Práctica Guia

Facultad de Ciencias Biolgicas. Laboratorio de Fisiologa Vegetal Mery L. Suni, Blga. Blgo.M.Sc., Rafael La Rosa, Blgo.Mag.
Universidad Nacional Mayor de San Marcos

(Universidad del Per, Decana de Amrica) FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO ACADMICO DE BOTNICA Laboratorio de Fisiologa Vegetal
GUA DE PRCTICAS DEL CURSO FISIOLOGIA VEGETAL
AUTOR: Mery L. Suni Ninataype, Blga. Mg. Rafael La Rosa Loli, Blgo. Mg.
SEMESTRE 2013-I
CONTENIDO
PRCTICA Prctica 1. Prctica 2. Prctica 3.
TEMA Absorcin de microelementos Potencial hdrico foliar Densidad de estomas y estado hdrico foliar Medicin de la tasa de fotosntesis (Uso del IRGA) Evaluacin en campo
PG.
Prctica 4. Prctica 5.
Contenido de clorofila en la hoja Evaluacin de la maduracin de los rganos reproductivos
Prctica 6.
Prctica 7. Prctica 8. Prctica 9.
Interaccin de ABA y AG3 en la germinacin de semillas. Instalacin Embriognesis somtica en zanahoria. Instalacin Induccin de races Calidad de la luz y la regulacin de la germinacin. Instalacin
Prctica 10.
PRCTICA 1. INTRODUCCIN.-
ABSORCIN DE MICROELEMENTOS
El desarrollo y el crecimiento ptimo de la planta dependen de la presencia en la cantidad necesaria de los elementos minerales esenciales. Por lo tanto el aporte insuficiente o en exceso de un elemento dar lugar a sntomas muchas veces apreciable a simple vista. Por otra parte, se conoce que Limnobium laevigatum, planta acutica perenne con hojas simples, cuando es mantenida en condiciones adecuadas, posee una rpida multiplicacin incrementando su biomasa en pocos das. Estas caractersticas adems de su fcil manejo hacen de Limnobium laevigatum un material ideal para la evaluacin de sntomas de deficiencia y toxicidad. Adems dado que es posible encontrar ambientes con contenido de minerales alto pudiendo las plantas de dichos lugares mostrar sensibilidad o tolerancia en la presente prctica se desea evaluar la respuesta de Limnobium laevigatum a condiciones de niveles altos de cobre. OBJETIVO.Evaluar el efecto de niveles altos de cobre en el crecimiento de Limnobium laevigatum MATERIAL.Soluciones hidropnicas 1 balde de 4L para las soluciones conteniendo 0,1 y 10 ppm de sulfato de Cu 6 recipientes de plstico de 500 mL Balanza, pHmetro y conductmetro Pipeta 10 mL Probeta 1000 mL Buffer de calibracin para pHmetro de 7 y 10 Placas petri Plantas de Limnobium laevigatum por cada recipiente plstico Kit para la cuantificacin de cobre 4 bateras SP357/1.55 V para pHmetro y conductmetro Papel toalla
MTODO.En el presente experimento se evaluar un factor, la concentracin de cobre y se tendr 2 tratamientos, uno con nivel alto y otro con nivel ptimo de cobre, ambos con niveles ptimos de los dems elementos. Tendrn 3 repeticiones cada tratamiento (Tabla 2.1). 1. Preparacin de las Soluciones: Preparar un volumen suficiente de las soluciones a fin de tener 3 repeticiones de cada tratamiento, diluyendo las soluciones como se le indique. Se usar el agua de cao como disolvente. Aadir sulfato de cobre al tratamiento correspondiente en cantidad q brinde los ppm de Cu a evaluar. 2. Instalacin del experimento: Vaciar 0.8 L de solucin a cada reciente plstico, segn tratamiento de Cu. Rotularlos indicando tratamiento, repeticin y fecha de instalacin. Aadir una cantidad (tres individuos de Limnobium laevigatum) a cada recipiente, registrar sus pesos 3. Mantenimiento: Tanto al inicio como al trmino del experimento retirar un volumen apropiado de la solucin y determinar la cantidad de cobre presente en cada tratamiento. Igualmente evaluar el pH y conductividad elctrica (c.e.) al inicio y trmino del experimento. Realizar los ajustes de pH en caso necesario. Mantener el pH en 6,5 o menos y la c.e. en valores menores de 3. Registre sus datos en una ficha. 4. Evaluacin: Registre los pesos de la muestra de Limnobium laevigatum al inicio y trmino del experimento en la Ficha de registro. Evale el color, nmero de hojas, senescencia de las hojitas y longitud de sus races RESULTADO.1. Presente la Ficha de registro de datos y una Tabla con los promedios de los datos, organizados. 2. Analizar estadsticamente sus resultados y graficar los promedios mediante barras o lneas donde se pueda observar las diferencias estadsticas entre los tratamientos.
TABLA 2.1. Tratamientos a aplicar y valores de concentracin de Cu presentes en las soluciones tratamiento segn el kit Tratamiento Calculado (ppm) Cobre alto Cobre ptimo 10,0 0,1 Cu (ppm) Concent. inicial (kit) Concent. final (kit)
FICHA DE REGISTRO DE DATOS. Evale al inicio y trmino de su

experimento las variables abajo indicadas. Registre sus datos. 0,1 ppm Cu Tiempo To
N frondas verdes, senescentes o clorticas N frondas verdes, senescentes o clorticas
3,5 ppm Cu
Repeticin 1 2 3 Promedio
Long raz
Pf
Long raz
Pf
Tiempo T1 1 2 3 Promedio
PRCTICA 2.
DETERMINACIN DEL POTENCIAL HDRICO FOLIAR
INTRODUCCIN.Las plantas desempean un papel importante en el movimiento del agua en la naturaleza y son el eslabn intermedio en el flujo del agua desde el suelo a la atmsfera. El cuerpo de las plantas est constituido, al menos, por un 70% de agua. Para que un vegetal est fisiolgicamente activo precisa, entre otras condiciones, de un balance hdrico favorable. La tendencia del agua a ser retenida por un vegetal es la propiedad ms importante para conocer los movimientos del agua en el sistema suelo-planta/atmsfera. El agua siempre se mover, de manera pasiva hacia los lugares del sistema, en donde el potencial hdrico () sea ms bajo, y sus unidades son el megapascal (Mpa), el bar o la atmsfera. Por otro lado, el estado hdrico de la planta influye fuertemente en su crecimiento y en la produccin de biomasa. Inclusive la tasa de fotosntesis declinar bajo estrs hdrico debido al cierre de los estomas. OBJETIVO.Determinar el potencial hdrico foliar en plantas sometidas a condiciones de dficit hdrico. MATERIALES. Tubos con tapa
Sacabocados 48 Placas petri 10 Frascos Erlenmeyer Soluciones de sacarosa 0.8m 10 Pipetas 10 mL Balanza analtica y estufa rea de cultivo
Por cada grupo de trabajo: Ramas de una especie vegetal con diferente condicin hdrica (sometidas a dficit hdrico y otras con riego). Este material ser colectado con el (la) profesor(a) Pinzas de punta fina 1L agua destilada a entregar un da anterior a la prctica Papel absorbente (toalla de papel) Etiquetas pequeas o marcador de tinta indeleble MTODO.Determinacin del Potencial Hdrico Foliar por el Mtodo Gravimtrico El potencial hdrico de un tejido vegetal mediante el mtodo del volumen constante o mtodo gravimtrico, se fundamenta en la variacin del peso de un tejido vegetal debido al flujo de agua. a) Rotular y preparar en 5 frascos Erlenmeyer, soluciones de sacarosa con las siguientes concentraciones de 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 y 0.8 molal a partir de la solucin 0.8m. Determinar el volumen a preparar considerando el nmero de repeticiones y grupos de trabajo ms un pequeo excedente. b) Con la ayuda de una pipeta retirar 10 ml de sacarosa, de cada concentracin, y verterlo a cada placa petri previamente rotulada. c) Luego con la ayuda de un sacabocado obtener 25 discos foliares por cada condicin hdrica, y los ponemos en un frasco con tapa, con la finalidad de evitar la deshidratacin de los mismos. d) Pesar 5 discos de cada condicin hdrica para cada concentracin de solucin de sacarosa. Estos valores corresponden al peso inicial de muestra (Po). e) Introducir los cinco discos, de cada condicin hdrica, a cada placa petri con la concentracin de sacarosa correspondiente. f) Trascurridos 15 minutos, de cada placa petri sacar con una pinza los discos, secarlos con papel toalla y pesar los discos (P15).
g) En seguida devolver los discos a las placas petri. Repetir este proceso con cada uno de las placas con las concentraciones restantes, siguiendo el mismo orden. h) A los 45 minutos repetir este proceso, anotando los pesos y estos sern (P45). Dado que las soluciones estn a presin atmosfrica el potencial de presin (p) =0. Por lo que el potencial hdrico () de la solucin depende del potencial osmtico (s). El potencial osmtico se calcula a partir de la ecuacin de Van Hoff. s=miRT m= i= R= T= molalidad constante de ionizacin del soluto (para sacarosa=1) constante de los gases (0.00831 kg Mpa/`oK mol); temperatura absoluta (oK)= oC+ 273
RESULTADO.1. Registre sus datos en una tabla y determine en qu concentracin de sacarosa no ocurre cambio de peso del tejido foliar (h). 2. Grafique el porcentaje de cambio de peso inducido por el potencial de soluto de las soluciones de sacarosa versus su potencial osmtico. 3. Determine el contenido de hdrico de las hojas segn la condicin de estrs y explique.
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Ficha de registro de datos. Determinacin del potencial hdrico foliar

Sacarosa (m) Repeti cin 1 2 3 4 5 Prom. 1 2 3 4 5 Prom. 1 2 3 4 5 Prom. 1 2 3 4 5 Prom. 1 2 3 4 5 Prom. s (Mpa) P0 (g) c/Est s/Est P15 (g) c/Est s/Est P45(g) c/Est s/Est (P45 - P0) c/Est s/Est % Cambio c/Est s/Est
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
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DENSIDAD DE ESTOMAS Y ESTADO HDRICO FOLIAR
La epidermis posee estomas usualmente ms numerosos en el lado abaxial de la hoja. La epidermis est usualmente cubierta por una capa denominada cutcula. Esta previene de una excesiva prdida de agua por transpiracin. En otras plantas, sin embargo, las hojas pueden estar reducidas o aun estar ausente, como en las xerofitas. Las plantas en s regulan el intercambio de gases a travs de sus estomas permitiendo el control de las relaciones hdricas y la asimilacin del carbono. Por lo tanto la apertura del estoma refleja un compromiso entre el requerimiento fotosinttico de CO 2 y la disponibilidad de agua. La cantidad de agua en el vegetal puede ser expresado de diversas maneras. Todas consideran la medida del peso fresco al momento del muestreo (Pf), el peso seco (Ps, usualmente a 80C) y el peso trgido (Pt) de la muestra. Esta ltima medicin se obtiene al flotar hojas o secciones de hojas en agua en condiciones de punto de compensacin de la luz hasta que se alcance el peso constante.
OBJETIVO.Comparar la densidad, apertura de los estomas (en el haz y envs) y estado hdrico de las hojas de una especie vegetal, sometida a dos condiciones de humedad del suelo.
MATERIAL.Ramas foliares de especies sometidas a estrs hdrico y otra a riego normal. Portaobjetos y cubreobjetos Goteros, pinza, estilete Hoja de afeitar y papel lente, esmalte de uas Tubos con tapa Sacabocados 18 Placas Petri
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06 Pipetas 10 mL Balanza analtica Etiquetas para rotulacin rea de incubacin
MTODO.1.
Densidad y apertura de los estomas Sin mover a la hoja de su posicin original, aplicar con la ayuda del pincel, una o dos capas de esmalte en la superficie superior e inferior de una hoja madura. Permitir que seque. Luego con la ayuda de una pinza de punta fina, levantar desde un extremo la pelcula que se ha formado y preparar una lmina para su observacin con el microscopio. Reconozca las clulas epidrmicas y las de guardia. A 400X contabilice el nmero de estomas que observa y exprselo como densidad de estomas (nestomas/mm2) o ndice estomtico [(nestomas/nclulas epidrmicas + nestomas) * 100]. Asimismo contabilice el nmero de estomas abiertos y cerrados presentes en la muestra observada.
2.
Contenido relativo de agua Obtener 5 discos de las hojas de cada condicin hdrica con la ayuda del sacabocados y colocarlos en los tubos con tapa. Pesarlos inmediatamente (Pf). Colocar los discos en las placas con agua destilada a 20C por 3 horas en su punto de compensacin de la luz. Cumplido el tiempo secar cuidadosamente entre hojas de papel absorbente y volver a pesar (Pt). Secar las muestras en la estufa a 70C hasta peso constante (Ps). Determine el contenido de agua, contenido relativo de agua, dficit de saturacin de agua, relacin peso trgido-peso seco para los discos segn el tratamiento, en base a las siguientes frmulas:
Contenido de agua Contenido relativo de agua (R*)
= ((Pf Ps)/Ps) *100 = ((Pf Ps)/ (Pt Ps)) * 100
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Dficit de saturacin de agua Relacin peso trgido- peso seco
= 100 R* = Pt/Ps
RESULTADO.Esquematice sus observaciones (o edite sus fotografas) indicando el aumento de la imagen y las caractersticas de las estructuras observadas. Relacione los resultados obtenidos con la especie y el momento de colecta.
Ficha de registro de datos.- Determinacin del estado hdrico foliar (una repeticin por cada subgrupo de trabajo) Repeticin Pf Ps Pt c/Est 1 2 3 s/Est 1 2 3 Df sat Pt/Ps Apert estoma
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MEDICIN DE LA TASA DE FOTOSNTESIS
El crecimiento de un vegetal es explicado en ltima instancia por la Tasa Fotosinttica (o Fotosntesis Neta) que se expresa como la cantidad de CO 2 que fija la planta por unidad de rea foliar y de tiempo, y se define como la cantidad neta de carbono (descontando la respiracin) que se incorpora al vegetal en un momento dado, esto es: Fotosntesis neta = fotosntesis - respiracin - fotorrespiracin El dixido de carbono atmosfrico difunde a los espacios intercelulares de la hoja a travs de los estomas, mientras estos estn abiertos, igualmente el vapor de agua puede difundir fcilmente de los tejidos vegetales internos que se encuentran turgentes hacia el exterior (transpiracin). El Analizador de Gases Infrarrojo (IRGA) permite la medicin de ambos. Se basa en la propiedad de ambos gases de absorber luz infrarroja de manera proporcional a su concentracin. Debido a que ambos gases presentan picos de absorcin en el espectro infrarrojo en zonas prximas o solapadas, el equipo incorpora filtros especficos al evaluar las concentraciones de cada uno. La cuantificacin considera un gas de referencia de concentracin conocida. Los componentes bsicos del IRGA son: la cmara foliar y una consola con teclado, pantalla y memoria (figura 1). Los "sistemas abiertos" modernos de fotosntesis tambin incorporan un cilindro de gas comprimido pequeo y tuberas de suministro de gas. Esto es porque el aire exterior tiene fluctuaciones naturales en el contenido de CO 2 y vapor de agua, lo que puede introducir ruido de medicin. Los modernos "sistemas abiertos" de fotosntesis eliminan el CO2 y el vapor de agua por el paso a travs de cal sodada (soda lime) y Silica Gel o Drierite, luego aade CO 2 a una velocidad controlada para obtener una concentracin estable de CO 2, de tal manera que cuantifica la diferencia de concentraciones en CO2 y vapor de agua en el aire entre la entrada y salida de la cmara. Algunos sistemas cuentan con control de temperatura y una unidad extrable de luz, por lo que tambin se puede medir el efecto de estas variables ambientales. La consola puede tener una ranura para tarjetas PC. Los datos
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almacenados pueden verse en la pantalla LCD, o enviados a un PC. Algunos sistemas de fotosntesis permiten la comunicacin por internet usando protocolos estndar de comunicacin de internet. El IRGA contiene en la cmara foliar (figura 2) una fuente de radiacin infrarroja de bajo voltaje que usualmente es una espiral de aleacin nquel-cromo o tungsteno que se calienta a aproximadamente a 800 C; (2) una celda de anlisis de gas con una entrada y una salida de gases a travs de la cual pasa el haz de radiacin infrarroja, y (3) un detector de radiacin infraroja de estado slido hace pasar el flujo que atraves la cmara con la muestra y el flujo de referencia alternadamente a travs de la celda de anlisis por perodos de 2 segundos cada uno. La radiacin infrarroja que atraviesa la celda es filtrada siendo finalmente la seal incrementada y almacenada. Una bomba interna en el instrumento hace pasar el flujo que atraves la cmara con la muestra y el flujo de referencia alternadamente a travs de la celda de anlisis por perodos de 2 segundos cada uno. Posteriormente es comparada con la seal recibida en ciclos posteriores y en funcin de las diferencias entre muestra y referencias se calculan las variables de inters. Modernos sistemas fotosintticos tambin pueden ser diseados para medir la temperatura de las hojas, temperatura de aire de la cmara, PAR (radiacin fotosintticamente activa), y presin atmosfrica. Estos sistemas pueden calcular la eficiencia del uso del agua (A/E), la conductancia estomtica (gs), eficiencia de uso de agua intrnseca (A / gs) y concentracin de CO2 subestomtica (IC). Temperaturas de la Cmara y hoja son medidas con un sensor termistor. Algunos sistemas tambin estn diseados para controlar las condiciones ambientales.
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Consola con pantalla, teclado y memoria
Cmara foliar
Figura 1 Sistema Porttil de medicin de fotosntesis. Marca Li-cor, modelo Li6400XT-R
Figura 2. Esquema bsico mostrando las diferentes partes de la cmara foliar en un sistema IRGA modelo Li-6400XT-R y la trayectoria del haz de radiacin infrarroja dentro del sistema.
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OBJETIVO.Determinar la tasa fotosinttica foliar de varias especies, herbceas, arbustivas o arbreas en el periodo de mxima radiacin. MATERIAL. especies, herbceas, arbustivas o arbreas presentes en la C.U. Analizador de Gases Infrarrojo (IRGA) marca Li-Cor modelo modelo Li6400XT-R PROCEDIMIENTO.1. Se transporta el IRGA a campo (con sumo cuidado) 2. Elegir la especie a evaluar 3. Determinar la hoja a ser evaluada. Se recomienda que sea la primera hoja adulta ms prxima al pice. 4. Colocar la cmara foliar cuidadosamente de tal manera que encierre la hoja a ser medida manteniendo su posicin original. Registrar el valor de la tasa de fotosntesis. 5. En caso de haber estado en otra posicin, colocarlo en posicin perpendicular a la incidencia de la radiacin solar y registrar el valor de la tasa. Registre los datos que muestra la Pantalla de cristal lquido en la consola. 6. En el laboratorio, en caso de haber almacenado la informacin en la memoria del equipo, descargar la informacin y se procede a analizarla RESULTADOS.Llene la ficha que se adjunta. Realice un grfico que compare la tasa de fotosntesis y otras variables evaluadas para las especies estudiadas. CONCLUSIONES
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Considerando los resultados obtenidos y la bibliografa existente, justifique los resultados obtenidos. Referencias.Mara Elena Fernndez, Javier E. Gyenge. 2010.Tcnicas en medicin en ecofisiologa vegetal: conceptos y procedimientos / editores Buenos Aires : Ediciones INTA, 2010.140 p.
Ficha de evaluacin Fotosntesis Especies Especie 1 Especie 2 Especie 3 neta (mol m2
Concentraci n de H2O (mmol mol-1)
Conductanci a estomtica
PAR
s-1)
19
MADURACIN DE LOS RGANOS REPRODUCTIVOS
El xito del mejoramiento gentico y de los trabajos de polinizacin est relacionado con el momento y la duracin de la receptividad del estigma y la viabilidad de los granos de polen. Adems estos estudios pueden permitir conocer si una especie presenta esterilidad, homogamia o dicogamia (si es protandra o proterogina). De modo que en la presente prctica se desea evaluar la receptividad del estigma y relacionarlo con el momento de la apertura natural de la antera en diferentes etapas del desarrollo floral. OBJETIVO.Evaluar la variacin de la maduracin de los rganos reproductivos (receptividad de estigma y liberacin de polen) desde la antesis hasta el inicio de senescencia floral MATERIAL.Material biolgico: flores en diferentes etapas de desarrollo de Aloe sp, u otra especie vegetal Equipos de laboratorio: Microscopio estereoscpico Materiales: H2O2 Debe traer el estudiante: Regla (flexible de preferencia), ficha de registro de datos, lpiz, papel toalla. Portaobjeto, cubreobjetos, pinzas, estiletes, gotero, METODO.Evaluacin de la dehiscencia de la antera y receptividad del estigma: a. b. Colectar flores en cada etapa bsica de desarrollo: yema, flor y flor senescente, de 3 a 5 de cada etapa. Obtener los datos de las columnas 2 y 3 de la Ficha de Registro de Datos. Realizar las mediciones bajo el microscopio estereoscpico si fuera necesario.
20
c. d.
Identificar en qu etapa ocurre el inicio y trmino de la apertura natural de las anteras y registrar sus datos en la Ficha (columna 4) Determinar la receptividad del estigma aplicando sobre su superficie H2O2. Asociar la intensidad del burbujeo con el grado de receptividad del estigma. Realizar la prueba a los pistilos de las diferentes etapas encontradas a fin de caracterizar cada etapa.
RESULTADO.Registre sus datos en la ficha que se adjunta. Prepare una tabla con el promedio obtenido para las variables evaluadas en cada etapa de desarrollo. Grafique dispersando todos sus datos de cada variable e identificando con un color diferente cada etapa de desarrollo en funcin del tiempo
Ficha de Registro de Datos

Estado y long de repeticin (ej filamento / Y1, F1 y S1) long de antera long de pistilo / long de ovario Dehiscencia de la antera b Receptividad del estigma a
a b
= registrar si el burbujeo es leve, moderado o abundante = indicar si la dehiscencia es inicial, parcial o total

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PRCTICA Prctica 1. Prctica 2. Prctica 3.

Contenido de clorofila en la hoja Evaluacin de la maduracin de los rganos reproductivos

Prctica 7. Prctica 8. Prctica 9.

FICHA DE REGISTRO DE DATOS. Evale al inicio y trmino de su

DETERMINACIN DEL POTENCIAL HDRICO FOLIAR

Ficha de registro de datos. Determinacin del potencial hdrico foliar

DENSIDAD DE ESTOMAS Y ESTADO HDRICO FOLIAR

06 Pipetas 10 mL Balanza analtica Etiquetas para rotulacin rea de incubacin

Contenido de agua Contenido relativo de agua (R*)

= ((Pf Ps)/Ps) 100 = ((Pf Ps)/ (Pt Ps)) 100

Dficit de saturacin de agua Relacin peso trgido- peso seco

MEDICIN DE LA TASA DE FOTOSNTESIS

Consola con pantalla, teclado y memoria

Figura 1 Sistema Porttil de medicin de fotosntesis. Marca Li-cor, modelo Li6400XT-R

Ficha de evaluacin Fotosntesis Especies Especie 1 Especie 2 Especie 3 neta (mol m2

Concentraci n de H2O (mmol mol-1)

MADURACIN DE LOS RGANOS REPRODUCTIVOS

Ficha de Registro de Datos

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