Mecanismos de Accin de carvacrol sobre la Alimentacin-Borne Patgeno Bacillus cereus Carvacrol, un compuesto natural presente principalmente en la fraccin de aceite

esencial de organo y tomillo, Se estudi su efecto en los parmetros de bioenergticos clulas vegetativas de los patgenos de alimentos Bacillus cereus. Incubacin durante 30 minutos en presencia de 1 a 3 mM carvacrol reducido el nmero de clulas viables exponencialmente. Carvacrol (2 mM) un agotamiento significativo de la piscina intracelulares de ATP a valores cercanos a 0 en 7 min. No un aumento proporcional de la ATP extracelular se observ piscina. El agotamiento de la piscina interior de la ATP se asoci con un cambio de potencial de membrana ( ). En concentraciones de 0,01 mM carvacrol y el anterior, una reduccin significativa de Se observ, lo que lleva a la disipacin de la plena en concentraciones de 0,15 mM y superior. Por ltimo, un aumento de la permeabilidad de la membrana citoplsmica de los protones y los iones de potasio se observ (en el 0,25 y 1 mm carvacrol, respectivamente). De este estudio, se podra concluir carvacrol que interacta con las membranas de B. cereus por cambiar su permeabilidad para cationes como H y K. La disipacin de los gradientes de iones provoca el deterioro de procesos esenciales en la clula y, por ltimo, a la celda muerte. Bacillus cereus es una formadora de esporas alimentos a menudo agentes patgenos asociados con los productos alimenticios, como carne, verduras, sopa, arroz y la leche y otros productos lcteos. Entre el 1 y el 20% de el nmero total de brotes de infeccin alimentaria en el mundo es causada por B. cereus (19). Crecimiento vegetativo de las clulas normalmente ocurre dentro de la gama de temperaturas de 10 a 50 C, con una ptimo entre 28 y 35 C. Sin embargo, psicrtrofas variables hormigas de B. cereus, capaz de crecer a temperaturas por debajo de 5 C, se han identificado (6, 22). Aunque las clulas vegetativas de B. cereus puede ser fcilmente inactivado por el calor, las esporas se con blemente ms resistentes y pueden causar el deterioro de los alimentos despus de posterior germinacin (6). Leve preservacin tecnologas son cada vez ms impor - importante en la moderna industria alimentaria. Como consecuencia de ello, las esporas de forma - cin microorganismos pueden proliferar y, por tanto, convertirse en un grave riesgo para la seguridad alimentaria. Procesos de leve a menudo se combinan para obtener productos seguros, con una mejor calidad organolptica. Un forma novedosa para reducir la proliferacin de microorganismos es la uso de aceites esenciales. Los efectos antibacterianos y antifngicos de estos componentes en diferentes microorganismos han sido de - descrito en varios estudios (5, 14, 16-18, 26-29). Entre los diverso grupo de componentes qumicos en los aceites esenciales, carvacrol ejerce una accin antimicrobiana. Es el carvacrol componente importante de la fraccin de aceite esencial de organo (60 a Carvacrol 74%) y el tomillo (45% carvacrol) (1, 20). En la prctica, carvacrol, se aade a diferentes productos, por ejemplo, productos de panadera (15,75 ppm), bebidas sin alcohol (28,54 ppm/0.18 mM), goma de mascar (8,42 ppm), etc (8). Sin embargo, no se sabe mucho sobre los mecanismos de accin de este compuesto. Una mejor conocimiento del modo de accin es importante en relacin con pa - aplicacin de los sistemas alimentarios. Recientemente, Ultee et al. (29) mostr el efecto de los antibiticos sobre el carvacrol B. cereus. Hidrfobas compuestos como el carvacrol es probable que tengan una influencia en membranas biolgicas. La membrana citoplsmica de las bacterias tiene dos funciones principales: (i) la funcin de barrera y la energa transduccin, que permiten a la membrana para formar gradientes inicos que pueden ser utilizados para conducir los distintos procesos, y (ii) la formacin de una matriz de membrana embebido en protenas (como la F-membrana integrado 0 complejo de la ATP-sintasa) (12, 24). En el presente estudio, los cambios en la energa transducing pro - sos de la B. cereus causados por el carvacrol fueron estudiados en ms detalle. El efecto de carvacrol intracelulares de ATP en la piscina, el potencial de membrana, el gradiente de pH en todo el cytoplas - micrfono de membrana, y el gradiente de potasio fue evaluada. MATERIAL Y MTODOS Cepa bacteriana y las condiciones de crecimiento. B. cereus IFR-NL94-25 (obtenida del Instituto de Investigacin en Alimentos, Norwich, Reino Unido) fue utilizado a lo largo de este estudio. Las clulas fueron cultivadas en infusin cerebro corazn (BHI) a medio (Oxoid) suplementado con 0,5% (peso / vol) de glucosa (pH inicial de 6,7) a 30 C. Celular se mantuvieron en las culturas 80 C en un 15% de glicerol como crioprotector. Productos qumicos. Purificada carvacrol se obtuvo de Fluka Chemie AG (Buchs, Suiza). Una solucin stock (1 M) se hizo en el 95% de etanol. El ltimo de etanol concentracin en los experimentos siempre se ha mantenido por debajo del 2% (vol / vol). Vigilancia de la viabilidad. Vegetativa de las clulas B. cereus fueron cosechadas por centrifugation, lavado dos veces en un 50 mM tampn HEPES potasio (pH 7,0) que contiene 1 mM MgSO 4 Y diluida a una densidad ptica a 660 nm (OD 660 ) De 0,1 (luz camino de 1 cm). 20 ml de suspensin se mantendr a 20 C. Carvacrol fue aadido a una concentracin final de entre 1 y 2 mm. Se tomaron muestras cada 5 minutos durante la exposicin (un

mximo de tiempo de exposicin, 40 min) y diluida inmediatamente (10 2 - A 10 5 veces) en peptona-solucin salina fisiolgica (1 g por litro de peptona y 8,5 g de NaCl por litro) para saciar la influencia de carvacrol. Diluciones seriadas se chapada en placas de agar BHI y se incuban durante 24 horas a 30 C. Determinacin de los intercambios intracomunitarios y las concentraciones extracelulares de ATP. Clulas de un cultura de la noche a la maana se lavaron tres veces en un 25 mM fosfato de potasio tampn (pH 7), y se prepar una suspensin con un dimetro exterior 660 de 1 (camino de la luz 1 cm). El experimento se inici mediante la adicin de glucosa a una concentracin final de 0,5% (peso / volumen). 200 l de las muestras fueron tomadas cada 2 minutos, sumado a Eppendorf tubos que contienen 200 l de una mezcla de aceite de silicona (AR200/AR20 relacin 2:1) (Wacker Chemicals, Munich, Alemania) en la parte superior de 100 l de tricloroactico cido tampn de EDTA (10% cido tricloroactico y 2 mM EDTA), y centrifugado directamente (5 min, 12.000 g). El extracelular (capa superior) y el intracelular (capa inferior) se midieron las concentraciones de ATP por medio de un ensayo de ATP 1243-107 Kit (Bio-Orbit, Turku, Finlandia). Luminiscencia se registr con un modelo de 1250 luminometer (Bio-rbita). Influencia de carvacrol sobre el potencial de membrana ( ). Las clulas de una noche a la maana la cultura se lavaron dos veces en un 50 mM tampn HEPES potasio (pH 7,0), conteniendo 1 mM MgSO 4 La celda de pellets se diluye hasta una OD 660 (camino de luz de 1 cm), de 10 se alcanz. Exactamente 30 l de la suspensin celular fue diluida en 2 ml de buffer, que contiene 5 M 3,3-dipropylthiacarbocyanine [Disco 3 (5)] (Molec - Sondas particular, Leiden, Pases Bajos). El potencial de membrana ( ) Se monitored con un Perkin-Elmer LS 50B spectrofluorometer a 20 C (onda de excitacin longitud, 643 nm, longitud de onda de emisin, 666 nm). Tras el equilibrio, 15 mM glucosa se ha aadido a energizar las clulas. Despus de una constante lectura haba sido alcanzado, 1 nM nigericin se ha aadido a disminuir el pH a travs de la gradiente membrana citoplsmica. Despus de una constante lectura de fluorescencia se lleg, diferentes concentraciones de carvacrol (0,01 a 2 mm) se han aadido. Valinomycin (1 nM) se aadi como control. Mediciones de pH intracelular. La determinacin del pH intracelular se basa en el mtodo descrito por Breeuwer et al. (3). Clulas de una noche a la maana cultura fueron cosechadas, lavadas tres veces en tampn HEPES 50 mM (pH 7,0), y diluido a una OD 660 (camino de luz, 1 cm) de 1. Posteriormente, las clulas se incuba - debatido en presencia de 1,5 M carboxyfluorescein diacetato succinimidyl ster durante 10 minutos a 30 C. Carboxyfluorescein diacetato succinimidyl ster se hidroliza a carboxyfluorescein ster succinimidyl en la celda y posteriormente conjugados De aminas alifticas. Despus de haber sido lavados con 50 mM de tampn fosfato de potasio (pH 5,81), las clulas fueron incubadas con 10 mM de glucosa durante 30 min a 30 C a eliminar nonconjugated carboxyfluorescein succinimidyl ster. Adems, las clulas se lavaron dos veces, resuspendido en 50 mM fosfato de potasio, y mantener en hielo hasta nuevo uso. El anlisis se inici el 30 de l de la suspensin celular est aadido a una cubeta de cuarzo que contiene 3 ml de tampn fosfato 50 mM (pH 5,81), colocados en una cubeta de un titular spectrofluorometer (Perkin-Elmer LS 50B), y agita constantemente. Intensidades de fluorescencia se mide a la excitacin longitudes de onda de 490 nm (pH sensibles) y 440 nm (pH insensible) rpidamente por alterar el monocromador entre ambas longitudes de onda. La emisin fue de - determinada a 525 nm, y la excitacin y de emisin de hendidura anchos se fijaron los das 5 y 10 nm, respectivamente. El pH intracelular se calcul a partir de la relacin de la de emisin en 490 - y 440-nm de excitacin. Una curva de calibracin se determinar de bferes con valores de pH de 3 a 10. Tampones contena 50 mM glicina, 50 mM cido ctrico, 50 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O, 50 mM y KCl. valores de pH se ajustaron con NaOH o HCl. El pH en y pH fuera (pH intracelular y extracelular,respectivamente) se equilibran Adems de 1 M valinomycin y 1 M nigericin. Determinacin de los intercambios intra y extracelular cantidades de potasio. Exponenmente cada vez ms clulas (cultura de la noche a la maana) fueron cosechadas y lavado dos veces en un 50 mM tampn HEPES sodio (pH 7,0). Las clulas se concentraron hasta un dimetro exterior 660 de 1 (camino de luz de 1 cm) se alcanz. La extraccin de potasio de las clulas se llevado a cabo segn lo descrito para la determinacin de ATP. La concentracin de potasio cin se midi con un Fotmetro de llama (Jenway, Felsted, Inglaterra), despus de dilucin de las muestras en agua destilada. Valores se compararon con un estndar curva de calibracin de KCl. Determinacin de protenas. La determinacin de la cantidad de protena en la de clulas B. cereus se llev a cabo de acuerdo con el trabajo de Lowry et al. (21) con albmina srica bovina como estndar. RESULTADOS Viabilidad de B. cereus en presencia de carvacrol. carvacrol inhibe el crecimiento de B. cereus eficaz. Incubacin y exposicin a temperaturas afectan significativamente la tasa de mortalidad de B. cereus (29). La viabilidad de B. cereus clulas cultivadas a 30 C se determin en las condiciones (pH 7, 20 C), que fueron utiliza en este estudio. Se tomaron muestras cada 5 minutos vanisado y en placas de BHI para supervisar la viabilidad del

producto (Fig. 1). Un inicio de sesin se encontr relacin lineal entre el tiempo de exposicin seguro y viable contar con la de B. cereus. 1 mM en el carvacrol, casi no viable la reduccin de la cuenta se observ despus del 30 de min, mientras que 1,25 y 1,5 mM carvacrol como resultado una clara re - de la produccin de bacterias. Por lo tanto, puede concluirse que es el carvacrol bactericida hacia B. cereus clulas a 20 C cuando estn presentes en concentraciones superiores a 1 mM. Efecto de la ATP en el carvacrol piscinas. La actividad bactericida puede estar en la alteracin de la integridad de la membrana, ya que carvacrol es un compuesto lipoflico preferentemente particionado en este compartimento celular. Membrana citoplsmica interrupcin es se espera que tengan un gran impacto en la membrana asociada FIG. 1. Viable contar de B. cereus clulas (log UFC / ml) en el tiempo entre diferentes vals despus de la adicin de carvacrol. Las clulas fueron cultivadas en BHI (30 C), lavado, y mantenerse en tampn HEPES a pH 7,0 (20 C). Carvacrol concentraciones probados fueron 1 ()), 1,25 (s) y 1,5 (H) mm. Los datos representan valores medios de tres mediciones. La lnea discontinua representa el lmite de deteccin. FIG. 2. Intracelular (plazas) y extracelular (crculos) de la glucosa ATP piscinas energa vegetativa de las clulas B. cereus en ausencia (smbolos abiertos) o la presencia (cerrado los smbolos), de 1 (uno) o 2 (b) el carvacrol mM. Se aadi el carvacrol at 4 min (indicado por la flecha). Representan los valores medios de las mediciones por duplicado. El errores estndar de los medios indicados en las barras de error. energa transducing sistema. Por lo tanto, el efecto de carvacrol en el intra y extracelular ATP piscinas se estudi. Adems de 1 mM carvacrol intracelular disminuy la cantidad de ATP a valores cercanos a 0 en 14 min (Fig. 2a). Ningn aumento extracelular de la ATP se observ piscina. Resultados similares se obtuvieron con la adicin de 2 mM carvacrol (Fig. 2b). La piscina intracelulares de ATP se redujo a 0 en 10 min. Un pequeo aumento de la ATP extracelular piscina se observ, aunque esto no era proporcional a la disminucin de la en - ATP tracellular piscina. Influencia del potencial de membrana en el carvacrol ( ). Agotamiento cin de la piscina interior de la ATP por el carvacrol puede estar asociada con una reduccin de la sntesis de ATP. Por lo tanto, se investig la efecto de carvacrol sobre el potencial de membrana, la conduccin vigor para la sntesis de ATP. Cambios en el potencial de membrana pueden ser visualizados por los cambios en la fluorescencia de una potentio mtricas tinte. B. cereus clulas fueron incubadas en presencia de DISC 3 (5). Despus de la adicin de la glucosa y la nigericin, carvacrol se ha aadido (Fig. 3). Carvacrol reducido de la membrana si est presente en el potencial de 0,01 mm o superior. El aumento de concenciones provoc una mayor tasa de reduccin (0,01 y 0,25 U / s en 0,01 y 0,5 mm, respectivamente), y un menor de estado miemBrane potencial alcanzado. En concentraciones superiores al 0,15 mm, una completa desaparicin de la membrana potencial Se observ. Efecto del pH intracelular en el carvacrol. Agotamiento de los intercambios intracomunitarios de celular y la disipacin de la ATP por el carvacrol sugieren efectos sobre los gradientes de iones a travs de la membrana celular. Por lo tanto, la pH en se investig en ms detalle. Para descartar otras esencial de gradientes de protones adems de rampas y pendientes, todas las mediciones se llevaron a cabo en presencia de valinomycin. El pH en de B. cereus, cultivados en BHI a pH 6,7 y lavada con HEPES tampn (pH 5,81), fue de aproximadamente 7.1. Adems de la glucosa y la valinomycin noafect el pH en Como era de esperar, nigericin disipa el pH a travs de la gradiente membrana (datos no mostrados). La exposicin de las clulas de carvacrol (Fig. 4) disminucin del pH en En presencia de 0,25 mM carvacrol, el gradiente de pH a travs de la membrana de la clula se redujo a 1 U. Una nueva reduccin del pH a 0,5 U se observ con 0,5 mM carvacrol. Ningn efecto sobre el pH se observ en concentrciones por debajo de 0,25 mm. Completa disipacin del pH gra ingrediente se alcanz en la presencia de 1 mM carvacrol o superior. Influencia del flujo de salida de potasio en el carvacrol. Carvacrol afecta las concentraciones intracelulares de ATP y la transmembrana potencial elctrico y se disipa el pH. Posteriormente, el efecto de carvacrol sobre la permeabilidad de la membrana al sala de iones de potasio se ha investigado. Adems de la glucosa (a energa de las clulas) en t 0 causado alrededor de un 100% aumento de las piscinas intracelulares de potasio (K en ) (Fig. 5). Extracelular piscinas (K fuera ) Disminuy de 0,98 a 0,67 mol / litro. Adicin de 1 mM carvacrol despus de 5 minutos de incubacin rpida disminucin de la cantidad de K intracelular. Despus de 9 min de incubacin, la cantidad intracelular de K se redujo del 12 mol / mg de protena de la clula (en t 5 min) a 0,99 mol / mg protena de la clula y el K extracelular se elev de 0,67 mol / litro despus de 5 minutos a 1,14 mol / litro a los 9 minutos de incubacin. La cantidad total de potasio (K en K fuera ) Se mantuvieron con permanente durante todo el experimento. DISCUSIN Este estudio describe el efecto de carvacrol en clulas de la alimentos patgeno B. cereus. Carvacrol acta como bactericida compuesto, con su actividad depende de la concentracin cin y el tiempo de exposicin. Sikkema et al. (23) encontr que la acumulacin de compuestos lipfilos en miembros de la clula FIG. 3. Efecto de carvacrol

sobre el potencial de membrana de B. cereus en presencia de glucosa (glu), nigericin (NIG) y diferentes concentraciones de carvacrol. Exponencialmente creciente clulas se lavaron y se mantendr en tampn HEPES a pH 7,0 (20 C). Se aadi el carvacrol at 250 s. El potencial de membrana se vigila utilizando la sonda fluorescente DISC 3 (5). au, unidades arbitrarias. Brane (probado en liposomas preparados a partir de Escherichia coli labios IDS) es proporcional a la concentracin en la fase acuosa y la membrana de la fase acuosa, coeficiente de particin. Eno moto et al. (7) observ una disminucin de en liposomas en la exposicin a algunos compuestos de fragancia. Estos hidrfobas compuestos se disuelven en la membrana, y su actividad se estrechamente relacionada con la fluidez de la membrana. Sobre la base de estos estudios, se espera que ms se disuelve en el carvacrol membrana en concentraciones ms altas. Nuestro estudio ha demostrado que la exposicin a carvacrol conduce a una disminucin de la ATP en concentracin. No aumento proporcional de la ATP fuera Se observ. Por lo tanto, se concluye que carvacrol no aumentar la permeabilidad de la membrana de la ATP. En consecuencia, el agotamiento de la piscina interior de la ATP el resultado de un tipo reducido de sntesis de ATP o el aumento de la ATP hidrlisis. El agotamiento de la reserva de ATP a la adicin de un componente lipfilos se ha observado en diferentes estudios (13, 15). En contraste con el presente estudio, Helander et al. (11) observ una fuga de ATP a partir de clulas que fueron expuestas a carvacrol (2 mM). Sin embargo, este estudio se llev a cabo con bacterias gram-negativas, que tienen una dotacin de clulas diferentes. La observacin de que ya bajas concentraciones de carvacrol (0,01 mM) provocan una disminucin del potencial de membrana sugiere que la membrana se vuelve ms permeable para los pro toneladas. Esta conclusin es apoyada por la observacin de que exposicin de las clulas a carvacrol tambin causa de la disipacin gradiente de protones a travs de la membrana. De conformidad con el estos resultados, Sikkema et al. (25) mostr un aumento de protones liposmica permeabilidad de las membranas durante la exposicin a la te - tralin. Del mismo modo, Cartwright et al. (4) describe la disipacin de el pH en presencia de etanol, debido a una mayor afluencia de protones. Anlisis de la intracelulares y extracelulares de potasio piscinas de manifiesto unaumento de la permeabilidad de la membrana de la clula para K a la exposicin a carvacrol. K es el principal cytoplas cin del crecimiento de micro clulas bacterianas, que participan en varias funciones de las clulas bacterianas. Este in juega un papel en la activacin citoplsmica de las enzimas, el mantenimiento de la presin de turgencia seguro y, posiblemente, la regulacin de la citoplsmica de pH (2). Diferentes estudios demostraron que un flujo de salida de iones de potasio es un primera indicacin de daos en la membrana de las bacterias (10, 24, 30). depende sobre todo de la concentracin de potasio en la clula (2). Heipieper et al. (9) mostraron una significativa a la excrecin de K el entorno externo durante la exposicin de Pseudomonas putida P8 al fenol. Gradientes de solutos a travs de la cytoplas - micrfono de membrana que utilicen H como el acoplamiento de iones puede ser ambin afectados por una dispersin de la fuerza motriz de protones. Aunque no hubo efecto inmediato de carvacrol sobre la viabilidad a concentraciones de 1 mM y ms bajo, claro los efectos en bioenergtico diferentes parmetros se han observado. Clulas probablemente puede hacer frente a muy bajas concentraciones de carvacrol. No slo la reduccin de la sntesis de ATP por una dispersin de la la fuerza motriz de protones, pero tambin otros (secundaria) los efectos del auto - vacrol puede dar lugar a la accin bactericida o bacteriosttico. Por ejemplo, una inhibicin de varias enzimas, debido a las fugas esencial de iones, la prdida de turgencia de presin, influencia sobre el ADN sntesis, la reduccin de actividades metablicas, y en otros procesos la clula puede ser una causa de la disminucin de viabilidad durante la expo - Asegrese de carvacrol. Una prdida de integridad de membrana a causa de disturbio Bance hidrfobas de las interacciones entre los lpidos y protenas es a menudo un factor importante al considerar la actividad de compuestos txicos (24). Se puede concluir que la hydropho - BIC carvacrol compuesto interacta con las membranas de B. cereus por cambiar su permeabilidad para cationes como H y FIG. 5. Cambios en la intracelular (K en ) (E) y extracelular (K fuera ) (F) potasio piscinas de B. cereus clulas durante la exposicin a 1 mM carvacrol. Las clulas fueron cultivadas en el BHI, lavado, y se mantendr en NaHEPES buffer (pH 7,0). Carvacrol se aadi en t 5 min. FIG. 4. Efecto del pH sobre el carvacrol en y pH de las clulas vegetativas de B. cereus. Las clulas fueron cultivadas en el BHI, lavado, y se incuban en un 50 mM fosfato de potasio tampn (pH 7) (vase Materiales y Mtodos). K. La disipacin de los gradientes de iones da lugar a alteraciones de la procesos esenciales en la clula y, por ltimo, a la muerte celular. Este estudio muestra que el carvacrol tiene efectos biolgicos en la con centraciones que son pertinentes para el sabor de los alimentos (por ejemplo, bebidas sin alcohol [0,18 mM/28.54 ppm], y productos horneados [15.75 ppm]) (8). A los productos asociados con brotes de B. cereus (por ejemplo, el arroz, la pasta, y la sopa), el carvacrol puede ser re ca como un antimicrobiano y un sabor complejo.