N - Formil - F H 4
Gly
N - Formill - F H 4
N H
2 4
PIRIMIDINAS Gln Gln
1
Carbamil - P CITOSINA NH 2 C 4 CH5 CH 6 N 1
2
Asp
URACILO O C N O C N CH CH O N C
TIMINA O C C CH N CH 3
3 N 2 O C
Fig. 1 - 14. Los aminocidos son los precursores de las Purinas y Pirimidinas. Las Purinas se construyen sobre el anillo de Ribosa activado como Fosfo-Ribosil-Pirofosfato (PRPP). En primer lugar se adiciona el grupo del Amino (1) de la Gln que entra al PRPP, seguido del esqueleto de la Gly (2) y el grupo Formilo (3) aportado por el c. Flico (FH4). A continuacin, entra otro grupo Amino aportado por una nueva Gln (4), acompaado por el cierre del anillo con ATP (5). Luego se contina con la incorporacin de un CO2 (6), ms un grupo Amino aportado por el Asp (7) y finalmente otro Formilo (8), aportado por el c. Flico, ms el cierre del segundo anillo y formacin del Ac. Inosnico ( Inosina -Ribosa - Fosfato). Por otro lado, las Pirimidinas se forman a partir del Carbamil-P citoplasmtico (1) con el aminocido Asp (2), formando el Carbamil Aspartato, que se cierra para formar el anillo por medio de una deshidratacin y posterior oxidacin con NAD, entregando el Ac. Ortico. A este ltimo se le agrega Ribosa en la forma de PRPP, para dar finalmente el c. Orotidlico (OMP) precursor de Uracilo, Citosina y Timina.
En cuanto a las bases nitrogenadas aportadas por la dieta, estas no se utilizan ya que pueden haber sufrido alguna modificacin previa y seguro aumentar el riesgo de producir mutaciones al ser incorporadas al DNA o al RNA. Por otro lado, algunas de estas bases son transformadas por las bacterias intestinales en ac. rico y Amonio que puede ser absorbido y luego excretado en los productos de deshecho. ESQUEMA GENERAL DE LA SNTESIS Y SALVATAJE DE LOS NUCLETIDOS DE PURINA Y PIRIMIDINA
658
Hctor Rocha L. DNA
SNTESIS DE LAS PURINAS Gln PRP Gly N5,N10 Metenil-FH4
VIA DE SALVATAJ E Gln

-
Hipoxantina
Guanina
PRPP
HCO3
Asp
HGPRT PP
N10 Formil-FH4 C- P Asp PRPP Ortico OMP

-
HCO3
UMP AMP Fosforilacin ADP
IMP
Asp Gln
GMP
CDP
CTP Gln
UTP
UDP
GDP
SNTESIS DE LAS PIRIMIDINAS NDPs

Complejo Ribonucletido Difosfato Reductasa
Metilacin del Uracilo por N5,N10 Metilen-FH4 P dTMP

Timidilato Sintasa
NTPs
RNA
dUMP
dNDP Fosforilacin dTDP dTTP dATP DNA dGD dCDP dGTP dCTP
ATP
ADP
dADP
Otra de las vas que aporta bases nitrogenadas corresponde al rescate de bases, que ocurre a partir del DNA o RNA endgeno que ha sido metablicamente degradado. En este caso las Purinas como bases libres pueden ser unidas a la Ribosa activada, como Fosfo-RibosilPirofosfato (FRPP) para formar el correspondiente nucletido y las Pirimidinas son rescatadas a nivel de los Nuclesidos los cuales con ATP se vuelven a fosforilar, como se observar en detalle ms adelante. El costo energtico de la sntesis de novo de las Purinas y Pirimidinas
659
Hctor Rocha L. DNA
es alto, por lo tanto el reciclaje es menos costoso y a su vez tiene un efecto regulador sobre la va de sntesis inhibindola. Las Purinas forman como producto de excrecin c. rico que es parcialmente soluble y 2/3 del que se produce diariamente es excretado por el rin y solo 1/3 es excretado por el intestino. En contraste las Pirimidinas no tienen un solo producto de excrecin definido, sino que varios siendo todos ellos solubles como la -Alanina y el cido -Aminoisobutrico, junto a Amonio y CO2. CMO SE RELACIONA LA VITAMINA B12 CON EL CIDO FLICO? La vitamina B12 se necesita para que el Metil-THF pase su grupo metilo a la Cobalamina para as formar Metil-Cobalamina. Sin B12 se acumula todo el cido flico bajo la forma de Metil-THF, mientras que los niveles de THFdisminuyen. De esta manera no existir THF libre para ser destinado a formar N5, N10 Metenil THF y N10- Formil-THF, que intervienen en la sntesis de las Purinas y el otro compuesto N5, N10 Metilen-THF, empleado durante la sntesis de Timina, lo que a su vez impide la sntesis de los cidos Nucleicos. Esta carencia de disponibilidad se traduce en una incapacidad para dividirse de parte del ncleo de los eritroblastos, ya que no disponen de una reserva adecuada de Purinas y Timina para formar Deoxiribonucletidos y permitir la replicacin del DNA. La consecuencia de esta falta provoca la enfermedad denominada Anemia Perniciosa. Esta es del tipo megaloblstica (eritrocitos de gran tamao, ya que no se dividen sus precursores). Por otro lado la falta de Metil Cobalamina, no permite la formacin de Metionina a partir de Homocistena en el metabolismo de los aminocidos. POR QU LAS PIRIMIDINAS NO TIENEN VIA DE SALVATAJE? En las Purinas el salvataje se produce a nivel de las bases nitrogenadas Hipoxantina y Guanina, mientras que en las Pirimidinas este proceso no es tan importante y ocurre a nivel de los Nuclesidos. Esto se debe a que las Purinas forman productos de degradacin parcialmente solubles, que al acumularse cristalizan y producen dao (c. rico), mientras que las Pirimidinas forman compuestos de degradacin totalmente solubles. PORQU EL DNA TIENE TIMINA Y EL RNA PURINA? a) Una de las razones se debe a que la base Uracilo del RNA no es lo suficientemente especfica en su apareamiento, mientras que la misma base metilada como Timina s lo s y aparea solo con Adenina. De esta manera se gana en estabilidad y se evita la formacin de bucles en un DNA mal apareado, preservando la fidelidad en la replicacin. b) Por otro lado el DNA, es en general metilado para preservar su integridad ya que lo hace de esta manera irreconocible a ciertes Nucleasas que puen ser aporatdas mediante partculas virales o bacterias c) La adicin de un grupo metilo hace al DNA que sea ms hidrofbico y menos expuesto a cambios en el solvente. En especial el grupo metilo de la Timina es repelido por el agua hacia una cierta posicin escondida en la hendidura mayor. De
660
Hctor Rocha L. DNA
esta manera la Timina se encuentra menos expuesta a la interaccin con otras bases, al ser su base precursora Uracilo un tanto promiscua en su apareamiento en el RNA. Volver inicio al
3) SINTESIS DE LAS BASES NITROGENADAS. a) Sntesis de las Purinas . El Fosfo-Ribosil-Pirofosfato (FRPP) es una Ribosa activada con ATP, con un Fosfato en la posicin del carbono 5, mientras que en el carbono 1 se halla el Pirofosfato, (Fig. 2 - 14). En este ltimo carbono activado (posicin 1), se recibe al grupo Amino, donado por la Glutamina con salida del Pirofosfato, denominndose ahora como 5-FOSFO-RIBOSIL-1-AMINA (PRA). A continuacin se procede la adicin del aminocido Glicina, activado previamente con ATP en la forma de un acilfosfato, el cual se une al grupo anterior 1-Amino. Una vez que sale el fosfato activador de la Glicina, se forma la GLICINAMIDA RIBONUCLETIDO (GAR). En la etapa siguiente el grupo amino de la Glicina es formilado por el N10- Formil-FH4, para formar la -N-FORMILGLICINA RIBONUCLETIDO (FGAR). A continuacin la Glutamina con ATP, dona su Nitrgeno en la posicin , al carbonilo de la Glicina ya incorporada, para as formar la -N-FORMILGLICINAMIDINA RIBONUCLETIDO (FGAM). Posteriormente se cierra el anillo con la energa del ATP, formando el 5'-AMINOIMIDAZOL RIBONUCLETIDO (AIR). De esta manera queda formado el primer anillo de la Purina. A continuacin se carboxila sin Biotina y con -HCO3, para dar origen al 4-CARBOXI- 5AMINO-IMIDAZOL RIBONUCLEOTIDO (CAIR). Luego, el Aspartato con la ayuda de ATP dona su grupo amino para formar el N-SUCCINO-5-AMINOIMIDAZOL-4-CARBOXAMIDA RIBONUCLEOTIDO (SAICAR), el que posteriormente se descompone liberando c. Fumrico, para quedar en la forma de 5-AMINOIMIDAZOL-4-CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (AICAR). Posteriormente, este ltimo intermediario, recibe otro carbono por la N10-Formil-FH4, para formar un nuevo compuesto, el N-FORMILAMINO-IMIDAZOL-4-CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (FAICAR). Luego, se cierra el anillo con salida de agua, para quedar sintetizado el precursor llamado c Inosnico, INOSINATO o IMP. Una vez sintetizado el doble anillo de la Inosina sobre la Ribosa-Fosfato o IMP (c. Inosnico), la va biosinttica se bifurca para dar origen al Adenilato (AMP) y Guanilato (GMP), (Fig. 3 - 14). En el caso del AMP, el Aspartato deja su Amonio en la posicin 6 del doble anillo saliendo nuevamente como Fumarato y en el caso del GMP, se produce la oxidacin del IMP con NAD en el carbono 2, para quedar como Xantilato o XANTINA MONO FOSFATO (XMP). Este ltimo, al recibir Amonio aportado por la Glutamina, se convierte en Guanilato o GUANINA MONOFOSFATO o GMP (Fig. 3 - 14). Finalmente por medio de la accin de las Fosfoquinasas los nucletidos monofosfato GMP y AMP, pueden pasar a formar los respectivos Nucletidos Trifosfato GTP y ATP.
661
Hctor Rocha L. DNA
Nombre de cada una de las enzimas y productos que participan en la sntesis de las Purinas de la figura 2-14: NMERO 1 2 3 ENZIMA FOSFORIBOSIL PIROFOSFATO AMIDOTRANSFERASA GAR SINTASA GAR TRANSFORMILASA COMPUESTO FORMADO 5-FOSFO-RIBOSIL-1-AMINA ( PAR) GLICINAMIDA RIBONUCLETIDO (GAR) -N-FORMILGLICINA RIBONUCLETIDO (FGAR) -N-FORMILGLICINAMIDINA RIBONUCLETIDO (FGAM) 5'-AMINOIMIDAZOL RIBONUCLETIDO (AIR) 4- CARBOXI-5-AMINOIMIDAZOL RIBONUCLETIDO (CAIR) N-SUCCINO-5-AMINOIMIDAZOL4-CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (SAICAR) 5-AMINOIMIDAZOL-4CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (AICAR) N- FORMIL AMINO IMIDAZOL-4CARBOXAMIDA RIBONUCLETIDO (FAICAR) AC. INOSNICO (I M P)
FGAR AMIDOTRANSFERASA
FGAM CICLASA
AIR-CARBOXILASA
SAICAR-SINTASA
SAICAR-LIASA
AICAR -TRANSFORMILASA
10
I M P Sintasa
662
Hctor Rocha L. DNA
2H 2
P R P P OPOCH2
H
H
O
1
O
2H 3O P O C H 2
H H H O
1
H
N H2 H H O H ATP + G ly
2H 3O P O C H 2
N
H H O H
C O
H H H O ADP + Pi
C H 2
N H 3 2
H N H C O C N H R ib o s a - P
F o r m il - G lic in a m id a R ib o n u c le t id o (F G A R )
C H O
O P O PO H
OH OH OH G ln
H O G lu + PPi
PRPP s in ta s a
N , N - M e te n il- F H 4
10
F H 4
R ib o s a - 5 - P + ATP
5 - P - R ib o s il -1 A m in a (P R A )
G lic in a m id a R ib o n u c le t id o (G A R )
G ln ADP + Pi C O 2
ATP ATP
H O O C C H H C 2 H O O C
N -S u c c in o 5 -A m in o im id a z o l 4 -C a r b o x a m id a R ib o n u c le t id o (S A IC A R )
O C N H H N 2 C C N
ADP + Pi
A sp + ATP
+ G lu
4
H N C H O N H R ib o s a - P C
ADP + Pi
H O O C C H C N C H N H C N C H N H C C H N 2
R ib o s a - P
H N 2
H N
R ib o s a - P
R ib o s a - P
5 -A m in o im id a z o l R ib o n u c le t id o (A IR )
8
F u m ar at o
4 -C a r b o x ila to 5 A m in o im id a z o l R ib o n u c le t id o (C A IR )
O C H N 2
5 -A m in o im id a z o l 4 -C a r b o x a m id a R ib o n u c le t id o (A IC A R )
10
N -F o rm il-F H 4
F H 4
O C
H O 2
O C HN HC
F o r m ilg lic in a m id in a R ib o n u c le t id o (F G A M R )
C C
N C H N
H N 2
R ib o s a -
N -F o r m ila m in o -Im id a z o l 4 -C a r b o x a m id a P R ib o n u c le t id o (F A IC A R )
HN 2 O C H
C C N H
N C H N
C C
N C H N
10
R ib o s a - P
N H
R ib o s a - P
c . In o s n ic o o I M P
Fig. 2 - 14. Sntesis de las Purinas a partir de PRPP (Pirofosfato va en el carbono 1 de la Ribosa y en el carbono 5 el Fosfato), ATP y los aminocidos precursores.
663
Hctor Rocha L. DNA
HO 2 + NA D O C HN HC N
+ H + NA DH
O C HN C O N C N
Gl n + ATP
Gl u + A MP + P P HN
O C C N CH
CH C N
C N XM P HN C N 2 A m inasa
Ribosa - P IM P Deshidro genasa Ac. Xantlico C N CH C N
Ribosa - P GMP
I MP o Ribosa - P A c. Inosnico A s p + GT P GDP + P i HOOC CH CH COOH 2 C HN HC N C N CH C N Fum arato Ribosa - P A c. A denilosuccnico AMP NH A denilo 2 Succinato C Liasa HN C N CH HC N C N Ribosa - P
A denilo Succinato Sintasa
Fig 3 - 14. Paso del IMP a AMP con Amonio del c. Asprtico y paso del IMP a GMP por oxidacin y posterior adicin del Amonio perteneciente a la Glutamina con ATP.
b) Sntesis de las Pirimidinas (Fig. 4 - 14). En la biosntesis de las PIRIMIDINAS, se sintetiza primero el anillo y despus se lo une a la Ribosa activada. El Carbamil - Fosfato es uno de los precursores del anillo de las Pirimidinas y se forma en el citoplasma, sin relacin con la molcula producida por la mitocondria en el resto del organismo, con excepcin del Hgado, donde la Carbamil-P Sintasa perteneciente al Ciclo de la Urea, puede aportar algo del Carbamil-P para la sntesis de las Pirimidinas cuando este es exportado al Citosol. El otro precursor es el c. ASPARTICO, (Fig. 4 -14). La primera reaccin de la va, es la unin del CARBAMIL-FOSFATO y c. ASPARTICO para dar origen al c. CARBAMIL-ASPARTICO. Esta molcula posteriormente se deshidrata, cerrndose el anillo y pasa a formar el c. L-DIHIDRO-OROTICO, que se oxida con FAD para convertirse en c. OROTICO. Este ltimo recibe el anillo de la Ribosa activada, como 5-Fosforibosil-1-Pirofosfato, para formar la Orotidina-5-Fosfato o c. OROTIDILICO (OMP) con salida del Pirofosfato y posterior hidrlisis. El OMP por descarboxilacin dar
664
Hctor Rocha L. DNA
origen al URIDILATO, tambin llamado URIDINA MONO FOSFATO o UMP. Una vez formado, se le adicionan dos fosfatos en dos reacciones sucesivas con ATP para dar el UTP o URIDINA TRIFOSFATO. Esta molcula al recibir un amino de la Glutamina activada con ATP, forma finalmente la CITIDINA-5-TRIFOSFATO (Fig. 4 - 14). Como se puede observar esta va de sntesis es lineal sin mayores bifurcaciones como ocurre con las Purinas.
Nombre de las enzimas y productos involucradas en la sntesis de las Pirimidinas (Fig. 4 14): NMEROS ENZIMAS 1 CARBAMIL- FOSFATO SINTASA II ACTI 2 ASPARTATO VIDADES TRANSCARBAMILASA 3
ENZIM-
DIHIDROROTASA
TICAS EN UN SOLO COMPLEJO
PRODUCTOS CARBAMIL-P (CP) CARBAMIL- ASPARTATO (CA) DIHIDROOROTATATO (DHO)
4 5
Dihidrorotato deshidrogenasa Orotato Fosforibosil Transferasa
Orotidilato Descarboxilasa
7 8 9
UMP Quinasa Nuclesido Difosfoquinasa CTP sintasa
OROTATO OROTIDINA MONO FOSFATO (OMP) URIDINA MONO FOSFATO (UMP) URIDINA DIFOSFATO (UDP) URIDINA TRIFOSFATO (UTP) CITIDINA TRIFOSFATO (CTP)
(O)
Volver inicio
al
665
Hctor Rocha L. DNA
Carbamil - P
O H N C O PO3H2 2 1
-
O Ac. A s p a r t i c o HO C CH C HN 2 H 2 COOH Pi O HO HN 2 C
O C
Ac. N Carbamil Asprtico

HO 2 CH C H 3 COOH O FAD FAD HN C
Ac. Dihidro-ortico
O C C H2 C H N H COOH
N H
HCO3 + Gln + ATP (U D P)

HN C O N O C ADP CH CH 7 O
(U M P)
ATP HN C
O C CH CH N
2H3OP
(O M P)
CO 2 6 O O C H2 O H HO OH HN C
O C CH C N HN 5 COOH O C N H PP i 2 FADH 2 PRPP O C
CH C COOH
ATP ADP
Ribosa - O P2 O6 H3 8 O C CH CH N
Ribosa OPO3H2
Uridina - 5' - Di - P
Gln + ATP 9
Uridina -5' - P
NH
Orotidina - 5' P o c. Orotidlico
Ac. Ortico
(U T P)
HN C O
Glu + A D P + Pi H N C O
(C T P) C
2 CH CH
N Ribosa - O P3 O9 H4
Ribosa - O P3 O9 H4
Uridina - 5' - Tri - P
Citidina - 5' - Tri - P
Fig. 4 - 14. Biosntesis de las Pirimidinas a partir de Carbamil-P y Aspartato. Las enzimas reguladoras se encuentran en un rectngulo oscurecido.
666
Hctor Rocha L. DNA
4) DIFERENCIAS ENTRE LA SINTESIS DE PURINAS Y PIRIMIDINAS.
PURINAS Representadas por Adenina y Guanina, tanto en el DNA como en el RNA. Su nico anillo se sintetiza inmediatamente sobre la Ribosa activada como 5-Fosfo-Ribosil-1-Pirofosfato. El cido Flico se emplea para adicionar carbono como Metenilo y Formilo
PIRIMIDINAS
Representadas por Timina, Citosina y Uracilo El DNA tiene TIMINA y CITOSINA. El RNA tiene URACILO y CITOSINA. Ambos anillos se sintetizan primero y despus se unen a la Ribosa activada como 5-Fosfo-Ribosil-1-Pirofosfato Una vez formado el anillo del URACILO, el c. Flico se emplea para adicionar el grupo Metilo al nucletido dUMP que se transforma en dTMP Sus precursores son el c. Asprtico, la En su sntesis solo se emplea Glicina, dos Glutaminas, CO2 y dos c. Glutmico y Carbamil Fosfato grupos Formilos A partir de la IMP se bifurcan en la va para El c. Orotidina-5- Fosfato (OMP) es la sntesis de AMP y GMP precursor directo de UMP y CMP
Volver inicio
al
5) NUCLEOTIDOS Los Nuclesidos estn formados por una base nitrogenada ms el azcar, mientras que los Nucletidos tienen la base nitrogenada, el azcar y uno o ms fosfatos en la posicin 5. Tanto el producto final de la sntesis de las Purinas como de las Pirimidinas es el nucletido Monofosfato. En la figura 5 - 14, se pueden observar las bases nitrogenadas Adenina y Guanina junto a sus nuclesidos y nucletidos, los que se encuentran dispuestos en la forma SIN. Esto significa que el C-5' del azcar tiene un Fosfato al mismo lado que la posicin en que se encuentra el doble anillo de la base nitrogenada (Figs. 5 - 14 y 6 - 14). Cuando se encuentran en la forma opuesta se denominan ANTI. El azcar de los Nuclesidos puede ser Ribosa o (Desoxi) Deoxiribosa y los fosfatos en el Nucletido pueden estar en nmero de 1 a 3. Con 3 fosfatos es cuando la molcula contiene la mayor energa. Los fosfatos se ordenan de adentro hacia fuera, es decir desde el C-5' del azcar hacia su extremo y se denominan Fosfatos (C-5'-O-PO3H2), (C-5'-O-PO2-O-PO3 H2) y (C-5'-O-PO2-O-PO2-O-PO3H2), luego el ms externo es l .
667
Hctor Rocha L. DNA
NH C
NH 2 C C N CH N HC N HOH C 2 C
2 C C N CH N
HO
NH C N
2 C C N CH N
NH C
2 C C N CH
6
N H2 C
7
N CH N H
HC HOH C 2
1N 2H C
N
5C 4C 3
ADENINA
N O H H
O P O O
HC N
H C 2
N
O HO P O
HC N
H C 2
4
H
1
H H
O H H H HO H
O H H H HO OH
H H HO
O H H H
3 2
HO OH
6 - Aminopurina
Adenosina
Deoxiadenosina
Ac. Adenlico
Ac. Deoxiadenlico
O O C HN C HN 2 N GUANINA H HO C C HN N CH N C HN 2 HOH C 2 H N O H H OH H C N C C N CH HN 2 HOH C 2 HN C
O C C C N N CH N
HO
O C HN C C N O H H HO OH H H N CH C HN 2
O H C 2
O C HN C C N N CH C HN 2
O H C 2
O P O
N
HO
O P O
O H H H HO H
O H H H HO H
2 - Amino - 6 - ceto purina
Guanosina
Deoxiguanosina
Ac. Guanlico
Ac. Deoxiguanlico
Fig 5 - 14. Bases Pricas junto a sus Nucletidos y Deoxiribonucletidos
668
Hctor Rocha L. DNA
N H N H
2 C H C H
N H C N C O N
2 C H C H O
N H C N
2 C H
N H C N
2 C H C H
4 3
O N C
2 C C H C H N N
5 6
H O H 2 C O H H H O H
O
C N
H O P O O H 2 C
C O N
C H O H O P O O
H 2 C
C O N
1 C IT O S IN A
H O H 2
C O H H H H O H
O H H H O H H O H
O H H H O H H H
H O H
2 - C e to - 4 A m in o P ir im id in a
O C
C itid in a
O C
D e o x ic itid in a
O C
A c . C itid lic o
C M
H N
C O N C H C H O
P
O C
A c .D e o x ic itid lic o d C M P
O C C H C H N H O O P O O H C 2
HN
C N
C H C H O
HN
C N
C H C H
O H O P O O H 2 C O
HN
C
HN
C N
C H C H
H O H 2
C O H H H O H H O H
H O H 2
C O H H H H O H
O H H H O H H O H
O H H H H O H
U R A C IL O
2 , 4 - D ic e to p ir im id in a
O C
U r id in a
S e u d o u r id in a
O C
A c . U r id lic o U M P
C H 3 O H O P O O H 2 C
A c . S e u d o u r id lic o O d U M P
C
H N
C C H C O N H O
C C H
C H
H N
C O N
C C H
C H
H N
C O N
H O H 2
C O H H H H O H
O H H H O H H H
T IM IN A
H
2 , 4 - D ic e to - 5 M e t il P ir im id in a
d -T im id in a o D e o x itim id in a
A c.
T im id lic o
d T M P
Fig. 6 - 14. Bases Pirimidnicas con sus respectivos Nuclesidos y Nucletidos.
669
Hctor Rocha L. DNA
En la Figura 6 - 14, se pueden observar los Nucletidos y Nuclesidos de las bases Citosina, Uracilo y Timina. Es importante destacar que los nucletidos de la Timina son solo del tipo Deoxi.
670
Hctor Rocha L. DNA
Los Nucletidos, fuera de constituir los cidos nucleicos son empleados en otras actividades y entre ellas tenemos: a) la activacin de sustratos, como es el caso de la UDP-Glucosa y el CDPDiacilglicerol o la CDP-Colina. b) como parte de los cofactores vitamnicos en las coenzimas NAD, FAD, la Deoxiadenosilcobalamina (B12) y la Coenzima A. c) Cmo segundos mensajeros en las cascadas de amplificacin AMPc y GMPc. Los Ribonucletidos en la forma nucletido difosfato (NDP), son los precursores de los deoxiribonucletidos (dNDP), que son necesarios en la forma de dATP, dGTP, dCTP y dTTP para la sntesis del DNA. As tenemos que la enzima RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA de la figura 7 - 14 se encuentra activada en las clulas mitticas y cataliza la Deoxigenacin de la D-Ribosa a D-Deoxiribosa, por medio de la reduccin directa del OH a H, sin cambios en la configuracin del azcar.
Complejo de la Ribonucletido Difosfato Reductasa donde ocurre la reduccin del 2OH de la Ribosa a 2H en la Deoxiribosa. Solo los Nuclesidos Difosfato son los sustratos del Complejo.
ADP CDP GDP UDP
NADPH+ H
+
FAD
2 Fe + 2
T
Tioredoxina
S S
Ribonucletido Reductasa
E SH SH S E S
NADP
Tiorredoxina Reductasa
F A D H2 Fe + 3
SH SH
d ADP d CDP d GDP d UDP
Fig 7 - 14. La actividad denominada Tiorredoxina Reductasa es parte del Complejo y acta sobre los grupos 2'- Hidroxilos de los Ribonuclesidos Difosfatos.
. El sistema enzimtico de la figura 7 - 14, pertenece al E. Coli, siendo similar en sus caractersticas principales al de los Eucariontes. Este sistema cuenta con un dador de protones como el NADPH + H, un transportador como FAD, hierro no Hemnico como transportador de electrones y la protena Tiorredoxina de PM. 12kD. Esta protena contiene un par de Cys formando un puente disulfuro entre sus estados reducido y oxidado. El Complejo de la Ribonucletido Reductasa, toma los hidrgenos reversiblemente de ambas Cistenas de la Tiorredoxina y con sus propios grupos Tioles o SH procede a la reduccin de la Ribosa A continuacin la enzima Timidilato Sintasa (Fig. 8 - 14), tiene por funcin catalizar la reaccin en que el Deoxiuridilato (dUMP) pasa por metilacin a Deoxitimidilato (dTMP). Se emplea en este caso la coenzima que contiene c. Flico (THF) como transportador de carbono, en la forma de N5, N10- Metilen -Tetrahidrofolato. Esta coenzima despus de entregar el Metilo, queda como c. Dihidroflico (DHF). Para llegar nuevamente a este ltimo compuesto funcional se lleva a cabo una reduccin con la enzima Dihidrofolato Reductasa y NADPH + H. En la reaccin de carga del metilo, como metileno al c. THF, es tambin necesaria la Vitamina B12 o Cobalamina en la forma de Metil-Cobalamina. De esta manera, se puede
671
Hctor Rocha L. DNA
inhibir la sntesis de DNA en Quimioterapia (tratamiento para Leucemia) por la inhabilidad de contar con el dTMP necesario para formar dTTP. Para ello se emplean los compuestos qumicos conocidos como Aminopterina, Metopterina y Trimetoprima (Fig. 8 - 14). Su capacidad, se debe a que actan como inhibidores competitivos de la enzima Dihidrofolato Reductasa (DHFR), ya que su estructura es anloga al c. Flico.
a)
NADPH + H FH2 (DHF) DIHIDROFOLATO
dTMP
DIHIDROFOLATO REDUCTASA NADP F H 4 (THF) TETRAHIDROFOLATO
TIMIDILATO SINTASA dUMP

5-FLUORURACILO Y 5-FLUORDEOXIURUDINA SON INHBIDORES
AMINOPTERINA, METOPTERINA Y TRIMETOPRIMA SON INHIBIDORES DE LA DIHIDROFOLATO REDUCTASA
N ,N
10
- METILEN - F H 4
b)
dUMP
TIMIDILATO SINTASA
dTMP
N5 , N10 - METILEN - F H 4
DFH
NADPH + H
DIHIDROFOLATO REDUCTASA
GLICINA
Serina Hidroxi Metil Transferasa o Serina Trans Hidroxi Metilasa
B12
TFH
SERINA
NADP
Fig 8 - 14. a) Accin de la enzima Timidilato Sintasa y Dihidrofolato Reductasa. b) Ciclo de carga del grupo Metilo desde la Serina en el c. Flico.
Tambin inhiben la sntesis del IMP, precursor de ATP y GTP en aquellas reacciones que requieren de c. Flico (Figs. 2 - 14 y 4 - 14) en la sntesis de las Purinas. Ver el Captulo 6 de las Vitaminas. Por otro lado, se puede tambin evitar la sntesis de dTMP mediante la inhibicin de la enzima Timidilato Sintasa (Fig. 8-14) con el empleo de sustratos suicidas (5Fluoruracilo y la 5-Fluordeoxiurudina o 5-FdUMP), ya que se unen irreversiblemente al sitio activo.
Volver inicio
al
672
Hctor Rocha L. DNA
6) REGULACIN DE LA SNTESIS DE LAS BASES NITROGERNADAS. En la Figura 9 - 14, se observa la sntesis general de los Nucletidos destinados al RNA y DNA. La enzima Tiorredoxina Reductasa, esta a cargo de la formacin de los Deoxiribonucletidos, mientras que la Timidilato Sintasa se encuentra encargada de la transferencia de metilo al dUMP para formar dTMP, adems la enzima CTP - Sintasa se encuentra catalizando el paso entre UTP y CTP. Finalmente la Desaminasa cataliza el paso desde dCMP a dUMP.
ESQUEMA DE REGULACIN EN LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS

R IB O S A - 5 - P
R IB O S A - 5 - P P IR O F O S F O Q U IN A S A
-
HCO3 + Gln + ATP

CARBAMIL-P SINTASA II
PRPP
UTP
G L U T A M IN A - P R P P - A M ID O T R A N S F E R A S A
CP
C-Asp
ASPARTATO TRANSCARBAMILASA DIHIDRO OROTASA
5 - P - R IB O S IL A M IN A
A D E N IL O S U C C IN A T O S IN T A S A
CTP
IM P
DI-HIDROOROTATO
A D E N IL O S U C C IN A T O
XMP
OROTATO PRPP OMP

DIHIDRO OROTASA DESHIDROGENASA
AMP
GMP
ADP
GDP
UMP
ATP
GTP
UDP
UTP
CTP
Fig 9a 14. Regulacin de las Purinas y Pirimidinas
Fig 9b 14. regulacin de la Pirimidinas
La regulacin de las Purinas (fig. 9a 14), es en gran parte a nivel celular, pero la disponibilidad de PRPP se encuentra controlada por inhibicin de ADP y GDP en la primera enzima de la va metablica. Cuando sube el nivel de estos nucletidos disminuye la actividad de la Ribosa-P Pirofosfoquinasa o PRPP Sintasa. Adems, la segunda enzima de la va Amido Fosfo Ribosil Transferasa (Glutamina PRPP Amidotransferasa), es inhibida por ATP, ADP, AMP y GTP, GDP y GMP. Esta misma enzima es activada por la presencia de PRPP. Por otro lado, el paso donde se produce la bifurcacin de IMP a GMP y AMP, es tambin regulado en forma cruzada. El aumento de ATP estimula la sntesis de GMP y el aumento de GTP estimula la sntesis de AMP.
673
Hctor Rocha L. DNA
La regulacin de la sntesis de las Pirimidinas (fig. 9b 14) es distinta en bacterias y animales. En animales la enzima es multifuncional o bien es un complejo de multiples actividades enzimticas que presenta actividad de Carbamil-P Sintasa (CPS II) en su primera reaccin, que ocurre en el citoplasma a diferencia de la Carbamil Fosfato Sintasa I del Ciclo de la Urea en la mitocondria. La CPS II del citoplasma, es inhibida por UTP, CTP, UDP y dUTP a la vez que es activada por ATP. Otras de las actividades de este mismo complejo son la Aspartato Transcarbamilasa y la Dihidrorotasa. (Fig. 9b - 14). En general la actividad de CPS II es inhibida por UDP y dUTP y , mientras que el ATP y el PRPP la estimulan. Otra enzima de la va biosinttica es la Dihidroorotato Deshidrogenasa, que es estimulada por ATP y PRPP. Por otro lado, la enzima OMP Descarboxilasa u Orotidilato Descarboxilasa (fig. 4 - 14), es inhibida competitivamente por UMP y CMP . Finalmente, la enzima CTP sintasa es inhibida por CTP y activada por GTP. En la figura 10 14 , se puede observar el panorama general de la sntesis de los Nucletidos de Purina y Pirimidina.
Volver inicio
al
674
Hctor Rocha L. DNA
C O 2 + G ln + A T P
E s q u e m a G e n e r a l d e la S n te s is d e N u c le tid o s y A c id o s N u c l ic o s . C a r b a m il-P S in ta s a II
C O M P LE JO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A T IM ID IL A T O S IN T A S A
C P S II
UDP U TP dUTP C TP
A s p a r t a to
T r a n s c a rb a m ila s a CTP + ATP

C a r b a m il - P A c . U r e id o S u c c n ic o C T P A c . O r t ic o
d U M P d U D P
d T M P
D E S A M IN A S A
d T T P
U D P U M P
C T P S IN T A S A
+
A s p
d C M P
U D P
U T P
C T P
C D P
d C D P
d CT P
AM P G MP ADP GDP ATP G TP
C O M PLEJO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A
R N A DN NA A D
P R P P (G lu ta m il) A m id o T r a n s fe r a s a
A T P G T P
P R P P
R -5 - P + ATP
S IN T A S A AM P GMP
AM P G M P ADP GDP ATP G TP
AM P GM P ADP GDP ATP G TP
G M P I M P
G D P
d G D P
C O M PLEJO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A
d G T P
P R P P
+ G ln
5 - P - R IB O S IL A M IN A
A M P
A D P
d A D P
C O M P LE JO R IB O N U C L E T ID O D i-P -R E D U C T A S A
d A T P
T IO R R E D O X IN A R E D U C T AS A
Fig. 10 - 14. Resumen general de la sntesis de los Nucletidos.
675
Hctor Rocha L. DNA
7) VIAS DE RESCATE PARA LAS PURINAS Y PIRIMIDINAS. Debido a que se estn continuamente formando y destruyendo clulas, lo que implica sntesis y degradacin de DNA y RNA, es necesario un suministro adecuado o pool de bases nitrogenadas tanto de Purinas como de Pirimidinas. En aquellas clulas cuya destruccin esta programada se produce un primer ataque por las Endonucleasas, que cortan los cidos nuclicos en el interior de la cadena, precisamente en los enlaces fosfodiester produciendo Oligonucletidos de distintos largos. Estos son posteriormente atacados por las Fosfodiesterasas, que hidrolizan individualmente las uniones fosfodiester entregando como producto a los 5o 3 Mononucletidos, los que son posteriormente hidrolizados por las 5- Nucleotidasas o 3- Nucletidasas, que eliminan su fsforo para convertirse en Nuclesidos. Sobre estos ltimos, actan las Nuclesido Fosforilasas (fig.10-4), para dejar finalmente a la base nitrogenada sola y una Ribosa-1-P. Esta ltima reaccin, es del tipo reversible y las bases individuales pueden ser tambin recicladas para formar nuevamente un Nuclosido, que bajo la accin de una enzima denominada Nuclesido Quinasa (fig. 11-14) y ATP pueden dar origen a un Nucletido que puede ser integrado a los cidos nucleicos. Las enzimas ADENOSINA FOSFORIBOSIL TRANSFERASA (APRT) e HIPOXANTINAGUANINA FOSFORIBOSILTRANSFERASA (HGPRT) en la figura 11 - 14, son las principales enzimas dedicadas a volver a unir las bases pricas de deshecho a los respectivos azcares. De esta manera se evita que las bases de los nucletidos degradados sean descartadas.
( A P R T ) A d e n o s i n a F o s f o R ib o s il T r a s f e r a s a y ( H G P R T ) H i p o x a n t i n a , G u a n i n a F o s f o r i b o s il T ra n s fe ra s a s
A d e n in a G u a n in a H ip o x a n t i n a + + + P R P P P R P P P R P P A M P G M P I M P + + + P Pi P Pi P Pi
N u c le s id o
N u c l e s id o + + P i A T P
F o s fo r ila s a
B ase N it r o g e n a d a + A M P R ib o s a - 1 - P + A D P
A d e n o s in a ( A d e n in a - R ib o s a )
N u c le s id o
T im i d i n a + ( T im i n a - D e o x i r i b o s a ) U r id i n a + ( U r a c i lo - R ib o s a ) C it id i n a + ( C it o s i n a - R ib o s a ) A T P A TP
Q u in a s a
dT M P UMP + + A D P ADP
ATP
CMP
ADP
Fig 11 - 14. La mayora de las vas de salvataje en los animales no incluyen a las Pirimidinas. La Nuclesido Fosforilasa rompe el enlace Glicosdico entre el Carbono 1 de la Ribosa y la Base Nitrogenada, dejando la base sola y la Ribosa fosforilada en el mismo Carbono 1.
676
Hctor Rocha L. DNA
Por otro lado, en el hombre las Pirimidinas no son recicladas de manera significativa, como ocurre con el salvataje a nivel primario de las Purinas por HGPRT y APRT, adems las Pirimidinas forman compuestos de degradacin solubles sin generar problemas clnicos, como sucede con el c. rico de las Purinas. En todo caso, en las Pirimidinas es importante el salvataje de las Timinas (Fig. 11-14) por la Timina Fosforilasa (Timina + Deoxiribosa-1-P-------Timidina + Pi) y la Timidina Quinasa (Timidina + ATP------dTMP + ADP) que preparan a la clula para entrar en divisin. Volver al inicio
8) DEGRADACION DE LAS BASES NITROGENADAS. Como se vio anteriormente los Nucletidos de las Purinas (Fig. 12 - 14), se degradan primero por accin de una 5'-Nucleotidasa que remueve el fosfato tanto del AMP como del GMP, para luego eliminar en la Adenosina el grupo Amino por una Adenosina Deaminasa dejando a la Inosina, esta posteriormente pierde la Ribosa con una Nucleosidasa dejando Hipoxantina. Esta ltima por medio de la doble actividad enzimtica representada por la Xantina Oxidasa y Xantina Deshidrogenasa, genera Xantina como intermediario para dar finalmente c. rico. La Guanosina (Guanina-Ribosa), (Fig. 12 - 14) pierde a la Ribosa por la Nucleosidasa y la base restante Guanina, por accin de una Deaminasa, se convierte en el compuesto de
O N H Adenosina 2 C N N C CH C C N N HOHC 2 H HO O H C HN HC N HOHC 2 H HO O H H C C
Degradacin de las Purinas

Inosna
N CH N HN O C C C N
Hipoxantina
N CH N H
Adenosina H Deaminasa H
OH
NcleoHC sidasa
NAD
H2O, O2
OH
Xantina Deshidrogenasa
O C
Xantina Oxidasa
2H+, O2HN O C
NADH + H
C C N CH N H HN O C
O C C C N H H N C N H O
O Guanosina C N HN 2 C N HOHC 2 H HO O H H H OH HN 2 C C N CH N
N H
Xantina
O C N C N C C
Ac. Urico
Ncleosidasa
Guanina
Deaminasa
N CH N H
Fig 12 - 14. En la figura 15 14, se observa el paso de Hipoxantina a Xantina y desde esta ltimal c. rico. Este paso es catalizado por dos actividades enzimticas: Xantina Oxidasa, que emplea Agua y Oxgeno para formar Superxido ( O2- ) y Xantina Deshidrogenasa, que emplea NAD como coenzima. Los pjaros eliminan gran cantidad de c. rico, mientras que los primates lo hacen en menor cantidad, eliminando principalmente Urea.
677
Hctor Rocha L. DNA
convergencia Xantina. Esta ltima, se oxidada por accin de la Xantina Oxidasa para formar c. rico. En el caso de las Pirimidinas, la Citosina (Fig. 13 - 14), se deamina pasando a formar el Uracilo mediante una reduccin del doble enlace del anillo, produciendo el Dihidrouracilo por medio de la enzima Dihidropirimidina Deshidrogenasa. Este compuesto se descompone luego en c. -Ureido Propinico mediante la accin de la
(1) Dihidropirimi dina Deshidro genasa
NH C N C O N H Citosina NADPH + H CH 3 CH CH N H Timina C C O 2 NH 3 HN C N H Uracilo NADP
Catabolismo de las Pirimidinas

NADPH + H NADP
O C C C O HN C
O C
(2) Dihidropiri midinasa

HO 2 CH 2 CH 2 O HN 2 C
Ureidopro pionasa
COOH HO 2 CH 2 CH N H 2 + CO + NH 2 4 + H N CH C H C O O H 2 2 2
N H Dihidrouracilo
Ac. Ac.-Ureidopropinico
-Alanina Ureidoisopro pionasa
O C HN C O
O C CH 3 HO 2 COOH HN 2 C CH
HN C
CH CH
CH 3 HO 2
2 (1) O N O N Dihidropi H H rimidina Ac. -Ureido isobutrico Ac. Deshidro Dihidrotimina genasa (2) Dihidropiri midinasa
C H2
+ CO + NH 2 4 + HN CH C H C O O H 2 2 CH 3
Ac. -Amino Isobutrico
Fig. 13 - 14. El Amonio de las pirimidinas se excreta como UREA, mientras que los esqueletos hidrocarbonados pueden degradarse en el CTC. En (1) y (2) se observan los mismos pasos.
Dihidropirimidinasa para dar finalmente - Alanina, CO2 y NH4 por accin de la Ureido Propionasa. La - Alanina puede ir a la sntesis de CoASH o bien despus de algunas transformaciones se puede convertir en Acetil-SCoA para entrar al CTC. Por otro lado, la Timina (Fig. 13 - 14) al no contar con un grupo Amino, se degrada por reduccin con NADPH (igual que la Citosina) a Dihidrotimina y posteriormente se transforma + en c. -Ureidoisobutrico. Este ltimo se descompone en CO2, NH4 y c. Aminoisobutrico. Este ltimo se puede transformar despus de varios pasos en SuccinilSCoA y entrar al CTC. En el caso de las aves, primates, reptiles e insectos estos producen c. URICO, mientras que otros vertebrados forman ALANTOINA (Fig. 14 - 14).
678
Hctor Rocha L. DNA
Los peces telesteos eliminan Alantoato y los anfibios junto a los peces cartilaginosos eliminan solo UREA. Finalmente, los invertebrados marinos llevan a cabo toda la va degradativa y ms completa y eliminan solo CO2 y NH+4 directamente al medio.
OH C N HO C N C C N
AC. URICO EN PRIMATES PAJAROS, REPTILES E INSECTOS

C N H OH 1/2 O
+ HO 2 H N C C H N H O HO 2 NH 2 C N H O C OH NH 2 O C C H O H N 2 COOH H CHO O HN 2 C N H2 HO 2 CO 2 + NH 4
CO
ALANTOINA EN ALGUNOS VERTEBRADOS

O
2 O C
NH 2 C N H
ALANTOATO EN PECES CON ESQUELETO
UREA EN ANFIBIOS Y PECES CARTILAGINOSOS AMONIO EN INVERTEBRADOS MARINOS
Fig. 14 - 14. Distintas especies excretan diferentes productos nitrogenados.
Volver inicio
al
679
Hctor Rocha L. DNA
9) ALGUNOS PIRIMIDINAS.
TRASTORNOS
DEL
METABOLISMO
DE
LAS
PURUNAS
I ) En el caso del metabolismo de los Nucletidos de las Purinas algunas enzimas involucradas pueden fallar provocando los siguientes problemas:
Cuando falla la enzima enzima Xantina Oxidasa (XO) o la Xantina Deshidrogenasa (XDH) tenemos: a) Gota Falla la Se produce por la acumulacin e insolubilidad del c. rico o Hiperuricemia (acumulacin de c. rico en la sangre) por sobre 7 mg/dl. Las manifestaciones clnicas aparecen por la precipitacin de cristales de Urato de sodio en el lquido sinovial de las articulaciones especialmente dedo gordo del pi (Podagra), esto produce inflamacin y artritis de la articulacin. Surge en general por exceso de Purinas o una deficiencia parcial de la HGPRT. Se trata con Alopurinol, el cual es un ismero de la Hipoxantina y a la vez inhibidor competitivo de la Xantina Oxidasa.
Hipoxantina
Alopurinol
Por otro lado la Gota juvenil o nefropata hiperuricmica, ocurre tanto en hombres como mujeres y es de naturaleza fatal. El defecto bioqumico se desconoce hasta la fecha. b) Falla de Xantina Deshidrogenasa (XDH) que provoca la Xantiuria Hereditaria La enzima XDH presente en el Hgado y la Mucosa intestinal cataliza la degradacin de Hipoxantina a Xantina y de esta ltima a c. rico, emplea NAD como coenzima. La enzima requiere de cofactores como Molibdeno (Mo), FAD y Hierro (Fe). La enzima tiene una baja actividad o es inexistente en Homocigotos con deficiencia de XDH. En estos casos se acumula Xantina, ya que Hipoxantina es empleada en la va de salvataje. La deficiencia en la absorcin de Molibdeno tambin se traduce en una acumulacin de Xantina. Todos estos problemas se manifiestan con transtornos renales agudos a la edad de 8 aos. c) Deficiencia de Adenina Fosforibosil Transferasa (APRT) Se encuentra en todo el organismo principalmente en el ncleo. Tiene dos diferencias Tipo I en caucsicos y Tipo II en Japoneses con una Km 10X superior a la primera. Se acumula como 8-Hidroxi adenina y 2,8-Dihidroxiadenina que es muy insoluble produciendo falla renal en infantes. Esta enfermedad tiene un amplio espectro y puede ir desde clculos a temprana edad hasta pasar inadvertida sin afectar la calidad de vida de la persona.
680
Hctor Rocha L. DNA
d) Deficiencia de Hipoxantina Guanina Fosforibosil Transferasa (HPGPRT) La falla en la enzima HGPRT de la figura 9-14 o la falta de su expresin, provoca en los nios el sndrome de Lesh-Nyhan. Esta enfermedad se caracteriza por altos niveles de c. rico en la sangre y una descontrolada sntesis de novo (cerca de 20 veces) en la va de las purinas. Estos transtornos son acompaados por artritis, gota una alta agresividad a la edad de dos aos, acompaada con episodios de automutilacin debido a la ingestin de su propia lengua y dedos. En esta enfermedad se encuentra deteriorado el sistema nervioso, ya que el rescate de Purinas es en gran medida empleado por el cerebro durante su desarrollo. Esto ltimo explicara en parte el comportamiento aberrante de los pacientes. e) Superactividad de Fosforibosil Pirofosfato Sintasa (PRPS) Pasa Pirofosfato desde ATP hasta Ribosa-5-Fosfato y se encuentra ligado al cromosoma X con Gota severa y clculos en los riones en adolescencia o antes de la edad adulta.. La enzima es reguladora y se encuentra sometida al efecto de diferentes nucletidos como productos finales de las distintas vas que se derivan ms adelante. f) Deficiencia de Purina Nuclesido Fosforilasa (PNP). Causa una inmunodeficiencia por afectar la reproduccin de los Linfocitos T y B. g) Deficiencia de Adenosina Deaminasa (ADA). Es causada por la falla en la enzima Adenosina Deaminasa que convierte Adenosina en Inosina, ver figura 11-14. Cuando falta la enzima, el sustrato Deoxiadenosina se acumula y se fosforila para formar dATP en grandes cantidades. Como en los Linfocitos son altas las enzimas de salvataje incluyendo a la Nuclesido Kinasas, ver figura 10-14, las altas concentraciones de dATP inhiben a la Ribonucletido Reductasa (fig. 6-14), evitando que otros dNTP sean formados. El efecto de la falta de dNTPs, conduce a la incapacidad de divisin de las clulas precursoras y destruccin de los Linfocitos T y B de los cuales depende la respuesta inmune. Esta enfermedad es fatal en la infancia. h) Deficiencia de Mioadenilato Deaminasa (MAD) Cataliza el paso de Deaminacin de AMP a IMP, son 4 isoenzimas con mxima actividad en msculo esqueltico. Su falla produce calambres musculares y mialgia el exceso de Amonio producido neutraliza la produccin de cido Lctico. Se incrementa la Gliclisis. i) Deficiencia de Adenilo Succinato (ADS). j) La enfermedad de Von Gierke en el metabolismo de la Glucosa (falla Glucosa-6Pasa), produce un exceso de Glucosa-6-P, la cual se dirige a la Va de las Pentosas y finalmente a la formacin de un exceso de Ribosa-5-P y consecuentemente a un posterior exceso de PRPP (Ribosa activada), lo que lleva a su vez a tener un exceso de Purinas, con las dificultades que esto trae consigo, como es el caso de una Hiperuricemia.
681
Hctor Rocha L. DNA
II) En el caso del metabolismo de los Nucletidos de Pirimidina pueden fallar algunas enzimas provocando los siguientes desrdenes:
a) Aciduria Ortica hereditaria: Se produce cuando falla el complejo (UMP sintasa) que mantiene a las actividades enzimticas conocidas como la enzima (4), Orotato Fosforibosil Transferasa (OFRT) y la enzima (5) Orotidilato Descarboxilasa en la figura 4 14 y 15-14. Esta enfermedad es responsable de inhibicin del crecimiento junto a una anemia severa. Esto se debe a que se forman eritrocitos hipocrmicos junto a una medula megaloblstica (no hay bases para que se replique el DNA). Leucopenia es tambin comn. Se trata con Uridina y con Citidina, que conducen a un aumento en la formacin de UMP por las Nuclesido Kinasas. A su vez el UMP inhibe a la Carbamil-Fosfato Sintasa del citoplasma atenuando la produccin del c. Ortico, precursor de las Pirimidinas. b) Deficiencia de la enzima (1) Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DHPD) en la figura 13 14 y 15 - 14. Se caracteriza por una excrecin aumentada de Uracilo y Timina en la orina. Ocurre tanto en adultos como nios acompaados por desordenes y malformaciones neurolgicas respectivamente. Estos problemas se deben al defecto en la primera de las tres enzimas que degradan las Purinas, DHPD, que normalmente acta catalizando el paso limitante y emplea a la coenzima NADPH como fuente de protones para reducir el anillo de la Pirimidina. Esta enzima tambin limita la efectividad del compuesto anticancergeno 5-Fluoruracilo al destruirlo. c) Deficiencia de (2) Dihidropirimidinasa. Ver figuras 13 14 y 15-14. Enzima que cataliza la abertura del anillo de Pirimidina, para formar c. -Ureido Propinico y c. -Ureido Isobutrico, tanto en la va de degradacin de la Citosina como de la Timina respectivamente. El aminocido -Alanina es un producto final de estas vas y se le considera como neurotransmisor putativo (puede ser y puede no ser) y su falta provocara transtornos nerviosos en infantes con 6 a 8 semanas de edad. d) Deficiencia Pirimidina-5- Nucleotidasa (PMNA).Ver figura 15-14. Cataliza la hidrlisis de los Nucletidos de Pirimidina por medio de dos actividades isoenzimticas: Uridina Monofosfato Hidrolasa (UMPH1) 1 y (UMPH2) 2, la 1 hidroliza UMP a Uridina y CMP ms dCMP a Citidina y la 2 hidroliza dUMP a Uridina y dTMP a Timidina. La mayor parte de la actividad se encuentra en la UMPH1. Cuando esta falla en homozigotos se observa anemia hemoltica acompaada de esplenomegalia y colelitiasis (formacin de clculos biliares en coldoco). Altos niveles de Bilirrubina son tambin comunes.
e) Deficiencia de CDP-Colina Fosfotransferasa
682
Hctor Rocha L. DNA
Se produce una acumulacin de CDP-Colina al fallar el paso de CDP-Colina + Diacilglicerol para dar Fosfatidilcolina (Lecitina) y CMP. Esta acumulacin ocurre en eritrocitos y produce hemlisis crnica acompaada de ictericia y esplenomegalia.
RNA ATP ADP ADS AMP APRT AMPS MAD ADENOSINA ADA INOSINA HGPRT GUANOSINA HGPRT ADENINA METILTIO ADENOSINA POLIAMINAS PNP HIPOXANTINA S-ADENOSIL HOMOCISTEINA XDH XANTINA XDH PNP IMP XMP GMP dATP AMPc DNA R - 5- P PRPS PRPP ADS ITP dGDP DNA RNA GMPc GTP
GDP
8-HIDROXI ADENINA XDH 2,8 HIDROXI ADENINA
XDH
GUANINA
S-ADENOSIL METIONINA
AC.URICO
Fig 15 14. Vas de catabolismo, sntesis y salvataje de las purinas en el hombre
ENZIMAS DE LA FIGURA 15-14: XDH: XANTINA DESHIDROGENASA APRT: ADENINA FOSFORIBOSIL TRANSFERASA HGPRT: HIPOXANTINA GUANINA FOSFORIBOSIL TRANSFERASA PRPS : FOSFORIBOSIL PIROFOSFATO SINTASA PNP: PURINE NUCLEOTIDO FOSFORILASA ADA: ADENOSINA DEAMINASA ADS: ADENILO SUCCINASA MAD: MIOADENILATO DEAMINASA
683
Hctor Rocha L. DNA
CICLO NH4+ GLUTAMINA DE LA Carbamil-P UREA Sintasa 1 y 2 CARBAMIL-P + ASPARTATO DNA CDP- DIACILGLICEROL RNA dCMP AC. OROTICO OFRT OMP dCMP CMP PMNA ODC PMNA PMNA URIDINA CITIDINA URACILO CITOSINA DHPD DIHIDROURACILO DHPA -UREIDOPROPINICO DHPD DIHIDROTIMIDINA DHPA -UREIDOISOBUTRICO TIMINA TIMIDINA UMP dUMP dTMP CDP- DIACILGLICEROL RNA UTP dUTP DNA
dCDP
CDP
UDP
dUDP
dTDP
-AMINOISOBUTRICO -ALANINA Fig 16 14. Vas de sntesis, catabolismo y salvataje de las Pirimidinas en el hombre.
ENZIMAS DE LA FIGURA 16-14:
OFRT ODC DHPD DHPA PMNA

inicio
: OROTATO FOSFORIBOSIL TRANSFERASA : OROTIDILATO DESCARBOXILASA : DIHIDROPIRIMIDINA DESHIDROGENASA : DIHIDROPIRIMIDINASA : PIRIMIDINA-5-NUCLEOTIDASA

Volver al
10) DNA
684
Hctor Rocha L. DNA
La doble hebra duplohelicoidal (Fig. 17 - 14), puede tener varias grados de organizacin al igual que una protena. Por lo tanto se describen en ella las siguientes estructuras:
a) La estructura primaria, depende del orden y secuencia de las bases nitrogenadas que se encuentran unidas al carbono 1' de las Deoxiribosas, tanto por el Nitrgeno ubicado en la posicin 9 de las Purinas como por el Nitrgeno ubicado en la posicin 1 de las Pirimidinas. La disposicin del Deoxiribonucletido es del tipo SIN, es decir la deoxirribosa y la base nitrogenada se encuentran hacia el mismo lado, mientras que el arreglo duplohelicoidal de la doble hebra se forma debido a que la Deoxiribosa no opone impedimento estrico al acomodarse la doble hebra con una torsin hacia la derecha por la falta de su 2'- OH. En cada una de las hebras los Deoxiribonicletidos se encuentran unidos entre s por los enlaces FOSFODIESTER, llamados as por ser los enlaces entre el carbono 5'- OH que porta el fosfato cido Alfa con el carbono 3'- OH del Deoxiribonucletido siguiente. b) La estructura secundaria, consiste en la interaccin mediada por enlace Hidrgeno entre las bases nitrogenadas de cada una de las hebras que se encuentran dirigidas hacia el interior de la hlice. Dos enlaces hidrgeno para la interaccin A-T y tres enlaces hidrgeno para la interaccin G-C. Entre las bases apareadas existe una pequea desviacin del plano horizontal que las hace ver como las aspas de una hlice. Adems cada una de la hebras esta dispuesta en sentido antiparalelo de 5'a 3', mientras que las bases de cada hebra se encuentran apiladas hacia el interior unas sobre otras y se relacionan por medio de la interaccin hidrofbica. c) La estructura terciaria depende de lav interaccin con las Histonas. Estas son cerca de 5 protenas que poseen cargas (+) debido a la presencia de Lisinas y Argininas en su
5'
EXTREMO
3' 5'
HO
N N
H N
CH OH
CH
N 2 N
3'
EXTREMO
H O
H
ENLACE
O O P O
N
CH
FOSFO
O H N H O
N
ENLACE
P O
FOSFO DIESTER
DIESTER
H
N
N N N
CH
H O CH
2
3'
EXTREMO
3'
HO
OH
5'
EXTREMO
5'
Fig. 17 - 14.Representacin de la estructura bsica del DNA.
685
Hctor Rocha L. DNA
secuencia. Estas protenas se organizan en los complejos (H2A-H2B)2, (H3)2 y (H4)2 formando un octmero (Fig. 18 - 14), que posee ciertas hendiduras especficas que interaccionan con las cargas negativas de los fosfatos expuestos en los surcos del DNA. La molcula de cido nucleico se encuentra en este caso superenrrollado y procede a dar dos vueltas en el complejo del carrete de Histonas, mientras que su entrada y salida se encuentran protegidas por la Histona H1.
HISTONAS
Interaccionan electrostticamente con el DNA
HA
2 Oct'amero : (H ) 3 (H ) 4
HB
2
2 2
H1 Histona protectora del carrete : H1
H1
H1
H 4
Histona que interaca con protenas activadoras y silenciadoras de los genes
Fig 18 - 14. Empaquetamiento de las Histonas para formar el Nucleosoma.
El complejo DNA-Histona es denominado Nucleosoma y su formacin se encuentra regulada por la interaccin del amino terminal de la histona H4 con los factores proteicos activadoras o silenciadoras que modulan la expresin de los genes. La histona H4 mediara la estabilidad del Nucleosoma, ya que al entrar en contacto con un factor activador , se producira la descomposicin del Nucleosoma para dejar al DNA desnudo, con su promotor expuesto listo para su transcripcin. En caso contrario al interactuar el Nt de la Histona H4 con una protena silenciadora se formara esta vez el nucleosoma ocultando al promotor. Al continuar con la organizacin estructural del DNA, encontramos que la agrupacin de nucleosomas es denominada polinucleosomas. Estos a su vez forman estructuras compactas denominadas solenoides los que son parte de las hebras o la cromatina del cromosoma mismo.
d) DNA tipo B
686
Hctor Rocha L. DNA
La doble hebra de DNA desnudo puede tener distintas formas y entre ellas encontramos al DNA B o clsico de Watson y Creek. Este se caracteriza por tener la torsin duplohelicoidal hacia la derecha y mostrar profundas hendiduras mayores y menores en sus costados debido a que el carbono C 2 de la Deoxiribosa se encuentra en la forma ENDO. Esto significa que al comparar la deoxiribosa con un sobre, uno de sus vrtices se encuentra levantado, es decir por arriba del plano del resto de los otros vrtices o carbonos del anillo.
e) DNA tipo A
Entre las otras formas tenemos al DNA tipo-A con torsin hacia la derecha, pero que se forma cuando la humedad baja del 75% y es ms ancho y corto por vuelta debido al plegamiento que sufre en este caso la Deoxiribosa. El azcar aqu es del tipos C 3' ENDO. Este plegamiento hace que los pares de bases que se encuentran apareados en el centro se inclinen respecto al eje central, mientras que la disposicin entre las Deoxirribosas y las bases nitrogenadas ser del tipo ANTI u opuesta. Estos arreglos hacen desaparecer la hendidura menor, tpica del DNA B y desfavorece la unin de las molculas de agua a los fosfatos.
f) DNA tipo Z
Este otro tipo de DNA se encuentra en las secuencias alternadas de C y G, las que se acomodan con una torsin hacia la izquierda donde los fosfatos presentan un ordenamiento de ZIG-ZAG junto a una hendidura lateral profunda. En el DNA Z las bases nitrogenadas son capaces de girar 180o y pasar de la forma Syn a la Anti. Esto significa que la estructura cambia desde la forma en que la D-Ribosa y la Base Nitrogenada se encuentran a un mismo lado, a la forma en que la D-Ribosa y la Base Nitrogenada se encuentran opuestas una a la otra. A pesar de que este tipo de estructura no es termodinmicamente favorable, suele ocurrir por la metilacin de las citosinas en el carbono 5. Finalmente se puede agregar que las tres formas de DNA descritas aqu, ms otras que se vern a continuacin son estructuras promediadas. Esto significa que el pozo de energa que define la estabilidad de cada una de sus formas estructurales no es lo suficientemente profundo y permite variaciones dinmicas a lo largo de las estructuras propuestas. El hecho de definirlas como estructuras fijas sera como tomarles una foto con un "flash" en determinada etapa de su movimiento y encontrarlas solo en la estructura ms probable dadas las condiciones del momento. A continuacin en la Tabla 1 - 14, se pueden observar las caractersticas de los distintos tipos de hlices:
TABLA 1 14
687
Hctor Rocha L. DNA
A Forma Incidencia
Ms ancha DNA natural y sinttico
Intermedia DNA natural y sinttico 34nm
Ms elongada DNA alternado de purina y pirimidina 38nm
Elevacin por par de 23nm bases Dimetro Hlice Sentido Enlace Glicosdico
255nm Derecho "anti"
237nm Derecho "anti"
184nm Izquierdo "anti" para C,T y "sin" para G 12
Pares de bases por vuelta Altura por vuelta
11
10.4
246nm
322nm 1o
456nm 9o
Inclinacin desde el 19o eje normal Hendidura Mayor
Estrecha y muy Profunda Muy ancha y superficial
Ancha y Profunda
Sin surco plana
Hendidura Menor
Estrecha y Profunda
Muy estrecha y profunda
En la figura 19, 20 - 14, aparecen representadas las tres formas del DNA. Existen an otras dos formas ms del DNA. Estas son el: DNA C con 9,3 pb/vuelta a la derecha y 33nm de elevacin por cada par de bases, frecuente en modelos dshidratados de DNA natural y sinttico. El DNA D con 8pb/vuelta a la derecha mayormente encontrado en el DNA sinttico de secuencia ATATAT y con 30 nm de elevacin por cada par de bases. Otra forma extra corresponde al DNA T presente solo en bacterifagos. Cmo se di a entender anteriormente las distintas formas del DNA estaran ligadas al reconocimiento especfico que ocurrira por protenas activadoras y silenciadoras de los genes, junto al reconocimiento de ciertos tipos de DNA por receptores hormonales que actuaran controlando la expresin al reconocer, no solo secuencias especficas, sino que tambin diferentes formas y tipos en que se acomoda la doble hlice. Por otro lado las distintas formas del DNA dependeran de las secuencias que se encuentran presentes en el y de su capacidad para adaptarse a los cambios inducidos por el medio, donde son de importancia el grado de hidratacin, la salinidad del medio, el pH y la presencia de otros factores involucrados en la expresin de los genes. Por ejemplo un espcimen
688
Hctor Rocha L. DNA
adaptado a alta temperatura tendra un mayor nivel de secuencias GC para mantener la estabilidad de la doble hebra y favorecer con ello una de las formas promedio que puede tomar el DNA. Volver inicio
11) DNA CRUCIFORME
al
Ocurre cuando aparece una secuencia repetitiva de tipo recproca, en que para una secuencia dada de bases le sigue otra complementaria de orden inverso lo que se denomina palndrome. La estructura cruciforme se representa aqu por un trbol de dos hojas u horquillas: C T G A T T 5' AGCCTGA 3' TCGGACT A A T C G A T A A TCGGCCT 3' AGCCGGA 5' T T A T A
Esta forma con simetra bicatenaria en el DNA tambin puede servir de reconocimiento para algunas protenas que controlan la expresin de los genes. Hbridos DNA-RNA. Estas formas hbridas seran similares al DNA tipo A con 11 a 12 pares de bases por vuelta. Sin embargo segn la secuencia de bases que se apareen pueden llegar incluso a ser polimrficas. Estos hbridos estaran involucrado en el control de la expresin de los genes. Volver inicio
12) DNA PRESENTE EN MITOCONDRIA, CLOROPLASTOS y DNA VIRAL.
al
El DNA mitocondrial humano tiene solo 16,569 kB y es cerca del 1% del DNA nuclear. Codifica para cerca de trece genes estructurales sin intrones y 22 molculas de RNA en total que son del tipo de transferencia y ribosomal. Entre las protenas que codifica estn algunas subunidades de la Citocromo Oxidasa del Complejo IV de la Cadena Respiratoria, el Citocromo b del Complejo III y algunas subunidades de la ATP Sintasa incluyendo el canal de los protones en la parte Fo. El DNA mitocondrial se encuentra en su mayor parte desnudo sin histonas y es similar en todos los vertebrados con un peso de 15 a 20 kD, sin embargo difiere con el DNA de los no vertebrados representado por las plantas, cuyo DNA mitocondrial tiene de 218.000 a 2.400.000 nucletidos de extensin. Esto no significa un mayor nmero de
689
Hctor Rocha L. DNA
genes codificadores, sino que pueden ser incluso los mismos genes que se hallan en el DNA mitocondrial de los vertebrados, pero en este caso acompaado de grandes trozos de DNA no codificante entre ellos. Los genes mitocondriales son de herencia exclusiva materna y se han empleado en la actualidad para trazar los orgenes de las distintas razas. Cada persona hombre o mujer porta el DNA mitocondrial de su madre.
Fig 19 - 14. Modelos de algunas de las conformaciones del DNA representadas por la unin de los tomos de fsforo, mientras que los segmentos horizontales indican la posicin de los pares de bases.
De esta forma en la mitocondria se encuentran codificadas solo un pequeo nmero de protenas que ejerce una funcin esencial, mientras que la mayora de las otras proviene de los cromosomas nucleares. Las protenas de origen nuclear se transportan a la mitocondria por medio de un complejo sistema de seales que se encuentra en la secuencia misma, para de esta manera integrarse con las protenas de origen mitocondrial una vez cortada la seal que les premiti entrar a la mitocondria. El Cloroplasto tambin cuenta con un DNA ms pequeo que el del ncleo y con su propio sistema de transcripcin y traduccin. Al igual que la mitocondria, no fabrica todas las protenas que necesita, por lo tanto se importan del citoplasma las subunidades proteicas o las enzimas que necesita y cuyos genes forman parte del genoma de la clula. Los virus tienen su material gentico en el interior de una envoltura o cpside y no son capaces de expresar esta informacin por lo que deben infectar bacterias para usurpar la maquinaria de la Traduccin y Transcripcin. Algunos permanecen largo tiempo integrados al genoma nuclear y se expresan posteriormente, mientras que otros codifican para elementos de control de la expresin en los genes normales que se han vuelto silentes en los Eucariontes durante la ontogenia.
690
Hctor Rocha L. DNA
ig. 20 - 14. Distintos largos entre DNA A, el ms corto, B y Z el ms extendido respectivamente.
El virus de la gripe tiene 8 cadenas de RNA de 800 a 5000 nucletidos. El virus de la hepatitis B con tiene una doble hebra de DNA de solo unos pocos miles de pares de bases. Los virus RNA se pueden expresar inmediatamente pasando la informacin a una protena empleando su RNA como RNAm. Mientras que otros generan otra cadena de RNA complementario que ser el verdadero RNA mensajero. En el caso de los RETROVIRUS, estos generan un DNA a partir de su RNA por la accin de la Transcriptasa Inversa codificada en su propio gen. Este DNA se integra al genoma de la clula husped donde puede estar silente, es decir se comporta como integrante del DNA o bien se puede expresar causando enfermedades como tumores en animales o el SIDA en los humanos. Los Retrovirus son an capaces de arrancar elementos de control de los genes de una clula husped y en una posterior infeccin controlar la expresin de un gen que ha sido silenciado durante los eventos normales correspondientes al desarrollo y diferenciacin celular. Este mecanismo de accin ocurre con los proto-oncogenes, los que codifican para algunas Protenas Quinasas que controlan la actividad de ciertas vas metablicas de las clulas y que estn a su vez relacionadas con los efectos causados por algunas hormonas. De esta manera tejidos que no responden a una hormona despus de diferenciados, lo empiezan a hacer nuevamente con posterioridad a la infeccin con un retrovirus que porta un oncogen. Por este mecanismo reaparece la multiplicacin celular e indiferenciacin lo que se denomina usualmente como cncer. Afortunadamente esta ltima forma de infeccin viral ocurre principalmente en animales y no ha sido del todo comprobada en los humanos. Volver inicio al
691
Hctor Rocha L. DNA
13) PROPIEDADES DEL DNA. a) En solucin:
El DNA forma soluciones viscosas en agua segn el grado de denaturacin que presente. A mayor denaturacin presentar mayor viscosidad. La viscosidad disminuye cuando se fragmenta el DNA.
b) Temperatura:
692
Hctor Rocha L. DNA
La temperatura produce la "fundicin" o separacin de ambas hebras. La Temperatura de fusin 50 o Tf50, es la constante que indica la Temperatura a la que el 50% del DNA duplohelicoidal se ha separado en sus hebras individuales (Fig. 20a - 12). La Tf50 variar con la composicin de las bases, as a mayor % de GC se tendr un mayor Tf50 y a mayor % de AT una menor Tf50 .
c) Hibridacin del DNA.
Las hebras individuales o separadas del DNA duplohelicoidal pueden unirse nuevamente entre s o con otras hebras homlogas al bajar gradualmente la temperatura (Fig. 20a - 14). La reasociacin del DNA se estudia por la ecuacin de la figura 20b-14, que relaciona de manera inversamente proporcional la fraccin f de DNA monofibrilar con su concentracin inicial y el tiempo de asociacin. En la figura 20c - 14, se observa en forma numerada del 1 al 4 la cintica de reasociacin de secuencias cada vez ms heterogneas. La curva 1 corresponde al DNA repetitivo o con un alto % de GC alternadas, mientras que la curva 4 corresponde al DNA heterogneo. Las curvas 2 y 3 corresponden a DNA entremezclado de repetitivo y heterogneo. Este efecto permite estudiar casos de secuencias repetitivas, donde ambas hebras pueden unirse en forma desfasada y no necesitan alinearse de manera estrictamente opuesta o bien el caso de secuencias heterogneas donde ambas hebras deben aparear en solo una posicin como ocurre entre una llave y una cerradura.
A)
D N A fragmentado me Desnaturalizacin Trmica T o C Reasociacin al bajar la Temperatura k
B]
: fraccin de molculas de una sola hebra
C)
f
+
1 = 1 + k C ot
1,0 0,5
f = fracci'on de mol'eculas monofibrilares k
k =
Cte. de Velocidad de reaccin
10
-- 4
10
Co t
C o = Concentracin del DNA t = tiempo
Fig 20a - 14. Separacin y reasociacin de hebras del DNA. Fig 20b - 14. Cintica de reasociacin de las hebras del DNA Fig 20c - 14. Reasociacin del DNA.
Por el anlisis anterior se puede estudiar el grado de parecido entre un gen y sus similares dentro de una misma especie y tambin entre dos especies distintas. Mientras mejor aparee el DNA monocatenario de una especie con la hebra de la otra especie, ambas estarn
693
Hctor Rocha L. DNA
mayormente relacionados entre s. De esta forma se ha demostrado que el Chimpanc pigmeo difiere del hombre en solo un 1% de sus secuencias y que el Orangutn difiere en un 4,5%, siendo el ms distinto. El DNA repetitivo que se encuentra cerca de los centrmeros del cromosoma es de tamao pequeo e hibridiza mucho ms rpidamente que aqul de largo tamao y heterogneo. Este DNA se emplea en la actualidad en pruebas de paternidad al estudiar la fragmentacin de sus trozos por medio de enzimas restrictivas (solo cortan el DNA doble hebra en un centro de simetra bicatenaria) y electroforesis entre los posibles familiares y no familiares del vstago.
d) Absorcin de luz:
Las bases nitrogenadas absorben luz UV a 260 nm (Fig. 21 - 14) y el grado de absorcin aumenta cuando una doble hebra en solucin, se descompone exhibiendo sus bases nitrogenadas a la luz incidente. Este efecto se conoce como Hipercrmico. En el caso contrario cuando se baja la temperatura de un DNA que se encuentra separado, se produce el efecto Hipocrmico, ya que ambas hebras se aparean nuevamente y ocultan sus bases disminuyendo la absorcin de la luz UV.
e) Reparacin del DNA.
El DNA puede sufrir ya sea lesiones de origen exgeno por el medio ambiente que lo rodea y tambin del tipo endgeno. Este ltimo ocurre cuando el apareo entre las bases no es correcto, es decir las DNA pol I y III introducen un error en el apareo de las bases con un promedio de 1 en un total de 104 bases. Sin embargo se ha descubierto que casi todas las DNA polimerasas de origen bacteriano tienen una actividad correctora por la que reparan las secciones mal apareadas del DNA. Este tema se abordar ms adelante.
A bs.
E fe c to H ip e r c r m ic o E fe c to H ip o c r m ic o
220
260
280
( nm )
Fig 21 - 14. El DNA de una sola hebra absorbe mayor cantidad de luz UV que el DNA duplohelicoidal por tener sus bases descubiertas.
f) Daos que puede experimentar el DNA.
694
Hctor Rocha L. DNA
La doble hebra no es inmutable y puede experimentar una serie de modificaciones fsicoqumicas que en caso de no ser reparadas acarrean una modificacin en el control o la expresin de los genes. En la Tabla 2-12, se pueden observar algunas de las lesiones a que se encuentra expuesto el DNA.
TABLA 2 - 14 Lesin del DNA Perdida de una base CAUSA Remocin por medio cido o temperatura. 2x104 purinas/clula da en eucarionte a 37oC. Radiacin ionizante GAMA, agentes alquilantes, diol epxidos derivados del cigarrillo. Deaminaciones espontaneas: C-->U, A->Hipoxantina Agentes qumicos que se intercalan, Ej.:Acridina Radiacin U.V. Radiacin ionizante, tipo o rayos X
Base alterada
Base incorrecta Delecin/Insercin Dmeros de Timina Ruptura de las Hebras
g) Mutaciones en el DNA.
Las mutaciones (Figs. 22-14 y 23-14) que cambian el marco de lectura para la sntesis de una protena pueden ser por delecin o la insercin de una base en la secuencia de la hebra. Otro tipo de mutaciones solo afectan a un solo triplete y se traducen en un solo aminocido cambiado en la protena y su mecanismo es por transicin, en que una Purina se cambia por otra Purina o transversin en que se cambia una Purina por una Pirimidina o viceversa.
695
Hctor Rocha L. DNA
TIPOS DE MUTACIONES .
A) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA
CODON DE INICIO CODONES DE
: AUG
Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Lys - Glu - Val - Glu - Pro U
: UAA UAG UGA
TERMINO
INSERCION
B) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA AUG UUU UCU UAU CGG AAU GGA AGU UGA
Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Asn - Gli - Ser

A
DELECION
C) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA AUG UUU UCU UAU CGG AGG AAG UUG AAC CUU
Met - Phe- Ser - Tyr - Arg - Arg - Lys - Leu - Asn - Leu - ETC - ETC
Fig. 22 - 14. a) Secuencia normal de un gen. b) Se produce la insercin de Uracilo en el triplete AAG que pasa a AAU-G. c) El triplete AAG pierde Adenosina y pasa a ser AG-G.
A continuacin se explica detalladamente cada una de estas mutaciones y se puede empezar analizando las que ocurre cuando se introduce una base como Citosina* en el lado 3' de la hebra cebadora. La Citosina no aparea con la Adenina de la hebra Templada: 3' A G C T G C A C T A G 5' Hebra Madre 5' T C G A C G C*- - - - - 3' Hebra Hija En este ejemplo la base mal apareada puede ser removida junto con otras vecinas por la capacidad exonuclesica 3'--> 5'de la DNA pol I o la DNA pol III de E. Coli y el sitio puede ser repavimentado con la base correcta. Esta capacidad es tambin denominada EDITORA en las DNA pol bacterianas y animales. Otro ejemplo de mutacin ocurre cuando una molcula plana como el Benzopireno (alquitrn de cigarrillo) o las Aminas cclicas (carne a las brazas) se intercalan en el DNA separando las bases. En estos casos se produce una mutacin por cambio del marco de lectura. Esto significa que una protena puede ser normal en su secuencia aminoacdica hasta el punto de la mutacin y desde este lugar se salta en la lectura una o dos bases por la presencia de la molcula fornea que se encuentra intercalada en la secuencia. De esta manera la protena es totalmente distinta desde el triplete de la mutacin en adelante y en este caso la secuencia anormal puede en algunos casos detenerse prematuramente cuando se forme el codn que no codifica para ningn aminocido (debido al desfasamiento de la lectura) o continuar an ms all de su terminacin normal, hasta que se forme alguno de los codones de terminacin por similar razn a la anterior.
696
Hctor Rocha L. DNA
Igual cosa ocurre si se intercala una base extra en una de las hebras como se observa en la figura 19 - 14, donde la secuencia desde el lugar de la mutacin en adelante es distinta a la original. Mutaciones por Delecin ocurren cuando se pierde una base por Depurinacin espontanea, la que puede ser llevada a cabo por la Temperatura o la acidez del medio. En este caso se pierde el marco de lectura, ya que la base que falta para la lectura de un triplete se toma del siguiente alterando la protena desde aqu en adelante en su secuencia (Fig. 19 - 14). En el caso de mutaciones por Transversin, es decir el cambio de una Purina por una Pirimidina o de Transicin con el cambio de una Purina por otra Purina o de una Pirimidina por otra Pirimidina, ocurre que se altera en la secuencia de la protena solo el aminocido correspondiente al triplete afectado (Fig. 20 - 14). Si ocurre que este aminocido tiene entre cuatro a seis tripletes para su codificacin, este tipo de mutacin puede ser silente. Esto significa que la mutacin ocurre en el DNA, pero no se manifiesta en la Protena, ya que el nuevo triplete producido an codifica para el mismo aminocido. De acuerdo a este postulado la primera y segunda base de un triplete afectan ms la identidad de un aminocido que la tercera base. Esta ltima no es importante ya que el cdigo gentico es degenerado o ambiguo. Lo que significa que distintas combinaciones pueden an codificar para el mismo aminocido. La expresin de la mutacin siempre depender de los mecanismos correctores de la clula y en el caso de que esta sobrepase la correccin, depender del sitio y el nivel donde se produzca. Si es en los elementos de control de la expresin de un gen, el resultado ser catastrfico, pero si ocurre en las zonas no codificadoras es probable que no ocurra ningn efecto, excepto cuando ocurre en las zonas repetitivas como se observar posteriormente.
697
Hctor Rocha L. DNA
h) Dao por luz UV.
La luz Ultravioleta por tener la longitud de onda de mayor energa del espectro induce daos en el DNA especialmente en aquellos lugares donde un par de bases nitrogenadas como la Timina se encuentran vecinas en la misma hebra, (Fig. 23 - 14). As tenemos que en una clula de la dermis en un da de playa, dos timinas vecinas pueden dar origen a un aducto formado por un Ciclo Butilo entre los dos anillos de Timina. Esta unin produce una pequea joroba en el DNA que si persiste en la replicacin del DNA, las dos Timinas no tendrn representacin como dos Adeninas en la hebra hija y en el caso de sintetizarse una protena se producir un salto en la lectura de las Timinas lo que se traducir en una mutacin por delecin. En los humanos existe la enfermedad denominada Xeroderma Pigmentosa, en que la piel se mancha fcilmente bajo la exposicin de la luz solar. Esta enfermedad presenta una alta susceptibilidad al desarrollo de carcinomas y melanomas, donde se sospecha la existencia de varios genes involucrados en la reparacin del DNA y que pueden encontrarse defectuosos por esta razn. En este caso las enfermedades son clnicamente similares, pero molecularmente pueden tener distintos orgenes. En bacterias el fenmeno es mucho mejor comprendido y ha sido descrito en detalle (Fig. 2414).
TIPOS DE MUTACIONES .
A) AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA
CODON DE INICIO CODONES : U A A DE UAG UGA : AUG
Met - Phe - Ser - Tyr - Arg - Lys - Glu - Val - Glu - Pro G
TERMINO
TRANSICION
B ) AUG AUG UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA UUU UCU UAU CGG GAG GAA GUU GAA CCU UAA
Met - Phe - Ser - Tyr - Arg - Glu - Glu - Val - Glu - Pro C
TRANSVERSION
C ) AUG AUG Met UUU UCU UAU CGG AAG GAA GUU GAA CCU UAA UUU UCU UAU CGG CAG GAA GUU GAA CCU UAA Phe - Ser - Tyr - Arg - Gln - Glu - Val - Glu - Pro
Fig. 23 - 14. a) Secuencia normal de un gen. b) Mutacin por Transicin donde Adenina es reemplazada por Guanina. c) Transversin donde Citosina es reemplazada por Citosina.
698
Hctor Rocha L. DNA
Las protenas UvrA y UvrB participan en la reparacin unindose a la joroba del aducto y lo desenrollan con la energa del ATP. Luego una tercera protena, UvrC se une a las otras dos e induce cortes de 12 nucletidos, los que se desenrollan por la accin de la helicasa II. Este hueco es posteriormente relleno por la DNA pol I y a continuacin la enzima DNA ligasa completa la reparacin cerrando los extremos libres.
Reparacin de ADN daado por luz U V.
por sistem a de reparacin Uvr ABC. Luz UV .
se separan cerca de 12 bases de la hebra daada .
D N A pol I cierra la brecha .
Accin de la LIGASA.
P
ATP ADP P
P P OH
T T
T T
T T
OH
T T
OH
Uvr A
Uvr B
Uvr C
Corta la seccin de 12 nucleotidos y con Helicasa II se remueve el fragmento
Ambas protenas desenrrollan la seccin de ADN con joroba . Requieren de ATP .
Fig 24 - 14. La reparacin de los dmeros de Timina en E. Coli se emplea de modelo para el estudio de la reparacin del DNA en humanos.
Volver inicio
al
699
Hctor Rocha L. DNA
14) REPLICACION DEL DNA.

Durante la replicacin del DNA descrita en procariontes intervienen una serie de protenas que se catalogan en la Tabla 3 - 14. Estas protenas son de varios tipos y entre ellas encontramos a las protenas estabilizadoras, las enzimas replicadoras y aquellas protenas que evitan la formacin de nudos al desenrollar el DNA.
TABLA 3 - 14
PROTEINAS NECESARIAS PARA INICIAR LA REPLICACION DEL DNA.
Protena Protena DNA A
PM kD 50
Protena DNA B o 300 Helicasa Protena DNA C 29 HU Primasa o protena G SSB RNA polimerasa DNA topoisomerasa II o Girasa 19 60 75,6 454 400
N de subunidades Funcin 1 Abre la doble hebra en lugares especficos en el origen 6 Desenrolla DNA 1 2 1 4 6 4 Requerida para la unin del DNA B en el origen Protena similar a la Histona. Se necesita para el inicio. Sintetiza RNA cebadores Se une a una sola hebra del DNA Facilita la actividad de la DNA A Reduce la tensin generada por el por el desenrrollamiento del DNA.
En la Tabla 4 - 14, se aprecian las caractersticas de las distintas DNA polimerasas descritas hasta la fecha en E. Coli.
La DNA pol I es la que se encuentra en mayor proporcin, sin embargo es lenta para la replicacin del DNA en bacterias, pero tiene actividad exonuclesica 5' ---> 3', hidrolizando y rellenando sectores del DNA que no aparean.
La DNA pol II acta para reparar sectores especficos del DNA y la DNA pol III es la enzima principal involucrada en la replicacin del DNA bacteriano (Fig. 22 - 14). La DNA pol III es multimrica con ms de diez subunidades que poseen distintas actividades polimerizadoras y editoras.
TABLA 4 - 14.
700
Hctor Rocha L. DNA
COMPARACION ENTRE DNA POLIMERASAS DE E. COLI.
Gen Estructural Subunidades PM kD 3'-->5'Exonucleasa Editora 5'-->3'Exonucleasa Vel. Polimerizacin.(nct/sg ) NCT agregados antes de la disociacin
I polA 1 103 Si Si 16-20
II PolB >4 88
III polC > 10 900
No 7
250-1000
3-200
> 10000
> 500000
En la Tabla 5-12, se caracterizan las subunidades que constituyen la DNA polimerasa III:
TABLA 5 - 14 SUBUNIDADES DE LA ENZIMA DNA pol III EN E. COLI.

Subunidad Alfa Epsilon Deta Tau Gama Delta Delta' Xi Ps Beta PM kD 13,2 27,0 10,0 71,0 52,0 35,0 33,0 15,0 12,0 37,0 Gen polc(dna E) dnaQ (MutD) hho lE DnaX DnaX HolA HolB HolC Hold DnaN Funcin Polimerizacin 3'--> 5'Exonucleasa Editora
ATPasa requerida para ptima actividad
El lugar desde el que se inicia la replicacin se denomina oriC y se encuentra en un sitio especfico del cromosoma gigante en la bacteria E. Coli. Este sitio esta caracterizado por tener un sector con cuatro secuencias repetitivas de 9 pares de bases (4 de 9) y otro sector
701
Hctor Rocha L. DNA
con tres secuencias de 13 pares de bases repetitivas (3 de 13), dando un total de 245 pares
D N A Polimerasa I I I Holoenzima de E . Coli.
Fig 25 - 14. Estructura general de la DNA pol III.
de bases (Fig. 23 - 14).
3 secuencias de 1 3 pares de bases en tandem GATCTNTTNTTTT
4 secuencias de 9 pares de bases TTATCCACA
Fig. 26 - 14. Secuencias repetitivas en Ori C.
En la prctica se suele dividir el proceso de replicacin en tres etapas: Iniciacin, Elongacin y Terminacin. Volver al inicio
702
Hctor Rocha L. DNA
a) INICIACION:
Esta etapa parte con la unin de cerca de 20 a 30 molculas de protena bajo la accin del ATP al sitio Ori C con 4 sectores repetidos de 9 pb con la secuencia TTATCCACA (Fig. 27 14). Este sitio debe poseer DNA circular superen rollado negativamente como exigencia. Luego bajo la presencia de la protena HU similar a la histona, se forma un "loop" u horquilla con el DNA que se desaparea en la secuencia GATCTNTTNTTTT abrindose. Posteriormente se unen a este sitio la protena DNA B ayudada por la protena DNA C. La protena DNA B acta como helicasa en presencia de ATP y desenrolla el DNA oriC en forma bidireccional creando una burbuja de replicacin con dos horquillas de replicacin en cada extremo con la ayuda de las protenas DNA B y C.
Ori C Secuencias repetitivas Cromosoma de E. Coli DNA Circular Protenas dna A requerida para la iniciacin O r i C 9 - mers Protenas dna B Ambas protenas dna C son requeridas en el 30 oC primosoma 9 - mers 13 mers
DNA Super Enrrollado
13 mers
Fig 27 - 14. Etapa de Iniciacin. El trmino "mers" se refiere a las secuencias repetitivas.
En este momento es posible la unin de la protena SSB (Protenas estabilizadoras) para estabilizar el DNA abierto junto a la DNA Girasa (DNA topoisomerasa II). La Girasa corta la hebra para desenrollar y aliviar la tensin producida por la Helicasa y la une posteriormente con la energa del ATP.
Volver inicio
al
703
Hctor Rocha L. DNA
b) ELONGACION:
En esta etapa se sintetizan la hebra lder o continua de 5'--->3' y la hebra discontinua o retrasada que debiera ir de 3'--->5, sin embargo existe aqu un problema ya que la DNA polimerasa III y I avanzan en la direccin 5'--->3' solamente (Fig. 25a-12). La hebra lder o continua se sintetiza con la ayuda de la enzima PRIMASA del complejo PRIMOSOMA. Esta es una RNA pol que produce una hebra de 10 a 60 ribonucletidos de RNA cebador en el sitio de origen. Este RNA cebador o "primer", aporta su lado 3'OH para la unin del 5' Alfa Fosfato del primer Deoxiribonucletido del DNA que se esterifica a este lugar por medio de la enzima DNA polimerasa III (Fig. 25b - 14). Esta enzima solo avanza replicando en direccin 5'--->3' de acuerdo con el avance simultneo de la burbuja de replicacin en la misma direccin 5'--->3'. En la hebra discontinua o retrasada se presenta el problema de la falta de bidireccionalidad de la DNA pol III (Fig. 25c - 14). Por lo tanto un conjunto agrupado de protenas en el complejo denominado PRIMOSOMA( 7 protenas distintas) subsana este problema. En este caso se forman varios RNA cebadores o "primers" de 10 a 60 ribonucletidos por accin de la Primasa del PRIMOSOMA en direccin opuesta al avance de la burbuja de replicacin. Posteriormente a los cebadores de RNA se les unen trozos de DNA en su lado 3'libre por accin de la DNA polimerasa III, formando el fragmento mixto RNA-DNA conocido como fragmento de Okasaki (Fig. 25d - 14). RNA DNA Fragmento 5'---------->3'-P- 5'------------>3' de OKASAKI. unin fosfodister
Fig. 28 - 14. Horquilla con bucle permitira la sntesis de la hebra Retardada en el mismo sentido de la hebra Lder coincidiendo con el movimiento de la Helicasa. Las horquillas permiten el avance del replisoma en ambos sentidos.
Cuando se han completado varios de los fragmentos de Okasaki en ambas direcciones de la burbuja, la DNA polimerasa I del PRIMOSOMA hidroliza los RNA cebadores y simultneamente los reemplaza por DNA (Fig. 25d - 14). La brecha entre los distintos trozos es luego cerrada por una LIGASA del PRIMOSOMA, que forma los enlaces entre el final 3'OH de un deoxirribonucletido y el inicio 5' Fosfato del otro, formando de esta manera el enlace fosfodister y dndole continuidad a la hebra recin sintetizada (Fig. 25e - 14 y 25f - 14). Ocurre el caso de que la hebra retardada puede ser tambin sintetizada en la direccin del avance de la horquilla cuando se produce un "loop" o bucle alrededor de la DNA polimerasa
704
Hctor Rocha L. DNA
III (Fig. 26 - 14). De esta manera ambas hebras de DNA con sus respectivas DNA pol III, la lder (continua) y la retardada (discontinua), se encontrarn avanzando en la misma direccin de la horquilla (Fig. 26 - 14) a medida que el bucle se traslada en la misma direccin en que se mueven las Topoisomerasas. Volver al inicio
c) TERMINACION
Ambas horquillas de replicacin se encuentran en el otro extremo del cromosoma circular del E. Coli, donde intervienen las Topoisomerasas Tipo II. Estas enzimas son necesarias para la separacin de los dos pares de hebras madre-hija. Las protenas Ter especifica la terminacin evitando que las Helicasas desenrollen ms DNA impidiendo el avance de la horquilla. Algunos detalles de la replicacin an se desconocen, sin embargo es conocido que pueden aparecer varias burbujas de replicacin simultneas cuando la bacteria cuenta con un buen aporte de nutrientes. La replicacin en Eucariontes es de 50 nucletidos por segundo lo que es solo un dcimo de la rapidez con que ocurre en los Procariontes, pero empieza en sectores denominados sitios de replicacin autnomos y existen varios de estos sitios por cromosoma y a la vez varias burbujas de replicacin autnomas. En Eucariontes las DNA polimerasas son tres, ALFA (), DELTA () y EPSILON (). La replica la hebra retardada y la la hebra lder, mientras que la tiene actividad reparadora, adems acta en conjunto a otras protenas estabilizando y facilitando el ensamblaje de los sistemas replicadores.
705
Hctor Rocha L. DNA
O
O P O
H
O N
H
2 N
5'
CH
N 2 O O O OH O N N 2 O O O O P O CH 2 O OH O N N N
P O CH
H
2
O O P O CH
OH O N
N N 2 O N N
H
2
3'
Fig. 29 - 14. Hebra de RNA.
OH
OH
Volver inicio
al
15) RNA
El RNA est formado por solo una hebra de Poliribonucletidos al igual que una de las hebras de DNA y se dirige desde el extremo 5'Fosfato al 3'OH. Los Ribonucletidos se encuentran unidos por enlaces fosfodister y poseen las siguientes bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina y Uracilo (Fig. 27 - 14). La molcula tiene en su Ribosa un grupo 3' OH para el enlace fosfodister y un grupo 2'OH que la hace susceptible a la hidrlisis alcalina. La molcula de RNA puede aparear consigo misma, pero no forma hlices duplohelicoidales similares al DNA debido al impedimento estrico de la Ribosa con 2'OH que impide la torsin adecuada. El RNA es una molcula que posee variadas funciones y entre sus diversas molculas se puede contar al RNAm que lleva la informacin desde el DNA a la protena, al RNA ribosomal que interacciona con las protenas del Ribosoma (RNAr) e interviene en el reconocimiento y fijacin del RNAm a los ribosomas. Otras de estas molculas se conocen como RNA de transferencia (RNAt) que lleva aminocidos al sitio de ensamble en el Ribosoma, tambin se pueden citar al RNA cebador, para la DNA pol III en la formacin de los fragmentos de Okasaki y an se le puede encontrar como una enzima (Ribozima) en los Intrones de los
706
Hctor Rocha L. DNA
transcritos primarios (RNA recin transcrito que lleva al RNAm) que son capaces de cortar y empalmar Exones de forma autocataltica. La secuencia aminoacdica de una protena esta determinada por la secuencia de los tripletes en el DNA. Cada triplete esta formado a su vez por tres bases y codifica para un aminocido de la protena. La informacin total para la secuencia aminoacdica de cada protena reside en el Cdigo Gentico (Fig. 28 14). Esta informacin es transportada por el RNAm y leda por la maquinaria que da origen a la protena. En el Cdigo Gentico cada aminocido de los 20 conocidos, est codificado por uno o ms tripletes de tres bases. En general existen 64 tripletes para codificar los 20 aminocidos. Dos aminocidos estn codificados por solo un codn, como es el caso de la Metionina por AUG y Triptfano por UGG, mientras que Leu y Arg tienen seis codones para cada uno de ellos, adems existen
Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val
Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala
Tyr Tyr No codifica No codifica His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu
Cys Cys No codifica Trp Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly
U C A G U C A G U C A G U C A G
Fig. 30 - 14. Cdigo Gentico.
tres codones que no codifican para aminocidos e indican el final de una protena y son UAA, UAG y UGA. Todas las protenas empiezan con el aminocido Metionina (AUG) en Eucariontes, mientras que en bacterias empiezan con Formil-Metionina. El cdigo gentico es universal entre comillas, ya que en ciertos organismos y las Mitocondrias es un tanto diferente lo que indica que an se encuentra evolucionando. Su origen segn las nuevas teoras puede provenir a partir de materiales encontrados en cometas orgnicos, sistemas marinos hidrotermales o bien de un mundo primordial regido por el RNA como origen de genes y protenas.
Volver inicio
al
707
Hctor Rocha L. DNA
16) PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE RNA Y DNA EN EUCARIONTES RNA a) Posee una Ribosa con 2'OH que no le permite formar una hlice similar al DNA cuando aparea consigo mismo DNA a) La Deoxiribosa tiene un 2' H que le permite formar la doble hlice
b) Posee en su secuencia Uracilo en vez de Timina c) Se hidroliza con NaOH
b) En vez de Uracilo posee Timina
c) Estable a la hidrlisis alcalina
d) En su estructura reside la informacin o d) Solo almacena informacin la actividad cataltica.

e) Interacciona con las protenas formando las Ribonucleoprotenas y Ribosomas
e) Interacciona con protenas en los Nucleosomas y los complejos activadores y silenciadores f) Se forma por Replicacin todo el DNA como DNA--> DNA
f) Se forma por de transcripcin selectiva de los genes de la forma DNA --> RNA o pasa informacin de la forma RNA --> DNA en los retrovirus g) Existen los siguientes tipos: RNAm (mensajero), RNAr (ribosomal), RNAt (transferencia), Ribozimas.
g) Existen varios tipos como: DNA gnico y DNA basura que comprende a su vez al DNA repetitivo DNA satlite DNA minisatlite, etc.
Volver inicio
al
17) TRANSCRIPCION DEL DNA EN PROCARIONTES Y EUCARIONTES.

La transcripcin del DNA es el paso de la informacin desde una de las hebras del DNA al RNA mensajero, tanto en Procariontes como en Eucariontes. En Eucariontes se lleva a cabo este proceso mediante la accin de tres RNA polimerasas y el comienzo ocurre antes del sitio real de codificacin. La nueva hebra de RNA crece en la direccin 5'--> 3' y proviene de la hebra 3'<-- 5', mientras que la hebra 5'-- 3' del DNA es totalmente idntica al RNA naciente excepto que en vez de Timina tiene Uracilo. El RNAhn es de gran peso molecular cuando est recin transcrito y tiene tanto exones como intrones. Los Exones son los elementos que darn origen a la protena y cada uno de ellos aportar una caracterstica especial a esta. Los intrones no sern expresados como protenas y ellos mismos procedern a catalizar en algunos casos el corte y empalme de los exones durante la etapa de procesamiento. En el extremo 5' se adicionar la estructura CAPUCHON (CAP) formada por una Guanina metilada que aporta un P, ms dos fosfatos del primer nucletido adicionado como Gmppp. La funcin del CAP parece ser el aumento de la afinidad por los ribosomas.
708
Hctor Rocha L. DNA
En el extremo 3' se encuentra la secuencia AAUAAA, la cual es poliadenilada para aumentar la estabilidad del RNAm procesado a las Ribonucleasas. Esta cola de poli A disminuye cuando envejece el RNAm. Una vez que el RNA ha madurado o ha sido procesado con estos tres cambios CAP, Poli A y corte y empalme de exones, el RNAm aparece en el citoplasma, ya que los cambios mencionados anteriormente ocurrieron en el ncleo. A continuacin se detallan las principales diferencias en la transcripcin de Procariontes y Eucariontes:
Procariontes
La RNApol tiene dos subunidades Alfa similares y dos Beta distintas: (Alfa)2 Beta-Beta' de 500kD en total. Existe una RNA polimerasa con un factor de inicio Sigma y otro de terminacin Rho. La RNA pol reconoce secuencias especficas de inicio junto al factor SIGMA en el PROMOTOR
Eucariontes
Las RNA pol tienen de 10 a 15 polipptidos y un origen comn con las de E.Coli. Existen tres tipos distintos de RNA polimerasas especializadas. RNApol I transcribe RNAr 45S ubicada en el nuclolo RNApol II transcribe RNAm y RNA procesador. RNApol III transcribe RNAt ubicada fuera del nuclolo y RNAs de histonas.
Hay distintos factores SIGMA para cada serie de El control de la transcripcin depende de genes u operones que se transcriben elementos CIS, los cuales son segmentos de DNA policistronicamente con secuencias especficas para intensificar o inhibir la transcripcin mediante los elementos TRANS o Protenas tanto Activadoras como las Represoras (silenciadoras) que se unen a los elementos CIS La holoenzima (RNApol+Sigma,) desenrolla la Existen factores de iniciacin, elongacin y de predoble hebra. iniciacin poco conocidos (Figs. 29a - 12, 29b - 12 y 31 - 12). El PROMOTOR tiene la secuencia especfica de El PROMOTOR contiene las secuencias de consenso de TTGACA y TATAAT a -35 y -10 pb consenso CCAAT, GC y TATA a -110, -40 y -25 corriente arriba de la regin del inicio del RNAm. pb respectivamente, en la direccin corriente -35 pb -10 pb +1 arriba de la regin codificadora: TTGACA---------TATAAT--/- . -110 -40 -25 +1 -CCAAT--/--GC-/-TATA--/--A estas secuencias se unen la protena TATA y los factores basales que permiten la unin de la RNA pol II Entre los Factores basales de Transcripcin (Fig. 30-12) tenemos al TFIID (100kD) o protena TATA que se une a la misma caja TATA corriente arriba de la regin codificadora. TF = Transcription Factor El factor TFIIB se une luego a la RNApol II y ambos se unen al DNA, donde hidrolizan ATP para abrir la doble hebra. Inmediatamente empieza la transcripcin con adicin de TFIIE y nucletidos. Esta transcripcin es de baja intensidad.
Los cambios que existen en la secuencia de los Por esta razn se requiere de los "enhancers" o
709
Hctor Rocha L. DNA
TF I I B
Transcripcin
R N A pol
Transcripcin
T F IID
Sitio de inicio de la transcripcion + 1
E l D N A se TF I I E TF I I S abre en l de N C T sitio iniciacin A TP A D P
5'
TF I I B T F II D
R N A pol I I
C aja T A T A _ 30 pb
R N A
T F II D
C O M PLEJO
Fig. 31 - 14. El inicio de la transcripcin depende de la unin primaria de los Factores Basales que facilitan la entrada a la RNApol. TF IID se une a TATA y el factor TF II B se une a la RNA pol II. El factor TF II B acta como ATPasa en el Complejo. El DNA se funde abrindose para iniciar la Transcripcin con los factores restantes TF II E y TF II S ms los NCTs o Nucletidos.
promotores afectan la afinidad con que la RNA pol intensificadores o exacerbadores de la eficiencia se une y los transcribe de unin de la RNA pol II. Los intensificadores se unen a la regin GC y actan favoreciendo la formacin de loops o repliegues del DNA que facilitan la entrada de la RNA pol II (Figs. 31-12 y 32-12). En procariontes los genes poseen protenas En Eucariontes tambin existen secuencias inductoras y represoras que se unen a regiones silenciadoras a las cuales se unen protenas adjuntas al promotor o en el operador mismo que represoras que inhiben la expresin del gen. se encuentra dentro del promotor. Ambas se activan por seales, moleculares (Fig. 30 - 12). Dentro de los promotores hay pequeas secuencias de 6 a 20 pb denominadas motivos donde se unen las protenas reguladoras Los motivos son tambin las regiones intensificadoras y silenciadoras
710
Hctor Rocha L. DNA
B son Secuencias Reguladoras, m ientras que X , Y y Z son Genes Inducibles
Sitio de unin de la Protena activadora
OPERADOR donde se une la protena Represora
Genes Inducibles Policistrnicos
PROMOTOR: Sitio de unin del a RNA pol y donde se encuentran las secuencias - 35 pb TTTACA y - 10 pb TATG TT Fig 32 - 14. Control de los genes inducibles en bacteria.
PO S IC IO N D E LAS S E C U EN C IAS A C TIV A D O R A S , IN TE N S IFIC AD O R AS O EN H A N C E R S .

INICIO TERM INO
a)
R egin corriente arriba del G en
R egin corriente abajo del gen G E N
- 200
C C A A T G G G C G
- 40
+ 1
TA TA
R egin C odificadora
b)
TA TA
Regin Codificadora
EXON
IN TR O N Activador de 0,1 a 10 kB ubicado antes de la regin codificadora INICIO
EXON
Regin activadora en el Intron TERM INO
Activador a 10 kB del trm ino
Fig. 33 - 14. a) Secuencias de consenso desde -200 pb hasta la regin codificadora. b) Las secuencias activadoras pueden encontrarse corriente arriba, en el Intrn o corriente abajo del gen.
711
Hctor Rocha L. DNA
La transcripcin es policistrnica, es decir consta Los puntos anteriores se resumen en el modelo de varias cadenas polipeptdicas con mltiples desnudo de la transcripcin del DNA. En este las secuencias activadoras y silenciadoras se unen a seales de inicio y trmino los factores del mismo nombre para facilitar la disposicin de los factores basales y la eficiencia de la RNApol (Figs. 34 - 14)
Factores basales
R N A polimerasa
Secuencia activadora ubicada curso arriba
Promotor proximal
Regin codificadora
Caja T A T A Lugar iniciador de la transcripcin Protenas Activadoras
R N A polimerasa R N A mensajero
R N A mensajero
Fig. 34 - 14. Activacin gnica. Modelo del DNA desnudo donde las secuencias intensificadoras junto a sus factores activadores ms la presencia de los factores basales pliegan al DNA y ayudan a la entrada de la RNApol.
712
Hctor Rocha L. DNA
EXPRESION NO MODULADA O BASAL

E F B RNA pol H
REGION CODIFICADORA
CAJA TATA
PROTEINA DE UNION FACTORES BASALES
Fig 35 -14. Expresin basal de baja intensidad
IR eg io ne s Inte nsifica dora s
R egio ne s S ilec iado ra s
P rotena s A ctivado ra s
P rotena R epre so ra s C O A C TIV A D O R A S
H E RN A pol
R egin C odific ad ora
C aja T A T A
P rotena de uni n a la caja TA TA Factore s ba sa le s
Fig. 36 - 14. Los factores intensificadores y silenciadores se unen a sus respectivas secuencias para interaccionar con los factores basales modulando la eficiencia de la Transcripcin por la RNApol.
713
Hctor Rocha L. DNA
El modelo de la transcripcin del DNA con histonas en Eucariontes atribuye a las histonas un papel encubridor de la caja TATA y para que se unan a ella los factores basales, las protenas activadoras corriente arriba deben interaccionar con el Nt de la histona H4 (Fig. 34-12); que forma parte del nucleosoma ms cercano. A continuacin el nucleosoma se desarma dejando la caja TATA libre para la unin de los factores basales apareciendo un bajo nivel de transcripcin. En seguida el DNA se repliega por accin de las protenas activadoras que interaccionan con los factores basales o coactivadores para tener un nivel mximo de transcripcin La transcripcin policistrnica es: AUG-//-UAA--AUG-//-UAA--AUG-//-UAA El gen es continuo en procariontes La transcripcin es monocistrnica es: AUG --//--UAA. El gen en Eucariontes es discontinuo con EXONES codificadores e INTRONES no codificadores.
Transcripcin y Traduccin son simultneas en El RNAhn contiene al RNAm procariontes
La terminacin puede ocurrir con el factor Rho o sin l. Se forma en el RNA transcrito una horquilla autocomplementaria cerca del final donde se debilita el apareamiento RNA-DNA entre poli Us del RNA con poli As del DNA y se facilita el apareamiento RNA-RNA transcrito formando una horquilla poli G-C y poli C-G.
El RNAhn sufre procesamiento para pasar a RNAm. El RNAhn esta intercalado por INTRONES que no se traducen y EXONES que si se traducen. El extremo 3 lleva un poli A (200-250 ncl)) integrado en el ncleo Post-transcripcionalmente al RNAhn que despus madura a RNAm
Existe una secuencia denominada SHINE- Otra modificacin en el extremo 5' es la adicin de DELGARNO previa al AUG del RNAm en el extremo CAP (m7G) que es el 7-metilguanilato en unin 5'--5 5'que aparea con el RNAr 16S del RNAm. Est tambin presente en el RNAhn. El RNAhn debe sufrir corte y empalme de exones. Existen 4 formas de corte y empalme, 2 son catalizadas por el Intrn y dos por enzimas proteicas RNAsn 1,2,4,5,6 y las ribonucleasas. El RNAm solo tiene extrones, una 5'-CAP y una. 3'poli A, con lo que sale del ncleo.
Podemos decir finalmente que en Eucariontes cuando un gen se activa, debe unirse un grupo de protenas a la regin promotora proximal donde se encuentra la caja TATA, posteriormente se unen otras protenas y forman el complejo de preiniciacin. Luego se coloca la RNApol en el promotor proximal. Otras protenas se unen curso arriba del DNA y son activadoras lo cual desencadena la produccin mxima de mensajero y son los enhancers o activadores o exacerbadoras o intensificadores como se observa en el esquema: Los intensificadores (Enhancers), son secuencias especficas del DNA o elementos cis donde se unen elementos trans como un complejo receptor-hormona, aumentando la actividad de
714
Hctor Rocha L. DNA
los promotores cercanos tanto para RNASpol I como II. No son en si mismos promotores, pero estimulan la Transcripcin. Se encuentran de 5' a 3' o de 3' a 5, en cualquiera direccin y su efecto mismo pareciera ser un cambio en la conformacin de la doble hebra para aumentar la afinidad por la RNA pol.
Volver inicio
COLA DE H 4 NH2 FACTORES BASALES SECUENCIA ACTIVADORA O INTENSIFICADORA CORRIENTE ARRIBA
al
PROTEINAS ACTIVADORAS
R N A polimerasa
CAJA T A T A
REGION CODIFICADORA
H2A-H2B R N A polimerasa
RESTOS DEL NUCLEOSOMA R N A mensajero
R N A mensajero
Fig 37 - 14. a) Los factores activadores interaccionan con el Nt de la Histona H4. b) El Nucleosoma se descompone y se unen los factores basales a la secuencia TATA. c) Entrada de la RNApol facilitada.
18) PROCESAMIENTO DEL TRANSCRITO PRIMARIO.
715
Hctor Rocha L. DNA
Existen cuatro formas de cortar y empalmar los exones:
I) La primera de ellas ocurre en el Intrn autocataltico (Fig. 38 - 14), con la adicin de un GMP. El grupo 3' OH del GMP acta como nuclefilo sobre el Fosfato de la unin 5'- 3' cortano la unin exn-intrn al extremo 5, para que de esta manera la Guanosina se una al intrn.
U Exon1 5' G 2' OH OH 3' 5' U Exon1 OH 3' OH pO OH 3' P
A OH P 5' GpU Exon2
(GMP)
pO
G 2' OH P
A 2' OH P 3' 5' P
G OH 3' P
U OH P Exon2
3' 5'
El empalme se produce por el ataque del grupo 3' OH del Exn a la unin ester situada al extremo del Intrn
U Exon1 OH 3' P U OH P Exon2
Fig 38 - 14. Corte y empalme Autocataltico de Exones.
Ahora el extremo 3' libre que resta del exn ataca el otro extremo del intrn, para romper nuevamente la otra unin 5'- 3', quedando de esta manera unidos el lado 3' del exn A con el lado 5' del exn B.
II) La segunda forma de corte y empalme (Fig. 39 - 14) es tambin autocataltica y en este caso el intrn mismo aporta el grupo 2' OH de una Adenosina en el centro del intrn y que acta como nuclefilo atacando la unin 5'- 3' cortando la unin exn-intrn al extremo 5'. La Adenosina a su vez queda unida al extremo del intrn formando un circulo o lazo, mientras
716
Hctor Rocha L. DNA
INTRON
C P OH P 2' A U2' G2' OH OH P 5' C OH P U OH 2' A
P
A P OH OH
U P A P OH
5'
Exon 1
Exon 2
3'
U G P
5'
Exon 1
OH 3' 5'
Exon 2
3'
OH
C OH P A U OH U
5'
A P 2'
P
OH
5'
Exon 1
3'
Exon 2
3'
P
3'
OH
Exones empalmados
Intron Circularizado
Fig 39 - 14. Otro mecanismo de corte y empalme de Exones autocataltico.
que en el otro extremo de la unin 5'-3' se produce ahora el ataque en la unin intrn-exn restante por el lado 3' OH del extremo 5' en el exn que acta como nuclefilo, as se
A
Exon 1
Sitio deCorte 5'
AGGUAAGU
Sitio deCorte 3' U ACU A CA AG
5'
3'
Exon 2
U1
U2
3'
R a m a 2' O H
A
U2
B
3'
5'
U1
5' p p p 5' 7 CA mUm UA C GG U C C A m G 5' A G GU A A G U
5' 3'
AG
A U G A U GU U A CU A CA
Exon 1
Exon 2
U1 U5 U4 U4 U6 U6 U4 U6 U5
C
U 2 U 4 Exon 1 U5 U6
Exon 2
U4
5'
U2
U5
U6
UACUA CA
AG
E
Exon 1
3'
U
A A GA
Lazo con e n l a c e 2' , 5' fosfodiester
Exon 2
Fig 40 - 14. Pequeos RNA participan en el corte y empalme de los exones.
empalma al otro exn.
717
Hctor Rocha L. DNA
III) Otra forma de procesar RNAs transcritos primarios es mediante los RNAsn (small nuclear) (Fig. 40 - 14). Cinco de ellos U1, U2, U4 ,U5, y U6 estn asociados a protenas y reconocen sectores de la unin exn-intrn donde cortan y empalman. Las protenas con que se asocian son de 6 a 10 en nmero y algunas son comunes a todos ellos y otras son especficas.
IV) Esta ltima forma de corte y empalme es mediada por la accin de endonucleasas y ligasas que actan en los extremos exn-intrn (Fig. 41 - 14).
5'
EXON!
INTRON
EXON2
3'
Endonucleasa
INTRON
OH
3'
2' 5' EXON! 5'

P P HO
2' 3' ATP Kinasa
EXON2 5'
3'
P P OH
2' EXON2
OH OH
ADP 3' Ligasa 2'
5'
EXON! 3'
5"A 2'
P P
ATP PP 3' EXON2

P
5'
EXON! 3' Fosfatasa

P
O H 2' EXON2
3'
RNAt MADURO
2' EXON! 3' 5'
5'
OH P
OH
2' 3'
EXON2 5'
Fig. 41 - 14. La presencia de enzimas proteicas permite el corte y empalme de este tipo de Exones.
Volver inicio
al
718
Hctor Rocha L. DNA
19) RNA r
El RNA ribosomal en Eucariontes proviene de precursores o transcritos primarios (RNA recin traducido sin haber sido procesado) de gran tamao que se encuentran representados en tandem en el genoma en un nmero cerca de 450 veces en el genoma y que se encuentran presentes en el nucleolo. Su transcripcin se lleva acabo mediante la RNA pol I. Los transcritos primarios o preribosomales son procesados paulatinamente mediante cortes y metilaciones, hasta formar las molculas que definitivamente participan en el ensamble de los ribosomas. En Procariontes el precursor es un RNA 30 S que luego de cortes y metilaciones da origen a los RNA 5s,16S y 23S (Fig. 42 - 14).
Procesamiento de pre RNA r en bacteria.
16 S
4S
23 S
5S
Metilacin
Ruptura
Nucleasa
Nucleasa
16 S
RNAr
4S
RNAt
23 S
RNAr
5S
RNAr
Fig. 42 - 14. La maduracin de un precursor 30S de RNAr en bacteria consiste en la eliminacin de secuencias intermedias y metilacin
En E.Coli hay 7 genes que producen el mismo precursor 30S, pero con distinta secuencia en los espacios entre los cuales se encuentran los precursores. Tambin ocurre que entre las secciones 16 S y 23 S de RNAr, hay secuencias para distintos RNAt en cada uno de los 7. En Eucariontes (Fig. 43 - 14), el precursor de los RNAr o RNA preribosomal es de 45 S y sufre procesamiento en el nucleolo para formar la familia de los RNA ribosomales 5.8 S, 18 S y 28 S.
719
Hctor Rocha L. DNA
P rocesamiento de R N A preribosomal en EUKARIONTES
18S
5.8S
28S
Metilacin
Corte
18S
5.8S
28S
RNAr
RNAr
RNAr
Fig 41 - 14. Formacin de los RNAr en Eucariontes.
El RNAr 5S es formado por otro transcrito distinto, que tambin se encuentra con un precursor representado en el DNA en tandem. Aqu los espaciadores son mayores que en el gen del RNAr 5S. Volver al inicio
20) RNAt
No existe interaccin directa entre los tripletes del Codn del RNAm y los aminocidos, por lo tanto se requiere de una molcula adaptadora denominada RNAt que lee la informacin del RNAm y la traduce en los aminocidos que formarn parte de la secuencia de la futura protena. Los RNAt se encuentran representados por unas 40 a 50 molculas en Eucariontes y por unas 32 en Procariontes. Tienen pesos moleculares que van de 24 a 31kD y con un nmero de 73 a 93 nucletidos donde algunos aminocidos tienen ms de un RNAt. Entre las caractersticas de los RNAt o adaptadores, est la presencia de 7 a 15 bases no comunes en su estructura. El extremo 5' esta fosforilado y puede ser pG, mientras que el extremo 3'OH donde se transporta el aminocido es CCA en todos ellos. Los RNAt tienen cuatro brazos (fig 44-14) y se denominan: 1)brazo Ribotimina-Seudouracilo-Citosina 2)brazo Dihidrouracilo 3)brazo anticodn que aparea con el codn del RNAm y 4)el brazo 3' CCA donde se une el aminocido.
720
Hctor Rocha L. DNA
5'pGUUAUCAGUUAAUUGA A UU 3 ' O H C G U A C G U G C G C G C U A C C G C G C C G G G G C GU U UG C U A A CC GA U C G U AGG C G A U G A G A UU C G A U A U G C A U A C A U A G G C U A
3'OH
Transcrito primario
5' p
Corte
A A U U
U C A C
3'OH G A G G 5' p C G U A C G C U A C G G C C C C G C G U G G G G CG U U C U U GA C G A U A C C G C C G U G C A U A G G C G A G C C C C G C G G A U A G G C G G UU U G U G C C G U U A A C CGA U C A U G A U U AGG C G A G G C U A G A UU A U C G A A U C A A U U A G G C G C A U U A A C
C U C U
A G A
Empalme
A A U 3'OH A C C A G A U
C A C
G U A 3'OH
U A
Procesamiento de RNA t en bacteria y eukarionte.
U A
RNAt
maduro
m
C U C G U G C G G C U C C G C G C C G G C G G T m GU U D GA A C CG mC G D AGG C G A UDU A G A mG C G A U A U G C A U A C A U
5'
Adicin de CCA
mA
G C C
Modificacin de Bases
C U C G U G C G C U G C A G C C C C G C G U G G G CG U UG C U A A U A CC G C G U A GGC G A U G A G A UU C G A U A U G C A U A C U A G U A
5'
A C C A G A
Fig 45 -14. Corte, empalme y modificacin de bases en la formacin de los RNAt.
Los RNAt provienen de precursores de 120 a 150 nucletidos que son transcritos por la RNApol III. A estos transcritos primarios se les acortan los extremos 5' y 3' y se modifican sus bases (Fig. 45 - 14). La enzima aminoacil RNAt sintasa que carga los aminocidos al RNAt, debe reconocer entre los aminocidos y entre los distintos RNAt disponibles. Esto parece que se consigue mediante las bases especiales que se encuentran en los brazos de los RNAt y la conformacin estructural de cada RNAt, de esta manera la enzima sabe cul es el aminocido que le corresponde (Fig. 45 - 14). La verdadera forma de L del RNAt (Fig. 46 - 14), se determin por cristalografa de RAYOS X, en esta estructura existen algunas interacciones entre las bases que no son estrictamente GC y A-U. Las bases se encuentran en algunos casos metiladas y con una secuencia comn a todos ellos cerca del centro de la secuencia UUCG. Un solo anticodn del RNAt puede reconocer ms de un codn siempre que este corresponda al mismo aminocido a causa del "alabeo o bamboleo", como se ver ms adelante. Sucede que la
721
Hctor Rocha L. DNA
Posiciones de identificacin por las Aminoacil'RNAt Sintasas.
posiciones iguales en todos los RNAt
5'
3'
Brazo de unin al aminocido.
posicines de reconocimiento para una o ms RNAt sintasas. Brazo D H U
Brazo T
Brazo extra
Anticodon
Fig. 45 - 14. Sitios especficos en la estructura de los RNAt.
tercera base del codn no se une estrictamente (como bases de Watson y Creek) a la primera base del anticodn. Lo que ocurre en realidad es una unin aproximada, ms dbil que permite mantener la velocidad de sntesis de la protena sin abandonar la especificidad.
Asa
con el ANTICODON
Asa DHU Extremo de unin del Aminocido A C C
Asa T C
3'
5'
Fig 46 - 14. Los RNAt tienen forma de L en su estado natural.
De esta manera Adenina, Uracilo y Citosina en la posicin 3 del Codn del RNAm pueden aparear con Inosina en la posicin 1 del anticodn del RNAt.,mientras que Adenina y Guanina en similar posicin del Codn aparean con Uracilo del Anticodn y Citosina y Guanina del
722
Hctor Rocha L. DNA
Codn aparearn con Guanina del Anticodn. Por otro lado Guanina del Anticodn puede aparear normalmente con Citosona del Anticodn y Uracilo con Adenina del Anticodn. Volver inicio al
21) LOS RIBOSOMAS.

Los ribosomas son complejos ribonucleoproteicos formados por distintas molculas de RNAr y protenas(Fig. 47 - 14). Entre ambos forman el andamiaje para la unin del RNAt cargado con su aminocido y el RNAm con la secuencia de la protena a sintetizar. En el Ribosoma el aminocido abandona al RNAt y se ensambla con su vecino de uno en uno siguiendo las instrucciones de orden y secuencia escritas en el RNAm. Si estas reacciones se llevaran a cabo en solucin de forma escalar la sntesis de protenas sera muy lenta y desordenada. En Procariontes (Fig. 47 - 14), 31 protenas ms los RNAr 23S y 5S forman la subunidad 50S de los ribosomas, mientras que la subunidad 30S esta formada por 21 protenas ms el RNAr 16S. En Eucariontes (Fig. 47 - 14), 50 protenas ms los RNAr de 5S, 28S y 5,8S forman la subunidad de 60S, mientras que la de 40S esta formada por 33 protenas ms el RNAr de 18S.
Eukarionte
RNAr 18 S RNAr 5,8 S
33 Protenas
Subunidad 40 S
Ribosoma RNAr 28 S Prokarionte 50 Protenas Subunidad 60 S 80 S
RNAr 16 S
21 Protenas
Subunidad 30 S
Ribosoma RNAr 23 S RNAr 5 S 31 Protenas Subunidad 50 S 70 S
Fig 47 - 14. Composicin de los Ribosomas en Eucarionte y Procarionte.
Volver al inicio
723
Hctor Rocha L. DNA
22) SINTESIS DE PROTEINAS.

1 ETAPA . La primera etapa requiere de los 20 aminocidos, 20 o ms Aminoacil-RNAt sintetasas y 20 o ms RNAt con ATP y Mg+2 . Las enzimas del citosol Aminoacil-RNAt-Sintasas son especficas para cada aminocido y su RNAt. AA + ATP ---------------> Aminoacilo-AMP + PPi PPi ---------------> 2Pi El aminoacilo-AMP permanece unido a la enzima hasta que entra el RNAt adecuado, producindose la aminoacilacin del RNAt. Aminoacilo + RNAt -------------->Aminoacilo-RNAt --------------------------------------------------AA + RNAt + ATP ------> aminoacilo-RNAt + PPi PPi-------> 2 Pi -29 kJ/mol De esta manera se activa el aminocido y se une a un adaptador para la sntesis de protenas. En aquellos aminocidos relacionados estructuralmente la enzima Aminoacil RNAt Sintasa tiene dos sitios activos uno para la formacin del compuesto intermediario AminoacilAMP, antes de unirlo al RNAt y el otro que compueba la efectividad de la unin del aminoacilo que corresponda al RNAt adecuado, ya que al menos existe una enzima por cada RNAt. En Procariontes (Fig 48 14), se empieza con FORMIL Metionina y en Eucariontes con solo Metionina, pero con dos RNAt uno para la Met del principio y el otro para la Met del interior de la protena. En la etapa de iniciacin se congregan el RNAt con Formil- Metionina, la subunidad 30S de los ribosomas con el RNAr de 16S , el RNAm, tres factores de iniciacin, GTP, la subunidad 50S y Mg+2. A la subunidad 30 S se une el factor de iniciacin IF-3, en seguida se une el RNAm dejando al codn AUG en un lugar preciso de la 30 S. La posicin adecuada del AUG en el 30S para que quede en el sitio P, se alcanza debido a la secuencia SHINE-DELGARNO, del RNAm que se encuentra corriente arriba de 8 a 13 pb del AUG y que aparea con el 16S RNAr:
16 S RNAr 3' OH G-----------//--5' A A U C UCCUCCA 5' A U U C C U A G G A G G U U U G A C C U [ A U G ] C G A G C 3' SECUENCIA SHINE-DELGARNO en el RNAm
724
Hctor Rocha L. DNA
El sito P (Fig. 48 14), est formado tanto por la subunidad 30S como la 50S. Ahora tenemos unido el IF-3, la subunidad 30S y el RNAm a los cuales se une el Factor de Iniciacin 2 o FI-2 que esta unido a GTP y el Formil-Metionina-RNAtfMet con el anticodn 5' UAC 3' Enseguida se produce la combinacin de este complejo con la subunidad 50S, se hidroliza el GTP unido a IF-2 y se sueltan los factores de iniciacin. El sitio P queda ocupado por el primer formil Met-RNAt.
Formacin del complejo de Iniciacin.

FI-3
5'
AUG
3'
30S
FI-3
P
U A C
A 3'
FI-2 GTP GTP fMet fMet U A C FI-2
5'
AUG
FI-3
FI-1
P 5' A AU UG G
U A C
A 3'
50S
FI-1
FI-2
GDP + P
fMet
Fig 48 - 14. Formacin del Complejo de Iniciacin.
2 ETAPA . La siguiente etapa (Fig. 49 - 14), requiere del complejo de iniciacin ms tres protenas o Factores de Elongacion (FE), como son los FE-Tu, FE-Ts y FE-G en conjunto con el siguiente RNAt cargado y GTP. El sitio A del complejo de iniciacin esta desocupado y tiene una vacante para la unin del segundo AA-RNAt, el cual entra unido a al factor Tu que se halla previamente unido al GTP. Una vez el AA-RNAt situado en el sitio A y con la interaccin codn-anticodn completada, se hidroliza el GTP saliendo el Tu unido al GDP. El GDP ahora, se libera por la accin del factor de elongacin Ts quedando unidos Tu-Ts. Luego entra otra molcula de GTP sacando a Ts y dejando GTP para la entrada del tercer AA-RNAt. Cuando ambos sitios P y A estn ocupados con sus respectivos RNAt cargados con los aminocidos la actividad enzimtica de Peptidil Transferasa se manifiesta, catalizando el ataque nucleoflico del Amino del segundo aminocido sobre el Carbonilo que se encuentra en la unin ster con el 3' OH de la Ribosa del RNAt del primero. Para formar enseguida un
725
Hctor Rocha L. DNA
enlace peptdico en que el primer aminocido aporta el carboxilo y el segundo el grupo amino. Es una reaccin en la cual se pierde una molcula de agua y es catalizada, no por una protena sino que por una RIBOZIMA (Peptidil Transferasa) formada por el RNAr 23S, de la subunidad mayor del ribosoma en Procariontes. Cuando se ha formado el enlace peptdico el ribosoma debe translocar un sitio para la unin del tercer AA-RNAt al sitio Aminoacilo. Esto se logra por la accin de la Protena G y la hidrlisis de una molcula de GTP. De esta manera el sitio P queda con el segundo RNAt unido al dipptido ( el aminocido que trajo el primer RNAt ubicado en el lado amino terminal del dipptido ms el segundo unido al lado 3' del segundo RNAt), mientras que el primer RNAt abandona el lugar para ser empleado nuevamente. El polipptido crece a medida que se repite la operacin mediante la formacin de sucesivos enlaces peptdicos. La enzima que cataliza este proceso se denomina Ribosomasa o Peptidil Transferasa y une el polipptido al lado amino de los sucesivos aminocidos que son transportados al sitio Aminoacilo por sus respectivos RNAt. Como la sntesis de las protenas debe ser un proceso rpido, la interaccin entre el
Etapa de la Elongacin .
P 5' A AU UG G
U A C U U U
A AAA
CCC
P 3' 5' A AU UG G
U AC
A AAA
U U U
CCC
3'
Tu
O O C O O C R C H NH 2 R C NH
GTP
Tu
GTP
Ts
O O C
GTP Tu
R C H
Ts
GDP
GTP
N
O C
R C H
Tu GDP
GDP+P
Ts
NH 2
P 5' P 5' A AU UG G
U A C
A AU U UG G G A
A AA A AA A AA
U U U
CCC 3'
CCC
A AAA
U U U U A C
GGG
CCC
3'
Tu
GTP
O O C R C H O O C R C H NH 2 O O C R C H NH 2 O O C H R C H NH
N
O C
R C H
NH 2
Fig 49 - 14. Formacin del enlace peptdico, translocacin y liberacin del RNAt vaco.
Anticodn del RNAt cargado con el aminocido y el Codn del RNAm debe ser de corta duracin. Esta necesidad no sera posible si la interaccin fuera normal, por ejemplo el Codn CCC apereara con el Anticodn GGG y tendra 9 enlaces hidrgenos, en cambio la interaccin del Codn AUA con el Anticodn UAU tendra solo 6 enlaces hidrgeno. Esta diferencia en la capacidad de interaccin retrasara la sntesis de las protenas en algunos
726
Hctor Rocha L. DNA
puntos ms que otros y se necesitaran 61 RNA distintos de transferencia. Para remediar esta situacin ocurre que la verdadera interaccin Codn-Anticodn no es tan estricta, de esta manera el Anticodn del RNAt puede reconocer a ms de un Codn del RNAm siempre que correspondan al mismo aminocido. Ms an, un Anticodn reconoce a varios Codnes debido a que el apareo entre la bases no es estricto entre el primer nucletido del Anticodn y el tercero del Codn, (Fig. 49 - 14). 3a ETAPA. Finalmente cuando aparecen los codones UAA, UAG y UGA,(Fig. 50-14) los que son reconocidos por los factores de terminacin FT1 que reconoce a UAG y UAA mientras que FT2 reconoce a UGA y UAA. Al unirse los FT al codn la actividad de Peptidil Transferasa transfiere la cola de la protena al agua en vez de a otro AA-RNAt, cosa imposible porque estos tres codones no codifican para ningn aminocido.
Etapa de Terminacin.
UAA
UGA
P 5' 5' A
FL
30S
P A
CCU GGA
U G AA AA
3'
5'
5'
CCU GGA
U G AA AA
3'
GGA
FL FL H O
C C N O C H H
O O R C C N O C H H
Ct
O R
50S
5'
CCU
UAG
3'
t
N
Fig 50 - 14. Terminacin y descomposicin del Complejo.
En bacterias la Transcripcin y la Traduccin son simultaneas, adems los RNAm son de corta vida media lo que permite una economa al cambiar su metabolismo rpidamente de un substrato a otro junto con las enzimas necesarias. Por lo tanto este sistema favorece una rpida adaptacin a las condiciones del medio en que se encuentren los Procariontes. Volver al inicio
727
Hctor Rocha L. DNA
23) PROCESAMIENTO DE LAS PROTEINAS RECIEN SINTETIZADAS.

No todas las protenas tienen Metionina o Formil Metionina como primer aminocido al ser analizada su composicin y secuencia. Esto significa la existencia de una etapa de procesamiento o que las protenas sufren algunas modificaciones antes de ser completamente funcionales. Entre estas modificaciones post-traduccin se encuentran: a) Modificaciones del Amino terminal y Carboxilo terminal. b) Perdida de las secuencias sealizadoras o "pptido seal". Aquellas secuencias que dirigen el destino final de las protenas, una vez en su lugar ya no son necesarias (Figs. 51,52 - 14 ).
Pre Pro Protenas

Nt Ct
Secuencia Funcional Pre
Pro Pre - Secuencia : Generalmente se emplea para indicar el lugar donde el pptido funcional ser Pro - Secuencia : Su salida se relaciona con la adquisicin de la estructura funcional por la pro Secuencia Funcional : Es la prote'ina con la conformaci'on 'optima para llevar a cabo su funci
Fig 51 - 14. Protenas con secuencias intermedias que sealizan su destino y el momento de entrar en funcin.
c) Modificaciones a los aminocidos. Los aminocidos como Ser, Thr y Tyr pueden ser fosforilados como ocurre en la Casena, otros como el Glu Carboxilados. Algunos otros pueden sufrir deaminaciones como ocurre en el paso de Gln a Glu o de Asn a Asp. Otros aminocidos pueden ser Hidroxilados, como Pro a OH-Pro o Lys a OH-Lys, Tyr a 3,4 Dihidroxifenilalanina, etc. d) Unin a carbohidratos o Glicosilacin. En aquellas glicoprotenas de lubricacin como las Mucoprotenas, los carbohidratos se unen a los aminocidos como Asn, Ser y Thr. e) Adicin de grupos prostticos no aminoacdicos. Algunas protenas como Hemoglobina, Citocromo C, Mioglobina reciben grupos HEME o grupos prostticos. f) Procesamiento proteoltico en los Zimgenos.
728
Hctor Rocha L. DNA
g) Formacin de puentes -S-S- durante el procesamiento proteoltico como en la insulina. h) Isoprenilacin. La protena Ras sufre la unin al farnesil pirofosfato, quedando con una cola hidrofbica con la que se pega a las bicapas aportndole su carcter transformante. (Para mayor informacin ver Captulo de Protenas).
Seal de la Secuencia
Caperuza m pppG 5'
GUA
Partcula Reconocedora de la Seal

UAA
A A A ( A ) A A3 ' n Poli A
Receptor del Ribosoma
Receptor de la Peptidasa Partcula Reconocedora
RETICULO ENDOPLASMICO
de la Seal
Protena Terminada
Fig 52 - 14. Asociacin entre poliribosomas y Retculo Endoplsmico Liso, por medio de un receptor especfico y la partcula reconocedora de la seal en el polipptido.
Volver al inicio
729
Hctor Rocha L. DNA
ALGUNAS CARACTERISTICAS DEL GENOMA HUMANO.

El contenido total del DNA en el humano es el genoma y consiste en 3109 pb (pb= pares de bases). Se le encuentra representado por 23 cromosomas individuales aportados por cada padre, es decir 22 autosomas ms el cromosoma X o Y segn sea el sexo de los progenitores (X: mujer, Y: hombre), de esta manera una persona tendr 46 cromosomas ms el par XX (mujer) o XY(hombre). Los cromosomas difieren fsicamente cuando son teidos y observados al microscopio (Kariotipo), presentando diferentes bandeos y tamaos. Es decir, solo los cambios groseros en su estructura pueden ser detectados, como lo son la prdida de una copia, las rupturas y translocaciones. As tenemos, que una tercera copia del cromosoma 21 se asocia al sndrome de Down o trisoma del cromosoma 21. Sin embargo, los cambio sutiles de unas cuantas a tan solo una base no pueden ser detectados como ocurre con la Fibrosis cstica o la Anemia Falsiforme. Por esta razn, con el fin de predecir, prevenir y encontrar una cura a estas enfermedades parti el Proyecto Genoma Humano en 1990. Se pensaba que los humanos cuentaban con 80.000 o 100.000 genes, sin embargo investigaciones recientes han mostrado que no son ms de 30.000 comparados a los 6000 u 8000 genes, que se encuentran presentes en los procariontes.. Los genes humanos en este nmero son capaces de controlar todas las etapas de la existencia de la clula, como ser embriognesis, desarrollo, crecimiento, reproduccin, etc. Algunos especmenes, como el Salmn son tetraploides con cuatro copias de un gen, mientras que otras especies, como lo es un tipo particular de ciervo es haploide con al menos una copia de cada gen. Sin embargo la cantidad total de DNA en este animal es similar a la encontrada en los ciervos diploides. Otro hecho sorprendente es lo que ocurre al comparar la cantidad de DNA presente entre las ranas, algunos peces y el hombre. Los anfibios poseen una mayor cantidad de DNA y se podra pensar que se encuentran en una etapa superior de la evolucin al asumir que cuentan con una mayor cantidad de genes expresados. Sin embargo no ocurre as, ya que una gran parte de su DNA es "intil" o no codificante y se encuentra formado por secuencias de relleno que no son precisamente genes. Los 30.000 genes humanos estaran codificados por cerca del 3% de su DNA total, mientras que el resto (97%) pasara a ser DNA "basura" o DNA "intil", sin embargo poco a poco se han desarrollado las tcnicas y medios para estudiar este ltimo tipo de DNA y hasta la fecha se ha visto que es responsable de algunas importantes funciones. Gran parte del DNA "basura" o "intil" esta formado por secuencias repetitivas que son caractersticas de cada persona y algunas de ellas se encuentran localizados en lugares tales como los centrmeros o punto de unin de los cromosomas al huso durante la divisin celular y en los telmeros o extremos del cromosoma. As tenemos que la familia "Alu" de secuencias repetidas tiene 300 o 500 pb y cuenta con cerca de 500.000 copias, algo as como el 4% del genoma humano. En esta familia de secuencias repetidas se piensa que estaran los centros en que se forman las burbujas durante la replicacin del DNA. Existen algunas hiptesis que le atribuye a este DNA repetitivo, la cualidad de no ser ms que un parsito de los genes tiles al observar que una parte del DNA humano y de los vertebrados superiores no codifica y que la otra parte es de secuencias repetidas. Este hecho
730
Hctor Rocha L. DNA
permite deducir que los genes tiles se encuentran dispersos en un mar de DNA no codificante.
A pesar de lo anterior, un reciente enfoque atribuye a los cromosomas con sus distintas secuencias la cualidad de ser "Organelos Informacionales", que presentan un sofisticado sistema de mantenimiento de su estructura y control de la expresin de los genes. Este sistema estara radicado en el % de DNA considerado como "intil" o DNA " basura". Esta hiptesis se basa en observaciones que han demostrado la existencia de al menos 5 secuencias regulatorias por gen, donde algunas de ellas se encuentran enterradas entre las secuencias denominadas intiles e incluso dentro de las secuencias de tipo repetitiva. Las mutaciones en el DNA minisatlite, formado por secuencias altamente repetitivas se han visto asociadas a algunos tipos de cncer mamario, colorectal, vejiga y an leucemia aguda. Otras secciones del DNA repetitivo que se encuentran en los centros y extremos del cromosoma, parecen ser centro de unin para protenas que protegen los extremos del cromosoma para que este no se "deshilache" en aquellos puntos o bien cumplen con el papel de reparar las posibles lesiones que ocurran en este lugar. Este DNA es parte del "DNA intil" y se denomina DNA satlite, aunque sus secuencias son de mayor tamao que las presentes en el DNA minisatlite. Otra funcin que posiblemente se pueda atribuir al "DNA basura", es que codificara para ciertas secuencias de RNAs que no se traduciran en protena y que actuaran en la modulacin de la expresin de los genes. Su mecanismo de inhibicin sera mediante la unin de este RNA regulatorio a una de las hebras del DNA en el gen mismo o al RNA producido por este. Ms an, este RNA regulatorio podra ser tambin parte de los Intrones que se encuentran durante el procesamiento del RNA heteronuclear en Eucariontes. En general el "DNA basura" constituido por el 97% del DNA en humanos consta de las siguientes secuencias:
INTRONES : Secuencias que no codifican protenas y que se encuentran entre los genes en Eucariontes separando las distintas regiones que si codifican (Exones) en los distintos dominios que forman una protena.
Por otro lado, el genoma Eucarionte presenta islas de secuencias cortas que se repiten una y otra vez en arreglos cortos y largos, los que se denominan DNA repetido en tandem (TR DNA) o bien DNA Satlite:
SATELITES: Secuencias cortas que se repiten de 100 a 1000 veces en el centro o extremo de los genes. Se dice que de la estabilidad estructural de estas regiones depende la sobrevivencia del cromosoma.
Otros tipos de estas mismas secuencias, an ms cortas son los mini y microsatlites que se pueden denominar como Secuencias Repetidas de Nmero Variable o VNTR (Variable Number Tandem Repeats) MINISATELITES: Secuencias similares a la satlite, pero ms cortas y que se encuentran en cualquiera parte del cromosoma. Algunos defectos en su secuencia estn asociados con cncer.
731
Hctor Rocha L. DNA
MICROSATELITES: Secuencias repetitivas an ms cortas que los minisatlites. Sus defectos estn tambin asociados con cncer.
Las repeticiones de una secuencia son altamente variables en distintos individuos e incluso el nmero de repeticiones en un locus especial es distinto en los cromosomas paterno y materno para este mismo locus que posee un individuo, es decir es heterozigoto Una tcnica altamente especfica para identificar la individualidad y que se emplea en anlisis fornsico consiste en distinguir el nmero de repeticiones de una secuencia dada perteneciente al DNA de cada sospechoso dejado en la escena de un crimen, ya sean pelos, piel, sangre o semen.
Sondas
La figura muestra los sitios de corte del DNA por una endonucleasa de restriccin (enzima Hinf1 extrada de Haemophylus Influenzae, estirpe 1 y que es capaz de reconocer una misma secuencia especfica las veces que se encuentre presente en la doble hebra de DNA procediendo a cortarla). Esta enzima reconoce el mismo sitio de corte, en dos segmentos de DNA que difieren en el largo de las repeticiones, es decir c/u de ellos posee lo que se llama un Nmero Variable de Repeticiones en Tandem o Variable Number Tandem Repeats con 8 y 3 repeticiones respectivamente. Los fragmentos una vez separadas sus hebras podrn hibridizar con la sonda o hebra de DNA marcada, que identifica la zona repetitiva en cada uno de los casos. Ambas zonas repetitivas pueden separadas por su tamao mediante Electroforsis. Otro alcance de esta tcnica es la variabilidad entre los sitios de restriccin o corte (Variable Restriction Site) por las Endonucleasas de Restriccin en zonas no codificantes del DNA. Este proceso es particularmente comn y puede ser empleado en el reconocimiento de individuos. La aparicin o desaparicin de un sitio de corte por una Endonucleasa de Restriccin, puede ocurrir cundo tan sola una de las bases sufre una mutacin. Por ejemplo un cambio de AGATCC por GGATCC, introduce un nuevo sitio de corte para la enzima Hinf en un segmento de DNA y este hecho permite distinguir un individuo de otro. Este tipo de polimorfismo se traduce en variabilidad en el largo de los segmentos de DNA producto de una digestin con una endonucleasa determinada y pasan a llamarse Polimorfismos en el Largo de los Fragmentos de Restriccin o RFLPs por Restriction Fragment Length Polymorphisms.
Sondas
732
Hctor Rocha L. DNA
En la figura, se observa que el fragmento superior tiene solo dos sitios de corte y el inferior tres sitios, por lo tanto despus de ser separados por tamao, la sonda ser capaz de identificar cada uno de ellos. En el siguiente Captulo se explicar con ms detalle cada una de estas tcnicas.
REGIONES NO TRADUCIDAS EN EL EXTREMO 3'(3'UTR): Las secuencias finales al extremo 3'de regiones codificadoras de protenas en el gen, son seguidas de DNA que es transcrito en RNA, pero que no es traducido en protena. Estas secuencias contienen regiones que regulan la actividad del gen mismo. RNA HETERONUCLEAR (RNA hn): Solo el 25% del transcrito primario o RNAhn corresponde a los Exones e Intrones que darn origen al RNAm. El 75% restante no se sabe que papel desempea. RETROTRANSPOSONES: Desarrollos posteriores respecto a los Transposones ha demostrado la presencia elementos conocidos por las siglas LINE y SINE o elementos intercalados largos y cortos respecitvamente. Se caracterizan por ser secuencias del DNA que pasan por RNA antes de volver a incertarse en distintos lugares del DNA. ELEMENTOS INTERCALADOS CORTOS O "Short interspersed elements" (SINEs): son de 100 a 400 pbs y comprenden a los genes que dan origen a RNA small nuclear o RNAsn, RNAs de transferencia o RNAt y RNA ribosomal especialmente RNAr 5S. Todos ellos son originalmente transcritos por RNA pol III. Los ms comunes son la secuencia Alu (300pbs) con 106 secuencias (11%). Dependen de la maquinaria de LINE para copiarse y pegarse en el genoma.Son copias de secuencias repetitivas que se encuentran repartidas a lo largo del genoma humano sin orden alguno. La secuencia ALu nombrada anteriormente pertenece a esta familia. Se sabe que estas secuencias pueden "saltar" a distintas partes del genoma (Transposones) e insertarse en un gen. Son causantes de enfermedad como la neurofibromatosis-1 presente en el caso del "hombre elefante". ELEMENTOS INTERCALADOS LARGOS (LINEs): Corresponden a un 18% del total del genoma. Son similares a los anteriores, pero ms largos como de 7000pb. Son causantes de enfermedad ya que por el mismo mecanismo anterior producen la discontinuidad del gen donde caen. Los LINEs constituyen unos (850.00 en genoma humano. El mecanismo por el cual los LINE, especialmente la familia L1 (LINE-1) ejercen su funcionan consiste en la transcripocin del DNA L1desde unos cientos de pares de bases hasta 90000pbs. Cera de 50 (6500 pbs) de ellos son funcionales, es decir se transcriben y se traducen. Codifican 3 protenas Endonucleasa , Transcriptasa Inversa. La regin con secuencia LINE L1-DNA se transcribe en RNA L1 por la RNA pol II. El RNA L1 se asocia a ribosomas y fabrica unas protenas: Transcriptasa Inversa y Endonucleasa. Posteriormente las Protenas y RNA se asocian y vuelven al ncleo donde la actividad de Endonucleasa corta al DNA en una secuencia blanco en un Intron y la Transcriptasa Inversa retrotranscribe el RNA L1I en DNA L1, e introduce el DNA aumentando al distancia entre los exones. Por lo tanto, similares personas pueden tener los mismos exones con distinta separacin Se sospecha que su presencia regula la eficinecia de la transcripcin en los mismos genes, pero de distintas personas.Se supone que este mecanismo pudo dar origen a los Pseudogenes sin promotores o intrones.
733
Hctor Rocha L. DNA
TRANSPOSONES: Actun provocando dao a la expresin de un gen cualquiera sea el lugar donde se incertan, exones, intrones , intensificadores y promotores. Solo hacen ms copias de si mismos. Su funcin en Humanos no se sabe. Los Transposones se encuentran muy bien caracterizados en las plantas.
Volver al inicio
25) DESARROLLOS POSTERIORES

Al continuar con la descripcin del genoma humano podemos decir que los genes se pueden agrupar en diferentes tipos, entre ellos tenemos las familias o grupos de genes que son muy similares en la secuencia de sus exones o de los pptidos que codifican, indicando con ello que han evolucionado desde un nico gen ancestral que se ha duplicado y diversificado. Algunos de los cromosomas humanos se encuentran llevando la mayora de la informacin (cromosoma 19: 23 genes/ 10 6 pb), mientras que otros son pobres en genes (cromosoma 5: 5 genes/ 106 pb) y tienen una mayor proporcin de DNA de relleno.
Entre los genes se pueden distinguir dos grandes tipos, aquellos inducibles o que se expresan bajo determinadas condiciones metablicas y los constitutivos, que se clasifican como de mantencin o "housekeeping". Estos ltimos son activos en todas las clulas cumpliendo funciones comunes. Entre estos ltimos se pueden clasificar las enzimas corrientes del metabolismo y entre los primeros algunas enzimas marcapasos. Dentro de las familias de genes es posible encontrar a los pseudogenes o genes inactivos como se los nombr anteriormente y que debido a una mutacin en los elementos que controlan su expresin permanecen silenciosos en la actualidad. Entre los genes de las cadenas de la Hemoglobina, el gen Delta permanece silente mientras que los Alfa y Beta se expresan. A su vez ambos parecen ser el producto de un crossing over desigual ocurrido entre sus genes. Otros genes se caracterizan por encontrarse anidados o "nested", tambin se les denomina solapados. Estos genes se encuentran dentro de otros genes en la misma hebra o en la hebra opuesta y no se expresan usualmente. En general los genes de los organismos superiores o Eucariontes, son discontinuos y presentan los llamados Extrones o partes codificantes y los Intrones o partes no codificantes, pero que tambin se transcriben aunque son posteriormente eliminadas al madurar el transcrito primario o RNAhn (RNA heteronuclear) en el RNA mensajero. En bacterias o Procariontes los genes son del tipo continuo, sin Intrones. Los Intrones van desde las 0,1kB (1kB = 1000 bases) hasta 1 kB o ms y pueden existir dos como en el caso de las cadenas Alfa y Beta de la Hemoglobina hasta 7 en la Ovoalbumina. Algunos de estos Intrones como ha visto tienen actividad enzimtica propia y pueden catalizar sus propias reacciones de corte y empalme del transcrito primario para formar el RNAm.
734
Hctor Rocha L. DNA
Los Extrones parecen codificar para zonas o dominios especficos en las protenas que les confieren una determinada caracterstica. Su existencia se justifica parcialmente al pensar que las protenas de Eucarionte han evolucionado intercambiando exones para obtener nuevas capacidades adaptativas antes de esperar a la aparicin de mutaciones puntuales que puedan ocurrir o no en cada una de ellas con el mismo fin. La familia del gen Beta de la Hemoglobina se encuentra dispuesta en varias copias que se emplean durante las distintas etapas del desarrollo u ontogenia como son, la etapa embrionaria fetal, la infancia primaria y el estado adulto. Presentando un total de 5 genes homlogos a lo largo de 80 kB. Se encuentran dentro de esta familia los llamados Pseudo genes 1 y 2, los cuales presentan una secuencia algo divergente a la original y no determinan a una protena ya que son inoperantes. Por lo tanto dentro de las 80kB en que se encuentran dispersa la familia Beta, solo 3kB pertenecen a los genes operantes de las globinas, o sea un 4% del total. Igual cosa sucede con otros genes como los de la Ovoalbmina o los genes de los Antgenos de Histocompatibilidad del ratn, con espacios no codificadores de 5 a 15 kB entre cada gen y con un promedio en total de un 10% de DNA no codificador. Parece ser evidente que la existencia de familias de genes dedicados a un fin entrega un mayor poder de adaptabilidad a la especie. Cada copia de una enzima correspondiente a una determinada familia de genes tendr caractersticas especiales de actividad bajo una determinada condicin, como lo es el pH, temperatura, fuerza inica, etc. Esto demuestra que la duplicacin de un gen original y su divergencia puede ser un poderoso motor evolutivo al variar este nuevo gen presentando caractersticas de funcionamiento y adaptabilidad distintas al gen original.
Por ltimo se puede concluir que los genes Eucariontes presentan una determinada dinmica interna, la que ocurre en un ambiente de secuencias no codificadoras rica en repeticiones y que pueden actuar como la causa o la seal de numerosas variaciones genticas junto con el control de la expresin de los genes. Es posible comparar esta disposicin a una solucin acuosa, en que los genes seran el soluto y las secuencias repetitivas el solvente. Cualquier cambio de uno de los componentes afecta al otro en el estado dinmico en que ambos se encuentran interrelacionados.
El proyecto Genoma Humano pretende arrojar luz sobre las distintas posibilidades que se han analizado en el prrafo anterior, contribuyendo al diagnstico, prediccin y susceptibilidad a las enfermedades. En la actualidad se han identificado cerca de 30.000 genes de los supuestos 100.000 genes que se haban propuesto. En la actualidad se ha encontrado que, entre la mosca Drosophyla de la fruta (13.500 genes), el gusano C. elegans (19.000 genes) y humanos, existe una gran similaridad en la informacin contenida en sus genes (genes homlogos) y se ha propuesto que cada uno de ellos actuara como las unidades de aquel juego denominado LEGO, donde se pueden construir variadas formas desde un automovil a un edificio con las mismas piezas. Gran parte del DNA codificante pertenece a los factores de Transcripcin que regulan la expresin de los genes como ocurre en el Ciclo Celular y muchos de los genes cofificantes producen ms de una protena por medio del corte y empalme alternativo (alternative
735
Hctor Rocha L. DNA
splicing) incluyendo protenas intensificadoras (Enhancers) de la trascripcin basal. Esto nos entrega un nmero superior de protenas que los mismos 30.000 genes descubiertos (Protemica). A la vez existen genes pequeos desde un exon a cerca de 80 exones cubrinedo una buena cantidad de bases de varios millones.La protena promedio tiene 450 aminocidos y 4 exones a lo ms. Aprendiendo ms del material gentico y su entorno, se desarrollar una nueva y mejor tecnologa, tanto en la secuenciacin como en la computacin asociada a ella, para as analizar y relacionar los datos obtenidos junto con revisar los aspectos ticos, legales y sociales que este nuevo procedimiento implique. Volver al inicio
736
Hctor Rocha L. DNA
REFERENCIAS.
The Chemistry and biology of Left-Handed Z-DNA. A. Rich, A. Nordeheim and A.H.J. Wang., Ann. Rew. Biochem. ,Vol 53,791-846,1984. The Three Dimensional Structure of DNA S.B. Zimmerman., Ann. Rew. Biochem.,Vol 51, 395 - 427, 1985. Biological catalysis by RNA. T.R. Cech and B.L. Bass., Ann.Rew. Biochem., Vol 55, 599-629, 1986 Splicing messenger RNA and his Precursors. R.A. Padgett, P.J. Grabowski , M.M. Konarska , S. Seiler and P.A. Sharp., Ann. Rew. Biochem.,Vol 55, 1119-1150,1986 DNA polymerase III Holoenzyme of Escherichia Coli. Ch.S. Mc Henry., Ann. Rew. Biochem.,Vol 57,519-550, 1988. Biochemistry. L Strier, Third ed, Copyright 1988, Freeman and Co. Publisher. DNA polymerase III Holoenzyme. C. S., Mc Hensy, J Biol Chem. 266, 19127-19130, 1191. Procaryotic DNA Replication. K. J. Marians., Ann. Rew. Biochem., vol 61, 673-719, 1992. Principles of Biochemistry. A. L. Lehninger, D. L. Nelson and M. M. Cox., Second Ed., Copyright 1993, Wost Publisher Inc.
http://info.bio.cmu.edu/Courses/BiochemMols/DNA/DNA.html http://gened.emc.maricopa.edu/bio/bio181/BIOBK/BioBookDNAMOLGEN.html http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/forenscr.html http://murray.francis.com/repair/DNArepair.htm http://photoscience.la.asu.edu/photosyn/courses/BIO_343/lecture/DNA-RNA.html http://www.dnalc.org/Shockwave/southernblotting.html
737
CICLO CELULAR 1
737
1) CUANDO SE ROMPE EL CONTROL DE LA EXPRESION GENICA
741 743
2) PROTO-ONCOGENES, ONCOGENES Y GENES TUMOSUPRESORES 3) MECANISMOS QUE PROPICIAN LA DIVISIN DESCONTROLADA DE UNA CLULA YA DIFERENCIADA 746 4) PROTENAS Y MECANISMOS PROTAGONISTAS DEL CONTROL EN EL CICLO CELULAR 748 a) La Familia de las Ciclinas 748 b) Kinasas Dependiente de Ciclinas (CDKS) 751 c) Mecanismo de Accin del Complejo Ciclina Kinasa 752 5) COREPRESORES DE LA TRANSCRIPCIN QUE NO SE UNEN DIRECTAMENTE AL DNA COMO LO SON pRB, p107 y p130 753 a) Factor pRB 753 b) Factores p107 y p 130 754
6) FACTORES DE LA TRANSCRIPCIN QUE SE UNEN AL DNA COMO p53 y E2F. 754 a) Factor p 53 754 b) Factor p 73 757 c) Factor E2F 757 7) APNDICE - CASPASAS - DIFERENCIA ENTRE NECROSIS Y APOPTOSIS 758-60 8) INHIBIDORES DEL COMPLEJO CICLINA/CDK QUE INTEGRAN LA FAMILIA CIP/KIP Y WAF 1 761 a) Protenas de la familia INK4 son p16, p19, p18 b) Familia de inhibidores incluye a los tipo CIP/ KIP 9) OTROS MODULADORES 762 a) Factor MDM2 762 b) Factor CDC 25 A, B Y C 762 c) Complejos Ligantes de Ubiquitina APC Y SCF 761 762
763
CICLO CELULAR 2 10) CICLO CELULAR 765
738
11) REPLICACIN EN LA FASE S 769 12) PUNTOS DE CONTROL G1/S, S, G2/M Y M a) Primer Sitio de Control G1/S 772 b) Segundo Sitio de Control en la fase S 775 772
c) Tercer Sitio de Control en G2/ M 778 d) Cuarto Sitio de Control a Nivel de la Mitosis (Sitio M), durante la formacin del Huso Mittico
779
13) EXPRESIN DE LOS GENES 784 FACTORES BASALES DE TRANSCRIPCIN ASOCIADOS A LAS RNA POL I, II Y III COMO LO ES TFIIH 1) RNA pol en Eucariotes 784 2) Factores de Transcripcin 785 14) TRANSCRIPCIN BASAL 788 791
784
15) TRANSCRIPCIN INTENSIFICADA
739
Hctor Rocha L. Ciclo Celular y Control de la Expresin de los Genes
740
En este captulo se describirn primero los Mecanismos que controlan el Ciclo Celular para continuar luego con la descripcin del Ciclo mismo y finalmente el control de la expresin de los genes. 1) CUANDO SE ROMPE EL CONTROL DE LA EXPRESION GENICA. Se asume que un organismo animal o vegetal se encuentra formado por un conjunto de clulas diferenciadas, que se encuentran fuera del Ciclo Celular (fig. 1 15), es decir en la etapa Go o de reposo. Las caractersticas especficas de sus tejidos dependern por un lado de los genes que se estn expresando y por el otro lado de aquellos que permanezcan silenciosos. Este proceso se encuentra a su vez vigilado por la actividad de otros genes de cuya expresin depende que este panorama sea estable. Como resultado de ello, podemos distinguir distintos tejidos y rganos diferenciados capaces de ser desarrollados a partir de un mismo genoma. El hecho de que una clula entre al Ciclo Celular se debe al producto de mltiples seales cuyo origen puede ser tanto externo como interno. Estas seales son a su vez capaces de desencadenar la orquestacin de una serie de eventos que controlan este proceso. Entre las seales podemos encontrar algunas de origen qumico, otras de origen elctrico y algunas producidas por contacto entre las mismas clulas. Todas ellas se encuentran regulando por retroalimentacin, la expresin de los genes tanto del crecimiento, como de la proliferacin de las clulas diferenciadas.
G2/M (sitio de control)
M (mitosis) Etapa de Reposo o Go
G2
G1
G1/S (sitio de control)

Fig. 1 15. Ciclo Celular donde se observan los principales puntos de restriccin ubicados en G1/S y en G2/M antes de la Mitosis.
La clula de un tejido diferenciado se encuentra normalmente en estado de reposo o G0. Por otro lado, en el intervalo G1 ( gap 1 en ingls) del Ciclo Celular, conocido como periodo de tiempo antes de la sntesis o etapa S (fig. 1 15), se reciben seales tanto del
741
ambiente celular como del estado interno de la clula. En este periodo G1, se prepara a la clula para la replicacin del DNA que ocurre en la etapa S (por synthesis). En esta ltima etapa, se sintetizan las hebras hijas del DNA, replicando los cromosomas mediante el empleo de un programa interno. Este se caracteriza por no recibir modulacin desde el medio externo como ocurre en G1. Posteriormente se pasa al intervalo G2 (gap 2), donde la clula acumula material y se dispone ahora a la divisin fsica. Esta ltima ocurre en la Mitosis (M), dando origen a dos clulas hijas con su respectiva dotacin de cromosomas. El tiempo empleado puede ser de 6 a 24 hrs. y las 3 etapas consumen el 90 % de este. En general el tiempo que demora el Ciclo Celular depende de la ventana en el intervalo G1, donde la clula decide si proliferar o no, en base a las seales moduladoras que recibe tanto desde el exterior cmo interior. Mientras ms largo sea G1 mayor tiempo tomar el Ciclo Celular. El cuerpo humano contiene de 50 a 100 trillones de clulas (10 18 ), de estas algunos billones (10 12 ) perecen diariamente y las restantes se deben multiplicar para reemplazar a las otras. Tomando en cuenta que el tiempo de vida promedio es de 70 aos. Se tiene al final un nmero astronmico de divisiones celulares, donde es necesario detener a las clulas que han sufrido mutaciones o errores durante su vida media o en sus preparativos para duplicarse. Estos errores pueden ocurrir cuando el DNA ha sido expuesto a agentes fsicos o qumicos dainos o cuando una enfermedad determinada, como la Ataxia Telangiectasia (ver captulo 13 ), es capaz de aumentar la susceptibilidad de los cromosomas a este tipo de dao. En estos casos los errores pueden inducir a ms errores, lo que sucede por ejemplo cuando se produce un huso mittico defectuoso, que impide la correcta segregacin de los cromosomas. La verificacin y balance de los intervalos G1 ( recepcin de seales) y G2 ( acumulacin de material), se lleva a cabo en los Puntos de Control del Ciclo Celular. El primero y ms conocido de ellos se encuentra destinado a evaluar el dao al DNA y se ubica hacia el final del intervalo G1 (lmite G1/S). Otro de ellos, se encuentra en el intervalo G2 (lmite G2/S), es decir mientras la clula aumenta de masa. En este ltimo sitio, se evalan tanto la fidelidad de la replicacin del DNA, como la generacin del huso mittico para dividirse posteriormente en M. En aquellos tejidos como piel, sangre y epitelio intestinal, la divisin celular contina durante toda la vida, en contraste con la clula nerviosa y la clula muscular que permanecen en la etapa Go. Aqu las clulas permanecen en un estado de continua de diferenciacin o bien sufren una llamada diferenciacin terminal. Por otro lado, las clulas de otros tejidos pueden salir de Go, luego de un tiempo y volver a entrar al Ciclo Celular normalmente. En el caso de las clulas cancerosas, tenemos que estas pierden la capacidad de control por retroalimentacin y la comunicacin con las clulas vecinas, por lo tanto se reproducen agresivamente migrando hacia otros tejidos, invadiendo y destruyendo aquellos rganos necesarios para sostener la vida. El estudio de los genes que controlan el Ciclo Celular, se inici observando el crecimiento en los brotes de la levadura Sacharomyces Cerevisiae. Se emple este espcimen por ser unicelular y contar con un ciclo que se encuentra regido tan solo por la disponibilidad de sustrato, es decir sus clulas no pueden dividirse sino se alcanza un tamao determinado. Adems, presenta la particularidad de que cuenta con solo 32 genes destinados a desarrollar las distintas etapas del Ciclo y que si alguno de ellos se encuentra alterado por alguna mutacin, el Ciclo se detiene.
742
Mucho ms complejas son las clulas animales que estn sometidas a una red de seales correspondientes a un organismo pluricelular, las que se encuentran a su vez involucradas en la coordinacin de cada clula que forma un tejido. Desde la etapa embrinica hasta la etapa adulta y a la vez regulan sus cambios metablicos en coordinacin con el resto del organismo. As tenemos que las seales recibidas en G1, son captadas por receptores y transmitidas por protenas de relevo que dependen de dos tipos especiales de genes. Estos pueden ser conocidos como los Proto-oncogenes y los Genes Tumosupresores (Fig. 2 15).
Factor de Crecimiento VIA ACELERADORA PROTEINAS DE RELEVO Protooncogenes Liberacin o retencin de Factores de Transcripcin
Factor de Inhibicin VIA FRENADORA
Genes Tumosupresores
NUCLEO
Fig. 2 15. Ambas vas de relevo se dirigen desde el exterior al ncleo pasando y amplificando seales para controlar la expresin de los genes.
Volver al inicio 2) PROTO-ONCOGENES, ONCOGENES Y GENES TUMOSUPRESORES a) Proto-oncogenes: son los genes que normalmente codifican protenas que sirven de relevo a seales qumicas que provienen desde el exterior de la clula y se dirigen hacia los genes en el ncleo (fig. 2 15). Estas seales son transportadas por las protenas conocidas como Factores de Crecimiento, Protenas Kinasas (asociadas y no asociadas a receptores), Receptores asociados a la Protena G (activados por GTP), Protenas G asociadas a membranas, Enzimas Fosforiladoras del tipo Serina y Treonina Kinasas junto a Protenas que se unen al DNA, como son los mismos Factores de Transcripcin. Todos estos elementos son capaces de amplificar la seal y acelerar la expresin de los genes que conducen a la divisin celular, sin embargo cuando sufren alguna mutacin inducen a una transformacin celular y pasan ahora a llamarse Oncogenes (del Griego: Onkos = masa o tumor). b) Oncogenes (Tabla 1 15): Estos genes no son capaces de controlar su expresin y ya no permanecen silenciosos cuando la clula se encuentra en Go, ya que producen una gran cantidad de copias anormales o defectuosas de sus propias protenas,
743
indicando que sufren ms de alguna mutacin. Esta puede ser tanto en los genes que regulan el control de su expresin, como aquellos genes que son regulados y portan a la vez una informacin defectuosa en sus copias proteicas. Todos estos errores son cumulativos y arrastran a la clula fuera de Go, estimulando la divisin y proliferacin celular sin control. Por ejemplo, en aves el gen viral v-src por Rous Sarcoma Virus, estimula la formacin de un carcinoma de un espcimen a otro, por medio de una simple infeccin viral. Sus efectos son capaces de sacar a la clula diferenciada de su estado de reposo (fig. 3 15). Sin embargo, otra forma de este gen es del tipo no oncognica y se encuentra silenciosa en el espcimen adulto, con el nombre de gen c-src, que se encuentra clasificado como un Proto-Oncogn. Este gen fue activo durante el desarrollo, pero ahora ya no se expresa en la clula diferenciada.
R E T R O V IR U S LTR gag pol env onc LTR
S e c u e n c ia r e p e titiv a te r m in a l q u e a c t a com o p r o m o to r a
P r o te in a d e la C a p s u la
Trans c r ip ta s a In v e r s a
P r o te n a d e la e n v o ltu r a
O ncogene
Fig. 3 15. Secuencias de un retrovirus que puede actuar promoviendo (aportan la secuencia para la unin de la RNA pol ) la transcripcin de un proto-oncogn o introducir parte de este a la clula normal.
El ejemplo anterior permite deducir que los proto-oncogenes tambin pueden constituir oncogenes mediante la accin de un Retrovirus (fig. 3 15), muchos de los 100 o ms oncogenes encontrados tienen su contrapartida en los retrovirus. El contenido de las partculas virales puede integrarse al genoma e inducir su transcripcin. Incluso puede ocurrir que un retrovirus sin un oncogen, se inserte cerca de un proto-oncogen del husped e induzca o aumente la expresin de este en unas 30 o 100 veces. Esta expresin anormal se atribuye a que las regiones LTR (Long Terminal Repeats) de los retrovirus, contienen poderosos promotores y secuencias intensificadoras que son responsables de estas caractersticas. c) Genes Tumosupresores (Tabla 1 15 ) : Son lo contrario de lo anterior y codifican protenas que normalmente inhiben o frenan la proliferacin celular. En el caso de mutar, sus copias ya no son efectivas frenando la expresin (fig. 2 15). Normalmente cuando las condiciones para la Mitosis son desfavorables, estos genes se activan y se da tiempo a la clula para que repare el dao. En el caso de que sea este muy extenso, la clula entra en la va de la Apoptosis o muerte programada. Este hecho ocurre por digestin de sus cidos nucleicos y la denaturacin de sus protenas. Lo anterior permite deducir que la alteracin de un gen Tumosupresor, debido a una mutacin conducir a la prdida de su actividad inhibidora y aquellas clulas diferenciadas, pero con DNA daado por mutaciones previas pasarn ahora a
744
reproducirse teniendo una ventaja selectiva sobre las clulas normales que s morirn. En la Tabla 1 15, se describen algunos Oncogenes y genes Tumosupresores descubiertos en diferentes tipos celulares. Estos genes son capaces de actuar a distintos niveles en la transmisin de seales desde el exterior de la clula hasta su ncleo. TABLA 1 15 ONCOGENES erb-B
Codifica para el receptor del factor de crecimiento epidrmico (EGFR) y es una Protena Kinasa transmembrana que forma parte de una familia de receptores ubicados en la membrana citoplasmtica. Se encuentran relacionados con la curacin de las heridas y pueden sufrir sobre expresin o amplificacin. Codifica para una protena que acta como relevo de seal estimulatoria en el citoplasma (se une al GTP y es conocida como protena G), sufre una mutacin puntual y se encuentra implicado en las Leucemias Codifica para un Factor de Transcripcin. La falta de su Ct inhibitorio por delecin o disrupcin, lo activa de forma trans y aumenta su capacidad de transformacin de clulas hematopoyticas. Se encuentra su contrapartida en el retrovirus generador de leucemia de las aves como v-myb Codifica para factores de transcripcin en el ncleo que a su vez activan genes promotores de crecimiento. Sufre de translocacin y amplificacin. Implicado en las leucemias, cncer a la mama, estmago y pulmones
GENES TUMOSUPRESORES NF-1 Codifica para la protena que inhibe a la

protena estimuladora Ras en el citoplasma. Implicado en cnceres del sistema nervioso perifrico y leucemia mieloide.
N-ras
RB
Codifica para la protena pRB que en el ncleo se une a los factores de transcripcin de la familia E2F impidiendo la expresin de los genes necesarios paras entrar al Ciclo Celular.
c-myb
c-myc
P53
Codifica para la protena p53 que detiene la divisin celular y puede conducir a las clulas a la Apoptosis. Se encuentra en el ncleo.
Es claro que los genes Tumosupresores al ser estimulados actan en conjunto con los Proto-oncogenes para decidir si una clula prolifera o no. Por lo tanto si cualquiera de los elementos de la cascada formada por las protenas inhibitorias desaparece, se corta su efecto. Es sabido que aquellos cnceres producidos tanto por mutacin en los Protooncogenes como por mutacin de los genes Tumo-supresores, son del peor pronostico, ya que la proliferacin celular es acelerada y a la vez no tiene freno. d) Genes involucrados en la reparacin del DNA, constituyen un tipo de genes similares a los anteriores. Su falla se encuentra relacionada con la perdida del control durante el Ciclo Celular. La misin de ellos es velar porque cada copia de las hebras madres sea replicada de una forma exacta y a su vez deben evitar la inestabilidad de los cromosomas. La alteracin de dichos genes por medio de algunas mutaciones, induce a los siguientes sndromes:
745
1) Ataxia (falta de coordinacin) Telangiectasia (dilatacin de los capilares), se produce por falla del gen ATM que a su vez provoca Leucemia o Linfoma. 2) Anemia de Fanconi, conocida como falla en el gen FancD2, que provoca Leucemia mielognica aguda. 3) Sndrome de Bloom, falla del gen BLM que codifica para una DNA Helicasa, cuya falta provoca una alta incidencia en la ruptura de los cromosomas. 4) Xeroderma Pigmentosum, caracterizado por una falta de reparacin en los cromosomas expuestos a la luz UV y que produce una alta susceptibilidad al cncer hereditario al colon sin la presencia de plipos. 5) Sndrome de Li-Fraumeni, producido a causa de los genes tumosupresores de la familia TP53, que entrega instrucciones para la sntesis de p53 y CHEK2 por Check point Kinase 2 o Protena Kinasa relacionada con reparacin al dao causado al DNA. La falla de ambos genes a la vez predispone a sarcomas, leucemias, tumores de mama, tumores cerebrales y adrenales. 6) Sndrome de ruptura de los cromosomas o Sndrome de Nijmegen, cuyo gen responsable es el NBS1. Este se relaciona con el procesamiento de las rupturas producidas en la doble hebra de DNA, su falla provoca Leucemia o Linfoma. Volver al inicio 3) MECANISMOS QUE PROPICIAN LA DIVISIN DESCONTROLADA DE UNA CLULA YA DIFERENCIADA Los siguientes mecanismos sacan del reposo a una clula diferenciada: a) La insercin, que puede ocurrir en cualquiera de los lados del proto-oncogen. Este tipo de activacin se ha demostrado en el caso de los proto-oncogenes c-myc y c-myb (Tabla 1-16). Ms an, pueden ocurrir mutaciones del tipo puntual, como sucede con cras, ubicado en el cromosoma humano 11, donde el cambio de una Guanina por una Citosina se relaciona con el cncer a la vejiga. Esta mutacin hace que el aminocido Glicina, normalmente en la posicin 12 de una protena G (Transductora de mensajes con subunidades , y ) se cambie por Valina. Este cambio no permite la liberacin de GTP de la subunidad de esta protena y queda continuamente activada, haciendo que la seal pase hacia el ncleo donde provoca una transformacin. b) La deleciones o prdida de una secuencia. Este tipo de accidente molecular provoca una transformacin de los tejidos, como ocurre con el oncogen del receptor EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), ubicado en el cromosoma 7. Cuando este receptor sufre la delecin del dominio que se une al ligante que lo activa, forma un dmero donde la enzima Tirosina Kinasa que es parte normal de su estructura permanece ahora activa y no es controlada por el ligante, por lo tanto el receptor permanece activado. Es decir como si el ligante estuviera unido continuamente al receptor y pasa seales que no han llegado o no existen, desencadenando una respuesta anormal en la clula. c) Las translocaciones que ocurren en los cromosomas, son tambin fuente de alteracin para uno o ms de los elementos de la cascada transductora de seales. Este
746
proceso se observa en el cromosoma Philadelphia, que contiene una fusin entre los oncogenes bcr1 y abl, que a su vez activan continuamente a la Kinasa de abl provocando un tipo especfico de Leucemia. d) Otro de estos casos ocurre como consecuencia de la amplificacin accidental de los proto-oncogenes, al aumentar su nmero de copias. Este mecanismo, tambin desemboca en el desarrollo de algn tipo de cncer. Por lo tanto, en base a lo anterior se puede concluir que al menos en las clulas Humanas, la transformacin ocurre por una o todas las causas anteriores, es decir cuando fallan los genes Tumosupresores, se estimulan los Oncogenes sin contrapartida o falla la reparacin del DNA. La consecuencia de las fallas anteriores es la aparicin de una nueva actividad enzimtica denominada Telomersica. Es interesante hacer notar la presencia de una nueva enzima denominada Telomerasa (Fig. 4 15) por Telmero o extremo de los cromosomas, en aquellas clulas que han perdido su diferenciacin y que se consideran malignas o cancerosas.
GGGG 5 CCCC GGGG CCCC GGGG CCCC GGGG CCCC 6:
GGGG
GGGG
Hebra hija o extremo ms corto donde el cebador fue hidrolizado por la DNA pol I
1: Telmeros o secuencias repetidas en tandem en la hebra madre en grupos de 5 2: Secuencia repetida por la Telomerasa y adicionada al grupo de secuencias anteriores del telmero
GGGG
GGGG
GGGG CCCC GGGG
3: La Telomerasa posee un RNA

cebador incluido, propio de su estructura
GGGG
GGGG
4: La elongacin por la Telomerasa deja espacio para la

unin de un cebador que es parte de la Telomerasa.
CCCC GGGG 5: Cebador hecho por la

Telomerasa
GGGG DNA pol
GGGG 3
GGGG
CCCC
CCCC
La DNA pol I tiene ahora lugar de anclaje y completa la hebra hija retardada
Fig. 4 15. La Telomerasa posee una secuencia de RNA complementario al repetido y el resto lo constituyen las subunidades de protena pertenecientes a la enzima.
Los Telmeros no tienen secuencias codificantes de protenas y presentan solo secuencias del tipo repetitivo en grupos de a 5 dispuestas en tandem. La actividad de la enzima Telomerasa, radica en la elongacin del extremo de los Telmeros cuando el cromosoma se replica una y otra vez. Lo sorprendente de esta enzima, es que no se encuentra presente en la clula normal, donde por cada Mitosis se acortan los cromosomas. Esto se debe a que la DNA pol I avanza solo en direccin 5 a 3 y el
747
cebador de RNA que emplea para anclarse e iniciar la replicacin, es eliminado por la actividad exonucleasa de la DNA pol I, dejando el extremo 5 ms corto en la hebra hija. De esta manera, despus de un total de 50 a 60 replicaciones se produce un acortamiento notable, comparado con la clula cancergena que es inmortal y cuyos cromosomas no se acortan a causa de que los telmeros son reparados oportunamente por la Telomerasa, ya que esta enzima incrementa el nmero de secuencias repetitivas y deja espacio para que entre un cebador de RNA que es parte de la misma enzima. La DNApol I se ancla a este cebador y completa la replicacin de la hebra madre al rellenar el hueco en la hebra hija. Volver al inicio 4) PROTENAS Y MECANISMOS PROTAGONISTAS DEL CONTROL EN EL CICLO CELULAR. Los procesos que ocurren en el Ciclo Celular se basan en el control que se ejerce sobre un complejo formado por dos protenas. Una de ellas es la subunidad reguladora denominada Ciclina y la otra es la subunidad cataltica que fosforila sustratos y a la vez es fosforilada. A esta ltima se la denomina Kinasa dependiente de Ciclina (CDK) (fig. 5 -15). El Ciclo Celular es un sistema de elevada complejidad, donde es necesario analizar el control, la identidad y el comportamiento de cada uno de sus integrantes. De esta manera se pretende distinguir, como ocurren aquellas transformaciones que conducen a la clula a replicarse normalmente o indiscriminadamente (cncer): Volver al inicio a) LA FAMILIA DE LAS CICLINAS Las Ciclinas (fig. 5 -15), integran una familia de protenas que comparten un segmento de su secuencia. Durante el Ciclo Celular, las Ciclinas son controladas en su expresin a nivel de transcripcin y degradacin, cambiando en cantidad y especificidad de accin. De esta manera, son capaces de caracterizar cada etapa del Ciclo y a su vez aseguran la continuidad de este. Luego de que cada Ciclina ha cumplido con su funcin, son destruidas mediante la accin de sistemas especializados (APC y SCF, ms adelante), manteniendo as la unidireccionalidad del Ciclo Celular. Los complejos entre Ciclinas y CDKs, una vez formados regulan su actividad mediante distintos procesos. Entre ellos tenemos fosforilacin, defosforilacin y unin a protenas inhibitorias capaces de retardar la actividad de este complejo. De esta manera se hace al Ciclo Celular ms lento y se le da tiempo suficiente a los sistemas de reparacin, para subsanar aquellas fallas y errores ocurridos durante situaciones adversas, como aquellos efectos genotxicos causados tanto por radiacin como la presencia de agentes qumicos, fuera de aquellos errores normales cometidos durante la replicacin del DNA. Las Ciclinas son a su vez capaces de regular la especificidad de las CDKs. Esta tarea la ejecutan mediante la induccin de cambios conformacionales, mientras que la actividad misma del complejo Ciclina/ CDK es regulada por las fosforilaciones y defosforilaciones de la subunidad cataltica desde otros factores.
748
CICLINAS:
SON LAS SUBUNIDADES REGULATORIAS DE LAS KINASAS, QUE SE EXPRESAN PERIDICAMENTE DURANTE EL CICLO. CONFIEREN ACTIVACIN Y DISTINTAS ESPECIFICIDADES
5 CICLINA Ubiquitina 1 KINASA 4 CKI Ubiquitina
KINASAS DEPENDIENTES DE CICLINAS:

SON LAS SUBUNI-DADES CATALTICAS ACTIVADAS POR LAS CICLINAS. SON CONS-TITUTIVAS. ACTAN COMO SERINA Y/O TREONINA KINASA. AL FOSFORILAR ACTIVAN, INHIBEN Y/O MARCAN PARA LA DEGRADACIN
P-Thr(14)P-Tyr(15)- DENDIENTE DE -Thr(160)- P
CICLINA(Cdk)
1 : Activacin de las Kinasas por asociacin entre Ciclinas y Cdk

2 : Control por fosforilacin inhibitoria de Thr 14 y Tyr 15 3 : Control por fosforilacin activadora de Thr 160 mediante CAK, este ltimo formado por el complejo CDK7- Ciclina H - MAT1. 4 : Unin con inhibidores de Cdk denominados como CKIs (Inhibidor de la Kinasa dependiente de Ciclina) 5 : Degradacin de Ciclinas y/o CKIs por medio de Ubiquitinacin
Fig. 5 15. Control del Ciclo celular mediante el Complejo Ciclina Kinasa dependiente de Ciclina (CDK).
Las Ciclinas poseen un segmento de secuencia homloga de aproximadamente 100 aminocidos, que es altamente conservado y que se denomina Cyclin box donde se encuentra una Secuencia tpica de la Ciclina. Esta regin es la que se une a la Cdk. En general, las Ciclinas se dividen en dos tipos, las G1(Ciclinas D y E) y las Mitticas (Ciclinas A y B). Las G1 son de vida media corta y se degradan por sus secuencias conocidas por las siglas PEST, ubicadas en el extremo Ct de la Cyclin box. Por otro lado, las Mitticas duran ms tiempo y se acumulan durante G2, para unirse a las Cdks y formar el Factor de Promocin de la Mitosis o MPF. Este ltimo acta como la seal necesaria para entrar a la Mitosis. Las Ciclinas mitticas (A y B) se degradan precisamente antes de entrar a la mitosis, por medio de la marcacin con Ubiquitina. Este ltimo es un pptido sealizador, que se une a la secuencia tpica denominada secuencia para la destruccin. Esta se encuentra localizado hacia el lado N terminal de la secuencia comn a todas las Ciclinas. La unin de la Ubiquitina es llevada a cabo por los sistemas APC y SCF. Estos sistemas de proteasas, se conocen bajo el nombre de APC por Complejo Promotor de la Anafase y SCF por Skp1-Cullin-Fbox (o complejo de tres protenas). Ambos contienen al Proteosoma 26 S encargado de hidrolizar a las Ciclinas.
749
Ciclina D Ciclina E Ciclina A Ciclina B
G0 G1
G1/S
G2
G2/M
INKs
Cip/Kip
Cip/Kip
Fosforilacin Ciclina B Cdc2
Ciclina A Cdk2/Cdc2 Ciclina E Cdk2 Ciclina D- Cdk4/Cdk6

Fig. 6 -15. Niveles de las distintas Ciclinas durante el Ciclo Celular
Volver al inicio
b) KINASAS DEPENDIENTE DE CICLINAS (CDKS).
750
En la Tabla 2 15 se observan los distintos complejos fosforilantes Ciclina CDK, donde tanto CDK4 como CDK6 son tpicas de G1 y se activan por las Ciclinas D (Ver figura 12 15). TABLA 2 15 Pares de Ciclina CDK Ciclina D/CDK4,6 Ciclina E/CDK2 Ciclina E/CDK2 Ciclina A/CDK2 Ciclina A/ CDC2 o CDK1 Ciclina B/ CDC2 o CDK1 Etapa del Ciclo
G1 S
Sustrato
Efecto Regulatorio
pRB fosforilado pRB fosforilado
Suelta los E2F de pRB para que E2F se una al DNA e inicie la transcripcin Reafirma el efecto de fosforilacin sobre pRB Se une a E2F1/DP1 y lo fosforila impidiendo que se unan al DNA Estimula especificidad de unin al DNA Paso de G2 a M
G1/S G2, G2/M G2/M
E2F-1/DP1 fosforilado p53
ORC fosforilado
Ciclina B/CDC27 Como parte de TFIIH/Cdk7
TFIID
Inhibicin Fosforilacin del Dominio carboxiterminal de RNA pol II (CTD Fosforila otras CDKs
Como parte de la actividad CAK: Cdk7 Ciclina C/CDK8, Ciclina H/CDK7/MAT1 (factor de ensamblaje) Ciclina B/CDC2 Ciclina B/CDC2
G1, S, G2, M RNA pol II
TFIIIB Poly (A) Polimerasa
Inhibicin Inhibicin
A continuacin a finales de G1 aparece la actividad fosforilante de CDK2 que se mantiene hasta S con la Ciclina E y Ciclina A. En la etapa S, se tiene la actividad de CDC2 o CDK1 y adems la actividad de CDK7. En G2 se tiene a CDK2 y CDC2 con Ciclina A, para terminar con CDC2 y Ciclina B en la Mitosis.
751
CAK o el complejo entre CDK7 y Ciclina H, no vara su expresin durante el Ciclo y regula positivamente a CDC2 y CDK2, que fosforilan a las kinasas en las Treoninas. Volver al inicio c) MECANISMO DE ACCIN DEL COMPLEJO CICLINA KINASA En el caso genrico del complejo CiclinaCDK ocurre que la CDK en especial CDK2, se encuentra formada por dos lbulos en cada uno de sus extremos. El Nt tiene segmentos de estructura - pegada y el lbulo del extremo Ct tienen estructura - hlice. Entre ambos lbulos queda el sitio activo donde se une el ATP y la entrada a este mismo se encuentra resguardada por el bucle T. Al unirse la Ciclina a CDK2, se provoca el acercamiento de tres residuos de Argininas dispersos en la estructura, uno de ellos unido a la hlice de secuencia PSTAIRE, el otro unido al bucle T y el ltimo pertenece al bucle cataltico. El bucle T, es un sitio especfico de la secuencia, donde se encuentra una Serina o una Treonina capaz de ser fosforilada y que ejerce a la vez un cambio conformacional, que se imparte al resto de la protena. De esta manera las tres Argininas se desplazan siendo coincidentes en el bucle T, donde forman un bolsillo en el que la Thr 160, es fosforilada por CAK (Ciclina HCDK7). Esto se traduce en la abertura del sitio cataltico para aceptar y fosforilar a una protena como sustrato, adems se estabiliza la forma activa de la estructura y se produce un aumento de la interaccin con la Ciclina por medio del aumento de los enlaces hidrgeno. Por otro lado, la fosforilacin en Tyr 15 y Thr 14 de la secuencia por otras kinasas acta inhibiendo la actividad fosforilante. En general acerca de la actividad de las Kinasas se pueden desprender los siguientes conceptos: 1) Los complejos Ciclina/CDK se encuentran involucrados en todos los procesos de activacin del Ciclo Celular incluyendo a la Mitosis 2) Las Kinasas dependientes de Ciclinas son constitutivas, mientras que las Ciclinas son inducibles. 3) La especificidad de las Kinasas depende exclusivamente de las Ciclinas. 4) La actividad enzimtica de las Kinasas es regulada por procesos de Fosforilacin y Defosforilacin. 5) Los inhibidores de las Kinasas (CDKIs o CKIs) actan por unin a las Kinasas. 6) Los sistemas Ubiquitina-Proteosoma son los encargados de hidrolizar a las Ciclinas y a los CDKIs. 7) Una gran cantidad de sustratos son fosforilados por las Kinasas resultando en activacin, inhibicin adems de marcacin para la degradacin e incluso el reconocimiento de su ubicacin en distintos compartimentos de la clula. 8) En general existen 4 mecanismos para controlar la actividad de las Kinasas: a) Unin de las Ciclinas
752
b) Unin de los CDKIs (Inhibidores de las Kinasas dependientes de Ciclina) c) Fosforilaciones activadoras e inhibitorias d) Degradaciones mediadas por Ubiquitinas de Ciclinas y CDKIs Volver al inicio 5) COREPRESORES DE LA TRANSCRIPCIN QUE NO SE UNEN DIRECTAMENTE AL DNA COMO LO SON pRB, p107 Y p130. a) Factor pRB La funcin de la protena pRB 105 110 kD (998 aminocidos), se determin al descubrirse que faltaba total o parcialmente en un tipo especial de cncer que afecta a nios con una muy baja incidencia y que se conoce como Retinoblastoma Retinal. El gen responsable, es de 200kb y no se encuentra presente a causa de una delecin total o parcial del brazo largo (q) del cromosoma 13, banda 14 (13q14). La enfermedad tambin aparece cuando el gen se encuentra normalmente presente, pero debido a un error durante la etapa de procesamiento en el transcrito primario (RNAhn), se producen copias proteicas no funcionales que se encuentran mal ensambladas. Cuando uno de los alelos del gen RB se pierde por alguna delecin accidental en las clulas somticas no se produce ningn efecto, sin embargo la perdida de este alelo en las clulas germinales crea un portador con un fenotipo an normal, cuya descendencia tendr mayor probabilidad de tener una segunda mutacin en los heterozigotos, pero en el alelo normal adquiriendo ahora la enfermedad a una edad mas avanzada. Por otro lado, la perdida de ambos alelos en un homocigoto hace que la enfermedad aparezca a temprana edad. pRB es fosforilado por los complejos Ciclina/ CDKs y normalmente la protena pRB, no se encuentra fosforilada o bien se le halla hipofosforilada en la clula en reposo. pRB forma parte de un complejo inhibidor de la expresin (pRB-E2F-Gen), precisamente de aquellos genes que son necesarios para entrar al Ciclo Celular o pasar por los distintos puntos de control del Ciclo. pRB tiene por funcin retener a los factores activadores de la familia E2F en un complejo que se halla en su forma inactiva. Cuando pRB en el complejo es fosforilado progresivamente o hiperfosforilado, libera a los factores de transcripcin, dejando ahora al factor E2F unido al Gen. A su vez E2F activa de forma trans (alelo paterno y materno) la expresin de los genes. Por lo tanto sin pRB, las clulas abandonan Go y se replican an con el DNA daado producindose el Cncer de la Retina o Retinoblastoma. Volver al inicio
b) Factor p 107 y p 130. Otras protenas de la familia de pRB denominada tumosupresora, son las protenas p107 (107 kDs) y p130 (130kDs), ambas retienen o inactivan a algunos de los factores de transcripcin de la familia E2F (fig.11-15) y a su vez inhiben la expresin de varios genes que solo pueden ser liberados por fosforilacin.
753
Tanto pRB como p107 y p130, se les puede denominar protenas bolsillo, ya que tienen por funcin reclutar o echarse al bolsillo a la Histona Deacetilasa (HDAC). Esta ltima junto a la otra enzima Histona Acetil Transferasa (HAT), tienen por funcin deacetilar y acetilar respectivamente a las Histonas, precisamente en el grupo -Amino de sus Lisinas. Al ser Acetilada una Lisina esta pierde su carga positiva, por introduccin del grupo N- Acetilo y ya no interacciona con los fosfatos negativos del DNA. De esta manera se pierde la estabilidad del nucleosoma que se desarma para dejar DNA al descubierto e iniciar la transcripcin. Una complicacin que presenta este mecanismo, es que el efecto depende en parte, de la identidad de las Histonas pertenecientes al Nucleosoma y la posicin en la secuencia de las Lisinas modificadas. En otras palabras, cuando pRB se halla hiperfosforilado no se une a E2F y tampoco recluta a HDAC, quedando el DNA descubierto para su expresin. El mecanismo exacto an no se ha dilucidado. Volver al inicio 6) FACTORES DE TRANSCRIPCIN QUE SE UNEN AL DNA (p53, p73 Y E2F). a) FACTOR p53 Uno de los primeros genes tumosupresores que fue encontrado en vertebrados es el p53, de 393 codones y 53 kD ubicado en el cromosoma 17 regin p13 (brazo corto, banda 13). Durante el Ciclo Celular normal, el gen p53 es inactivo, pero en el caso de que ocurra dao en el DNA como radiacin UV, agentes qumicos o variacin del pool de los nucletidos. La clula expresa este gen y su producto la protena p53, aumenta de vida media manteniendo a la clula en reposo, es decir permite que el dao que estimul su expresin sea reparado. Si este dao es muy extenso o el gen es activado muy tarde para prevenir la divisin celular, la clula entra en Apoptosis o muerte programada. De esta manera se eliminan permanentemente los errores genticos. La protena del gen p53, posee a su vez modificaciones post-traduccionales que la hacen an ms activa. As su dominio cerca del Nt (amino terminal) es acdico con cargas +, similares a las de los factores de transcripcin y se une al DNA en la forma de un tetrmero. Esta conformacin es tambin promovida por las interacciones de su dominio en el extremo Ct (carboxilo terminal) que una vez fosforilado, tiene la capacidad de activar la transcripcin de un gen conocido como p21/ WAF1. El producto de este gen, acta a su vez inhibiendo la accin de los complejos Ciclina-Kinasa dependiente de Ciclina. De esta manera se impide la accin fosforilante de estos sobre pRB y no se expresan los genes que permiten el paso por el punto de restriccin antes del lmite G1/S, como se ver ms adelante. La vida media de la protena p53 es de corta duracin (15 a 30 minutos) y se encuentra sujeta a fosforilaciones por los complejos Ciclina A-CDK2 y Ciclina B-CDC2 que operan en la fase S y G2/M, pero no por las Ciclinas de la fase G1 como Ciclina E/CDK2 y Ciclina D1/ CDK4. Por otro lado, el gen p53 puede sufrir a su vez, mutaciones en ciertos lugares denominados puntos calientes y que se encuentran ubicados entre los codones 129146, 171-179, 234-260, y 270-287. Sucede aqu, que no todos los daos son reparados con la misma premura y a causa de ello, ocurren mutaciones permanentes en los aminocidos 175, 248 y 273 que conducen a la prdida de la funcin. En estos casos la
754
protena p53, no es capaz de inducir la expresin de p21 (Protena inhibidora del Complejo Ciclina/CDK) y de retardar por consiguiente el Ciclo Celular o dirigirlo hacia la Apoptosis (muerte celular). La clula alterada se divide as, con su DNA daado y este es pasado a la descendencia. En general las mutaciones por insercin o delecin en ambos alelos de este gen se asocian con cncer al colon, mamas, hgado y pulmones. Por lo tanto la clula con p53 daado tiene una ventaja selectiva sobre aquellas clulas normales, pero tambin daadas que se dirigen hacia el proceso de Apoptosis. La forma mutante de p53 parece tener an ms afinidad por el DNA que la forma wild type (original, no mutada) y acta de manera dominante tipo trans, es decir como un oncogn (trans significa que afecta al gen de su alelo materno y paterno) estimulando en este caso la proliferacin celular a diferencia de su forma original, que es en realidad tumo-supresora.
ESTIMULO GENOTXICO
MDM2 secuestra
p53
P19/ARF
Degradacin SENSORES Aumento en la cantidad o en la actividad de p53 Transactivacin P21 Transactivacin

BAX
Transactivacin Corte y Empalme alternativo en locus ARF-INK4a P16 / INK4A
APOPTOSIS
E2F
MUERTE CELULAR
pRB Ciclina D CDK4

Complejo activador Ciclina /CDK inhibido por p21 y p16
DETENCIN EN G1
pRB
E2F
PASO A LA FASE S
Fig. 7 15. Apoptosis y detencin en G1 del Ciclo Celular mediados por la protena p53. pRB no es fosforilado y permanece unido a E2F.
El balance entre la diferenciacin celular, progreso en el Ciclo Celular y Apoptosis se encuentra regulado por la razn pRB y p53. Si el nivel de pRB es mayor que el de E2F la clula no progresa en el Ciclo como ocurre en Go. Por otro lado si la cantidad de pRB fosforilado es mayor que la cantidad de pRB no fosforilado y este es menor que la cantidad de factor de transcripcin, la clula progresar en el Ciclo Celular pasando a S y luego a G2/M. Cualquier dao que sea detectado en este proceso aumentar los niveles de p53 y empezar el proceso Apopttico. Durante la Apoptosis la clula no libera contenido intracelular y no produce inflamacin como en la necrosis celular. Durante la Apoptosis se produce una agrupacin de los organelos junto a la formacin de agregados por los ribosomas, incremento en el volumen
755
de las mitocondrias y generacin de vacuolas por el retculo endoplsmico que junto a la anterior condensacin del citoplasma y cromatina, forman los cuerpos apoptticos. En estos casos ocurre que en la superficie de la clula se muestra Fosfatidil Serina, N-Acetil Glucosamina y Lectinas o receptores opsnicos, que a su vez estimulan la fagocitosis por clulas vecinas del parnquima. En la figura 7 15, se observa el dao causado al DNA por luz UV y/o radiacin, lo que se denomina como estmulo genotxico. Este ltimo es capaz de detener la sntesis de DNA y RNA mediante un agotamiento del pool de nucletidos, ya que no se continan sintetizando las enzimas correspondientes, las cuales son inhibidas en su transcripcin. Los sensores que reconocen el dao al DNA, se encuentran constituidos por una serie de protenas codificadas por aquellos genes cuya falla acarrea los siguientes sndromes: Ataxia Telangiectasia, Sndrome de ruptura de los cromosomas o sndrome Nijmegen, Anemia de Fanconi y sndrome de Bloom como se vio anteriormente. Una vez reconocido el dao, se activa la produccin y/ o actividad de la protena p53 por medio de aquellos mecanismos de control a nivel de la transcripcin o post transcripcin. La protena p53 es capaz de autorregularse al inducir el factor MDM2, este ltimo disminuye los niveles del mismo p53, ya sea por degradacin o bien secuestrando la protena misma hacia el nucleolo. Por otro lado, p53 estimula mediante transactivacin la sntesis de la protena p21 que inhibe directamente la fosforilacin y/o activacin de pRB (fig. 7 -15). A continuacin se activa el sistema ARF/INK que significa Alternative reading frame / Inhibitor of Cyclin Dependent Kinase, donde se emplean exones comunes (2 y 3) para generar protenas totalmente diferentes como p16 y p19, donde ambas presentan el primer exn diferente. La primera de ellas p16 es parte del sistema INK4a y acta directamente como inhibidor del complejo Ciclina D/CDK4, mientras que la segunda p19, es parte del sistema ARF que inhibe a MDM2 e indirectamente impide el crecimiento celular por medio del aumento de los niveles de p53, que ya no es secuestrado por MDM2. Esto ltimo se traduce en un aumento de los niveles de inhibidor p21 sobre el complejo CiclinaD/CDK4. En base a lo anterior, no se puede pasar a la fase S y continuar con el Ciclo, producindose el arresto o detencin en la fase G1. En cuanto a la Apoptosis, p53 induce por transactivacin el factor BAX, que acta sobre la Mitocondria e induce un desacoplamiento entre la Fosforilacin Oxidativa y la Cadena de Transporte de Electrones. Este hecho deja sin energa al sistema y conduce a una posterior muerte celular. Un mejor anlisis de estos procesos se encontrar en el siguiente Apndice al final de este tema. Volver al inicio b) FACTOR p73 p73 tiene dominios con un cierto grado de identidad con p53. 29% para el dominio de transactivacin, 63% para el dominio de unin al DNA y 38% para el dominio responsable de la oligomerizacin. El gen de la p73 se halla asociado a la regin del brazo corto del cromosoma 1, banda 36(1p36). Cuando este gen se encuentra con una delecin (le falta un pedazo), se produce un tipo de cncer conocido como neuroblastoma. Por otro lado, este mismo gen presenta los mismos puntos calientes que p53. Presenta lugares de su secuencia con una alta incidencia de mutaciones, como lo es aquella zona entre los residuos 113 y 190.
756
Otra evidencia que la liga a p53 es que el producto proteico de p73 inhibe el crecimiento de las clulas de neuroblastoma in vitro y tambin parece promover la apoptosis. Volver al inicio c) FACTOR E2F. Estos incluyen a la familia E2F 1, 2 y 3 que se unen predominantemente a pRB, ms el factor E2F4 que se une a todas las protenas como pRB, p107 y p130, mientras que E2F5 se une a p130. Estos factores se necesitan libres para pasar desde Go a G1 y el punto de restriccin antes del lmite G1/S. Los factores E2F heterodimerizan con otras protenas relacionadas distantemente y que son las DP-1, 2 y 3, las cuales se emplean para mejorar su eficiencia de unin con el DNA. Estas ltimas montan la capacidad de unin al DNA mediante el complejo E2F-DP. Por lo tanto DP es considerado como un factor activador que promueve en forma cooperativa la actividad de los promotores de la familia E2F. De esta manera, el heterodmero E2F-DP funciona como activador trans (activa alelo paterno y materno) de la transcripcin de aquellas secuencias promotoras que se encuentran ubicadas corriente arriba de los genes. Estos genes ahora activados codifican para las siguientes enzimas y factores: Dihidrofolato Reductasa (DHFR), Timidina Kinasa (TK), Timidilato Sintasa (TS), DNA polimerasa (DNApol), CDC2, Ciclina E y Ciclina A. PCNA por Antgeno Nuclear de la Clula Proliferativa y Factores de licenciamiento (familias CDC y MCM). Adems de aquellos genes que regulan la proliferacin celular como: c-Myc, B-Myb, pRB, p107, E2F1, E2F2, CDK1, p21, p27 y p19 En general, la va del E2F-pRB se encuentra formada por la familia E2F de factores de transcripcin, la familia de las Protenas del Retinoblastoma o Protenas Bolsillo, Ciclinas y Kinasas dependientes de Ciclina (CDKs) e Inhibidores de las Kinasas dependientes de Ciclina ( CKIs o CDKis). De esta manera regulan el progreso durante el Ciclo Celular, adems tambin regulan la Apoptosis celular. Esta ltima va se encuentra descontinuada en la mayora de los cnceres. La familia E2F1, 2 y 3 tiene una secuencia aminoacdica donde se distinguen distintos motivos como la regin donde se une la Ciclina, regin donde se une el DNA, la regin responsable de la dimerizacin, la caja marcada, la zona de transactivacin y la zona del bolsillo. Mientras que los factores reforzadores del efecto como DP1 y DP2 que son expresados a lo largo del Ciclo comparten algunas regiones homlogas como la zona de unin al DNA y la zona responsable por la dimerizacin. En general con E2F forman un heterodmero que pueden estar reprimido, inhibido o activado, segn sea el grado de fosforilacin. Volver al inicio 7) APNDICE- CASPASAS- DIFERENCIAS ENTRE NECROSIS Y APOPTOSIS
757
Aqu se describen como ejemplos, algunas de las vas entre las cuales p53 no se encuentra mediando la Apoptosis Celular, sin embargo los mecanismos para destruir la clula son similares a nivel de la Mitocondria. CASPASAS Son proteasas que existen en la forma de Zimgenos. Tienen tres dominios el prodominio del Nt, un dominio p20 y otro p10. Pueden ser activadas por otra Caspasa, por la induccin en la cercana de otra molcula y por asociacin con alguna subunidad regulatoria. Poseen en el sitio activo Cistena y rompen el enlace peptdico despus de un residuo de Asprtico. Este efecto puede activar o desactivar a otro miembro de la va de sealizacin desencadenando o inhibiendo su efecto. Existen en general dos tipos, el Tipo I son iniciadoras de pro-dominio largo, que sirve para interaccionar con otras molculas y Tipo II o efectoras con un Pro-dominio corto y son el producto de la va de sealizacin. Las Caspasas actan sobre mltiples blancos, por ejemplo Lamin A o Laminina A. Esta ltima es una protena estructural que mantiene la integridad del ncleo, otro blanco es PARP o poly-ADP Ribosa Polimerasa, que se encuentra involucrada en la reparacin del DNA, RB protena tumo supresora y a la vez reguladora del ciclo celular, Histona H1 otra protena esencial que se necesita para la organizacin de la cromatina y CAD o DNA asa activada por Caspasa, encargada de romper el DNA en clulas apoptticas. Otra de estas vas la constituye la activacin de Linfocitos citotxicos que inyectan la enzima denominada Granzima B. Esta ltima estimula los niveles de Caspasa 8 que cataliza el paso de Pro-caspasa 9 a Caspasa 9 activa, que a su vez desencadena una cascada amplificadora de Caspasas, cuyo resultado final consiste en la protelisis de la integridad estructural tanto del citoplasma como del ncleo, atacando protenas del citoesqueleto y aquellas enzimas involucradas tanto en la replicacin como reparacin del DNA. La Apoptosis celular puede ser mediante seales externas a la clula y este tipo se denomina como instructiva, ya que es transmitida por receptores en la membrana celular. El otro tipo es interno o intrnseco y es mediado por la Mitocondria. Aquellos receptores en la superficie de la clula denominados TNF-R1 (Tumoral Necrosis Factor) caen en el primer tipo y son especficos para el Factor de Necrosis Tumoral (fig. 8 15). En su estructura presentan varios dominios y entre ellos encontramos a DD por Death Domain, que solo enfoca hacia el lado citoplasmtico de la clula. DD se une se une lateralmente al dominio homlogo DD de una molcula adaptadora, denominada FADD o MORT1. Esta ltima contiene al dominio DED por Death Effector Domain . A su vez el dominio DED de la molcula adaptadora se une al dominio homlogo de la molcula ProCaspasa 8 (Caspasa: Proteasa tipo Zimgeno) que a su vez da origen a la molcula funcional como Caspasa-8. Esta ltima activar por protelisis a p22BID, convirtindola en una protena de menor peso molecular como p15BID. Esta ltima migra dentro de la membrana mitocondrial y acta como un factor pro-apopttico estimulando la abertura del canal PTP. Este hecho provoca la prdida del gradiente electroqumico,
758
LINFOCITOS CITOTXICOS
TNF: Factor Tumoral de Necrosis TNF-R1: Receptor de TNF
DD DED
ADAPTADOR O PROTS. FADD/MORT
ANT P15 BID
G R A N Z I M A B
PTP
Pro-Caspasa 8
P22 BID
P15 BID
Pro Caspasa 9 ProCaspasa 3
Caspasa Tetramrica 8
Caspasa 9- Activa
Caspasa 3 Fig. 8 -15. Vas de Apoptosis en la clula.
Cascada de Activacin de las Caspasas
desacoplamiento de la fosforilacin oxidativa, produccin de ROS ( Reactive Oxygen Species por radicales libres del Oxgeno altamente txicos), disminucin del elemento reductor protector de membranas GSH y de ATP, liberacin de Ca +2, Pro-caspasa y otras Proteasas al citoplasma. En fin, toda una cadena de eventos conducentes a la muerte celular. A continuacin en la Tabla 3 15, se observan algunas de las diferencias entre Necrosis y Apoptosis. TABLA 3-15 DIFERENCIAS ENTRE NECROSIS Y APOPTOSIS
759
CARACTERSTICAS
NECROSIS
APOPTOSIS
Respuesta de los tejidos A nivel de los tejidos Volumen celular Membrana celular Organelos citoplasmticos. Ncleo
Inflamacin Grupos de clulas afectadas Clulas hinchadas Perdida de la integridad y formacin de vesculas En pedazos Agregados irregulares de cromatina
Ninguna Solo clulas individuales Clulas se condensan Formacin de cuerpos apoptticos en vesculas Morfologa Intacta Condensacin de la cromatina
Volver al inicio
8) INHIBIDORES DEL COMPLEJO CICLINA/CDK QUE INTEGRAN LA FAMILIA INK 4 Y CIP/KIP, WAF1 a) Protenas de la familia INK4 son p16, p19, p18 (fig. 9-15). Las Kinasas dependientes de las Ciclinas D, E y A pueden ser inhibidas por las familias de inhibidores (CDKIs) correspondientes a las protenas INK4 (Inhibidores de Kinasa, Tabla 4 15), representadas por p16 (INK4a), p15 (INK4b), p18 (INK4c) y p19 (INK4d). Todos se unen a los complejos de G1 (fig. 9 15), como lo es Ciclina D CDK4,6 aunque tambin pueden ser inhibidores de CDK2. La protena tumo-supresora llamada p16 (sinnimo Mts1), es un regulador negativo del complejo Ciclina D-CDK4.
760
F a m ilia IN K 4
p19 p18 T G F -B p15 p16
F a m ilia C ip / K ip
p21 p57 p27
p53
P r o te n a s e c u e s tr a dora de p27
M yc
C ic lin a D CDK 4
C ic lin a CDK 2
p 107
p130
p RB
E 2F
DP
G e n d e C ic lin a E G e n d e C ic lin a A O tr o s G e n e s
G1
Fig. 9- 15. Cadena de Inhibidores del Ciclo Celular
Al parecer modula o inhibe la fosforilacin de pRB por este complejo. Por lo tanto cuando p16 sufre mutaciones o deleciones, el complejo se hace activo y pRB es fosforilado totalmente, liberando sin control a los factores de transcripcin E2B pasando por el punto de restriccin antes del lmite G1/S. En algunos tipos de cnceres al pulmn, el 20% ha perdido la funcin de p16 y el 80% ha perdido la funcin de pRB. Volver al inicio b) Familia de inhibidores incluye a los tipo CIP/ KIP. Se encuentran constituidos por las protenas p21 (Cip 1), p27 (Kip1) y p57 (Kip2), que pueden bloquear directamente la accin fosforiladora del Complejo Ciclina E CDK2 en la fase G1 tarda para que la clula no pase a S. Tambin son capaces de unirse, pero en menor grado a los complejos Ciclinas D-CDK4,6. Factor KIP1 o protena p27 y Kip2 o p57, permanecen altas durante Go y caen en respuesta a la estimulacin mitognica. La protena p27 se une al complejo CiclinaDCDK4,6 bloqueando la entrada a la fase S y tambin a los complejos Ciclina E-CDK2 y Ciclina A-CDK2 , (Tabla 4 15). Factor WAF1 ( wild type fragment 1), es la protena p21 (Cip1). Es producida cuando la protena p53 aumenta su nivel despus para detectar dao al DNA. La p53 se une a la
761
regin regulatoria del gen de la protena p21, conocido como CIP1 y hace expresar a este gen su protena inhibidora que acta sobre el complejo CiclinaD-CDK4,6. Este hecho inhibe la fosforilacin de pRB, que no llega a soltar a los E2F, que a su vez continuarn inhibiendo la expresin de los genes. p21 es capaz de unirse a ambos complejos Ciclina D1-CDK4 y Ciclina D2-CDK4, adems de los otros complejos Ciclina E- CDK y Ciclina A-CDK. TABLA 4 15 Induccin por: Senescencia TGF- (Tumor Growth Factor) Senescencia, diferenciacin Diferenciacin Dao al DNA, diferenciacin y senescencia TGF- Diferenciacin Familia de inhibidores CDKIs p16 (INK 4) p15 (INK 4b) p18 (INK 4c) p19 (INK 4d) p21 (Cip/Kip) Sistemas Blanco Ciclina D/CDK 4 ,6
p27(Cip/Kip) p57(Cip/Kip)
Ciclina D /CDK 4,6 Ciclina E /CDK2, Ciclina A /CDK2 Ciclina B/ CDK1 Volver al inicio
9) OTROS MODULADORES a) Factor MDM2 Este es la enzima E3 del sistema de unin de Ubiquitina a el factor p53. Su gen es a su vez controlado por p53 y su funcin es regular la actividad de p53, ya que al unirse a p53 inhibe o detiene el exceso de este en la Apoptosis, tambin impide que p53 detenga al Ciclo Celular en el punto de restriccin G1/S. Es incluso capaz de marcar para la degradacin por proteasas a p53. Su nivel se reduce cuando se une a p19, ya que este ltimo promueve la degradacin de MDM2. La protena p19 es una protena supresora de MDM2 que a su vez es antagonista a p53. Volver al inicio b) CDC 25 A, B y C Esta es una familia de fosfatasas de aproximadamente 500 aminocidos que muestran su homologa hacia el lado Ct. Son especialistas en remover fosfatos de las Tirosinas de los Complejos Ciclina-CDKs, especialmente en el Complejo Ciclina B-CDK1(Cdc2) en el punto de transicin G2/M. CDC25 aparece en clulas que estn proliferando y conduce a las clulas a las fases S y M. Esta familia de fosfatasas puede ser a su vez fosforilada. Volver al inicio
762
c) COMPLEJOS LIGANTES DE UBIQUITINA APC Y SCF. Unir Ubiquitina a un sustrato requiere de tres enzimas E1 por activadora, E2 por conjugadora y E3 por ligadora de la misma Ubiquitina. El progreso por el Ciclo Celular requiere de la actividad de varios Complejos cuya actividad consiste en reconocer sustratos ( Ciclinas y CDKis) y ligarles Ubiquitina para que sean reconocidos por el Proteosoma que los procede a hidrolizar. De esta manera se queman las distintas etapas y no se repiten nuevamente.
DEGRADACIN DEPENDIENTE DE APC

SECURINA Ciclina B SECURINA Ciclina B Ubi
Ubi
Ciclina B
Ubi
Ciclina B Ubi
Ubi
Ubi
Separacin de los Cromosomas
Salida de la Mitosis
METAFASE
ANAFASE
CITOKINESIS
Fig 10 15. El Complejo APC marca a Securina (mantiene cromosomas juntos) y Ciclina B para se destruccin permitiendo a la Mitosis continuar con su rutina normal.
El Complejo APC (fig. 10 15) o Anaphase Promoting Complex , es necesario para salir de la mitosis, ya que interviene en la degradacin de complejos fosforilados de Ciclina B/ CDKs en la fase M junto a Securina, que mantiene a los cromosomas unidos. La destruccin de Securina mantiene la euploida o nmero normal de cromosomas y la degradacin de las Ciclinas B confiere estabilidad al material gentico a la salida de la Mitosis (fig. 10 15). APC es activado por las molculas denominadas Cdc20 y Hct1. Cdc20, es la subunidad activadora de APC, se une en Metafase y Anafase. Posterior a su efecto viene la accin de las enzimas E1 y E2 ms la unin de la Ubiquitina. Por otro lado Hct1 o Cdh1 (relacionado a Cdc20), mantiene activo a APC despus de Anafase y a travs de G1. El otro Complejo, es denominado SCF (fig. 11 -15) por Scaffold proteins y es necesario para alcanzar la fase S. Interviene como SCFSkp1 y se encuentra formado por la unin de las protenas Skp1,Cullin (como parte de E3-ligasa) y la protena FBP denominada F-box por su dominio de 40 aminocidos necesario para la especificidad. Otra protena de este complejo es la Roc1. Existe, un Complejo homlogo al primero y es el Skp2-Cullin-F-box que es denominado SCFSkp2 . SCF es capaz de inducir la formacin de una cadena de mltiples unidades de Ubiquitina en los CDKIs: p21 y p27, que son los inhibidores de los complejos Ciclina/ CDKs que una vez destruidos, permiten el paso a la fase S. Los CDKIs (p21 , p27) se fosforilan primero mediante una kinasa para ser posteriormente reconocidos por las actividades
763
enzimticas del complejo SCF, como son E1, E2 y E3 que junto a la unin de varias unidades de Ubiquitina forman una cola bifurcada que finalmente es reconocida por el Proteosoma y es degradada. En la fase S, este mismo sistema degrada al complejo Ciclina A-CDK, reconocido por el motivo F-box de la protena FBP. Es tambin posible que SCF intervenga en la degradacin de las Ciclinas D y E.
Skp1
E3
Roc1
Cull 1 E2
Ubi
Sustrato
FBP
Fig. 11 15. Protenas o subunidades que forman el Complejo SCF
Volver al inicio
10) CICLO CELULAR Despus de analizar los mecanismos individuales involucrados en el control del Ciclo Celular es necesario entrar a observar en que orden se integran y el grado de complejidad que alcanzan al reunirse todos estos mecanismos en un proceso delicado. La clula tiene la capacidad para multiplicarse, permanecer en reposo o diferenciarse y cualquiera de las elecciones que tome depender del control que exista en el paso Go/G1. En reposo la clula normal recibe una sinfona de seales tanto del tipo estimuladoras como inhibitorias y el camino que decida tomar depender del balance o imbalance entre ambas seales. A lo largo de todo el Ciclo (Fig. 12 15), se observa la aparicin y desaparicin de las Ciclinas junto a la actividad fosforilante de los distintos complejos Ciclina CDKs, acompaada por la actividad contraria o defosforilante de las fosfatasas Cdcs, junto a la regulacin en la transcripcin de nuevos factores y el control de su actividad por medio de protelisis, llevada a cabo por los sistemas APC y SCF. Otra de las formas de regulacin incluye el secuestro de factores por MDM2 y 14-3-3, junto al efecto de inhibidores del tipo Cip/Kip e INK. En general, las Ciclinas D y E aparecen en la fase G1,
764
las Ciclinas E y A aparecen durante la fase S del Ciclo (replicacin del DNA) y las Ciclinas A y B durante las fases G2 y M (Mitosis).
4
Mitosis regulada por unin de Ciclina tipo B
1 Go
Ciclina tipo D se unen a CDK4 y CDK6. Actividad esencial para entrar a G1
Ciclinas B CDK 1
Ciclinas D Ciclinas D CDK4 CDK 6
M G1 2 G2
Ciclinas A CDK 1 Ciclinas A CDK 2
Ciclina tipo E se asocia a CDK2 y regula el progreso de G1 a S. Se inducen por Ciclina D y refuerzan esta accin
Ciclina tipo A se une a CDK2 y se requieren durante fase S para promover paso de G2 a M con CDK1
Ciclinas E CDK 2
Fig. 12 -15. Complejos Ciclina/ CDK activan las distintas partes del Ciclo celular
El Ciclo se inicia normalmente por medio de los factores de crecimiento o mitgenos, que actan sobre la clula en reposo o la etapa Go e inducen la aparicin de las Ciclinas tipo D en G1 (Ciclinas G1: D y E), representadas por la familia D1, D2 y D3, etc. (Fig. 12 15). En algunas ocasiones puede ocurrir que la Ciclina D1 se sobre-exprese anormalmente, como resultado de una amplificacin gnica o una translocacin accidental y que junto a la enzima CDK4, que es donde ejerce su accin activadora, se dispare fuera de control. De esta forma se sacara a la clula de la etapa Go y se la llevara a la transformacin inducida. En ambos casos normal y alterado, las Ciclinas de la familia D se asocian a las Kinasas CDK4 y 6 para formar el Complejo Ciclina CDK4,6 y hacer entrar a la clula al Ciclo (Figs. 13 15). A continuacin se observa que para activar a este complejo se necesita del concurso de CAK o Kinasa Activadora de CDKs. Esta es una familia de enzimas fosforiladoras. La fosforilacin se lleva a cabo en la Thr 160 con lo cual el complejo Ciclina D-CDK 4,6 Thr 160-P se encuentra activado. Por otro lado existe tambin una familia de protenas defosforiladoras o Fosfatasas, Cdc25 A, B y C que pueden desactivar y cada una de ellas tiene una distinta afinidad por los Complejos Ciclina/CDKs. Continuando con el Ciclo, una vez fosforilado el complejo Ciclina D-CDK 4,6 Thr 160-P entra al ncleo y fosforila a su vez a las protenas de la familia pRB, p107 y p130 (fig. 14 15). Estas ltimas se encuentran inhibiendo la transcripcin de los genes encargados de preparar a la clula para la entrada al Ciclo Celular (paso Go/G1) o para pasar el punto de Control antes del lmite G1/S. Como consecuencia de lo anterior se fosforila progresivamente pRB, que se suelta del complejo inhibidor pRB-E2F-DP- DNA (DP, por
765
DNA Binding Protein, es una protena relacionada con los E2Fs) y se expresan sucesivamente los genes de las Ciclinas E, A y B, ms los genes de la fase S, G1 y M junto a la enzima Dihidroflico Reductasa y Timidina Kinasa (Figs. 13 15). Los genes son activados en forma trans, es decir se activan tanto el alelo paterno como el materno por el complejo E2F-DP- DNA.
Ciclina D CAK Ciclina D CDK4,6 P CDK4,6 pRB

E2F E2F Fosforilacin
Fosforilacin por CAK
P P pRB P
P pRB
E2F E2F
P
Fosforilacin
Ciclina E CDK 2
CAK
Fosforilacin por CAK
Ciclina E CDK 2 P
E2F E2F
Activacin de Genes de las Ciclinas E, A y B ms genes de las fases S, G2 y M junto a DHFR y TK
Fig. 13 15. Activacin por Fosforilacin de complejos Ciclina/CDK por CAK y control del Complejo pRB - E2F- DNA mediante fosforilacin en G1. Efecto de la Ciclina D y posterior refuerzo de la Ciclina E para fosforilar a pRB. E2F queda libre e inicia la transcripcin (DHFR : Dihidrofolato Reductasa) y (TK :Timidina Kinasa).
Luego, para que la clula pase de G1 a S, las Ciclinas G1 de la familia D deben experimentar protelisis, dejando de esta manera lugar a las Ciclinas E y A. Estas ltimas han sido recin sintetizadas por los genes expresados por el mecanismo de la fase anterior o G1. Al mismo tiempo se fosforilan los CDKIs, que podran inhibir el Ciclo, por lo que son hidrolizados y destruidos por los sistemas Ubiquitina/ Proteosoma 26S. De esta forma se deja libre de influencias a los nuevos complejos Ciclina/CDKs para continuar.
766
Dao al DNA
p53
Apoptosis p27 p21
TGF- Familia INK4 p15,p16,p18,p19 CICLINAS D1, D2, D3 CDK 4, 6
Ataxia Telangiactasia
CICLINAS D1, D2, D3 CDK 4, 6

GENES REPRIMIDOS
CICLINAS D1, D2, D3 CDK 4, 6
pRB E2F 4,2,3 DP
p107 E2F 4,5 DP DNA p107 P P P
p130 E2F 4,5 DP DNA P p130 P P
Fosforilacin por CDK4,6 de la familia pRB
pRB
GENES DESREPRIMIDOS
P P
E2F 4,2,3,
Genes que permiten pasar control G1/S
DP
E2F 4,5
DP DNA
E2F 4,5
DP DNA
DHFR -TK -TS - POL - CDC2 - E2F1 Ciclina E, A - p107 - E2F 1,2
Fig. 14-15. Activacin e inhibicin de pRB, p107 y p130. Se expresan enzimas para la sntesis de DNA y las Ciclinas de la fase S y los CDKs correspondientes que se mantienen latentes por accin de los CDKis. (DHFR : Dihidroflico Reductasa. TK: Timidina Kinasa, TS Timidina Sintasa)
Por su parte la Ciclina E (figs. 13 15), aumenta y disminuye rpidamente en el lmite G1/S y en su periodo ascendente se asocia a la Kinasa CDK2 acelerando la fosforilacin de la familia pRB, previa fosforilacin de la Thr 160 del complejo Ciclina E- CDK2 por CAK. Su efecto contribuye a liberar ms factores E2F, para que estos pasen a actuar de forma trans sobre sus respectivos genes. Por otro lado, el complejo Ciclina E -CDK2 es tambin capaz de actuar por retroalimentacin positiva, es decir estimula su propia sntesis.
767
Ms adelante en el Ciclo, la Ciclina A (figs. 14,15 15) se expresa despus de la Ciclina E, entre la lnea divisoria de la etapa G1 y S. La Ciclina A se hace importante para esta transicin, al asociarse a CDK2 en la fase S y an con CDC2 (CDK1) en la fase tarda de S y en el inicio de G2 (fig. 9 15). Posteriormente baja su concentracin en la fase M. Al parecer se encuentra relacionada con el paso por el punto de control G2/M, donde se comprueba la normalidad del huso mittico antes de poder continuar.
P18 P15 P19 P21 P16
G1 M
CDK 1 Ciclina A E2F p107 Ciclina A CDK 1 DP1 Ciclina B CDK 1 P P CDC25A E2F pRB Ciclina A CDK 1 P
p
Ciclina D1 CDK4,6 P P p107
Ciclina D2 CDK4,6 P
Ciclina D3 CDK4,6 P
P27
P21
Ciclina E E2F pRB CDK2
P P
pRB
G2
P pRB
E2F P pRB P
E2F E2F pRB Ciclina A P CDC25 P27 P21 CDK2 P
P CDC25A
Ciclina H CDK7
Fig 15 15. Control del Ciclo Celular en todas sus fases G1, S, G2 y M.
En la fase S participan las Ciclinas E y A (fig. 15 -15), el complejo Ciclina A CDK2 es a su vez fosforilado y mantenido inactivo por el otro complejo CAK o Ciclina H-CDK7. Posteriormente, Cdc 25A defosforila al complejo Ciclina A-CDK2, el cual pasa ahora a fosforilar al complejo RB- E2F, donde RB se libera ya fosforilado y deja libre a E2F que junto a DP1, permiten la expresin de nuevos genes. En esta fase los Complejos Ciclina/CDKs fosforilan los sitios regulatorios de las protenas que formarn los sitios de
768
Pre-replicacin del DNA, cuyo ensamblaje original ocurri en G1. El evitar el ensamblaje de nuevos complejos asegura que no exista ms de una replicacin por sitio. Durante la fase S otros complejos Ciclina-CDK se forman, pero son mantenidos inactivos por su fosforilacin en sitios inhibitorios, especialmente por Wee1. Volver al inicio 11) REPLICACIN EN LA FASE S
La replicacin del DNA tienen lugar en la fase S y depende de la asociacin de una serie de protenas en distintos lugares de cada cromosoma. Estos sitios de unin en el DNA se denominan orgenes de replicacin (RO) y poseen una secuencia especial. A ellos se une el complejo proteico de reconocimiento del origen (ORC), que provee de un sitio o plataforma al cual se pueden unir factores adicionales. Este proceso es capaz de provocar la separacin de la doble hebra, para recibir an nuevos factores destinados a la replicacin. La presencia de los factores que constituyen el ORC o complejo de replicacin depende a su vez de la actividad presentada por el factor E2F. Este es liberado por la accin de las Ciclinas A-CDK2 y Ciclina E -CDK2 (fig. 16 - 15). El complejo de replicacin a su vez, presenta dos estados:
P ORC Al Citoplasma ORC P
Defosforilacin
Degaradacin de Geminina
M G2 post-RC
P
Cdt1 cdc6 ORC MCM2-7
P MCM2-7 P P ORC Horquilla de Replicacin ORC P P Cdt1 cdc 45
pre-RC G1
Cdt1 cdc6 ORC adquisicin de la licencia
S
licencia activada por fosforilacin
cdc6
G1/S
cdk Enzimas hcdc7 Fosforiladoras

disparan la iniciacin
Geminina Cdt1
Degradacin y exportacin
Fig. 16 15. Activacin de la maquinaria de replicacin en los ORC.
a) uno que se denomina pre-replicativo (pre-RC) y parte en la fase de Mitosis tarda o inicio de G1. En aquellos sitios del DNA donde se origina la replicacin (fig. 13 - 15), el ORC permanece asociado durante todo el Ciclo Celular y una vez que la clula ha completado la Mitosis, aparecen los factores para adquirir licencia para replicar. Estos ltimos son los llamados Cdc6 y Cdt1, ambos se integran a la cromatina en el ORC y a su vez permiten la entrada del factor MCM 2-7 (por mini chromosome maintenance).
769
Este es supuestamente una helicasa de replicacin, cuyo montaje en el complejo es evitado por una protena denominada Geminina, que acta como regulador negativo. Por lo tanto es necesario que la Geminina, se encuentre degradada para que se monte el complejo, lo que ocurre en la fase de Mitosis tarda e inicio de G1. b) el otro estado es post- replicativo (post-RC), que existe desde el inicio de la etapa S y termina en la etapa final M. A continuacin de esta etapa aparecen dos Kinasas a la vez, denominadas cdk y HsDbf4 (hcdc7 o cdc7) que se requieren para activar la licencia de los Orgenes de Replicacin. La actividad de las Kinasas provoca fosforilacin de Cdc45 que se une al complejo MCM2-7 fosforilado ORC- Cromatina, lo que es seguido por el desenrrollamiento de los sitios de inicio de la replicacin. Posteriormente, protenas de la replicacin controladas por E2F, como lo son RPA, DNA Polimerasa y se integran al sitio de replicacin. Est claro que solo el aumento de las Kinasas cdk y hsDbf4 (hcdc7) en G1/S, dispara la iniciacin y replicacin del DNA, pasando luego a la etapa post-RC, donde se genera nuevamente este complejo, pero solo hacia la etapa final de la mitosis. Las protenas MCM se mueven lejos del origen desenrollando el DNA y el ensamblaje posterior de complejos pre-replicativos es bloqueado por actividad de CDK. Esta kinasa activa la replicacin y evita re-iniciacin en la fase S. De esta manera todo el DNA se replica tan solo una vez. La replicacin depende entonces de los factores cdt1 y cdc6. La ausencia de estos factores en y durante el final de la etapa S, evita el adquirir nuevamente la licencia de replicacin por los Replicones. Ambos factores no aparecen hasta despus de la Mitosis, asegurando que la replicacin sea de tan solo una vez por ciclo. Por otro lado los cromosomas mitticos no inician la replicacin del DNA hasta que no se monten totalmente los complejos ORC y se adquiera la licencia. Map2 es el mecanismo que evita el licenciamiento en esta etapa. La fosforilacin inhibitoria de ORC y MCM2 por kinasas mitticas, les evita interactuar entre ellos y otras subunidades para formar el complejo de replicacin junto al reclutamiento de otros factores junto a ORC/MCM/DNA Por otro lado, el paso desde la etapa G2 a M se encuentra controlado por la Fosfatasa Cdc25 que acta sobre el complejo fosforilado Ciclina B/ Cdc2 (fig. 17 15). Este complejo controla el arreglo de los microtbulos durante la Mitosis y se forma al unirse la Ciclina B con la subunidad Kinsica Cdc2. Una vez formado se fosforila por los compuestos Myt, Wee y CAK (fig. 17 15), sin embargo el complejo permanece inactivo y solo se activa por la defosforilacin de Tyr 15 por medio de la fosfatasa Cdc25. Una vez que el complejo se encuentra activo fosforila al complejo de la protena Rb E2F- gen, quedando E2F libre de unirse con DP1 al DNA para iniciar la transcripcin de los genes involucrados en la fase M, como son los genes encargados de la formacin de los microtbulos del huso mittico, la condensacin de la cromatina y ruptura de la membrana nuclear. La Ciclina B se degrada cuando las clulas entran en la Anafase. En la misma fase M fase actan los complejos de Ciclina Mittica (Ciclinas A y B) / CDKs, que sufren defosforilacin de los sitios inhibitorios. Por otro lado las actividades de la Ciclina A-CDK2 y Ciclina E CDK2 son esenciales para el inicio y completacin de la replicacin del DNA, adems aseguran de que este evento ocurra tan solo una vez por
770
Ciclina B CDC2 T14 Y15 T161
Ciclina B CDC2 P P P T14 Y15 T161

Complejo inactivo
Ciclina B CDC2 P T14 Y15 T161 Cdc 25
APC
+ Ub
CAK
(Thr 161)
CACAK
Complejo activo que promueve el ensamble del Huso mitotico, condensacin de la cromatina y ruptura de la membrana nuclear
Wee 1 (Tyr 15) Myt

(Thr14)
Ciclina B Ub CDC2 CDC2 P T14 Y15 T161 Ciclina B
Fig. 17 15. Activacin del Complejo Ciclina B-CDC2 mediante fosforilacin y defosforilacin especfica. APC es el complejo que une o liga la Ubiquitina a la Ciclina B.
Ciclo. Ambos complejos, al fosforilar a la protena RB dejan libre la capacidad para aumentar la transcripcin de histonas y otros genes relacionados con la replicacin. TABLA 5 15 CUADRO RESUMEN DEL CICLO CELULAR ACTIVACIN DEL CICLO
Complejo Ciclina D-Cdk4,6
FASE DEL CICLO

Reprimen a pRB por fosforilacin y se produce la liberacin de E2F para iniciar transcripcin y paso por G1 Inicio de fase S Preparacin para la Mitosis Inicio de Mitosis
Complejo Ciclina E Cdk2 Ciclina A se une tambin a Cdk2 Complejo Ciclina B-Cdc2 (Cdk1), a este complejo se le llama tambin promotor de fase Mittica o MPF
CONTROL DEL CICLO Activacin de CDKs
Inhibicin de CDKs
MECANISMO Unin a Ciclinas Fosforilacin por CAK o Ciclina H - Cdk7 Control sobre E2F Transcripcin Protelisis por sistemas SCF o APC Localizacin ncleo o citoplasma Fosforilacin
La Ciclina B que regula la entrada a la fase M, aumenta desde la fase S alcanzando un mximo en el punto de control G2/M y se asocia con CDK1 y CDC2. Ambas Ciclinas A y B mantienen a la familia pRB fosforilada al mximo hasta que la clula completa la mitosis y reentra a G1 o pasa a Go. En la figura 17-15, CAK es el complejo fosforilante formado
771
por Ciclina H - CDK7 - MAT1 (por Menage A Trois o factor ensamblador) y promueve una respuesta transcripcional que se le compara a la producida por el factor de transcripcin TFIIH y a otros ms de la misma familia como TFIIE y TFIIF. A continuacin (Tabla 5 15), se puede observar la vigencia de los distintos complejos activadores junto a los inhibidores presentes durante las diferentes fases del Ciclo Celular. Volver al inicio 12) PUNTOS DE CONTROL DEL CICLO CELULAR a) PRIMERO G1 / S (Dao al DNA) A medida que la clula se prepara para replicar su DNA en la fase S y crecer en G2 para luego dividirse en dos celulas hijas en la fase M, aparecen ciertos Puntos de Control (fig. 18 -15). Estos permiten asegurar la sincronizacin y la secuencia de las transiciones. De esta manera, se pretende mantener la alta fidelidad durante la replicacin del DNA. Sin la presencia de los puntos de control, se producira una inestabilidad genmica conducente al cncer. Por lo tanto, los genes que intervienen en este proceso son altamente conservados en las distintas especies. Todos es tos puntos de control vigilan el correcto desempeo secuencial de los mecanismos que rigen el Ciclo Celular. El punto G1/S se relaciona con la partida del Ciclo Celular, mientras que S depende del dao que haya sufrido el DNA. G2/M depende de que la replicacin sea completa y que el DNA no halla sufrido daos. A su vez activa al
Control de la replicacin del DNA CENTROSOMAS
Control de la formacin del huso G2/M
Control del dao en el DNA o dao Genotxico en G1/S
G1
G2
Fig. 18 15. Distintos puntos de control para la replicacin del DNA.
Complejo Promotor de la Anafase o APC (Anaphase Promotor Complex) para el paso por la Mitosis desencadenando la destrucccin de muchas protenas mediante el mecanismo de Poliubiquitinacin y Proteosoma. El Ciclo se detiene si la clula no esta preparada para la replicacin del DNA en G1/S o su divisin en G2/M. Primer Sitio de Control G1/S (VA DEL ATM / ATR / CHK2(CHK1)-p53 / MDM2- p21)
772
RELOCALIZACIN DE LOS ATR
INHIBICIN DE LA HORQUILLA DE REPLICACIN
Inestabilidad Genmica y CNCER Inh. complejo Ciclina-CDKs , Reparacin del DNA, Remodelacin de la Cromatina Apoptosis
DAO AL DNA
ACTIVACION DE LOS ATM
MODULACIN EN EL DESTINO DE LA CLULA
Fig.19-15. Pasos a seguir despus del dao al DNA
Destruccin por Proteosoma 26S
Dao al DNA o estrs genotxico
MDM2
P P53
MDM2 es una ligasa de Ubiquitina y su presencia mantiene los niveles de P53 bajos. En este caso es inh. por fosforilacin y p53 aumenta
Chk1/2
Va rpida
ATM / ATR
Va lenta
Cdc25A es una Fosfatasa que activa las Kinasas del Ciclo Celular. En este caso se marca por fosforilacin para su unin a Ubiquitina y posterior destruccin por el Proteosoma 26S
Ser 15
Ciclina CDK
P21 se une a los complejos Ciclina/CDK para disminuir la fosforilacin de RB
Ubiquitina
Cdc25A
P Cdc25A
P21
Cdc25C
Ciclina E CDK2 Ciclina E CDK2 No se activa
E2F E2F RB P P P P RB
Inh. de Ciclina E, promotora de paso G1/S(inh. sint. DNA). Detencin del Ciclo en G1. No hay transicin a S por solo algunas horas a menos que el paso lento de p53 contine apoyando
Inhibicin de la Sntesis de Ciclina DCDK4, Ciclina E - CDK2 y Ciclina A-CDK2
Fig. 20 15. El Complejo ATM/ATR tiene una va rpida y otra lenta .
Los sensores de las alteraciones y/o lesiones que sufre el DNA traspasan esta informacin a dos enzimas denominadas ATM y ATR. ATM es el gen que codifica para
773
una kinasa, cuyo gen mutado provoca la enfermedad denominada Ataxia Telangiectasia que predispone al cncer. Por otro lado, ATR es otro gen de la familia, que codifica para una kinasa relacionada secuencialmente con ATM y la kinasa Rad3. Tanto ATM como ATR pueden ser considerados como genes tumosupresores. Los productos de la expresin de ambos genes ATM y ATR son enzimas capaces de fosforilar activando a otras dos Kinasas Chk1 y Chk2 respectivamente. Posteriormente, ambas desencadenan una cascada de regulacin conducente a detener o retardar el Ciclo Celular (fig. 19 -15). Los factores proteicos empleados para este fin sern aquellos que modifican la actividad de los distintos complejos Ciclina-CDKs. La primera cascada (ATM) de regulacin o Va rpida detiene el progreso en G1. Las Chk 1 y 2 fosforilan e inactivan a la Cdc25 (fig. 20 -15). De esta manera ya no puede activar al complejo CDK2/CiclinaE. El Ciclo se detiene en G1 por solo un tiempo determinado. La Va lenta o segunda cascada se relaciona con el aumento del nivel de p53, debido a la fosforilacin e inhibicin de MDM2 (factor que marca para la destruccin a p53), seguido del aumento de la transcripcin de p21. Este ltimo acta como inhibidor de las Kinasas dependientes de Ciclinas, tales como CiclinaD-CDK4, CiclinaE-CDK2 y CiclinaA-CDK2. De esta manera, se apoya la detencin provocada por la Va rpida en G1, al mismo tiempo se frena la fase S y se detiene el paso a la fase G2. De esta manera se da tiempo para inducir a los genes involucrados en la reparacin del dao.
Volver al inicio
b) SEGUNDO SITIO DE CONTROL EN LA FASE S. Este mecanismo debe detener la replicacin del DNA de forma casi instantnea y a la vez evitar que se formen nuevos sitios de inicio. Para ello existen dos procesos mediados por
774
los productos de los genes o kinasas ATM y ATR (fig. 21-15). La ruptura del DNA por radiacin provoca una alteracin de la Cromatina que conduce a una fosforilacin de ATM que a su vez desencadena la respuesta fosforilando una serie de protenas destinadas a detener el Ciclo y reparar el dao.
P mdm 2 P p53 P CHK2 Ser 957 Ser 966 P P SMC1 1
ATM/ATR
P Ser 343 P P Brca1 hRad17 P P
NBS1 Brca1 1 Rad50 Mre11 FancD2
p21
Detencin en G1 o Apoptosis
Control en fase S
Control en G2
Fig. 21 -15. Transduccin de seales mediante fosforilacin de distintas Protenas en la fase S. SMC1 es Cohesina, una protena que necesaria para la perfecta condensacin y segregacin de los cromosomas en la Mitosis.
Las protenas fosforiladas por este sistema provienen de una serie de mecanismos de regulacin, cuya falla puede provocar todo tipo de alteraciones a la clula. En la siguiente Tabla 6- 15, se observa la relacin entre las alteraciones de los genes codificantes de las protenas responsables de la cadena de control (SMC1, NBS1, Brca1, etc.) y el tipo de cncer que producen, cuando han sufrido una mutacin, se han expresado de forma alterada o hacen muchas o pocas copias de si mismas fuera de tiempo. El tipo de cncer provocado puede ser adquirido o hereditario (presente en clula germinal).
Por otro lado la luz UV y los agentes alquilantes desencadenan una respuesta similar de la Kinasa ATR, que tambin inicia o desencadena la cascada por fosforilacin. El propsito de este mecanismo es inhibir al sistema CiclinaB CDC2.
TABLA 6 -15 Gen Enfermedad Predisposicin a Cncer provocado por su Sndrome familiar
775
mutacin ATM NBS1 FancD2 Brca 1 P53,CHEK2 RB CDC25A

Ataxia-Telangiectasia Sndrome de Nijmegen Anemia de Fanconi Carcinoma Sndrome de LiFraumeni Retinoblastoma familiar Carcinoma Carcinoma, Leucemia, Linfoma Leucemia, Linfoma Leucemia mielognica aguda Ovario y mamas Sarcomas, leucemias, tumores cerebrales, tumores adrenales y otros Amplio espectro de cnceres Mamas, cerebro, pulmones, cuello y linfoma s s
s s
s No se sabe
En la figura 22 -15 se observa a lo largo del Ciclo los distintos estados de activacin del Complejo CiclinaB-CDC2. Es inactivo en G1 despus de la defosforilacin por Cdc 25 y destruccin de la Ciclina B por el sistema Ubiquitina/Proteosoma 26S. Tambin es inactivo cuando se encuentra totalmente fosforilado en G2 por los factores kinasas representados por Wee1, Myt y CAK y solo Cdc25 hidroliza los fosfatos correspondientes para su activacin en M. A su vez Cdc25 es fosforilado por el complejo activo para aumentar su actividad.
G2
In a c t i v o C ic lin a B CDC2 P T14 P Y15 P T161 W e e 1 (Tyr 15) M y t (T h r 1 4 ) C A K (T h r 1 6 1 ) CDC2 Cdc 25
A c tiv o C ic lin a B CDC2 P
T161
D e s tr u c c i n d e C i c l in a B
CDC2 In a c t i v o
S /G 2
C ic lin a B In a c t i v o
G1
Fig. 22 15. Regulacin de la actividad de CiclinaB CDC2. Este complejo prepara a la Clula para entrar a la Mitosis.
Otro punto de control en la fase S, es aquel que asegura de que ocurra solo una vez por ciclo, as tenemos que el ensamblaje del complejo de pre-reconocimiento ubicado en el punto de origen de la replicacin ocurre en pequeas secciones de DNA esenciales para este proceso. El montaje del complejo ORC, como se explic anteriormente es llevado a cabo por una serie de protenas unidas a estas secuencias y ocurre en G1, que es donde se originan los complejos iniciadores. Para entender este punto de control se deben analizar e identificar los factores que contribuyen a su formacin y aquellos otros
776
factores que la inhiben. En el paso G1/S, tenemos a dos kinasas y sus complejos activos CDK4/6- Ciclina D y CDK2-Ciclina E, ms los factores de transcripcin que incluyen a R2B y E2F. En G1 el represor Rb-HDAC se une al E2F-DP1 factor de transcripcin inhibiendo el sistema corriente abajo. Fosforilacin de CDK4/6 y CDK2 disocia el complejo represor donde se encuentra Rb, permitiendo la transcripcin de los genes para la fase S y que son necesarios para la replicacin del DNA. Algunos de los otros factores que son controlados incluyen la presencia de TGF beta, dao al DNA, inhibicin por contacto, senescencia replicativa y remocin del factor de transcripcin. Los cuatro primeros actan induciendo a miembros de los inhibidores INK4 y Kip/Cip. La remocin del factor de crecimiento activa a GSK 3 beta que fosforila a Ciclina D conduciendo a una rpida Ubiquitinacin y degradacin de Proteosomas.
Volver al inicio
c) TERCER SITIO DE CONTROL EN G2/ M El punto de control menos conocido corresponde al lmite G2/M que ocurre antes de la divisin celular. En este punto se debe evitar el inicio de la Mitosis, cuando se ha sufrido algn dao previo en el DNA durante G1, S o el mismo G2.
777
Retencin en el Citoplasma P
Dao al DNA o estrs genotxico
Retencin en el Citoplasma
14-3-3
CDC2
Chk1/2
ATM / ATR
P P53
Ciclina CDK
14-3-3
Cdc25C
Ciclina B
P Cdc25C
CDC2
GADD45
P21
Cdc25C
Ciclina B (CDC2) CDK1 Ciclina B
E2F E2F RB P P P RB
(CDC2) CDK1
No se activa
Detencin en G2
No hay entrada a la fase S
Inhibicin de la sntesis de Ciclina B y CDC2
Fig 23 15. Eliminacin de CDC25, efecto inhibitorio de P21 y factor RB unido a E2F impiden la activacin del complejo CiclinaB/CDC2 y la liberacin del factor E2F para estimular la sntesis de CilinaB y CDC2.
En la figura 23 15 se observa que el estrs genotxico activa a los sistemas ATM/ATR conduciendo a la fosforilacin y activacin de las kinasas CHK1 y CHK2, seguido de fosforilacin de Cdc25C. La entrada a la Mitosis se detienen cuando la Fosfatasa Cdc25c es retenida en el citoplasma por medio de la protena 14-3-3, que impide su accin sobre el complejo fosforilado Ciclina B/ (CDC2) CDK1. El sistema ATM/ATR tambin activa el sistema de seales p53 que contribuye a mantener a las clulas en G2, al retener en el citoplasma mediante la protena 14-3-3 a la kinasa CDK1 (CDC2). Por otro lado se observa el efecto de p 21, que reduce la fosforilacin de RB y evita que E2F se libere para mediar la expresin de Ciclina B y CDC2. La protena p21 tambin se une al complejo Ciclina B/CDC2 (CDK1) para bloquear la entrada a la Mitosis. GADD45 otra protena de la va de p53 tambin se puede unir al complejo Ciclina B/CDC2 (CDK1) para inhibirlo (fig. 23-15). Volver al inicio
778
d) CUARTO SITIO DE CONTROL A NIVEL DE LA MITOSIS (SITIO M), DURANTE LA FORMACIN DEL HUSO MITTICO. En primer lugar es necesario analizar las distintas etapas de la Mitosis que se distinguen por las siguientes caractersticas: Profase: Se desarma la envoltura nuclear. La entrada a la fase M se produce por fosforilacin de los filamentos de Lamininas Nucleares por los complejos Ciclina /CDKs. A consecuencias de ellos se produce la depolimerizacin del filamento y se desarma la estructura carioesqueltica de la superficie nucleoplsmica perteneciente a la membrana nuclear. Metafase: la membrana nuclear desaparece y se alinean los centrolos en los polos opuestos, las fibras polares se extienden desde los polos de la clula. Las fibras polares se extienden desde los polos al centro de la clula. Los cromosomas se mueven al azar hasta que se unen los cinetocros a los microtbulos, que nacen de los centrmeros y se alinea en la placa metafsica en ngulo recto a los microtbulos del huso. Los cromosomas se mantienen en esta placa debido a la tensin similar que ocurre en ambos centrmeros. Anafase: Las Fosfatasas hidrolizan los Fosfatos agregados a protenas por complejos de Ciclinas Mitticas / CDKs (MPF). Como se observ anteriormente el complejo APC-Cdh1 contribuye a la Ubiquitinizacin de las Ciclinas mitticas que son posteriormente degradas mediante el Proteosoma 26S. Telofase: Los cromosomas se hinchan y pierden su condensacin. Se vuelve a formar la membrana nuclear, aparece el aparato de Golgi y el citoplasma se divide. Se termina la Mitosis cuando se degradan las Ciclinas B. Citocinesis o kinesis: Empieza con una hendidura en la membrana citoplasmtica conducente a la divisin del citoplasma, citoesqueleto, organelos y membrana en dos clulas hijas. Se produce un anillo de actina y miosina con una contraccin perpendicular al huso mittico que empuja los cromosomas hacia cada extremo asegurando a la formacin de dos ncleos. Una vez terminada la separacin el anillo desaparece. A continuacin se analizar el sitio de Control M: El sitio de control M o restriccin de la Mitosis, detecta cualquiera fallas a nivel de G2 y Profase, luego entre la Metafase y la Anafase y finalmente a la salida de la Mitosis entre Telofase y G1. En estos subsitios se detecta una serie de procesos entre los cuales tenemos: a) la correcta unin de las fibras del huso con los cinetocros de los cromosomas. b) El correcto alineamiento y formacin del huso mittico.
779
c) inhibicin del proceso de citocinesis o divisin de la clula al inhibir la formacin de un cinturn de actina y miosina, que al apretarse produce dos clulas hijas. Ahora si el dao es irreparable normalmente se produce la Apoptosis Celular.
CICLINA B Cdc2 MPF
APC: reconoce la caja o secuencia de

destruccin en aquellas protenas donde agrega la Ubiquitina
APC: activado liga Ubiquitina

Inhibidor de la Anafase PDS1, CUT2 (Securina, Separasa, Scc1)
Hidrlisis
CICLINA B Cdc2
Hidrlisis
Cdc2
G2
Profase
Metafase
Anafase
Telofase Citocinesis
G1
Fig. 24 15. MPF puede controlar la entrada en la Profase, Anafase y salida de la Mitosis. El Control de la actividad Fosforilante de MPF (Factor Promotor de la Maduracin) se lleva a cabo mediante su destruccin. Esta se encuentra determinada por la actividad Ligasa presentada por el Complejo Promotor de la Anafase (APC) activo (Se activa por el mismo MPF), que une Ubiquitina a Ciclina B durante la Anafase tarda de la Mitosis. Si APC (Complejo Promotor de la Anafase) se mantiene inactivo la clula permanece en la anafase y se retarda segregacin de los cromosomas, no se promueve Telofase.
Para conocer la complejidad del sistema que emplea la clula es necesario desglosar este sitio de restriccin y analizar el desempeo individual de sus componentes: Las Ciclinas Mitticas (Ciclinas A y B) forman complejos regulatorios con las CDKs. Estos, a su vez se mantienen inactivos por fosforilacin en los sitios inhibitorios y solo previo a la mitosis se activan por defosforilacin. La funcin del Complejo Cdk1/Ciclinas A y B denominado Factor de Maduracin (MPF) o Factor Promotor de la Fase M es ser una Kinasa. Esta propiedad la emplea para activar protenas que a su vez promueven en cascada una serie de pasos destinados a preparar a la clula para la separacin de los cromosomas y la divisin celular. Adems, se fosforila a la miosina para facilitar la Citokinesis y se activa al Complejo Promotor de la Anafase (APC) o Ciclosoma mismo, para que este destruya a la ciclina B por unin de la Ubiquitina. De esta manera MPF se autoregula y prepara a la vez la produccin de Ciclinas G1 para la proxima vuelta del ciclo. APC es un regulador maestro que controla multiples eventos y entre ellos tenemos a : a) La separacin de cromtidas hermanas o desde Metafase a Anafase b) Movimiento de los cromosomas en la Anafase
780
c) Salida de la Mitosis d) Licencia para la replicacin del DNA y acoplamiento entre fase S y M. Todos estos procesos se han mantenido inalterados durante la evolucin, lo que indica su grado de importancia. Mediante su correcto funcionamiento se evita que aquellas clulas con cromosomas mal alineados den origen durante la mitosis a clulas con un nmero anormal de cromosomas o aneuploides. El proceso de unin de los cromosomas a los microtbulos es estocstico o al azar (lo contrario a determinstico), ya que no todos los cromosomas se alinean hacia el ecuador de la clula al mismo tiempo. Por lo tanto es necesario evitar que tan solo un cromosoma mal alineado, sea capaz de pasar a la anafase. Para ello se requiere de la presencia de aquellas protenas de control ubicadas en el cinetocoro y que forman un complejo macromolecular ubicado en el centrmero de los cromosomas. Este ltimo establece conexiones con los microtbulos del huso mittico. Las protenas de control manejan las actividades mecnicas entre las protenas asociadas al cinetocoro y los microtbulos destinados a separar a las cromtidas hermanas hacia el ecuador de la clula. Los defectos en las actividades mecnicas del cinetocoro activan a su vez a las protenas de control, para iniciar una seal que es amplificada en el entorno de la clula y que finalmente previene la activacin del proceso proteoltico necesario para la separacin de las cromtidas hermanas al principio de la anafase. Para que esta cadena de eventos ocurra normalmente se debe revisar la formacin misma del huso mittico. El huso debe ser bipolar y los cromosomas deben ser tirados a los polos opuestos formando la placa metafsica. El sitio control, evita que la anafase (separacin misma de los cromosomas) parta muy rpido, ya que se trata de un proceso coordinado que depende de la expresin de una serie de otros genes. Estos ltimos debern a su vez ser activados de manera secuencial evitando el mal alineamiento de los cromosomas, para que la segregacin sea correcta. De esta forma no se permite la existencia de cinetocoros defectuosos. La segregacin exacta de los cromosomas durante la Mitosis requiere de la destrucccin coordinada de los reguladores mitticos securina y ciclina. El APC es un complejo de multiples subunidades que une Ubiquitina a diversos sustratos. Pose una Protena Ligasa o E3 (uno de las tres actividades del complejo de activacin y unin de la Ubiquitina) que cataliza la Poliubiquitinacin de protenas y por lo tanto promueve su destruccin por el Proteosoma 26S. Durante la Mitosis el activador Cdc20 se une al APC y recluta sustratos por medio de una interaccin con el motivo o secuencia blanco conservada que se denomina la caja de destruccin. El proceso normal de Protelisis fue necesario para deshacerse de las Ciclinas de G1 y pasar a la etapa S regulando la actividad de las CDK, as como ahora es necesario para disparar la etapa de anafase en la mitosis, regulando el manejo de los cromosomas y la formacin del huso. (figs. 24,25 y 26-15). En el caso de que se requiera retardar el proceso anterior para un control en la fase M (lmite G2/M), aparecen enzimas que remueven las Ubiquitinas y retrasan y prolongan el efecto de las Ciclinas en el huso mittico (fig. 24-15). En otras palabras las etapas de formacin del huso y la separacin de los cromosomas (anafase) son qumicamente detectadas en el punto de control para comprobar su normalidad.
781
PDS1 Y CUT2 junto a Ciclina B: Son las protenas inhibidoras de la Anafase y Telofase respectivamente. Deben unirse a la Ubiquitina mediante la accin de APC o E3 para ser degradados y permitir la continuacin del Ciclo cuando no existen daos en la formacin del huso. MAD : (Mitotic arrest deficient) , existen dos genes MAD y codifican protenas que unen el cinetocoro a un microtubulo de la fibra del huso. Si falla la unin, MAD permanece y bloquea la entrada a la anafase. Las mutaciones en MAD producen clulas con muy pocos o muchos cromosomas (aneuploida), que son tpicas de las clulas cancerosas.
BUB 1 BUB 3 MAD1,2
Cdc20
INHIBICIN DE COMPLEJO
APC- Cdc20
No se separan los cromosomas

RUPTURA DEL MICROTUBULO CROMOSOMA SIN UNIN AL CINETOCORO
METAFASE
ANAFASE
APOPTOSIS
Fig. 25-15. El punto de control del huso mittico distingue la falta de alineamiento de los cromosomas y las alteraciones de los microtbulos, activando a Bub1, Bub3 y Mad2-Cdc20 que mandan a la clula a la Apoptosis o retrasan la Anafase.
Cdc20 es un promotor que puede ser activado por Mad 1,2. Estas ltimas son dos protenas mediadoras del sitio de control del huso junto a Bub1 (kinasa) y Bub3 (Budding Uninhibited Benomyl) que corresponden a protenas transductoras de la seal que se produce cuando los cinetocros no se han unido al microtbulo (figs. 25,26-15). Todos estos factores se ubican junto a los cinetocros y regulan la interaccin entre cinetocoro y los microtbulos. Todos estos factores son necesarios para inhibir el Ciclo Celular, en el caso de que se pierda algunas de las actividades mediadas por los microtbulos. La falla de estos sistemas conduce a una aneuploida, es decir a un nmero aberrante de cromosomas lo que a su vez conduce al cncer.
782
CDK1 Ciclina B
MPF inactivo
MPF activo
Ciclina B degradada por unin de Ubiquitina y Proteosoma
APC activado por MPF y

unin a Cdc20
SEPARASA INACTIVA SECURINA SEPARASA ACTIVA
Separacin de cromtidas hermanas
Cdc20
Restos de Scc1
Scc1
Cohesina Cohesina
SECURINA
Ubi Ubi METAFASE Ubi ANAFASE
Fig. 26 15. Las Cohesinas mantienen a las cromtidas unidas durante la Metafase inhibiendo el progreso hacia la anafase. Estas a su vez pueden ser degradadas por las Separinas o enzimas con actividad de Separasas (Proteasa) que son a su vez inhibidas por Securina. La degradacin de las Securinas se encuentra a su vez promovida por la Poliubiquitinacin dependiente de APC. Por otro lado la inhibicin del Complejo APC-Cdc20 impide la separacin y progresin de la Anafase. Cohesina y Scc1 son protenas que mantienen las cromtidas unidas.
Volver al inicio
783
13) EXPRESION DE LOS GENES FACTORES BASALES DE TRANSCRIPCIN ASOCIADOS A LAS RNA POL I, II Y III COMO LO ES TFIIH 1) RNA POL EN EUCARIOTES Existen tres RNA pol en los Eucariontes y cada una transcribe un nmero limitado de genes reconociendo a sus promotores especficos. Cada una funciona con un nmero relativamente alto de factores de transcripcin y la posicin inicial de ellos es guiada por un factor conocido como TBP (TATA Binding Protein). Pol I: Se ubica en el nucleolo, transcribe RNA ribosomal (Fig. 23 - 16) y no es sensible a la Alfa-Amanitina (toxina del hongo Amanita Phaloides). Los genes que codifican para los RNAr se encuentran en las reas del cromosoma denominadas organizador nuclear y se transcriben copias mltiples en tandem 1:1:1 de 18S: 5,8S : 28S, excepto para el RNAr 5S transcrito por pol III. La transcripcin es altamente coordinada con el estado de crecimiento de la clula. La secuencia que controla la expresin de este gen tiene dos partes, por un lado la secuencia promotora central que se extiende de -45 a +20 y es necesaria y suficiente para la transcripcin basal. La otra parte es el elemento de control CE (Upstream Control Element) que se encuentra corriente arriba de -180 a -107 pb y que se puede llamar el intensificador. La protena UBF1 (Upstream Binding Factor) se une por sus extremos conectando a ambas secuencias y
5,8S 18S 28S Transcripcin por RNA pol I 18S
5,8S 28S
5,8S 18S 30 prots 40S 60S
Procesamiento de RNA r 28S RNA 5S y 50 prots. 40S 18S
5,8S 28S
60S
Fig. 27 -15. Transcripcin por RNA pol I de los RNA ribosomales y procesamiento del transcrito primario.
aumenta la eficiencia de entrada de la RNA pol I. Ambas secuencias son ricas en GC y son 85% idnticas. Posteriormente se une la protena SL1 cooperativamente e incluye el
784
TBP que es el elemento comn a pol I, II y III. Por otro lado se ha visto que la protena RB cuando no esta unida inhibiendo a los E2F, puede tambin inhibir a la protena UBF. Los genes del RNAr consisten en repeticiones en tandem de cerca de 200 genes con regiones espaciadoras. El transcrito primario tiene 45S de RNAr y es posteriormente procesado a 18S, 5,8S y 28S Pol II: Se ubica en el Nucleoplasma y transcribe RNA heteronuclear que despus de procesado pasa a ser RNA mensajero y es inhibida por bajas concentraciones de Amanitina (0,03 ugr/ml). El sistema de transcripcin para la RNA pol II consta de la secuencia de consenso ubicada en la caja promotora TATA a -26 o -34pb (-30pb) desde donde empieza el gen. Otras secuencias promotoras son CAAT a -75pb y la caja GC con la secuencia GGGCGG y la caja ATTTGCAT de -50 a -120pb. Volver al inicio 2) FACTORES DE TRANSCRIPCIN Los factores que intervienen en la transcripcin son los siguientes: a) Las protenas de unin o los factores de transcripcin que se unen a la secuencia promotora central TATA a -30pb del inicio. Entre ellos tenemos a la protena que se une a TATA denominada TBP (TATA Binding Protein) ms otros factores asociados (TAF) que en conjunto se denominan TFIIID (fig. 28 15). Tambin parecen encontrarse involucrados mecanismos de regulacin post-traduccionales.
Sitios corriente arriba para muchos factores como c-Fos, c-Jun, c-Myc/Max
RNA pol II
ATF / CREB
TFIIE c-myc/max Sp1 D-EBP TFIID

TATA EXON intron - 25 Gen EXON
TGACCTCA CACGTG GGGCGG CCAAT Secuencias reconocidas por los factores - 100
Fig. 28 - 15. La Transcripcin de un gen Eucaritico cualquiera requiere de la presencia de los factores basales que reconocen TATA y CCAAT a -25 y -100 pb respectivamente. Corriente arriba del gen se puede apreciar un ejemplo de los otros factores que pueden intervenir en la expresin, donde ATF/CREB es la protena que responde al AMPc, c-myc/max es el heterodmero zipper de Leucina, Sp1 reconoce cajas GC con dedos de Zn, la C/EBP es una protena intensificadora con afinidad y especificidad por el DNA.
b) Los elementos de respuesta hormonal (HRE), son secuencias que permiten que la transcripcin responda a un estmulo especfico otorgando una expresin gentica coordinada a factores ambientales o relacionados al desarrollo de la clula. Estas secuencias son reconocidas como elementos discretos ubicadas a -100 o -200pb
785
corriente arriba del inicio del gen. Existen muchos tipos deferentes en distintas clases de genes. A ellas se unen los complejos Hormona-Receptor permitiendo el control directo por las hormonas. Los HRE son de actividad cis, es decir afectan al gen del mismo alelo que los produce y no al gen del alelo opuesto. Entre las hormonas que actan por este mecanismo tenemos a los Estrgenos (ERE) y Tiroxina (RE). c) Los factores de transcripcin se unen a las secuencias intensificadoras. Estas ltimas son secuencias ubicadas corriente arriba o abajo a distancias de hasta 3kB. Incluso pueden actuar cuando se ubican entre los genes. Su funcin es unirse a protenas que aumentan la velocidad de transcripcin mediante cambios en la estructura de la cromatina, mejorando la accesibilidad al DNA por los componentes encargados de la transcripcin, algunos de ellos son especficos de cada tejido. Algunos de los factores moduladores de la transcripcin pueden encontrarse relacionados con el AMPc como la familia ATA/CREE que se une a un elemento de respuesta formado por un octanucletido palindrmico TGACCTCA. Poseen estructura Zipper de Leucina y forman homodmeros entre si y heterodmeros con miembros de la familia AP1. .
G EN R N Ar 5S 5S
TFIIIA
5S
E lem entos de control para TFIIIA
C om plejo M etaestable TFIIIC C om plejo estable I TFIIIB
C om plejo estable II R N A pol III C om plejo lim itante de velocidad
Fig. 29 - 15. Unin secuencial de los Factores de Transcripcin previa a la unin de la RNA pol III a los genes que codifican para el RNA 5S.
AP1 es un heterodmero de protena producto de dos genes Jun y Fos que transforman clulas en cultivo si se sobre expresan. Ambos genes tienen sitios de unin para el heterodmero en la secuencia palindrmica TGA(C/G)TCA corriente arriba permitiendo el control por retroalimentacin. AP2 es un factor de transcripcin que estimula la accin de la RNA pol II mediante el reconocimiento de secuencias 5-GCCCCAGGC-3 en genes destinados a regular la morfognesis
786
Pol III: Se ubica en el Nucleoplasma y transcribe RNA de transferencia (fig. 25 -15), RNA 5S y algn RNAsn (Small nuclear empleado en corte de intrones). Se inhibe solo por altas concentraciones de -amanitina (100 ugr/ml). Al menos 5 factores proteicos se necesitan para la Transcripcin del RNA 5S por la pol III, mientras que los sitios de reconocimiento se encuentran a diferencia de los otros sistemas, en el interior de la secuencia codificadora y no corriente arriba de ella. La RNA pol III aparece relacionada con el control del Ciclo Celular y parece ser modulada por fosforilacin de Ciclina B/Cdc2 kinasa y MPF (Factor promotor de Mitosis) cuyo blanco es tambin similar al de pol II como lo es TFIIIB compuesto por TBP- TAFs La secuencia promotora de RNA 5S va de +50 a +80pbs y para los RNAt de +10 a +20pbs o de +50 a +60 pbs. El Factor TFIIIB contiene TBP o factor posicionador. TFIIIA y TFIIIC son considerados factores de ensamblaje. La enzima RNA pol III necesita de los tres factores TFIIIA, B y/o C para hacer un complejo de iniciacin estable .
Volver al inicio
14) TRANSCRIPCION BASAL Con el fin de encontrar una relacin entre el sistema que regula el Ciclo Celular y los factores de transcripcin que regulan la expresin de los distintos genes destinados a codificar los factores, enzimas y activadores que permiten el crecimiento y la divisin celular procederemos a esclarecer la presencia de este contacto.
787
IN IC IAC IO N D E L A R N A p o l II (M o d elo d e Inic iac i n S ec uencia l) T AT A IN I
T AF TBP T F IIA
TBP
TFIIB
R N A p o l II E ucario te
TFIIF
TFIIE H elicasa TFIIH P rotena K inasa TFIIE TFIIF TFIIH C TD E l C om plejo de P re-iniciacin hidroliza ATP para abrir el D N A en el prom otor TATA. La polim erizacin de los prim eros N TP y la Fosforilacin de C TD conducen a que TFIIB , TFIIE y TFIIH se liberen. La enzim a R N ApolII em pieza a elongar y TFIID m s TFIIA perm anecen en TATA.
TFIIB
T F IIA
Fig. 30 - 15. Modelo secuencial de unin para los Factores de Transcripcin que favorecen la transcripcin basal. Los Factores de Transcripcin y la RNA pol II se ensamblan progresivamente en un orden preferido para formar el complejo de pre-iniciacin (in vitro), ya que la unin de los primeros factores facilita la unin de los restantes. La protena TBP inicia el proceso de la Transcripcin al unirse a la caja TATA, lo puede hacer sola o en compaa de los TAF.
Los genes Eucariticos parecen estar mayormente regulados a nivel de la Transcripcin. Por lo tanto la iniciacin del Complejo de Transcripcin es un evento fino que requiere del concurso de varios factores proteicos y distintas actividades enzimticas. Entre ellas tenemos a la RNA polimerasa II que cuenta con un dominio Carboxi-terminal (CTD) donde se repite en tandem cerca de 50 veces la secuencia Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Thr. La fosforilacin de esta secuencia en los residuos de Ser y Thr modula su actividad y produce un dominio altamente cargado que permite a la RNA pol II liberarse del complejo de iniciacin al disminuir su afinidad por TFIID (fig. 30 15) y empezar la elongacin. Por otro lado corriente arriba del gen se encuentra la caja TATA, donde se une la Protena TBP (TATA Binding Protein) en la hendidura pequea del DNA. Los factores anexos a TBP se denominan TAF ( TATA Associated Factors) y
788
pueden ser o no necesarios para montar el complejo de transcripcin inicial. Cuando se forma un complejo entre ambos TBP y TAF, nace el Factor de Transcripcin correspondiente a la sigla TFIID. TBP es solo necesario para iniciar la transcripcin, no es as TBF que puede o no estar presente . Una vez formado el complejo TATA-TBP o TATA TBP-TAF (TATA -TFIID), se unen secuencialmente los factores, TFIIA primero y luego TFIIB. Ambos se unen a los extremos del complejo TATA-TFIID, para as crear el Complejo que confiere estabilizacin. Posteriormente entra TFIIF que media la asociacin de la RNA pol I con el Complejo ya formado y finalmente se asocia TFIIE que ayuda a la unin de TFIIH. Este ltimo tiene varias actividades, primero una Kinasa que fosforila la cola CTD y libera a la RNA pol II para la transcripcin, segundo una actividad ATPsica dependiente de DNA y una DNA helicasa. Se requiere ATP para la sntesis de RNA a menos que el templado de DNA se encuentre superenrrollado negativamente. En estos casos no se requiere de TFIIH. El Complejo de inicio sin TFIIE y TFIIH produce solo transcritos cortos. En la siguiente Tabla 7 - 15, aparecen los distintos factores de transcripcin junto a sus caractersticas moleculares y su funcin. TABLA 7 - 15 Factor N de Subunidades 1 12 2 1 2 2 9 Peso Molecular kD 38 15 a 250 12 o 19 , 35 35 30, 74 34 , 57 35 a 89 Funciones
TFIID : TBP TFIID: TAF TFIIA TFIIB TFIIF TFIIE TFIIH
Reconoce secuencia promotora mnima TATA Reconoce promotor distinto a TATA. regulacin positiva y negativa Estabiliza complejo TBP-DNA. Anti-represin Selecciona el sitio de partida para la RNApol II Marca la RNA pol II para el promotor. Destabiliza interacciones no especficas entre pol II y DNA Modula la actividad TFIIH helicasa, ATPasa y kinasa. Facilita la separacin de las hebras en el promotor La Helicasa separa hebras en el promotor , actividad de CTD kinasa libera la RNA pol II para iniciar la transcripcin, actividad ATPsica aumenta exhibicin del promotor
De esta manera se forma el complejo de pre-iniciacin que posteriormente hidroliza ATP para abrir ambas hebras y empezar la etapa de elongacin. En este momento la cola CTD de la RNA pol II queda abierta a una posible fosforilacin moduladora que la hace empezar a transcribir, mientras que TFIIB, TFIIE y TFIIH se disocian. TFIID y TFIIA permanecen en TATA a medida que la RNA pol II avanza. La actividad Kinasa de TFIIH hace que se fosforece CTD, reduce la afinidad por de RNA pol II por TFIID y permite que pol II se aleje del promotor. La actividad Helicasa permite que el DNA se abra corriente abajo del promotor.
789
Volver al inicio
15) TRANSCRIPCION INTENSIFICADA Para cada tejido o tipo de clula existen los factores Activadores de la Transcripcin que se definen como cualquiera protena necesaria para iniciar la transcripcin, pero que no son una polimerasa. Estos se unen a secuencias intensificadoras que se encuentran corriente arriba o abajo de los genes y a la vez promueven la formacin de complejos de iniciacin mediante la unin a dos sitios. Una parte de ellos reconoce a la secuencia
790
intensificadora y se une a ella mientras que la otra reconoce y se une al TFIID que su vez se haya unido a TATA. Entre ellos encontramos a distintas familias como a) Zipper de Leucina: Se forma cuando se repiten las Leucinas en una Alfa- Hlice cada 7 aminocidos. Los residuos R de las distintas Leucinas salen hacia afuera del dominio Alfa-hlice y de esta manera interdigitan con los residuos de otro dominio similar y estabilizan la dimerizacin. La protena activadora AP-1 es un factor de transcripcin que se controla por fosforilacin y oxidacin. Su estructura consta de un zipper de Leucina entre homodmeros de Jun o heterodmeros de Jun/Fos que se unen a la secuencia palindrmica de TGA(C/G)TCA. La familia Jun consiste de c-Jun, JunB y JunD, mientras que la familia Fos incluye a c-Fos, FosB, Fra-1 y Fra-2, todos ellos estructuralmente relacionados. Tanto Jun como Fos tienen su contrapartida en oncogenes virales como v-Jun (Avian Sarcoma Virus ) y v-Fos ( Murine ratn Sarcoma Virus) . b) Hlix-bucle-Hlix: Su estructura se encuentra compuesta de dos regiones de AlfaHlice separadas por una regin variable que forma un bucle entre ambas. Se le halla implicada en dimerizacin de protenas. Posee una regin con aminocidos bsicos en el N terminal necesario para la unin al DNA en secuencias especficas. Las protenas que no poseen este Nt actan como represoras de las otras que si lo tienen ya que al unirse a ellas las secuestran y evitan su unin al DNA. Como ejemplo de este tipo tenemos al factor de transcripcin denominado c-myc. Este se encuentra sobre-expresado en una serie de neoplasias, como linfomas, leucemias, y cnceres al pulmn, ovario, crvico, pecho y gstrico. Adems, pertenece a una familia de oncogenes que producen protenas similares como c-, N- y L-myc. Normalmente es un factor de transcripcin expresado durante el desarrollo embrionario que estimula a la clula a entrar al Ciclo Celular secuestrando a la protena inhibidora p27 (Fig. 6 -14). Los mitgenos lo estimulan, mientras que las seales inhibidoras del crecimiento y estimuladoras de la diferenciacin lo inhiben y permanece silencioso en un tejido diferenciado, sin embargo puede expresarse nuevamente debido a los siguientes eventos accidentales, como lo son la insercin de un retrovirus, la translocacin de un cromosoma y la amplificacin gnica. Su conformacin es la de un Nt Bsico-Hlice-bucle-Hlice-Zipper de Leucina. Myc puede an dimerizar con otra protena denominada Max, para unirse al DNA en la secuencia CACGTG y activar la transcripcin de promotores adyacentes. Su forma activa es en realidad dmeros de Myc/Max (actividad trans) que inducen la progresin del Ciclo Celular, Apoptosis y Transformacin maligna. Max tambin forma heterodmeros con Myc dando las protenas Mad1, Mxi-1 o Mad2, Mad3, Mad 4 y Mnt. Estas protenas se pueden unir se a la secuencia anterior y antagonizar Myc Uno de los elementos de control del gen c-Myc se encuentra de -115 a -142 pb corriente arriba de su promotor Pi. Este elemento es hipersensible a la nucleasa y esta formado por una hebra codificadora de homopiridina y la otra hebra no codificadora de homopurina. y de su integridad depende el 75 a 85% del control de la transcripcin de este gen.
791
c) Dedos de Zn: En este motivo se encuentran residuos de Cistena e Histidina que se unen a tomos de Zn. El dominio en forma de dedo de esta complejo coordinado con el metal se introduce en secuencias especficas en la hendidura mayor del DNA. Como ejemplo se encuentra TFIIIA de la RNA pol III. d) Homeodominio: Dominio conservado de 60 aminocidos encontrados en los distintos factores de transcripcin .Son responsables de la estructura bsica de un organismo, por Ej. columna vertebral o patas y antenas en moscas.
Volver al inicio
REFERENCIAS Brian D. Dynlacht. Regulation of Transcription by proteins that control the Cell Cycle. Nature, 389, 149 - 152, 1997 Charles J. Sher. Cancer Cell Cycles, Science Vol. 274, 1672 -1677, 1996 Stephen J. Elledge, Cell Cycle Checkpoints: Preventing an Identity Crisis, Science, Vol. 274, 1664- 1671, 1996
792
X. Mayol and X. Grana, The p130 pocket protein: Keeping order at the Cell Cycle Exit/ ReEntrance transitions, Frontiers in Bioscience 3, d11-24, January 1, 19981 http://bioscience.igh.cnrs.fr//1998/v3/d/mayol/2.htm B. Amati, K Alevizopoulus and J. Vlach, Myc and the Cell Cycle, Frontiers in Bioscience 3, d250-268, Febraury 15, 19981. http://bioscience.org/1998/v3/d/amati/d250-268.htm B. Klurman and M. Groudine, Killer in search of a Motive. Science 389, 122-123, 1997 C. A. Jost., M.C. Marn and W.G. Kaelin Jr. , p73 is a human p53-related protein that can induce apoptosis. Nature 389, 191-194, 1997. Benjamin Lewin, Genes, International Student Edition ,Oxford University Press, 1997 Nature Insight, Cell division and Cancer. Nature, vol 432, 18 November 2004 Elsevier, Science of Clinical Oncology, Part 1. Control of the Cell Cycle. Chapter 5. Jennifer A. Pietenpol, Michael B. Kastan. 2004. http://www.harcourt-international.com/e-books/pdf/952.pdf
Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases Robert T. Abraham Genes and Development Vol. 15, No. 17, pp. 2177-2196, September 1, 2001
793
Hctor Rocha L. Principios de Medicina Molecular
796
GENES 1 1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGA CELULAR 800
a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS
802
b) AMPLIFICACIN POR CLONACIN
803
c) BIBLIOTECAS DE GENES
806
d) ANLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS
806
e) AMPLIFICACIN POR REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
808
f) SECUENCIACIN DEL DNA
813
2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES
814
a) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) o Polimorfismo en el Largo del Fragmento de Restriccin 815 b) VNTR (Variable Number Tandem Repeats) o Reticiones en Tandem (una tras otra) de Nmero Variable 816 c) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) o DNA Polimrfico Amplificado al Azar 818 d) AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) Polimorfismo en el Largo del Fragmento Amplificado 818 e) STS (Sequence Tagged Site) o Sitio Marcado por la Secuencia 819 819
f) EST por Expresed Sequence Tag o Expresin de la secuencia marcadora g) MARCADORES MICROSATLITES 821
797
GENES 2
3) APLICACIONES EN LA MEDICINA MOLECULAR a) MUTACIONES b) CARIOTIPO 825 828 829
823
c) EL PROYECTO GENOMA HUMANO d) MAPEO DE LOS GENES 829
e) MAPEO LIGADO A MARCADORES
830
f) EMPLEO DE RFLP POR RESTRICTION FRAGMENT POLYMORPHISM O POLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS g) MAPEO DE UN GEN 833 831
h) EMPLEO DE VNTRS POR VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS O REPETICIONES EN TANDEM DE NUMERO VARIABLE 834 i) MAPAS FISICOS O MAPAS DE ADN j) MAPA CITOGENETICO k) LA HIBRIDACIN IN SITU 837 838 839 837
l) FISH POR FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION m) MAPEO TOP-DOWN n) MAPEO BOTTOM-UP 840 841
4) GLOSARIO
844
798
799
1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGA MOLECULAR
La Medicina Molecular se caracteriza por estudiar las enfermedades y su curacin a nivel molecular. Para ello emplea las herramientas de la Biologa Molecular y la Bioqumica aplicadas tanto en el estudio de las Protenas como de los cidos Nucleicos. Entre estas herramientas podemos empezar por aquellas enzimas denominadas Endonucleasas de Restriccin. Estas enzimas son originalmente empleadas por las bacterias para defenderse de las infecciones causadas por Fagos, es decir las bacterias restringen a los Fagos.
Eco R1 5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5
Hae III 5 G G C C 3 3 C C G G 5
Hind III 5 A A G C T T 3 3 T T C G A A 5
Bam H1 5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5
: Sitios de corte
Fig. 1 - 16. Secuencias de corte reconocidas por distintas Endonucleasas de Restriccin.
As, cuando aparecen secuencias de DNA que el fago ha introducido en la bacteria, se produce el corte de estas mientras que las secuencias similares, propias de la bacteria se metilan para no ser reconocidas por la misma enzima. A su vez los sitios de corte, se caracterizan por estar flanqueados por secuencias cortas de simetra bicatenaria. Una vez ocurrido el corte, ambos extremos pueden formar lados asimtricos o cohesivos. Sin embargo, otras enzimas de restriccin cortan en el mismo sector en ambas hebras quedando ambos lados romos.
800
Las Endonucleasas de Restriccin son ms de 400 y reconocen y cortan cerca de 100
sitios diferentes. Algunos de estos sitios, se encuentran frecuentemente o cada unos cuantos cientos de pares de bases, mientras que otros se hallan espordicamente, cada 10.000 pb
Vector cortado por Hind III Fragmento cortado por Hind III DNA del Vector
Unin entre DNA del vector y fragmento Empleando la enzima Ligasa
Molcula de DNA Recombinante Recombinante introducido a la bacteria
DNA Recombinante Cromosoma Bacteriano
Fig. 2 - 16. Concepto de DNA recombinante destinado a ser amplificado por clonacin.
801
En promedio las enzimas de restriccin cortan en sitios reconocidos que tienen 4, 6 y 8 pares de bases (fig. 1 16), produciendo segmentos sucesivos de 256, 4000 y 64.000 bases de largo en el genoma humano. Las endonucleasas de restriccin hicieron posible la tecnologa del DNA recombinante (fig. 2 16), ya que con estas enzimas se pueden cortar segmentos de DNA que tengan distintos orgenes y posteriormente juntarlos y proceder a ligarlos, empleando una enzima denominada Ligasa, que produce la unin 3, 5 Fosfato o en otras palabras, forma el Fosfodiester. Posteriormente, bajo las condiciones adecuadas (alta concentracin de CaCl2 , etc) las molculas de DNA recombinante pueden entrar a las bacterias y replicarse, autnomamente o bien pueden integrarse al cromosoma celular. Volver al inicio a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS Algunas enzimas de E.Coli se emplean para el manejo de los fragmentos de DNA con que se trabaja en la Medicina-Molecular. As tenemos que el DNA puede ser sometido a varios tratamientos, se puede marcar con grupos Fosfatos como P32 (as se lo ubica en una radioautografa), se puede amplificar con los cebadores adecuados (para aumentar Tabla 1 - 16 Enzima Actividad Transcriptasa Inversa DNA polimerasa RNA dependiente de origen viral
DNA Ligasa
Fosfatasa Alcalina
Une covalentemente la unin Fosfodiester 5 Fosfato al grupo 3 Hidroxilo Elimina fosfatos del extremo 5 del DNA
Uso Se emplea para convertir RNAm en su copia complementaria de DNAc continuo Se emplea en los procedimientos donde se requiere DNA recombinante Se emplea para reemplazar el fosfato 5 por otro radiactivo
Polinucletido kinasa Introduce el Fosfato de ATP en el extremo 5 del DNA DNA polimerasa termoestable Tac (Thermophylus que resiste los cambios de Acuaticus) DNA temperatura para abrir polimerasa (desaparear ambas hebras) y cerrar (aparear hebras complementarias) el DNA
Endonucleasas de Restriccin
Tcnica PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifica ambas hebras de un segmento de DNA, a partir de unos cebadores sintticos (de secuencia conocida) que se aparean con su parte complementaria. Al repetir el proceso en ciclos de fro (apareamiento) y calor (desapareamiento) de las hebras Reconocen sitios de simetra DNA recombinante, mapeo, bicatenaria de 4, 6 y 8 pbs cortan etc. dejando lados cohesivos y romos
802
su nmero de copias), transcribir desde RNA a DNA (se emplea una Transcriptasa Inversa de un retrovirus) o se puede cortar en lugares especficos (con Endonucleasas de Restriccin). Algunas de estas enzimas se observan en la Tabla 1 - 16. Volver al inicio b) AMPLIFICACION POR CLONACION
Uno de los vectores (fig. 3 16), que se emplea para introducir DNA exgeno o forneo a la bacteria es el Plsmido, mientras que el DNA forneo puede ser DNAc (Ver Glosario al final), obtenido de un RNAm (por Transcriptasa Inversa) o DNA genmico (fragmentos de DNA al azar de un organismo). Es posible aqu sintetizar una segunda hebra al DNAc con una DNA pol I y luego se pueden insertar ambas hebras en un Plsmido o un vector Lambda, para ser posteriormente amplificado por clonacin. La clonacin se lleva a cabo en vectores contenidos en levaduras, bacterias y partculas virales. El empleo de uno u otro depender del tamao del fragmento a clonar. El Plsmido (fig. 3 16), es normalmente conocido por ser un DNA doble hebra circular extracromosmico y autoreplicante de la bacteria, es distinto al genoma normal y no es esencial para la sobrevivencia de la clula. Son conocidos por conferir ventajas selectivas a la bacteria (resistencia a antibiticos).
Ori C Vector pBR322
Resistencia a la Ampicilina
PLASMIDO
Resistencia a la Tetrac iclina
Fig. 3 - 16. Caractersticas del vector pBR322
Los Plsmidos pueden ser transferidos de clula en clula y algunos de ellos se pueden integrar al genoma de la bacteria. Una clula husped puede tener muchas copias de un plsmido. En la actualidad existe una serie de plsmidos artificialmente construidos, que cuentan con sitios especficos para cargar DNA forneo y se pueden seleccionar al entregar a la bacteria resistencia a algn antibitico. Esto permite separar aquellas bacterias que han adquirido el Plsmido de las otras que no. Algunos de estos plsmidos, pueden tambin ser replicados en levaduras. Otros Plsmidos constituyen lanzaderas que son capaces de replicar tanto en E. Coli como en levaduras y son conocidos por las siglas YIP o Yeast Integrating Plasmid, YRP por Yeast Replicating Plasmid, YEP por Yeast Expression Plasmid y an por el nombre
803
de YCP por Yeast Centromer Plasmid. El uso de cualquiera de ellos depende del tamao del segmento de DNA que se quiera amplificar. Mediante los plsmidos se puede crear una biblioteca genmica o coleccin no ordenada de clonos formada por fragmentos superpuestos de DNA amplificado, perteneciente a un organismo cualquiera. La relacin de unos con otros de los fragmentos se puede establecer posteriormente por mapeo fsico, hasta poner orden en la biblioteca, es decir tener una coleccin de fragmentos amplificados, pero contiguos. Esto significa que donde termina la secuencia de uno empieza la del otro. Esta coleccin debe corresponder en total, a un sector especfico de un gen. Los clonos individuales (fragmentos amplificados) se colocan en placas de microtitulacin en dos dimensiones con mltiples pocillos en el plano, donde la ubicacin de cada uno es conocida por el nmero de la fila y columna, fig. 35 - 16. Otro vector a emplear, puede ser una partcula viral o un bacterifago como el fago Lambda que contiene 40kb de DNA doble hebra (fig. 4 16). A este se puede integrar DNA humano de un tamao que bordea las 15 a 25kb. Esto se logra por accin de la misma endonucleasa de restriccin y posterior unin mediante la enzima Ligasa. Posteriormente al infectar una bacteria y entrar en la etapa ltica se generan nuevas copias del fago que se amplificar junto con el DNA humano, produciendo tantas copias como partculas virales existan. Otro bacterifago, es el conocido como P1, que puede acomodar ms DNA que el Lambda y constituye el tipo P1- PAC por P1- Plasmid Artificial Chromosome o cromosoma artificial de plsmido.
Forma lineal Bacteripfasgo Lambda Cos: Lados Cohesivos Cos: Lados Cohesivos. La hebra es complementaria al otro extremo
OP RS
Secuencia de cabeza y cola Regin b2. Genes No esencial Rec. para Implica sobreviven dos en cia recombi nacin Secuencia de cabeza y cola Genes de Regulacin son genes que inician y terminan el proceso Regin b2 no esencial para la sobrevivencia Genes Rec. Implicados en Recombinacin Genes de Regulacin Lados Cohesivos
RS OP
RS: Lsis del huesped OP: Sints. DNA
Forma circular del Bacterifago Lambda
Fig 4 16. Caracterosticas del fago Lambda.
804
Un vector an, de mayor capacidad que los anteriores se denomina Csmido, y se encuentra construido artificialmente de forma quimrica o mixta con genes del plsmido, para resistencia a antibiticos y otros del Fago Lambda como transportador. Contiene el gen cos (Cohesivo) del fago, cuya actividad promueve el empaquetamiento del DNA forneo en la partcula viral para posteriormente infectar una bacteria tipo E. Coli, lo que permite la replicacin del DNA forneo con fragmentos de 30 Kb a 45 Kb de largo. Continuando con la descripcin de los vectores, tenemos a los YAC, por Yeast Artificial Chromosome (fig. 5 16) o cromosoma artificial de levadura. Contiene todos los elementos que un DNA necesita para funcionar como cromosoma en el organismo husped y se puede cargar con uno de los mayores fragmentos de 400 Kb a 500 Kb. Se encuentra construido con un fragmento telomrico, que entrega los extremos necesarios para la replicacin, ms fragmentos centromricos y las secuencias correspondientes, que indican y promueven el sitio de origen de la replicacin que es necesario en la levadura (YCP + Telmeros). Tambin contienen genes que se emplean en la seleccin de las levaduras que s han tomado el vector. A fin de propagar estos vectores en E. Coli antes de cargarlos con DNA, se les ha incorporado un sitio denominado Ori C o de inicio u origen de la replicacin bacteriana y un gen que les entrega resistencia a la Ampicilina. Este ltimo se emplea para seleccionar las bacterias que han tomado el YAC.
SECUENCIA DE REPLICACION AUTNOMA Sitio Ori de plasmido y gen Amp
CENTROMERO Eco R1 Marcador de Seleccin
Telomerasa
Telomerasa
Bam H1
Fig. 5 - 16. Caractersticas del YAC.
Bam H1
En general una vez que se tiene el DNA humano integrado, mediante el empleo de las Endonucleasas de Restriccin y Ligasas en un vector, se procede a amplificarlo mediante la Clonacin, proceso por el cual se producen mltiples copias exactas de un solo gen u otro segmento del DNA para as obtener suficiente material de estudio. El resultado de esta amplificacin en distintos segmentos de DNA genera una biblioteca de clonos o coleccin de clonos hechos de una serie de fragmentos de DNA que se superponen representando el genoma entero del organismo.
805
Otro tipo de clonacin ocurre cuando se divide una clula haciendo mltiples copias de s misma y este es el caso de la conocida oveja Dolly. En este caso se recurri a la clonacin produciendo animales genticamente idnticos a la oveja donadora de los ncleos de clulas mamarias, los que fueron posteriormente implantados en oocitos fecundados. Volver al inicio
c) BIBLIOTECAS DE GENES. El objetivo de la clonacin, fuera de amplificar copias del DNA sirve para aislar genes, expresar genes y generar clonos que se emplean como sondas para el anlisis genmico. Por lo tanto, para reponer los clonos se debe echar mano a la biblioteca. Durante el procedimiento de aislar genes se debe seleccionar un clono de los muchos presentes en una biblioteca, empleando para ello una sonda formada por un polinucletido de DNA o bien un anticuerpo. Una vez que se ha aislado un gen se debe estudiar su expresin mediante un vector de expresin, que consiste en la accin de un promotor especfico para este gen y sus condiciones de cultivo en alguna clula husped. Cuando se emplean clonos como sondas para el anlisis genmico es posible determinar el nmero de copias de un gen en el genoma, sus relaciones taxonmicas y la construccin de mapas por ligacin de caracteres. Biblioteca Genmica: Se produce cuando todo el DNA genmico se digiere y los fragmentos s clonan dentro de un vector apropiado. De esta manera es posible disponer de muestras de todo el genoma del organismo representando a las secuencias que codifican y no codifican. En el caso de que se busque un gen se emplear un vector de insercin que permite amplificar un gran segmento (YAC). En otro caso cuando se necesita una fuente de sondas para mapeo por ligacin se necesitaran inserciones menores en vectores (plsmidos). Idealmente una biblioteca de este tipo debe disponer de muchas copias de cada gen. Biblioteca DNAc: Esta biblioteca se genera a partir de RNAm y Transcriptasa Inversa, de tal manera que solo se representarn los genes que solo se expresan y no aquellos que permanecen silenciosos o aquellos segmentos que separan los genes y constituyen la mayor cantidad de DNA. Por lo tanto el nmero de genes de que se disponga depender del tejido que se est considerando y el estado de desarrollo en que este se encuentre. Volver al inicio
d) ANLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS. Un gen puede ser identificado mediante el empleo del DNAc (DNA complementario, sin intrones) obtenido desde su propio RNAm. De esta forma se pueden identificar los segmentos de DNA que portan sus caractersticas e incluso a cual de todos los cromosomas corresponde. Con este fin se emplea la tcnica denominada Southern 806
Blotting y Northern Blotting. La primera de ellas consiste en separar los fragmentos de distinto tamao producto de una digestin con Endonucleasas de Restriccin en un gel de Agarosa (fig. 6 16). Luego se trata el gel con NaOH para denaturar el DNA (separar ambas hebras), se neutraliza este y el DNA es transferido a un filtro de nitrocelulosa o a un papel filtro de nylon, mediante difusin capilar o bajo corriente elctrica (fig. 7 16). Posteriormente, se fija el DNA al papel filtro por tratamiento con UV o baking. El mismo papel filtro se pone luego en contacto con la sonda radioactiva o fluorescente que al reconocer su secuencia complementaria hibridiza, identificando a la hebra que despus de una radioautografa (si la sonda es marcada radiactivamente), mostrar las bandas correspondientes a los segmentos del gen o exones que se encuentran presentes. En el caso del Northern blotting, se separa RNA por electroforsis (fig. 6 16), el que luego es transferido al papel filtro de nitrocelulosa, para ponerlo en contacto con una sonda DNAc y proceder a visualizarlo como se describi anteriormente. Existe otro desarrollo an, de este mismo tipo y que se denomina Western blot, en el cual se separan ahora, protenas por electroforsis con una mezcla: detergente (Sodio Dodecil Sulfato: SDS) en un polmero de separacin (Acrilamida) denominada SDSPoliacrilamida. Las protenas separadas por peso molecular se transfieren electroforticamente a papeles filtros de nitrocelulosa. Luego, se detectan mediante una reaccin con anticuerpos marcados con Yodo 131 o con Fluorescena.
Suministro de energa a los electrodos
Gel
Hendiduras donde se pone la muestra
Buffer
Fig. 6 - 16. Serparacin de cidos nucleicos mediante electroforsis
Buffer
Capas de adsorbentes de toallas de papel Hoja de Nitrocelulosa

Hoja adsorbente
Gel de Agarosa
Fig. 7 - 16. Tcnica de traspaso o Southern Blotting. Los cidos nucleicos son arrastrados por las toallas absorbentes.
Volver al inicio
807
e) AMPLIFICACIN POR REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION).
El anlisis de los genes responsables de una enfermedad puede ser llevado a cabo en muestras extremadamente pequeas como son los fibroblastos fetales extrados del lquido amnitico. De esta manera se pesquisan posibles enfermedades genticas antes del nacimiento, as mismo se puede detectar la identidad del DNA perteneciente a cualquier tejido, pelos, piel, sangre, semen dejado en la escena de algn crimen. Esta tcnica es capaz de amplificar secuencias especficas de DNA, circunscrito a tan solo un determinado sector millones de veces, no se requiere de todo el genoma intacto. Incluso modificaciones a la misma tcnica permiten detectar mutaciones puntuales de una sola base y niveles de expresin de los genes en muestras muy pequeas de tejidos.
5 3
3 5
5 CEBADOR 3 5 3 UN SOLO CICLO DE REPLICACI 5 3
3 5 3 5 CEBADOR
3 5
DNA Pol + dNCT + Mg
HEBRA NUEVA
HEBRA NUEVA Fig. 8 - 16. Amplificacin por medio de cebadores
La tcnica presenta un solo inconveniente comparada con la amplificacin por clonacin, que siempre es necesaria en los trabajos preliminares y consiste en la sntesis in vitro de un segmento de oligonucletidos complementario al segmento de DNA a amplificar. Este segmento constituye el cebador o extremo 3 para la enzima DNA Polimerasa, que genera las hebras complementarias (fig. 8 16). De esta manera subiendo la temperatura la doble hebra se desune, separndose. A continuacin al bajar la temperatura, esta vez se aparea con los cebadores o primers, dejando estos el extremo 3 para que la DNA pol de Thermophylus Aquaticus (resistente a los cambios cclicos de temperatura), empiece la replicacin del segmento a amplificar. Posteriormente se repite el ciclo producindose nuevas copias cada vez que los cebadores se unen a sus respectivas secuencias complementarias. En 5 ciclos el segmento original de DNA se puede amplificar 2, 4, 16, 256, 65536 veces.
808
El producto amplificado se puede analizar mediante electroforsis en Agarosa, seguido de tincin con Bromuro de Etidio, que se intercala entre las bases del DNA y lo hace visible a la luz UV. Por otro lado, tambin se puede marcar el producto con nucletidos radioactivos en la posicin P32 , de esta manera el P32 se incorpora en los productos y estos pueden ser visualizados por radioautografa despus de separarse por electroforsis en Agarosa.. Variaciones de esta tcnica se logran aplicndola al producto de la enzima Transcriptasa Inversa o RT-PCR, es decir a partir del RNA total producido por una clula del tejido, la enzima Transcriptasa inversa produce DNAc, el cual es un segmento continuo de solo exones. Posteriormente al agregarse los cebadores adecuados que aparean con los extremos del DNAc, es posible amplificarlo. De esta manera se puede distinguir el producto de tan solo un gen entre cientos de ellos que se encuentran expresados en un cierto tejido, en otras palabras se dice que se abre una ventana.
G EN -G LO BINA NORM AL CCT G AG G AG G EN -G LO BIN A MUT ADO CCT G T G G AG
GG ACT CCT C G G AC A CCT C Am plificacin por m edio de cebadores CCT G AGG AG CCT G T G G AG G G ACT CCT C GG AC A CCT C
Material am plificado, m uchas copias a electroforsis MIGRAC IO N NO RM AL G EN -G LO BINA Una sola hebra MIG RAC IN ANOR M AL GEN -G LO BINA Una sola hebra
Fig. 9 - 16. Comparacin entre gen normal y mutado por PCR- SSCP. La migracin anormal de una sola hebra se debe a la mutacin
Otra variacin de estas tcnicas, donde se puede aplicar PCR, es posible cuando se reconocen mutaciones puntuales en genes ya descritos o caracterizados. Esta tcnica se denomina PCR-SSCP por PCR - Single Strand Conformation Polymorphism o Reaccin en cadena de la Polimerasa con Polimorfismo en la Conformacin de una Sola Hebra (Fig. 9 16), y consiste en explotar el cambio conformacional que se produce en una sola hebra entre el segmento del DNA que posee un gen mutado comparado al segmento normal sin mutacin. Para ello se amplifica una secuencia de
809
100 a 200 pb de un gen mutado y uno normal, empleando los cebadores que circunscriben el sector de la mutacin. Posteriormente sobre el producto amplificado, se lleva a cabo la separacin de ambas hebras y la electroforsis en Poliacrilamida (medio poroso de mayor resolucin que la Agarosa), se discrimina aqu la forma de las
G E N - G L O B IN A N O R M A L CCTGAGGAG T A GGACTCCTC L ig a s a t e r m o e s t a b le CCTGAGGAG O lig o n u c le t id o s L ig a d o s U n i n 5 , 3 GGACTCCTC NORM AL CCTGTGGAG
O lig o n u c l e - tid o s N o lig a d o s
G E N -G L O B IN A M U T A D O CCTGTGGAG
A p areo c o r r e c to
O lig o n u c le t id o s
T A
A p areo inc o rre c to
GGACACCTC
GGACACCTC A N E M IA F A L C IF O R M E
N ue vos O lig o n u c le ti d o s N o L ig a d o s
O lig o n u c l e t id o s L ig a d o s
Fig. 10 - 16. Reaccin en cadena de la Ligasa.
hebras observndose una diferencia en la migracin de ambas, la normal y la que posee la mutacin. Otra tcnica ms empleada para detectar mutaciones puntuales en genes ya conocidos y secuenciados en pacientes con alto riesgo de poseer un alelo mutante, se denomina Ligase Chain Reaction (LCR) por Reaccin en Cadena de la Ligasa (Fig. 10 16). Consiste en emplear una Ligasa termoestable que une dos Oligonucletidos adyacentes siempre que estos hibridicen totalmente con la hebra complementaria. Si la hebra complementaria es la original o wild type, la hibridacin es de 100% y ambos oligonucltidos son ligados por la enzima, es decir se produce la unin 3 OH con el 5 Fosfato formando el Fosfodiester. Ahora, en el gen mutante si ambos oligonucletidos aparean con el resto de su longitud, pero no en el extremo 3 de cada Oligonucletido donde se encuentra precisamente la mutacin puntual, ya que las bases normales del oligonucletido no corresponden a las complementarias en el DNA de cada hebra mutada. Se produce aqu una joroba que impide a la Ligasa unir los extremos de los oligonucletidos adyacentes. Por lo tanto, solo los correctos correspondientes al wild type sern amplificados y no los que no se unieron. De esta manera examinando el nmero de copias de ambos genes original y mutante se conoce si el paciente lleva la enfermedad 810
La Transgnesis (fig. 11 16), es una tcnica que consiste en introducir genes forneos para su estudio en la lnea germinal de algunos animales. Una de las primeras experiencias se llev a cabo al introducir en ratones el gen de la hormona del crecimiento, obtenindose individuos con doble tamao que el normal.
E nzim a d e re stric c i n q ue co rta p a rc ialm e nte
F rag m e nto s sup e rp ue sto s
D N A ve cto r c o rta d a c o n la m ism a enzim a d e re stric ci n U nui n d e lo s frag m e nto s usa nd o la enzim a L ig a sa
Fig. 11 - 16. Transgnesis.
Para ello se emplean vectores preparados con genes que codifican factores de transcripcin, que promuevan la expresin del gen necesario y se inyectan en el ncleo de huevos fertilizados.
811
dAT P dG TP dCT P dTT P ddATP
dAT P dG T P dCTP dT T P ddG TP
dAT P dG TP dCT P dTT P ddTTP
dAT P dG T P dCT P dT T P ddCTP
P o s illo s d o n d e s e s e p a r a n lo s fra g m e n to s r e p lic a d o s c o n la s m e z c la s d e N uc le tid o s q u e s e o b s e r va n m s a rr ib a
Fig. 12 - 16. Separacin por electroforsis de la hebra replicada en presencia de los 4 dNTPs ms un ddNTP
Los huevos a su vez, se trasplantan al tero de las hembras receptoras para el desarrollo de las cras transgnicas. El DNA de las cras se emplea luego para detectar la presencia del gen activo. Si el transgene posee herencia Mendeliana significa que se transfiere en la lnea germinal. Esta tcnica se emplea en plantas y animales de campo para introducir resistencia a enfermedades e infecciones, as como tambin para producir hormonas y protenas humanas presentes en la leche animal. Un desarrollo de esta ltima tcnica es la Terapia Gnica practicada en humanos, sin embargo, existen barreras ticas que impiden su aplicacin hasta ahora. En el futuro se pretende reemplazar de esta manera genes enfermos por los correctos. Si se introducen los genes en clulas somticas y no en la lnea germinal se impedir el traspaso del gen hacia los descendientes. Se ha practicado esta tcnica en la mdula de los huesos, fibroblastos y hepatocitos. Los vectores que se emplean en estos casos son derivados de retrovirus, que cuentan solo con las regiones promotoras transcripcionales, como LTRs (Long Terminal Repeats) para manejar la expresin del gen de inters. Se ha logrado xito solo en clulas en cultivo y an no se ha pasado totalmente a la etapa en humanos. Volver al inicio
812
f) SECUENCIACIN DEL DNA Para establecer que dos clonos especficos son adyacentes en el genoma se deben construir bibliotecas de clonos con fragmentos que se superpongan parcialmente. Estas bibliotecas de clonos se ordenan dividiendo los incertos en pequeos fragmentos y determinando que clonos tienen secuencias comunes. Uno de los mtodos tradicionales que an perdura es el de Sanger y consiste en el empleo de un dideoxinucletido trifosfato (ddNTP) durante la replicacin del DNA mediante la DNA pol I. Este nucletido carece del grupo 3-OH por lo que la enzima se detiene despus que lo adiciona por su lado 5 al extremo 3 del Deoxiribonucletido anterior y no puede continuar replicando en base a la hebra molde (figs. 12 y 13 16). De esta manera si se agrega un ddGTP junto a un dGTP se producir una competencia entre ellos por ocupar un lugar en la hebra naciente. Cuando la hebra madre tiene
SECUENCIA DE LA HEBRA MADRE: SECUENCIA DE LA HEBRA HIJA:
3 TCGATCGATCGATCGATCGA 5
5 AGCTAGCTAGCTAGCTAGCT3
FRAGMENTOS EN CADA POSILLO ddATP ddGTP ddCTP ddTTP
ddA AddG AGCTddA AGCTAddG AGCTAGCTddA AGCTAGCTAddG AGCTAGCTAGCTddA
AGddC AGCddT AGCTAGddC AGCTAGCddT AGCTAGCAGddC AGCTAGCTAGCddT
Fig. 13 - 16. Secuencia de los fragmentos que se encuentran en cada pocillo del gel
Citosina en su secuencia, la hebra hija adicionar dGTP y una fraccin adicionar ddGTP para detenerse produciendo una poblacin de fragmentos que se detienen o siguen cada vez que en la hebra madre aparece una Citosina. Por lo tanto si contamos con cuatro mezclas de los cuatro dNTPs, ms cada uno de ellos con ddNTP distinto, tendremos una poblacin de hebras hijas o hebras nacientes que se detendrn cada vez que aparezca la base complementaria a la que tienen como ddNTP. Por lo tanto se dispondr de una poblacin de fragmentos de distintos tamaos que se pueden separar por electroforsis ocupando cuatro pocillos, cada uno correspondiente al nucletido que se encuentra como ddNTP.
813
Marcador que flanquea el gen
GEN SECUENCIADO
Marcador que flanquea el gen
5 3
CEBADOR
5 3
CEBADOR
CEBADOR
CEBADOR
CEBADOR
Fig. 14 - 16. Tcnica de Chromosome Walking
Otra tcnica empleada para llenar huecos durante la secuenciacin es la denominada Chromosome walking (fig. 14 16) o caminar sobre el cromosoma. Mediante esta, s hibridiza un cebador de secuencia conocida a un clono al azar de una biblioteca gentica y se sintetiza la hebra complementaria, posteriormente esta se asla y su secuencia terminal 3 , se emplea como cebador para continuar replicando la hebra complementaria o continuar caminando sobre el cromosoma. Sin embargo, debido a que los cebadores deben ser sintetizados qumicamente el gran nmero de cebadores que se necesita para avanzar presenta una desventaja. Volver al inicio . 2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES. Se encuentran constituidos por distintas secuencias que no son parte de los genes y entre ellas tenemos: a) sitios especficos de corte para las enzimas de restriccin. b) secuencias repetidas en tandem de 8 a 16 pares de bases c) secuencias repetidas en tandem de 4 a 6 pares de bases 814
Todas estas secuencias se heredan segn la gentica Mendeliana, as tenemos que mientras ms relacionadas se encuentren dos personas, compartirn un nmero mayor de fragmentos de igual tamao como producto de las enzimas de restriccin. Esta tcnica es la ms antigua y se llama RFLP por Restriction Fragment Length Polymorphism o Polimorfismo en el Largo del Fragmento de Restriccin. a) RFLP ( RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) O POLIMORFISMO DEL FRAGMENTO DE RESTRICCIN Esta tcnica se basa en los polimorfismos que existen en la secuencia de los cromosomas, es decir, el mismo cromosoma en dos personas distintas, presenta una variacin cada 200 a 500 pb en la secuencia. Esta variacin crea o hace desaparecer un sitio de restriccin y se alterar con ello el tamao de los fragmentos. No requiere de secuenciacin, pero s de una biblioteca creada a partir de fragmentos de DNA clonados en un vector. Luego se emplea una sonda basada en DNA genmico o DNAc. Se debe emplear una separacin electrofortica en geles de Agarosa. El DNA del organismo que interesa se digiere con endonucleasa de restriccin y luego es sondeado con una biblioteca de DNA clonado. Los apareamientos de la sonda con el DNA se observan por radioautografa o fluorescencia. Se puede detectar siempre el mismo sitio y sirve para mapeos. Los polimorfismos se detectan como diferencias en pesos moleculares manifestado por la migracin en el gel de Agarosa de los fragmentos del DNA del husped.
SITIOS DE CORTE POR LA ENZIMA DE RESTRICCIN
ALELO A
ALELO B
ALELO A
ALELO B
* *
SONDA MARCADA
Fig. 15-16. Los fragmentos producidos por los sitios de corte por la enzima de restriccin se visualizan mediante un Southern Blot con su respectiva sonda.
Volver al inicio
815
b) VNTR (VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS) O REPETICIONES EN TANDEM (UNA TRAS OTRA) DE NMERO VARIABLE Por otro lado, al agregar cebadores o partidores sintticos que aparean con aquellos sectores de la hebra que flanquea a secuencias repetitivas en tandem, se logra observar que mientras ms relacionadas se encuentren dos personas mayor ser el nmero de fragmentos amplificados coincidentes, es decir con igual nmero de secuencias repetitivas y por consiguiente igual tamao. As tenemos que esta tcnica se puede aplicar a los VNTR por Variable Number Tandem Repeats o Nmero Variable de Secuencias Repetidas en Tandem (cabeza con cola como los carros de un tren). Estos segmentos se encuentran interespaciados en el genoma humano. El nmero de secuencias repetitivas en un locus (lugar particular del cromosoma) vara con las personas, es decir presenta polimorfismos (pueden tener un mayor o un menor nmero de repeticiones). Adems, en cada persona existe un alelo paterno y otro materno de distintos tamaos o nmero de la misma secuencia repetitiva. As que, mientras ms emparentados se encuentren las personas los segmentos repetitivos sern cada vez ms similares. Ocurre que en mellizos idnticos, al ser su DNA cortado por la misma Endonucleasa de Restriccin o en el caso de que sus secuencias repetitivas sean amplificadas por cebadores especficos ubicados en los flancos y ambos separados por Electroforsis, los fragmentos y las repeticiones debern de ser todas iguales.
a) RFLP expuesto a sonda de VNTR (aparea con solo una secuencia repetitiva) en seis individuos distintos
b) VNTR disperso en genoma. Sonda VNTR multilocus (aparea con distintas secuencias repetitivas) en 5 individuos distintos
Fig. 16a - 16. Los fragmentos obtenidos por endonucleasa de restriccin, que corta los sitios que flanquean a las secuencias repetitivas, se separan por tamao mediante Electroforesis. Finalmente se visualizan aquellos que se unen a una sonda fluorescente o marcada con P32. Esta sonda es una secuencia complementaria a la regin que se repite Fig. 16b 16. La sonda se une a los fragmentos con distinto nmero de secuencias repetitivas ya que se trata de secuencias Repetitivas de distinta naturaleza con distintos tamaos. Esta sonda es complementaria a las mltiples secuencias repetitivas (Sonda Multilocus)
816
Algunas secuencias repetitivas se encuentran en un solo locus (lugar) especfico en el genoma humano. Las sondas construidas en base a estas secuencias, son sondas de un solo locus (un solo tipo de secuencia repetitiva) y dejan un patrn de distribucin tpico cuando se usan como sondas para hibridar Southern Blots de RFLPs, es decir a como se denomina a los traspasos de RFLPs, fig. 16a - 16. En este caso, la visualizacin producida por sondas de un solo locus de la VNTR previamente cortada con endonucleasas de restriccin es ms fcil de interpretar, puesto que cada individuo no debe de tener ms de dos bandas claras constituidas por una regin no codificante con la misma secuencia repetitiva, pero en distinto nmero presente en el alelo paterno y materno, que puedan coincidir o diferir entre ellas para determinar su relacin o identidad. Otras secuencias con VNTRs se encuentran en muchos loci (mezcla de fragmentos con varios tipos de secuencias repetitivas) en el genoma humano o bien la visualizacin de estos fragmentos mediante sondas VNTR de mltiples locus, producen ms informacin puesto que se sondean de 10 a 30 loci o lugares en el cromosoma donde se encuentran secuencias repetitivas, pero distintas. Estos loci se encuentran dispersos entre los cromosomas humanos como se observa en Figura 16b 16, dando origen a muchas ms bandas que se pueden comparar para identificar a los individuos. Anlisis de un solo locus por sonda VNTR o anlisis por VNTR de mltiples locus se pueden usar con fines fornsicos o para determinar paternidad.
EL EC T R OF O R ESIS
10 K b
Alelo s d e rep etici n co rta
3K b
10K b 9K b
S E C U E N C IAS R E P E TIT IV AS E N T AN D E M
9K b
6K b
Alelo s d e rep etici n larg a
6K b
3K b
S itios d e corte p or la E ndo nucle asa de R es tricci n
Fig. 17 - 16.Dos tipos de secuencias repetitivas visualizadas con sus respectivas sondas en distintos alelos
En la figura 17-16, se observan dos secuencias repetitivas con sus respectivos alelos junto a los sitios de corte por las Endonucleasas de Restriccin. Ambas pueden ser identificadas por los fragmentos que aparecen en el Southern Blot a la derecha de la figura 17-16. En distintas personas variar el nmero de repeticiones y por lo tanto la
817
posicin de las bandas, si son parientes algunas bandas tendrn igual nmero de repeticiones entre ellos. Volver al inicio c) RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA) O DNA POLIMRFICO AMPLIFICADO AL AZAR. Esta tcnica requiere de PCR, pero no de clonacin ni de secuenciacin. Puede detectar varios loci o sitios mediante el empleo de cebadores cortos de 10pb que tienen una secuencia al azar, es decir, se amplifican sectores del DNA tambin al azar y que resultan en la presencia o ausencia de polimorfismos. Los cebadores demasiado cortos pueden ser afectados por las condiciones de hibridacin al DNA, en este caso se emplean bajas temperaturas para hibridizar. Los resultados pueden no ser siempre reproducibles. No es apropiada para mapeos comparativos. Solo cuando un par de cebadores se dispone correctamente, es decir, se encuentran bien orientados y lo suficientemente, cercanos los segmentos amplificados pueden ser comparados entre individuos para observar su relacin. Volver al inicio d) AFLP ( AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM ) POLIMORFISMO EN EL LARGO DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO. Se encuentra basada en PCR y no requiere de enzimas de restriccin o amplificacin por clonacin. Esta vez el cebador tiene 15 pb fijos y 2pb al azar. La porcin fija entrega estabilidad al cebador y la seccin al azar significa que amplificar muchos loci o sitios, los que pueden llegar a 100 con un solo tipo de cebador.
10 Kb Electroforsis de Fragmentos Amplificados
10Kb 9Kb
3Kb
SECUENCIAS REPETITIVAS EN TANDEM
9Kb
6Kb
6Kb
3Kb
CEBADORES
Fig. 18 16. Los cebadores se unen a los extremos de los segmentos que se desea amplificar. En distintos alelos los mismos cebadores amplificarn fragmentos de distinto
818
largo o nmero de repeticiones que caracterizan a cada individuo. Mientras ms emparentados, el nmero de repeticiones ser igual
El polimorfismo se detecta como la presencia o ausencia de una banda correspondiente al DNA amplificado. Es til para fingerprinting o tipificacin de sospechosos, tipificacin de semillas, animales finos o de pedigr, etc. No es til para mapeos. Por ejemplo en dos individuos tomados al azar o heterogneos, no relacionados entre s, se detectar la amplificacin del mismo sitio, pero en uno de ellos el fragmento amplificado por los mismos cebadores es ms largo o ms corto que en el otro (Fig. 18 16) y se notar la diferencia durante la visualizacin de los fragmentos despus de una electroforsis con la respectiva sonda marcada contra la secuencia o las distintas secuencias repetitivas. Volver al inicio e) STS (SEQUENCE TAGGED SITE) O SITIO MARCADO POR LA SECUENCIA. Los cebadores han sido diseados para amplificar una regin determinada que posee un polimorfismo entre dos o ms individuos. Los elementos mapeados como clonos individuales, contigs o regiones secuenciadas en distintos laboratorios y que pertenecen a distintas personas se pueden comparar por STS. Esta tcnica consiste en amplificar una secuencia corta reconocida de 200 a 500pb que no se repite y que sirve como secuencia marcadora de un lugar especfico comn a todos los genomas humanos, se le emplea como hito marcador o seal en el camino. Se puede formar el mapa sabiendo la posicin de las secuencias STS en los segmentos del mismo cromosoma, pero de diferentes personas en estudio. Mediante PCR se puede detectar esta secuencia nica en el genoma. No se requiere de clonacin, pero si de informacin sobre la secuencia. Los cebadores son de 18 a 20 pb y estn diseados para amplificar este fragmento conocido de secuencia corta y nica (STS) por RAPD-PCR, al contar con ambos cebadores y en presencia de todas las otras secuencias genmicas distintas, por lo tanto las STS definen una posicin dentro del mapa fsico o bien se pueden obtener de un clono de RFLP y generar hitos o mojones marcadores que mapean posiciones nicas dentro del genoma. Los polimorfismos se detectan como diferencias de tamao en productos amplificados. El anterior es un buen mtodo de mapeo y es confiable, todo depende de la seleccin de un buen par de cebadores. Con ellos se pretende crear un mapa de 100 kB de resolucin teniendo cerca de 30.000 marcadores STS distintos. Para lograrlo se procede mediante el corte del DNA en pequeos trozos o por segmentos, los que se amplifican por clonamiento fabricando innumerables copias, es decir, se implanta un plsmido cargado con el segmento a amplificar y se hace que se replique en la bacteria. Una vez amplificados, los segmentos se alinean para reflejar el orden que llevan en los cromosomas al superponer las secuencias marcadoras. Las STS son tiles para localizar y orientar el mapeo junto a los datos de secuencia reportados por diferentes laboratorios y a la vez sirven de hitos para desarrollar un mapa fsico del genoma humano. Volver al inicio
819
f) EST POR EXPRESED SEQUENCE TAG O EXPRESIN DE LA SECUENCIA MARCADORA. Se emplea PCR que no requiere de clonacin, pero si se requiere de informacin de la secuencia. Detecta una zona especfica del genoma y es bueno para el mapeo. El polimorfismo se detecta como diferencia de tamao en el producto amplificado, aunque toma tiempo crear un buen cebador representado por secuencias parciales de DNAc de 18 a 20 pb, como cebadores que proveen de marca especfica para un gen. Volver al inicio g) MARCADORES MICROSATLITES. Sirven para detectar regiones hipervariables del genoma. Los Microsatlites se denominan por los nombres de: Simple Sequence Repeats (SSR) o Short Tandem Repeats (STR). Estas secuencias son cortas de 2 a 5 bases y se repiten mltiples veces flanqueadas por DNA nico. Se encuentran bien distribuidas dentro del genoma humano. Es posible encontrar una STR trimrica o tetramrica por cada 20Kb. Muchos de estos loci o sitios son altamente polimrficos, varan entre individuos ya que tienen secuencias repetidas de distinto tamao o con distinto nmero de repeticiones. Es posible distinguirlas unas de otras mediante la amplificacin por medio de cebadores o partidores de la tcnica de PCR (previamente diseados), que se encuentran dirigidos a aparearse, con las regiones constantes o conservadas que las flanquean. Posterior a la amplificacin se pueden visualizar estos sectores mediante una sonda complementaria a la parte repetitiva, despus de su separacin electrofortica. Este procedimiento es til en aplicaciones fornsicas y paternidades. Existen varias ventajas cuando se emplea tecnologa basada en amplificacin de marcadores STR comparados a los RFLP con enzimas de restriccin. La amplificacin, por su parte requiere de solo un par especfico de cebadores para el sitio que flanquea a las secuencias repetitivas.
RFLP SITIOS DE RESTRICCIN
16-70 pb VNTR
2-4 pb STR CEBADORES Fig. 19 -16 Los tres sistemas emplean marcadores que buscan diferencias entre individuos.
820
En la figura 19-16, se observan los distintos sistemas empleados cronolgicamente (RFLP, VNTR y STR) para discriminar molecularmente los individuos. El ms antiguo (1980, RFLP) emplea sitios de restriccin como blancos para la enzima Eco R1. Los fragmentos obtenidos son separados por electroforsis en Agarosa y detectados por Southern Blot empleando una sonda radioactiva. Ambos alelos eran detectables por variaciones en su largo. Estas, eran caractersticas heredables que resultaban de la presencia o ausencia del sitio de restriccin en un locus determinado. Luego, las VNTR empleadas desde 1985 en adelante contenan muchos alelos en cada locus individual, que no se deban a la variabilidad del sitio de corte, sino que a la variabilidad en el nmero de copias de una secuencia de consenso desde 15 a 70 bases que se encontraba repetida en tandem y a la vez era flanqueada por un par de sitios de restriccin. Posteriormente, se descubrieron repeticiones con polimorfismos en di, tri y tetranucletidos llamados STR. Tienen la misma estructura que las VNTR, pero las repeticiones de consenso en tandem son de dos a cuatro bases y son ms compatibles con la tcnica de PCR, ya que se pueden emplear varios cebadores o partidores (previamente diseados) para amplificar muchos locus repetitivos a la vez. En la actualidad con el objeto de reconocer personas y/o tipificar exhaustivamente un DNA, sin importar que se encuentre parcialmente degradado o no, se ha recurrido al empleo de cebadores tipo Mltiplex (Fig. 20 -16). Es decir, estos cebadores tienen ms de un par y se encuentran marcados con distintas molculas fluorescentes y aparean en mltiples regiones que flanquean zonas repetitivas iguales o distintas. Se tiene cuidado en que el diseo de los cebadores o partidores no sea superponible y que se encuentren espaciados. De esta manera, es posible amplificar mltiples alelos del genoma al mismo tiempo y cada uno de ellos posee un color determinado. La probabilidad de encontrar alelos idnticos en dos individuos disminuye con el aumento de los sitios polimrficos, haciendo el ensayo mucho ms especfico y discriminatorio. Una vez hecha la amplificacin se separa el DNA por electroforesis capilar, consistente en un capilar relleno con formamida bajo un campo elctrico. Despus de su separacin se procede a su lectura con un lser para reconocer los distintos colores correspondientes a aquellos cebadores apareados y que han amplificado mltiples locus. La lectura de las bandas es transformada en peaks de distintos colores correspondientes a la fluorescencias de las sondas que han amplificado un locus determinado De esta manera cada persona distinta tendr un nmero de peaks determinados y puede ser reconocida entre otras. Mientras mayor sea el nmero de locus amplificados mayor ser la certidumbre. Esta tcnica se emplea para comparar sospechosos frente a la evidencia, test de paternidad, reconocimientos histricos, investigacin de personas desaparecidas, identificacin de victimas de desastres, identificacin de soldados y de delincuentes. Empleando 13 sitios de secuencias STR multilocus, es posible encontrar una serie de peaks repetidos de 1 en 594 trillones. Volver al inicio
821
Regiones multilocus con 3 secuencias repetitivas de distinto tamao
Escalera allica: Regiones de mltiples peaks correspondiente a los distintos alelos existentes en la poblacin y que se emplea como estndar
Alelos de
una persona comn
Alelos de otra persona no relacionada con la primera
Fig. 20 16. Regin multilocus amplificada por una mezcla de varios cebadores fluorescentes de tres colores distintos. Si la persona es homozigoto para una regin el peak es ms largo y si es heterozigoto el peak es ms pequeo.
3) APLICACIONES EN LA MEDICINA MOLECULAR Una de las metas de la Medicina Molecular es predecir las enfermedades antes de que los signos y sntomas se manifiesten en el individuo. Por ambicioso que esto parezca, se pretende alcanzar tal capacidad en un futuro cercano, mediante diversas tcnicas. De esta manera, es imperante explorar y analizar las unidades de informacin que se encuentran inmersas en el material hereditario conocido como DNA y que se identifica por el nombre de gen, junto a los factores que influyen tanto en su control como en su expresin. Al caracterizar el tipo de anomalas que pueda afectar a los genes, se espera poder predecir la susceptibilidad de las personas a este tipo de enfermedades y a la vez encontrar la forma de evitarlas y en el caso de que estas ocurran, cmo curarlas. Este ltimo desarrollo de la Medicina, comenz con la revolucin tecnolgica que ocurri alrededor de la dcada del 70, cuando se aplicaron nuevos diseos experimentales que ms tarde permitieron seleccionar, identificar y amplificar los genes humanos. Desde entonces hasta el ao el ao 2000 se han descubierto cerca de 4000 enfermedades, cuyo origen es atribuido al mal funcionamiento de uno o varios genes, como son por ejemplo los casos de Hipercolesterolemia familiar, Fibrosis Cstica, Fenil Cetonurea y distintos tipos de Hiperamonemias junto a algunos tipos de cncer, como son el de Colon o el de Mamas. Es tambin necesario considerar que a medida que progresan las tcnicas y se hacen ms comunes, las consideraciones ticas y morales junto a la legislacin deben marchar a la par. De esta manera los resultados adversos obtenidos mediante la examinacin de un paciente, debern ser tan solo del dominio del equipo de profesionales tratante de la enfermedad y nunca entregados a los pacientes, sin el debido tacto y menos an a las instituciones pblicas o privadas. En general una persona joven, que tiene toda una vida por delante, se reciente y puede sufrir dao psicolgico, al saber que debe enfrentar enfermedades para las cuales no se encontraba preparada, en vez de dejar estas al azar y al estilo de vida. Este es un tema que puede generar un intenso debate en el futuro cercano.
822
Para comprender los alcances de esta nueva medicina debemos comenzar por estudiar las unidades de la herencia o las subunidades del DNA. Estas comprenden aquellas estructuras que almacenan la informacin til para generar un individuo. Bastan cerca de 30.000 genes para definir un ser humano. En ellos reside la estructura de las protenas junto al conocimiento implcito para sus interacciones tridimensionales en su microambiente hasta el comportamiento de un organismo entero. Sin embargo, los genes forman tan solo una pequea parte de los cromosomas que tienen una mayor parte de DNA no codificante o de relleno. Los cromosomas humanos se encuentran divididos en dos juegos de 22 autosomas ms un cromosoma sexual, que puede ser X o Y (Fig. 21-16). Cada una de las clulas de un organismo son totipotenciales es decir, tienen la informacin para generar un individuo completo. Este hecho se conoca hace ya algn tiempo, desde que se logr clonar ranas a partir de ncleos de clulas extradas del intestino de una rana adulta, hasta la aparicin de la famosa oveja Dolly. Esta ltima fue clonada a partir del ncleo de una clula de la glndula mamaria. Esto significa que todas las clulas de nuestro organismo poseen la misma informacin, pero los genes que se expresan son diferentes. Cada tejido es caracterizado por la expresin particular de sus genes, lo que ocurre durante un proceso denominado diferenciacin celular y que acontece durante la Embriognesis. Por lo tanto dependiendo del balance en la expresin de las clulas totipotenciales algunos genes se prenden y otros se apagan, sin embargo el potencial gentico para convertir un hepatocito en neurona, an se encuentra presente en el tejido diferenciado, pero se lo encuentra silencioso.
Fig. 21 - 16. Cromosomas humanos ordenados por tamao mostrando sus bandeos.
En general, este tipo de disposicin de la expresin gentica, nos dice que los genes pueden ser inducibles y constitutivos. Los constitutivos se expresan siempre para que la clula subsista y codifican para enzimas que son responsables de las reacciones 823
enzimticas y sntesis de estructuras llevando a cabo las labores bsicas, mientras que los genes inducibles se encuentran inactivos la mayora del tiempo y solo se expresan para reacomodar el metabolismo o la estructura de la clula bajo determinadas circunstancias. Hay que considerar que dentro de estos genes, un subgrupo fue inducido durante la embriognesis y mantiene a la clula diferenciada en lo que ya s, sea esta una neurona, hepatocito, miocito, etc. y una vez logrado este propsito permanecen silenciosos. Volver al inicio a) MUTACIONES La compleja interaccin entre los genes determina el funcionamiento de nuestro metabolismo y sus defensas, sin embargo las mutaciones que se adquieren durante el curso de la vida pueden llegar a ser heredadas (Fig. 22 - 16) o congnitas, pasando por la lnea germinal. Por otro lado tambin pueden ser somticas (Fig. 23 - 16) o adquiridas, cuando en el transcurso de la vida solo pasan de clula en clula y no a los descendientes (efecto de la luz UV, txicos ambientales, etc.). Las primeras pueden afectarnos o predisponernos a enfermedades que van desde insignificantes, es decir, algo as como la intolerancia a ciertas dietas, hasta la inhabilitacin total de la persona, como es el caso de las enfermedades congnitas del metabolismo (Hiperamonemias, Fenilcetonurea, etc.). Por otro lado, entre las mutaciones somticas, podemos contar con la predisposicin al cncer provocado por el tabaquismo o a los melanomas provocados por el exceso de exposicin a la luz solar.
Oocito
Espermio
Mutacin
Hueso
Pancreas Neurona
Fig. 22 - 16. Mutaciones en la lnea germinal pueden ser heredadas.
Dentro de este ltimo punto, ocurre que algunas personas pueden ser ms susceptibles que otras a las enfermedades adquiridas, resaltando lo complejo que es su control y que parece depender de la expresin de varios genes a la vez.
824
Podemos citar que si una funcin determinada depende de los genes A, B, C y D, esta se lleva a cabo en un 100%, sin embargo, si la misma funcin se puede llevar a cabo en un 80% con tan solo A, B y C, debido a que D se encuentra mutado. Esta persona ser ms propensa a sufrir una enfermedad determinada por falta del control aportado por D. Aunque no es seguro de que as sea, no se tiene la certeza exacta de que se producir una falla, pero es lo ms probable.
Mutacin
Clulas mutadas
Clulas normales
Fig. 23 - 16. Mutaciones somticas solo pasan de clula en clula y no son heredadas.
En los humanos los genes se encuentran en pares y una copia pertenece a cada padre. Cada una de estas copias recibe el nombre de alelo, los cuales pueden ser del tipo dominante o recesivo (Fig. 24a - 16). El alelo dominante (D) en las enfermedades autosmicas, se expresa y prevalece independientemente de s su contrapartida es dominante (DD) o recesiva (Dd), mientras que el recesivo (d) se expresa si su contrapartida es tambin recesiva (dd). En el caso de que una persona posea un gen recesivo con la enfermedad y otro dominante normal, prevalece el normal, siempre que este ltimo no sea desactivado o se pierda. Sin embargo, la persona heterozigota para el gen recesivo es portadora de la enfermedad y tiene un 25% de probabilidad de pasar el gen alterado a cada individuo de su descendencia. Si ahora ambos padres son portadores, la probabilidad de producir descendencia portadora en cada embarazo es de 50% (Fig. 24a - 16). Estas probabilidades se hacen posibles, en especial en aquellos grupos tnicos cerrados, con poco intercambio gentico con la poblacin mundial.
Por otro lado, es necesario aclarar que no todos los alelos mutados pueden conducir a una enfermedad. El cncer de mamas, cuyo responsable es un gen dominante y no el recesivo, tiene solo un 80% de riesgo y no de 100% a edades superiores a 65 aos, ya que intervienen otros genes que se encuentran coludidos con el alelo mutado y de estos ltimos depender en parte, que el mal aparezca o no. Este hecho indica que para hacer posible un cncer, deben existir distintas mutaciones simultneas o bien que estas sean del tipo acumulativo y que ocurran durante todo el transcurso de la vida. Por ejemplo, en la enfermedad denominada Alzheimer se requieren mutaciones en los cromosomas 1, 14, 19 y 21. A la vez que esta enfermedad se encuentra asociada a la sobreproduccin de Apo E (Apoprotena E). Esta ltima participa en el transporte de los 825
lpidos y cuando sus niveles se encuentren alterados, constituira la seal marcadora de la enfermedad.
Am b o s p a d res p o rta d o res G en d e la F ib ro sis C s tic a
a)
H o m b re
M u je r
b)
N o rm a l M u taci n 1
Dd
Dd
DD
Dd
Dd
dd
S in sn to m a s
S n to m as le ves
H o m b re M u je r H o m b re M u je r N o rm a l P o rta d o ra P o rta d o r E n fe rm a 25% 50% 25%
M u ta ci n 2 D d G en o Alelo D o m in an te G en o Alelo R e ces ivo S n to m as s eve ro s
M u ta ci n 3
S n to m as d e carcter in term ed io
Fig. 24a - 16. La persona homozigota que porta los alelos recesivos (dd) tiene un 100% de probabilidad de padecer la enfermedad. Fig. 24b - 16. Mutaciones en distintas partes del mismo gen producen diferentes sntomas.
Por otra parte, ocurre de que las mutaciones pueden caer en distintos segmentos de un mismo gen (Fig. 24b - 16), produciendo manifestaciones clnicas que van desde el rango de severas a leves e incluso silenciosas, como es el caso de la Fibrosis Cstica. En otros casos los genes mutados se pueden heredar, ya que se transportan en clulas reproductivas, por lo que la mutacin estar presente en todos los tejidos del individuo producto de estos genes. As tenemos que los desrdenes hereditarios pueden ser tambin causados por un alelo mutante o un solo gen, como es la distrofia muscular de Duchenne, el Retinoblastoma o la Anemia falsiforme, comparados con otros desordenes que son polignicos, es decir ocurre que ms de un gen o alelo se encuentra involucrado. Se necesita aqu de la interaccin de varios genes para causar la enfermedad. Entre ellas tenemos las enfermedades al corazn, diabetes y algunos tipos de cnceres. Volver al inicio
826
b) CARIOTIPO Un primer avance en la bsqueda del origen de las enfermedades genticas, lo constituy la obtencin del Cariotipo. Mediante esta tcnica se puede visualizar a los cromosomas y sus caractersticas presentes en una muestra de sangre extrada a una determinada persona. Luego se procede a sincronizar la divisin celular y posteriormente se observa la disposicin de los cromosomas en metafase. Se determina as el nmero de ellos, la composicin de los cromosomas sexuales y se identifica cualquiera anomala que se presente en cuanto a su forma, ya que les puede faltar o sobrar un segmento, lo cual nos entrega una idea de la cantidad de DNA que portan. El Cariotipo nos permitir tambin determinar cual es el sexo real de una persona, as como los problemas de infertilidad que puedan existir.
TELOMEROS
CENTROMERO
BANDEO DE UN CROMOSOMA
q p
Submetacntrico Metacntrico
Fig. 25 - 16. Tipos de cromosomas que se encuentran en un Kariotipo
Acrocntrico
Los cromosomas pueden ser distinguidos por su tamao y por la posicin del centrmero, que puede llegar a ser Metacntrico (Fig. 25 - 16), cuando se ubica equidistante a ambos extremos del cromosoma. Submetacentricos, cuando el centrmero se encuentra fuera del centro, ya que un par de brazos del cromosoma es mayor que el otro p (brazo corto) y q ( brazo largo) y finalmente Acrocntrico, cuando el centrmero se encuentra en un solo extremo. Otro tipo de identificacin que se puede llevar a cabo sobre los cromosomas lo constituye su bandeo. Este aparece bajo ciertos tratamientos qumicos que dependen de la composicin de las bases y la estructura de la cromatina. As tenemos, que el bandeo C tie Centrmeros, luego el bandeo R es el inverso del C y tie regiones no centromricas como los brazos p y q. A continuacin tenemos el bandeo G, que se obtiene con la tincin de Giemsa, produciendo bandas a lo largo de su estructura y por ltimo el bandeo Q que se obtiene con Quinacrina y produce fluorescencia. Los dos ltimos bandeos G y Q son suficientes para permitir la identificacin de cada cromosoma y proceder a su arreglo por tamao y nmero de bandas para observar el Cariotipo. Volver al inicio
827
c) EL PROYECTO GENOMA HUMANO El Proyecto Genoma Humano (HGP) auspiciado por Europa y Estados Unidos parti en octubre de 1990 y pretendi secuenciar todo el DNA de la especie humana incluyendo los 80.000 a 100.000 genes supuestos genes , que resultaron ser solo 30.000 y que constituyen el patrimonio humano, ms el DNA de relleno en un periodo de 13 aos. Es decir, se reconoci la secuencia de aproximadamente 3 x 109 bases que forman el material gentico humano y se trabaja en la actualidad dilucidando todos los mecanismos de control posibles. Otros desarrollos consistirn en el anlisis de los productos proteicos de los genes y la observacin de cromosomas teidos con sondas fluorescentes en lugares especficos donde se encuentren las posibles anomalas. A la vez se llevaron a cabo estudios paralelos en otros organismos como Drosophylas, Levaduras y E. Coli, para desarrollar la tecnologa e interpretar la funcin de los genes en humanos. Las tareas fundamentales se desarrollaron a travs de varios mtodos independientes de anlisis que garantizaron su validez. A continuacin se ilustran algunos de los mtodos empleados: Volver al inicio d) MAPEO DE LOS GENES Consiste en emplear una tcnica que permita determinar el orden de estos y de otros marcadores (secuencias especficas que no son genes), junto al espacio que ocupan en cada cromosoma y a la vez determinar la distancia que exista entre ellos. As se pudo identificar ciertos genes asociados a determinadas enfermedades y las propiedades biolgicas de las cuales son responsables, constituyendo la columna vertebral del mapeo fsico. De esta manera se pretende mostrar el arreglo de los genes y los marcadores de secuencia del DNA. Estos mapas se construyeron en varias escalas y niveles de resolucin.
PRESENCIA DE AMBOS ALELOS EN EL PADRE Y LA MADRE MARCADORES EN EL PADRE Crossing-over o
X Y
HIJOS
recombinacin
X Y
X Y
Fig. 26 - 16. El material gentico del padre s recombin durante el proceso de espermatognesis. La frecuencia de estos eventos de crossing-over ayudan a determinar la distancia entre los marcadores
Volver al inicio 828
e) MAPEO LIGADO A MARCADORES
El Mapeo ligado a marcadores se encuentra constituido por los mapas de menor resolucin y dependen de regiones expresadas del DNA (genes), como secuencias que no se expresan, pero cuya pauta de herencia (secuencia especfica) puede ser reconocida y seguida (Ver marcadores moleculares en Herramientas) en los descendientes. Los genes se pueden analizar por sus caractersticas fenotpicas, como X e Y en la figura 26 - 16 o bien pueden ser reconocidos por sus caractersticas polimrficas, es decir las formas alternativas de un alelo o bien la presencia de distintos alelos entre los diferentes individuos de una familia, como ocurre con el color de los ojos, el pelo, la estatura. En cambio entre las secuencias que no se expresan y que pueden ser seguidas, encontramos a los polimorfismos representados por secuencias repetitivas en su DNA que pueden variar en tamao y nmero de repeticiones en los distintos individuos. En el mapeo ligado a marcadores se emplean las frecuencias con que se expresan los marcadores o las caractersticas ligadas a los genes que aparecen en los descendientes para asignar las ubicaciones en el cromosoma. Este reconocimiento se lleva a cabo despus de la gametognesis cuando han pasado por la recombinacin o crossing-over. Es as posible construir un mapa observando cuan frecuentemente dos marcadores o genes se heredan juntos o cuan frecuentemente dos marcadores o genes pasan desde los padres hacia los hijos. Mientras ms juntos en el cromosoma, es menos posible que se separen y mientras ms lejos es ms posible que se hereden separados y aparezcan en distintos hermanos y no en uno solo de ellos. De esta forma es posible asignar un par de genes o marcadores a un rea especfica del cromosoma, donde las distancias se miden en trminos de Centimorgans (cM), en honor a un genetista de ese apellido. Dos marcadores se encuentran separados por 1cM cuando aparecen separados por recombinacin, tan solo el 1% de todas las veces (el 99% salen juntos) y esto equivale en un mapa fsico a la distancia de 1 milln de pares de bases entre los dos marcadores. Por otro lado, dentro de los marcadores determinados por la secuencia cuya pauta puede ser seguida se encuentran ciertas secuencias con simetra bicatenaria que constituyen polimorfismos. Esto significa que la misma secuencia se ubica en distintos lugares en diferentes individuos y son reconocidas por ciertas enzimas denominadas Endonucleasas de Restriccin (Ver herramientas). Cada una de estas enzimas es capaz de reconocer una secuencia especfica, pero como esta se ubica en distintas posiciones en los distintos individuos, tanto en el DNA de relleno como en los genes que son de inters. Al ser cortadas generan una poblacin de fragmentos de distinto largo o polimorfismos tpicos de cada individuo. Cada endonucleasa acta produciendo un patrn tpico de cortes para cada individuo. Estos fragmentos se pueden emplear para reconocer sectores especficos del DNA tanto en los mapas fsicos como en aquellos mapas de entrecruzamiento o recombinacin y la tcnica derivada de esta anlisis se denomina RFLP.
Volver al inicio
829
f) EMPLEO DE RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) O POLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIN
En la Fig. 27 - 16 se observa el empleo de la tcnica denominada RFLP. Esta tcnica es utilizada para estudiar aquellos casos donde una enfermedad gentica produce un patrn tpico de fragmentos polimorfos distribuido entre los progenitores y descendientes. Esta observacin se logra mediante el anlisis de los productos de una digestin con una o ms endonucleasas de restriccin, lo que deja un patrn reconocido de cortes que se visualiza por una electroforsis. Los fragmentos obtenidos por digestin enzimtica (endonucleasa de restriccin) se separan por electroforsis en un gel de Agarosa segn tamao y carga. Los fragmentos de DNA migrarn desde el Ctodo (-) hacia el nodo (+) de acuerdo a: a) su carga negativa (Fosfatos), que aumenta con el largo del fragmento b) el dimetro de los poros del gel.. En aquellos individuos considerados como mellizos univitelinos o en aquellos casos en que los distintos genes poseen ambos alelos idnticos, se produce un patrn tpico de homocigotos, es decir la endonucleasa de restriccin cort el DNA entregando fragmentos del mismo tamao y que en el gel se superponen en la misma posicin (Fig. 27 16). Por otro lado, los fragmentos de distinto tamao que aparecen en el gel sern tpicos de los polimorfos o provenientes de genes heterozigotos de cada padre y dan una banda superior y otra inferior (Fig. 27 16). En ambos casos los fragmentos se distinguirn al visualizarlos pasando luz UV por ellos o tiendo con Bromuro de Etidio, colorante que se intercala en el DNA y lo hace visible.
Cmo resultado de la migracin de los segmentos de DNA es posible observar innumerables bandas, sin saber cuales son las que corresponden al gen de la cadena de la hemoglobina. Luego, para identificar al gen en esta poblacin de fragmentos de distinto tamao, se debe usar una sonda o hebra de DNA o RNA con marca radiactiva o inmunolgica o fluorescente a la UV. Esta sonda debe corresponder a una secuencia de bases especfica, complementaria al segmento del gen de la cadena .
Ahora, para que la sonda reconozca y se una a la hebra complementaria correspondiente al gen de la cadena , entre los fragmentos del gel. Se debe proceder a un tratamiento con una solucin salina capaz de separar ambas hebras. Posteriormente se traspasa una de ellas por difusin a un papel de nitrocelulosa. Esta ltima tcnica se denomina Southern Blot (ver herramientas) o tcnica del traspaso.
830
Padre Fragmentos dobles

GENOTIPOS : PADRE
Madre
Descendencia
MADRE
HIJO
HIJA
HIJO
GUAGUA
Homocigoto Homozigoto Heterozigoto Homozigoto Normal Anormal Normal Normal
Gen de la cadena de la Hemoglobina
Er Er
GEN CON DELECION
Er Er
GEN NORMAL
Fig. 27 - 16. Se observa la tcnica de RFLP. Donde se estudia una familia que posee una delacin en el gen de las cadenas de la Hemoglobina.
A continuacin, al disponer de un patrn de fragmentos representados tan solo por una de las hebras del DNA en el papel de nitrocelulosa, es posible agregar la sonda en un medio acuoso de menor salinidad, para observar como esta se aparea a su fragmento complementario, marcndolo para ser posteriormente identificado por medio de fluorescencia, una radioautografa o mediante un procedimiento inmunolgico.
Volver al inicio
831
g) MAPEO DE UN GEN
En la Fig. 28 - 16 se observa un gen que s mapea fsicamente para conocer su posicin mediante el empleo de dos Endonucleasas de Restriccin Eco R1 y Ind. III. La Eco R1 produce dos fragmentos de 4 y 6 Kb, mientras que la Hind III solo uno de 10Kb. La accin de ambas enzimas simultneamente, produce fragmentos de 1, 4 y 5 Kb. Los fragmentos fueron sometidos a la tcnica de Southern Blot y visualizados mediante una sonda para ubicar finalmente al gen entre los dos fragmentos de 1Kb, que no se observan en las
Fig. 28 - 16. Mapeo de un gen mediante dos enzimas de restriccin
Posicin desconocida del GEN

2 4 6 8 10 12 Kb
Visualizacin de los fragmentos por Southern Blot
10Kb
SONDA RADIACTIVA
GEN
6Kb 4Kb
4Kb Eco R1 Eco R1
6Kb Eco R1 10 Kb
GEN
10 Kb Hind III Hind III
6 Kb 4 Kb
Tratamiento con ambas enzimas de restriccin Eco R1 y Hind III
10 Kb
GEN
6Kb 5Kb 4Kb
1Kb 4Kb Hind III Eco R1
5Kb 1Kb Eco R1 Hind III Eco R1
radioutografas, pues la sonda no se une a ellos.
832
De esta forma es posible ubicar el gen en un mapa fsico, al saber por que endonucleasas de restriccin se encuentra flanqueado o bien en que patrn reconocible es fragmentado por estas enzimas. Es tambin posible saber el tamao en Kb de los fragmentos, conociendo la cantidad de DNA que comprende cada uno de ellos por medio de estndares consistentes en distintos pesos moleculares conocidos que no aparecen en la figura anterior. Volver al inicio h) EMPLEO DE VNTRS POR VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS SQUENCE O NMERO VARIABLE DE SECUENCIAS REPETITIVAS Y EL USO DE LOS STS POR SEQUENCE TAGGED SITES O SITIOS MARCADOS POR SECUENCIA. Otra de las metodologas para detectar polimorfismos hace uso del DNA microsatlite que presenta un Nmero Variable de Secuencias Repetitivas o Variable Number Tandem Repeats Sequence (VNTRS). Las secuencias repetitivas se encuentran asociadas o ligadas a algn gen o alelo y al variar en tamao o nmero de repeticiones entre una persona u otra, desplazan los sitos de restriccin produciendo fragmentos de distintos largos o polimorfos, que se pueden separar por electroforsis y visualizar por radioautografa o tincin con Bromuro de Etidio. De esta manera, es posible ordenarlos para generar un mapa de la seccin basado en los genotipos y tamaos de los fragmentos (Fig. 29 -16). Lo que se busca por estas tcnicas es la diferencia entre los sitios de restriccin reconocidos por una misma enzima o mezcla de ellas, para as tener fragmentos donde se relaciona su tamao con el genotipo.
Sitios de restricAlelo a cin fijos:
VNTRs
Alelo b
Sitios de restriccin desplazados por tamao de las VNTRs
Alelo c
GENOTIPOS: 0 aa 3,0 Kb ab
1 bb
2 bc
3 Kb cc ac
2,5 Kb
2,0 Kb
Fig. 29 - 16. Las secuencias VNTR tienen distintos tamaos los que se pueden atribuir a polimorfismos.
833
Una vez que se han caracterizado varios genes en un mismo cromosoma es posible ordenarlos mediante su reconocimiento por medio de marcadores moleculares (ver herramientas). Estos marcadores se pueden generar por diferentes tcnicas como se observar ms adelante. Una de ellas consiste en los STS o Sequence Tagged Sites por Sitios Marcadores caracterizados por la Secuencia. En esta tcnica se emplean dos cebadores de 18 a 20 bases que amplifican por PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa, ver herramientas), una secuencia conocida de DNA. Esta secuencia se emplea como un hito o letrero caminero (el mismo letrero en distintos caminos o secuencias), para saber si los genes caracterizados por las endonucleasas de restriccin se encuentran antes o despus de ellos. Por otro lado algunas de las alteraciones que sufren los genes pueden hacer desaparecer o crear nuevos sitios de restriccin. Estos sitios de corte varan de posicin de un individuo a otro, dando fragmentos de distintos tamaos o bien si son normales se pueden llamar polimorfismos de un mismo gen o alelos a y b como ocurre en la Figura 30 - 16.
Sonda
Alelo a Alelo b Genotipos a a 3Kb 2 1 0 1 a b

SOUTHERN BLOTS
Alelo b con sitio nuevo b b
Fig 30 - 16. Dos alelos de un gen presentan una secuencia distinta en el sitio de corte por la endonucleasa de restriccin, lo que permite estudiar sus genotipos. En los Southern Blots respectivos se observa una doble banda formada por alelos a,a largos de 3Kb y dos cortos b,b de 2 Kb, ms el afectado con un nuevo sitio de restriccin (al medio) a de 3Kb y b de 2Kb. El fragmento de 1 Kb no es visible pus la sonda no se uni a l.
834
Ambos genes de la figura 30 16, tienen una secuencia diferente que les hace capaces de producir distintos genotipos. En el caso normal que este gen codificara para una enzima podra dar origen a Isoenzimas o bien Aloenzimas. Esto significa que su secuencia aminoacdica difiere en uno u otro aminocido, pero cataliza la misma reaccin, lo que se traduce en una adaptacin para ser activa a una temperatura o a un pH diferente de la copia original Como se puede observar, en estas tcnicas se hace uso de las diferencias ms leves que existan en la secuencia de deoxiribonucletidos entre uno u otro individuo, de esta forma
S in D ig e s t i n 8 ,0 K b 4 ,7 3 ,3 1
S a l I
X h o l
S a l I + X h o l
6 ,5 K b 3 ,3 1 3 ,1 9 1 ,5 1 S a l I X h o l
3 ,3 1 K b
3 ,1 9 K b
1 ,5 1 K b
Fig. 31 - 16. Mapeo por restriccin. Se ordena un fragmento de 8Kb por las posiciones relativas en el corte de las enzimas de restriccin Sal I y X ho l.
se pueden detectar los distintos genotipos de que estn constituidos. En general entre los mismos humanos, se asume que puede existir una variabilidad de un 0.3% en la secuencia total de las bases que constituye el DNA de cada persona, comparado con el 1,7% de diferencia entre hombre y Chimpanc Bonomo. En la figura 31 - 16, se observa un ejemplo de cmo ordenar mediante endonucleasas de restriccin (Sal I y Xhol I) y electroforsis un fragmento de DNA de 8Kb. Mediante esta tcnica se separan los fragmentos de distintos tamaos producidos por las enzimas de forma individual y ambas juntas. De similar forma es posible alinear grandes fragmentos de DNA como se observar ms adelante con el fin de mapear un sector de un cromosoma mediante el procedimiento denominado top-down. Volver al inicio
835
i)
MAPAS FSICOS O MAPAS DE ADN.
Se basan en la formacin de clonos que contribuyen a proveer de la distancia fsica real entre marcadores presentes en el cromosoma expresado en kilobases. Los mapas
Clulas donadoras
Radiacin
Clulas donadoras irradiadas
Clulas de ratn
Anlisis Citolgico Anlisis molecular Clulas clonadas

Fig. 32 - 16. Mapeo obtenido por fusin de clulas de ratn con humanas cuyos cromosomas han sido sometidos a Rayos x para cortarlos. Posteriormente se observa en los hbridos la aparicin de los caracteres o marcas. Mientras ms cercanas menos posible de separarse y es ms probable que aparezcan juntos.
Clulas hbridas
Fsicos indicaran en un camino cuantos Kilmetros faltan para llegar a una ciudad o gen, mientras que el mapa gentico sera algo as como lo que dice un lugareo, que la ciudad queda ms adelante o que ya la pas, pero no sabe a cuantos Kilmetros. Los mapas fsicos proveen de las bases para la aislacin y caracterizacin de genes individuales u otras regiones del DNA que presenten inters, as como proveen de material para el mapeo molecular a distintas resoluciones. Volver al inicio j ) MAPA CITOGENTICO De esta manera, el mapa citogentico o mapeo de los cromosomas, que se basa en el bandeo observado sobre los cromosomas teidos (Fig. 25 16) es un mapeo de baja resolucin. Otro de estos mapeos similares, consiste en el anlisis de los hbridos obtenidos por radiacin (Fig. 32 - 16), se analiza aqu la frecuencia con que dos marcadores se separan despus de radiacin por rayos X que rompe ambas hebras del DNA en el cromosoma. Posteriormente las clulas humanas irradiadas se fusionan con otras intactas de ratn y se procede a estudiar los genotipos o fenotipos de los conjuntos de clulas descendientes a partir de un par original humano-ratn fusionado, que portan
836
variados cromosomas. La distancia se mide aqu en CentiRay (cR) que equivale al intervalo en el cual existe un 1% de probabilidad de ruptura inducida por irradiacin. Se pueden emplear marcadores no polimrficos ya que se requiere de tan solo un cromosoma para determinar la frecuencia de aparicin de marcadores ligados entre s, dependiendo de la distancia que los separa despus de la fragmentacin Volver al inicio k) LA HIBRIDACIN IN SITU Entre las tcnicas para confeccionar los mapas se encuentra la hibridacin in situ, que consiste en emplear una sonda de una secuencia no especfica del DNA, constituida por un DNA genmico (cualquier trozo de DNA) o bien una sonda especfica, como el DNAc (DNA complementario sin intrones obtenido del RNAm con Transcriptasa Inversa). Su localizacin se puede detectar al observar la sonda unida a la hebra de DNA complementaria del cromosoma intacto. El DNAc marcado se emplea como una sonda especfica para detectar las regiones expresadas o Exones de un gen donde se aparea. Las sondas de DNAc pueden reconocer las posiciones de los genes que ms interesa identificar y que se pueden ubicar en las cercanas de otro mapa generado por tcnicas de marcadores ligados (linkage map). De esta forma se pueden emplear distintas sondas y se pueden ubicar distintas secuencias marcadoras al mismo tiempo. La sonda se marca con biotina, dioxigenina o dinitrofenol de tal manera que pueda ser reconocida por protenas especficas a estas molculas, como son los anticuerpos o la avidina que se unir a la biotina. En resumen, la sonda despus de hibridizar, acompaada de su grupo especfico, recibe a una protena que se une a la sonda y que tiene una porcin conjugada con una molcula fluorescente, como la fluorescena o la rhodamina, etc., que posteriormente seala el lugar permitiendo su visualizacin.
SONDA
Fig. 33 - 16. En la figura A, una sonda de 1 kbp aparea con un exn de una sola copia de un gen. En la figura B, la sonda es de 40kpb y aparea inespecficamente en varios sitios. En la figura C, La Sonda anterior es acompaada por un exceso de DNA repetitivo.
837
l) FISH POR FLUORESCENCE IN SITU HIBRIDIZATION O HIBRIDACIN IN SITU CON FLUORECENCIA Una de estas tcnicas se denomina FISH (Fluorescence In Situ Hibridization o Hibridacin In Situ con Fluorescencia) (fig. 33 16) y es de baja resolucin por lo que se pueden detectar cromosomas en ncleos en interfase cuyos marcadores o genes se encuentran separados de 2 a 5 Mbp. En los cromosomas en interfase o prometafase, cuando son menos compactos se pueden incluso
Cromosoma Humano
Fragmento de 400Kb clonado en YAC
Fragmento de 40 Kb clonado en cosmido
Subclono proveniente de un YAC: Cromosoma artificial de levadura Cosmido
Eco R1
Eco R1
Eco R1
Eco R1
Eco R1
Eco R1 Eco R1
Bam H1
Bam H1
Bam H1
Bam H1 Bam H1 Bam H1
Bam H1
4 Kb clonadas en un Plsmido
Cada subclono es mapeado por enzimas de restriccin Plasmido
Secuencia nucleotdica parcial del gen de la -Globina Humana
Fig. 34 - 16. Clonacin y subclonacin de un fragmento de DNA el que se amplifica y mapea por endonucleasas de restriccin para disponer de material para su secuencia
ordenar los marcadores para que el mapa morfolgico y molecular sean colineales. An es posible amplificar los fragmentos correspondientes mediante PCR (Ver herramientas) al disponer de los cebadores adecuados y se pueden incluso aislar y caracterizar genes individuales y otras regiones de inters del DNA, a la vez que esta tcnica provee de sustratos para la secuencia del DNA. Por otro lado, aquellos mapas genticos obtenidos por anlisis de la recombinacin (lynkage map) no son lo suficientemente precisos para aislar un gen, por lo tanto se
838
debe recurrir a un nuevo tipo de mapas fsico. Para obtenerlos se debe emplear una serie de clonos que amplifican segmentos de DNA. Es decir, fabricando un YAC (Yeast Artificial Chromosome), CAC (Cosmid Artificial Chromosome) o un LAC (Lambda Artificial Chromosome), como se observa en la Fig. 34 16. Estos vectores se superponen cubriendo todo un sector del cromosoma y dan la idea fsica de la distancia entre los marcadores o genes en el cromosoma. La distancia se expresa aqu en Kb y se pueden ordenar por los cortes provocados por las enzimas de restriccin Eco R1, Bam H1 como ocurre en las figura 35 16. Se empieza con baja
resolucin y posteriormente se refina
Los mapas fsicos son diferentes de los genticos aunque tienden a ser iguales hacia el final cuando se tiene toda la secuencia.
Se emplean endonucleasas de restriccin que no cortan en todos los sitios posibles:
Cromosoma
De los 8 sitios de corte, en un principio solo se corta en 4
Cortes posteriores
Se reconocen los fragmentos por la superposicin de los sitios de corte
Fig. 35 16. Mapa top-down de macrorestriccin basado en la superposicin de macrofragmentos.
Volver al inicio m) MAPEO TOP-DOWN La aproximacin top-down, se lleva a cabo cuando se dispone de un fragmento de gran tamao. Este se asla mediante electroforsis de pulso en dos dimensiones (40Kpb a 10Mpb) o bien es un cromosoma aislado por citometra de flujo (aislado de clulas en divisin donde se separan por diferencia de flujo y cantidad de DNA presente), o mediante clulas hbridas humanoratn (que se propagan hasta dejar en su contenido cromosmico tan solo un cromosoma humano). A continuacin el fragmento se corta con una enzima de restriccin que digiere en menos sitios de los realmente existentes para ella, produciendo fragmentos de gran tamao (Fig. 35 16). Estos fragmentos se pueden ordenar y proceder a cortarlos en fragmentos menores que a su vez tambin se pueden ordenar como se observa en la Figura 36 16.
839
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Fig. 36 -16. clonacin mediante Csmidos, se separan por Electroforsis despus de su digestin con una o ms Endonucleasas de Restriccin. El fragmento A no est relacionado con los otros.
De esta manera se genera un mapa de macrorestriccin y se determina el orden y la distancia entre los sitios de corte por estas enzimas que son capaces de cortar rara vez. As se producen mapas de mayor continuidad que los contig, pero la resolucin es baja y no se pueden encontrar los genes en ellos ya que van de 100Kb a 1 Mb. Volver al inicio n) MAPEO BOTTOM-UP La aproximacin desde abajo hacia arriba (bottom-up) consiste en subdividir en pequeos trozos los fragmentos mayores. Estos forman una biblioteca que se puede Clonar en un vector, generando millones de copias idnticas que posteriormente se pueden alinear por superposicin. La biblioteca debe ser indexada o bien cada volumen o segmento de DNA debe estar ordenado y clasificado, es decir a que coleccin pertenece 840
y en que posicin se debe de encontrar. En la Figura 34 -16, se observan los fragmentos de cinco clonos de csmidos que han sido digeridos. Se procedi a digerir con Hind III, una enzima de restriccin con 6 pb en el sitio de reconocimiento, se marc y luego se digiri con Mbo I, que reconoce solo 4 pb en el sitio de corte. Los fragmentos se separaron posteriormente mediante electroforsis en Acrilamida y aquellos marcados se reconocieron por radioautografa (Fig. 36 - 16). En este caso corresponder a un arreglo multidimensional de los clonos donde se sabe la posicin de cada uno de ellos. De esta manera se puede decir, que los csmidos C, E, D, B se encuentran superpuestos en este sentido, mientras que A no se relacionaba con ellos (Fig. 37- 16).
C E D B
Fig. 37 - 16. Superposicin de fragmentos cortados por las endonucleasas para indicar la continuidad del macrofragmento mayor formado por fragmentos contiguos.
As se visualiza el orden existente en el cromosoma original, aquellos fragmentos que se superponen son contiguos y presentan en el gel de Agarosa igual migracin, o bien las bandas se encuentran a la misma altura unas de otras. Los fragmentos alineados de esta manera, se ordenan ahora en la biblioteca, por clonos contiguos y se denominan Contigs (Fig. 38 - 16). En el caso de que el mapeo, por marcadores ligados (lynkage map) indique que en estos fragmentos alineados reside un gen, se pueden emplear los clonos contiguos de cada uno de ellos para
Frag m entos co ntig uo s
Las superposiciones se detectan por m apa de restriccin, secuencia o hibridizaciones.
Se determina que C lonos son contiguos B ib lio teca de C lo no s

Fig. 38 - 16. Se localizan las posiciones relativas de las secuencias clonadas de la biblioteca. Se determinan los fragmentos y clonos contiguos.
841
Determinar la secuencia de las bases. El mapeo por Contigs genera mapas muy detallados, pero solo de reas pequeas. No se pueden extender a algunas regiones del cromosoma, pues estas no se pueden clonar. En la Figura 39 - 16, se pueden apreciar los distintos mapas desde la menor a la mayor resolucin. Entre ellos tenemos al mapa gentico obtenido por frecuencia de recombinacin de los genes o polimorfismos, seguido por aquel obtenido mediante alineacin de fragmentos de restriccin y el alineamiento por superposicin de una serie de fragmentos representados por clonos contiguos que generan una biblioteca, para llegar finalmente a la secuencia individual de cada fragmento.
M APA GENETICO PO R RECOM BINACIO N 2-5cM M APA FISICO DE M ENO R RESOLUCION O M APEO CROM OSOM ICO 5M b M APA FISICO PO R FRAGM ENTOS DE RESTRICCIO N 1-2M b 1m B
G enopoliom orfism o
2m B
0,5m B 2,5m B
TOP- DOW N M APA FISICO DE BIBLIOTECA ORDENADA DE COSM IDOS CONTIG UOS QUE SE SUPERPONEN BOTTOM- UP M APA FISICO DE M AYO R RESOLUCION SECUENCIA deBASES 1b
Fig. 39 - 16. Tipos de mapas con diferentes resoluciones
842
En general en la figura 39 16, aparece el diseo general a seguir para obtener el Mapa fsico del genoma humano
CROMOSOMA
Mapa gentico por recombinacin de marcadores tipo RFLP y STS separados por 1cM o 1Mb
Mapa fsico de marcadores RFLP y STS, donde se observa el orden y la distancia de alrededor de 100kb entre los marcadores
Clonos superpuestos de 0,5 a 1Mb
AGCTCTAGCGATGCAG
SECUENCIAS DE LOS FRAGMENTOS CLONADOS LAS QUE SE EMPALMARAN POSTERIOORMENTE EN LOS LUGARES DONDE SE SUPERPONGAN
Fig. 40 - 16. Estrategia general para secuenciar el genoma humano.
Volver al inicio
843
GLOSARIO A Alelo: Forma alternativo de un sitio gentico. Se hereda separadamente un alelo por cada padre. Pueden tener informacin como los genes o pueden ser sectores sin informacin como son las secuencias repetitivas de distinto tamao segn cada padre. Amplificacin: Aumento en el nmero de copias de un fragmento especfico de DNA. El procedimiento puede ser in vivo por clonacin de un vector o in vitro por PCR. Autoradiografa: Es una tcnica que emplea pelcula impresionable por rayos X para visualizar molculas marcadas radiactivamente. Se emplea para analizar el largo y nmero de los fragmentos de DNA despus de separados por electroforsis. Autosoma: Es un cromosoma que no esta involucrado en la determinacin del sexo. El genoma humano diploide consiste de 46 cromosomas con 22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales denominados X e Y.
B Bacterifago: Es un virus cuyo husped es una bacteria. Se emplean estos virus como vectores para amplificacin de fragmentos de DNA. Banco de Clonos: Coleccin de clonos consistente en fragmentos superpuestos de DNA que representan el genoma de un organismo. Biblioteca ordenada: Clonos primarios de DNA recombinante en Fagos, Csmidos o YACs, que se colocan en un arreglo en dos dimensiones en placas de microtitulacin. Biotecnologa: Conjunto de tcnicas biolgicas desarrolladas por medio de la educacin bsica y aplicadas a la investigacin y desarrollo de un producto. En especial en la industria del DNA recombinante. C Centimorgan (cM): Unidad de medida de la frecuencia de recombinacin. Un centimorgan es igual a la probabilidad de 1% que un marcador en un sitio gentico est separado de otro marcador en otro sitio debido a la recombinacin en una sola generacin. En humanos 1cM es en promedio equivalente a 1 milln de pares de bases. 844
Centrmero: Regin especializada del cromosoma donde las fibras del huso se unen durante la divisin celular. Clono: Una copia exacta de material biolgico, que puede ser un segmento de DNA que constituya un gen u otra regin, o bien una clula completa o un organismo completo. Clonacin: La obtencin de mltiples copias exactas de un solo gene, un segmento de DNA o un organismo completo. La coleccin de molculas de DNA copiadas o clonadas se denominan bibliotecas de clonos. Otro tipo de clonos lo constituyen las lneas celulares constituidas por clulas descendientes de una sola clula original. Un tercer tipo de clono al inyectar el ncleo de una clula cualquiera organismo superior en un oocito produce un animal completo genticamente idntico al patrimonio gentico del ncleo inyectado como la conocida oveja Dolly. Clonamiento posicional: Es una tcnica destinada a identificar genes responsables de enfermedades en el cromosoma. El gen puede cartografiarse, aislarse y clonarse sin ningn conocimiento del producto gnico. Contig.: Grupo de fragmentos de DNA copiados o clonados que representan fragmentos superpuestos de un cromosoma particular. Csmido: Vector de Clonacin construido artificialmente que contiene el gen cos del fago lambda. Los csmidos pueden ser empaquetados en partculas de Fago Lambda para infectar E. Coli. Se pueden introducir en estos huspedes bacterianos fragmentos de hasta 45kb. Cromosoma: Estructura gentica autoreplicante de la clula que contiene el DNA celular que mantiene en su secuencia nucleotdica el arreglo lineal de los genes. En procariontes la totalidad del genoma es llevado en un solo cromosoma. En eucariontes existen una serie de cromosomas cuyo DNA se encuentra asociado a una serie de protenas. Cromosoma Artificial de Bacteria: Es un vector denominado BAC por Bacterial Artificial Chromosome, que se emplea para clonar fragmentos de 100 a 300 Kb en clulas de E. Coli. Su componente principal es el plsmido F que se encuentra en esta bacteria. D Delecin: Es cuando falta una o ms bases en una de las hebras del DNA. Desorden de un solo gen: Desorden hereditario causado por un alelo mutante de un solo gen. 845
Diploide: Contenido total de material gentico consistente de cromosomas apareados, un cromosoma por cada padre. DNAc o DNA Complementario: DNA que se sintetiza empleando RNA mensajero como hebra patrn mediante una Transcriptasa Inversa. La hebra de DNAc se emplea como una sonda durante el mapeo fsico de los cromosomas. Dominio: Porcin discreta de una protena con su propia funcin. E E. Coli: Bacteria comn que se ha estudiado intensivamente debido a su pequeo genoma, tamao, carencia de patogenicidad y facilidad de crecimiento en condiciones de laboratorio. Electroforsis: Mtodo de separacin de molculas como fragmentos de DNA y Protenas desde una mezcla de molculas similares. Se somete la mezcla a un campo elctrico sobre una matriz porosa producindose la separacin al chocar las molculas con los poros de la matriz de distinto tamao. La migracin se debe a la carga y los choques al tamao de las molculas para atravesar los poros. Agarosa y Acrilamida son los polmeros que se emplean para cidos nucleicos y protenas. Enzima de Restriccin o Endonucleasa: Es una enzima que reconoce secuencias cortas con simetra bicatenaria y las corta. Son originarias de un mecanismo de defensa bacteriano contra el DNA inyectado por los bacterifagos. EST: Expressed Sequence Tag por Etiqueta de Secuencia Expresada o Marcacin de Secuencia Expresada. Se usan estas secuencias especficas que marcan el DNA como puntos de referencia, para comparar fragmentos de distintas personas y ubicar los genes antes o despus de estas secuencias marcadoras. Eucarionte: Clula u organismo cuyo ncleo es una entidad discreta y que consta de una membrana, adems, poseen formas subcelulares incluidas en el ncleo. Constituyen todos los organismos excepto partculas virales, bacterias y algas azul-verdosas. Exn: Secuencia del DNA que codifica para protena. Exonucleasa: Una enzima que rompe nucletidos secuencialmente desde un extremo de un fragmento lineal de DNA.
846
Expresin Gentica: Es el proceso por el cual la informacin del gen se convierte en estructuras Funcionales de la clula. La expresin de un gen consiste en la transcripcin y la traduccin en protena o tan solo la transcripcin en RNA. F FISH por Fluorescence In Situ Hibridization: Aproximacin a un mapa fsico que usa una marca de fluorescena unida a una sonda que hibridiza con cromosomas en metafase y con la cromatina menos condensada de la interfase. G Gameto: Clula reproductiva madura de macho o hembra conocida como esperma o huevo con un nmero haploide de cromosomas. Gen: La unidad fsica y funcional de la herencia. Es una secuencia ordenada de nucletidos localizado en una posicin particular de un cromosoma particular que codifica para un producto funcional como lo es el RNA o las protenas. Gentica: Estudio del patrn como se heredan las caractersticas especficas de un individuo u espcimen. Genoma: Todo el material gentico en los cromosomas de un organismo en particular. Su tamao se encuentra representado por el nmero de bases.
H Heterozigoto: La presencia de alelos diferentes en uno o ms lugares de los cromosomas homlogos. Homebox: Se traduce textualmente como boletera o lugar caracterizado por una secuencia corta de nucletidos cuya secuencia de bases es virtualmente idntica en todos los genes que la contienen. Se encuentra desde la mosca de la fruta hasta humanos. Se encuentra relacionada con la expresin de un grupo particular de genes durante el desarrollo. Homologa: Igualdad entre secuencias de DNA o protena entre individuos de una misma especie y entre especies.
847
Hibridizacin: Es el proceso de juntar dos hebras complementarias de DNA o una de DNA y otra de RNA para formar una molcula de doble hebra. I Informtica: Es el estudio de la aplicacin de tcnicas computacionales y estadstica para el manejo de la informacin. dentro del proyecto Genoma Humano se deben buscar los datos de las distintas secuencias y compararlos para encontrar la continuidad y ala vez predecir la estructura y funcin de la informacin almacenada en los genes y traducida a protenas.
Interfase: Periodo durante el ciclo celular cuando el DNA es replicado en el ncleo y es seguido por la mitosis. Intrn: Es la secuencia de DNA que se encuentra entre los exones de un gen y que no codifica para protena. Solo separa los dominios de una protena en el gen. In vitro: Significa fuera de un organismo vivo.
K Kariotipo: Fotomicrografa de los cromosomas individuales arreglados de acuerdo a un formato estndar mostrando su nmero, tamao y forma de cada tipo de cromosoma. Se emplea en mapeo fsico de baja resolucin para correlacionar anormalidades groseras (trisomia 21) con enfermedades caractersticas. Kilobase(kb): Unidad de largo de un fragmento de DNA y corresponde a mil bases. L Loci: (Plural de locus o varios locus) Posicin en un cromosoma donde se encuentran varios genes. Locus: Posicin de un gen u otro marcador en un cromosoma. Lleva implcito el entendimiento de que es una secuencia que se expresa.
M Mapa de Exclusin: Indica en que cromosomas o regiones no se encuentra un determinado gen. 848
Mapa de Macrorestriccin: Es un mapa que indica el orden y distancia a la cual las enzimas de restriccin cortan los fragmentos de DNA o los cromosomas. Mapeo:
Ubicacin de los genes u otras secuencias que forman hitos o son marcadoras y se encuentran en el genoma humano u de otro organismo
Mapeo fsico: Es un mapa de lugares que pueden ser identificados por sus caractersticas locales como lo son sitios de corte por enzimas de restriccin, secuencias repetidas en tandem, genes, etc. Su distancia se mide en pares de bases. En humanos el mapa de ms baja resolucin es l bandeo de los cromosomas y el de ms alta es la secuencia de bases de cada cromosoma. Mapeo por ligamiento o unin: Es un mapa que indica las posiciones relativas de los lugares o regiones donde se encuentran los genes (loci). Se determina la posicin observando cun a menudo se heredan juntas las caractersticas otorgadas por el loci (varios genes). La distancia se mide en centimorgans (cM). En algunos casos se emplea RFLP para producir mapas por ligamiento. Se estudian la disposicin de un gen o el patrn de cortes por enzimas de restriccin en una familia multigeneracional y se observa si se encuentra asociado a alguna enfermedad. En este caso se estudia la segregacin de un patrn de cortes determinado y una enfermedad en tres o ms generaciones de una familia. Por lo tanto un cierto patrn de cortes corresponder a la herencia de una caracterstica o enfermedad. Existe ligamiento si el patrn determinado y la enfermedad se encuentran en el mismo cromosoma y en el caso contrario significa que el cromosoma no contiene el locus de la enfermedad.
Mapeo por delecin: Descripcin de un cromosoma empleando sitios especficos donde han ocurrido mutaciones por delecin empleados como marcadores de reas especficas.
Mapeo por restriccin: Mapa que indica el orden y la distancia entre las secuencias que sirven de sustratos de las enzimas de restriccin en el cromosoma o un fragmento de DNA. Marcador: Lugar fsico identificable en un cromosoma que puede ser el sitio de corte de una enzima de restriccin o un gene cuyo patrn de herencia pueda ser monitoreado. Los marcadores pueden ser regiones expresadas de los genes o secuencias que no codifiquen, pero cuyo patrn de herencia pueda ser reconocido y seguido. Megabase (Mb): Significa un milln de bases y es equivalente a 1 cM.
849
Meiosis: Dos divisiones celulares consecutivas en clulas diploides destinadas a formar gametos, pero solo una replicacin de DNA dando origen a cuatro clulas haploides. Minisatlite: Son secuencias de DNA repetidas de 2(AG AG) a 100 (AGAGAGAGAGAG.........AG100) nucletidos de longitud que se pueden encontrar entre dos sitios de restriccin. Mutacin: Cualquier cambio heredable en la secuencia del DNA.
N Ncleo: Organelo celular en Eucariontes que contiene el material gentico.
O Oncogene: Un gen que se encuentra asociado con el cncer. Los Proto-oncogenes se encuentran regulando el crecimiento y la diferenciacin celular durante el desarrollo y posteriormente permanecen silenciosos durante la vida del organismo. Sin embargo, pueden mutar a los denominados oncogenes y estimular el crecimiento sin control.
P P1-Cromosoma Artificial Derivado ( PAC): Un vector para clonar fragmentos de DNA de 100 a 300kb con un promedio de 150 kb en E. Coli. Se basa en el bacterifago con genoma P1. PCR o Reaccin en Cadena de la Polimerasa: Tcnica para amplificar fragmentos de DNA que emplea dos cebadores de al menos 20 pares de bases con una secuencia conocida. Estos aparean con el fragmento y sirven para iniciar la replicacin que emplea la enzima resistente al calor Taq 1 DNA polimerasa, ya que se emplean ciclos sucesivos cambios de temperatura para abrir y cerrar la doble hebra apareando con los cebadores para as amplificar el fragmento en presencia de los nucletidos y su enzima.
Plsmido: DNA circular extracromosmico que se replica autnomamente en la bacteria. No es esencial para la sobrevivencia de la clula bajo condiciones no selectivas y son capaces de integrar fragmentos de DNA forneo. Se emplean como vectores de clonacin.
850
Polimorfismo: Diferencia en la secuencia de DNA entre individuos. Las variaciones genticas que suceden en ms del 1% de la poblacin se consideran tiles para el anlisis gentico por ligacin. Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restriccin (RFLP): Se emplean para distinguir copias normales de copias mutantes y tambin se emplean como marcadores genticos ya que se hereda un determinado patrn de cortes. La variacin entre los individuos ocurre en el tamao de los fragmentos producidos por las enzimas de restriccin. El tamao polimrfico de los fragmentos se emplea en el mapeo fsico y de ligacin gentica. Existe una base cambiada cada 200 nucletidos en el DNA de uno a otro individuo normal y estas variaciones crean o destruyen sitios de corte para las endonucleasas de restriccin. Distintas personas tendrn distintos patrones de corte aunque sean normales. De esta manera el patrn de cortes puede seguirse en distintas generaciones para identificar un gen o una regin intergnica, as como regiones reguladoras adyacentes e intrones. Procarionte: Clula u organismo que no posee una membrana que rodee su material gentico. En general son las bacterias. Promotor: Un sitio en el DNA donde se une la RNA polimerasa para iniciar la transcripcin.
Proyecto Genoma: Es la investigacin y desarrollo de nuevas tcnicas para el mapeo y secuenciacin de todo el genoma humano.
R Recombinacin: Proceso mediante el cual la progenie cuenta con una combinacin distinta de genes que los otorgados por sus padres. Esto ocurre por crossing-over o entrecruzamiento de cromtidas hermanas. Durante la meiosis se rompe el cromosoma de la madre y el padre para intercambiarse. Este proceso puede resultar en un intercambio de alelos entre ambos cromosomas.
S Secuenciar: Determinacin del orden de los nucletidos o la secuencia de bases en una molcula de DNA o RNA o bien el orden de los aminocidos en una protena.
851
Secuencia Complementaria: Es la secuencia de cidos nucleicos de una hebra cuyas bases puede aparear con la otra hebra para formar una doble hebra. Secuencia Conservada: Secuencia de bases o aminocidos que no ha cambiado a pesar del proceso evolutivo. Secuencia Genmica: Orden de las bases de un fragmento particular de DNA
Secuencias Repetidas en Tandem (TRS): Copias mltiples de las mismas secuencias de bases en un cromosoma. Se emplean como marcadores de mapeo fsico Secuencias Repetidas en Tandem de Nmero Variable (VNTR): Grupos de secuencias ampliamente repetidas de 14 a 100 nucletidos que constituyen polimorfismos entre los humanos. Tienen distintos tamaos entre una y otra persona, es decir, producen alelos y a la vez sirven de marcadores genticos por encontrarse en algunos casos en las cercanas de algn gen o en un locus dado. Producen un determinado patrn de bandas al ser cortadas con endonucleasas de restriccin cuando los sitios de corte se encuentran flanquendolas. Las bandas se visualizan despus de una separacin electrofortica en un gel, como la huella molecular del DNA o Fingerprinting, ya que es especfico para cada individuo, sin importar de qu tejido venga.
Sitio marcado por su secuencia o Sitio de etiquetaje de la secuencia (STS): Secuencia especfica nica ubicada en los cromosomas y que sirve de hito o marcador de la posicin de los genes al comparar los mapas fsicos de las secuencias de distintas personas. Se pueden localizar en genes ya secuenciados y emplearlos de marcadores por hibridacin in situ, para que se empleen como sitios de referencias. Otros marcadores STS son las Etiquetas de secuencias expresadas (EST) obtenidos de clonos de DNAc pertenecientes a genes que se expresan demasiado en un tejido (como ejemplo la cadena de la hemoglobina en eritroblastos). Tambin se pueden localizar por hibridacin in situ.
Otro marcadores STS son los segmentos P transponibles de las cepas salvajes en Drosfilas que al ser transpuestas a las cepas de laboratorio crean sitios de secuencia especfica donde se han insertado
Sitio de Corte por enzima de Restriccin: Sitio especfico donde acta la enzima de restriccin. Cada persona posee estos sitios, pero se encuentran ubicados en distintas partes del DNA.
852
Sitios de corte infrecuentes: Algunas enzimas de restriccin cortan los sitios cada 100 pares de bases y otras las poco frecuentes cada 10.000 pares de bases.
Sonda: Hebra de DNA o RNA marcadas inmunolgica o radiactivamente que se emplean para detectar secuencias complementarias por hibridacin. Southern Blotting: Transferencia por absorcin a papel de nitrocelulosa de los fragmentos de DNA separados por electroforsis para deteccin de la secuencia especfica por medio de sondas radiomarcadas.
T Telmero: Extremo final del cromosoma. Se encuentra involucrado en la replicacin y estabilidad de las molculas de DNA lineales. Transformacin : Proceso por el cual el material gentico que lleva una clula se altera por incorporacin del DNA exgeno.
V Vector: Molcula de DNA que se origina de un virus, plsmido u algn otro organismo superior en el cual otro fragmento de DNA de tamao apropiado puede ser integrado sin prdida de la capacidad de autoreplicacin del vector. Los vectores sirven para introducir DNA forneo en clulas anfitrionas donde se pueden reproducir o amplificar en grandes cantidades. Como ejemplos tenemos a plsmidos, csmidos y cromosomas artificiales de levaduras. Los vectores son molculas recombinantes que contienen secuencias de distintos orgenes. Vector de Clonacin: Molcula de DNA que se origina de un virus, bacteria o clula de un organismo superior (levadura) dentro de la cual un fragmento de DNA de un determinado tamao puede ser integrado sin prdida de la capacidad de auto replicacin del vector. Los vectores introducen DNA ajeno a las clulas huspedes donde puede ser reproducido en grandes cantidades. Ejemplo son los plsmidos, csmidos y los cromosomas artificiales de levadura (YAC).
853
Y YAC. o Cromosoma Artificial de Levadura: Es un vector que se emplea para clonar fragmentos de DNA de hasta 400kb. Se construye de la s secuencias telomricas, centromricas y de las necesarias para dar origen a la replicacin en levaduras.
Volver al inicio
854
REFERENCIAS
Human Biology Web Site http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/humbiol.html DNA Forensic Crime http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/humbiol.html Fingerprinting via Southern Blotting http://www.people.virginia.edu/~rjh9u/humbiol.html
855

Bioquimica Rocha. 2da Edic.

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Bioquimica Rocha. 2da Edic.

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

II

INFORMACION SOBRE EL AUTOR

Hctor Rocha Lohs, Ph.D. Bioqumico

Aprendizaje Basado en Problemas

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

c) Adaptacin de las bicapas de fosfolpidos a las bajas temperaturas 25

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

a) Causas de Acidosis b) Causas de Alcalosis

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Fig. 1-1. Orbitales atmicos y moleculares del Oxgeno.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

.O-O. Triplete O2 basal

+ Electrn H : O. Superhidroxilo + Electrn H:O:H Agua

Fig. 2-1. Reduccin monovalente de electrn por electrn.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Fig. 3 - 1. ngulos de los Tetraedros del Agua y Metano.

Componentes y resultantes de los momentos dipolares

Fig. 4 - 1. La densidad electrnica es mayor sobre el tomo de Oxgeno.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

METANO CH4 N + H 109,5 AGUA H2O H H + + 107,3 H AMONIO NH3

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Fig. 6 - 1. Interaccin de una molcula de agua con otras 4.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Tabla 1 Dador de Hidrgeno Aceptor de Hidrgeno

2) CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS DEL AGUA.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Estructura Tridimensional del Hielo

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Fig. 8 - 1. Curva Densidad versus Temperatura.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

evaporacin Lquido condensacin A Lquido fusin congelacin Hielo Vapor sublimacin

B Temperatura ( C ) 80 100 120

Fig. 9 1. Grfico presin versus temperatura del agua.

d) EL AGUA COMO UN BUEN SOLVENTE.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Parte polar del Acido Graso _ _

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Entalpa de formacin Kcal / mol

Radio Van der W aals

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Fig. 14 - 1. Ionizacin del agua.

Fig. 13 - 1. Fosfolpidos en contacto con el agua se agrupan en bicapas, micelas y liposomas.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Fig. 15 1. Efecto de transferencia de carga en el agua.

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

1/2 1/1 1/3

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Distribucin al azar en el agua fluida

Distintas fracciones que forman el agua fluida

20C DISMINUCIN DE LA TEMPERATURA

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Adaptaciones moleculares de los fosfolpidos

Se gana rigidez por la unin de las colas de los cidos grasos

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Hctor Rocha L. Agua y sus propiedades

Protenas que . impiden la propagacin del cristal de hielo

L E C : Lquido extracelular LIC

Volver al inicio d) COMPATIBILIDAD DEL AGUA CON LA VIDA A ALTAS TEMPERATURAS.