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UNIDAD DIDACTICA 5.- METODOS CROMATOGRAFICOS INTRODUCCION La cromatografa es una tcnica de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin muy amplia. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las tcnicas cromatografas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla que se va analizar interaccionan con la fase estacionaria. De este modo, todos los componentes que forman la mezcla atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando a distinto tiempo. Cuando se trabaja con un equipo de cromatografa una vez que los componentes han pasado por la fase estacionaria, separndose de forma individual, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto. Pequeas diferencias en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado diferentes retenciones sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla. La cromatografa cumple dos funciones: Separar los componentes de la mezcla Medir la proporcin de los componentes de la mezcla El esquema muestra una disolucin que contiene dos compuestos A y B, que se depositan en la cabeza de la columna de cromatografa rellena con partculas solidas y llena de un disolvente. Seguidamente se aade un nuevo disolvente por la entrada de la columna y la mezcla fluye a travs de la columna. El compuesto A se adsorbe ms fuertemente que el B y sale despus porque desciende de manera ms lenta. Este es la forma de separar los compuesto de la mezcla Compuesto A Compuesto B

Representacin esquemtica de una separacin por cromatografa. El compuesto A tiene una mayor afinidad por la fase estacionaria que el compuesto B, por ello permanece ms tiempo retenido

Obtencin del Compuesto B

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Tipos de cromatografa Segn la disposicin de la fase estacionaria: Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son: o Cromatografa en papel o Cromatografa en capa fina Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: o Cromatografa de lquidos o Cromatografa de gases o Cromatografa de fluidos supercrticos La cromatografa de gases se utiliza para gases o para compuestos relativamente voltiles, lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos. Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol).

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Entre las diferentes tcnicas cromatograficas, la cromatografa en capa fina (TLC, thin-layer chromatography) es una herramienta importante en la industria farmacutica para los controles rutinarios de pureza de los medicamentos. Tambin es habitualmente empleada en la industria de la alimentacin para el control de aditivos, as como en numerosos estudios bioqumicos y biolgicos. En esta tcnica la separacin se realiza sobre una delgada capa que es la fase estacionaria inmovilizada en un soporte plano, como una placa de vidrio, aluminio o plstico. La muestra que se va analizar se deposita en pequeas cantidades en un extremo de la placa a unos 2 cm del borde. La separacin de los componentes de la mezcla se realiza en un recipiente cerrado (Imagen 1) que contiene la fase mvil, la cual asciende por la placa debido al efecto de capilaridad. Cuando la fase mvil sube hasta alcanzar 2-3 cm. del borde superior de la placa, la separacin finaliza. En algunas ocasiones para obtener una mejor separacin de los componentes se realizan dos desarrollos con fases mviles diferentes y en direcciones perpendiculares, esta tcnica se conoce como cromatografa plana bidimensional.

Imagen 1

El tratamiento de la placa con un reactivo adecuado permite la visualizacin de los reactivos por separado, cuando estos no son coloreados, en algunas ocasiones pueden utilizarse placas que llevan incorporado un material fluorescente, de manera que toda la placa presentar

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fluorescencia bajo luz UV menos el lugar donde se encuentran los compuestos no fluorescentes que aparecern sin fluorescencia.

Esquema del desarrollo de la placa en una cromatografa en capa fina: a) Inicio del ensayo; b) despus de la separacin.

Placa de cromatografa

Frente del disolvente

A)

B)

Fase mvil
Lnea de inicio

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PRACTICA 5.1. SEPARACIN DE DOS COLORANTES POR CROMATOGRAFIA EN COLUMNA INTRODUCCION La polaridad de una molcula viene dada por la existencia de distintas densidades de carga positivas o negativas en diferentes partes de dicha molcula, ocasionando la aparicin de un dipolo elctrico. As, en las molculas donde este efecto sea muy marcado, diremos que son polares, mientras que en las molculas apolares, no aparecen dipolos o stos se compensan entre s. Debido a la existencia de densidades de carga positivas y negativas, aparecern fuerzas electrostticas intensas entre las molculas polares, siendo ms fuertes estas fuerzas, cuanto ms polar sea la molcula. En cromatografa se utiliza la intensidad de las fuerzas intermoleculares para separar sustancias. En primer lugar tendremos un lecho poroso constituido por un compuesto slido, inerte y de elevada polaridad, como puede ser el xido de aluminio o almina. Este lecho slido recibe el nombre de fase estacionaria. Por otra parte, tenemos un disolvente llamado fase estacionaria que fluye a travs de la fase estacionaria. La muestra a separar se situar en la parte superior de la fase estacionaria. Por una parte, el lquido tender a disolver cada uno de los componentes de la muestra y a hacerlos descender. La fase estacionaria retendr a los compuestos a travs de fuerzas intermoleculares. Si comparamos los solutos, cuanto ms polares sean stos, ms intensas sern las fuerzas que los unan a la almina y por tanto tardarn en salir. Por tanto, para conseguir despegar de la fase estacionaria compuestos de baja polaridad, bastar con disolventes orgnicos poco polares como el ter etlico, si la polaridad de las muestras es ms elevada, tendremos que utilizar etanol o incluso agua, como en nuestro caso, para compensar las grandes fuerzas de atraccin que los unen al soluto a la fase estacionaria. OBJETIVOS Aprender el concepto de polaridad en una molcula orgnica. Relacionar entre polaridad y fuerzas intermoleculares. Utilizar la cromatografa como tcnica de separacin analitica. Separar una mezcla de colorantes, empleando la cromatografa en columna.

REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIO Reactivos: Almina (Oxido de aluminio) Etanol Disolucin de azul de metileno y fluorescena Amoniaco Material: Columna cromatogrfica Vasos de precipitados

Tubos de ensayo Pinzas y varillas metlicas

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL La prctica se realizar en una columna cromatogrfica de vidrio en caso de no disponer de columna podemos preparar una bureta de modo que se pueda utilizar como columna, introduciendo un algodn o lana de vidrio para que hagan el papel del vidrio poroso. Se vierte en la columna almina neutra para cromatografa, formando una suspensin en etanol (no debe disolverse, la almina es insoluble en agua y en etanol), hasta que alcance una altura de unos 10 cm. La suspensin debe ser espesa pero fluida. Golpeamos ligeramente la columna para permitir una sedimentacin uniforme del adsorbente y la salida de burbujas de aire. Se abre la llave de la columna y se deja salir el etanol hasta que no quede lquido por encima de la almina. Se introducen entonces cuidadosamente, con la ayuda de un cuentagotas, unas 10 gotas de disolucin alcohlica de fluoresceina y azul de metileno. Una vez se observa que la muestra se ha absorbido en la almina, se rellena cuidadosamente la columna con etanol, intentando no redisolver los colorante. Se abre nuevamente la llave y se observar que el flujo del disolvente es muy lento. En este caso se le puede ayudar introduciendo presin con la ayuda de algn sistema de bombeo (un mtodo muy sencillo consiste en colocar un globo en la parte superior de la columna). El lquido se recoge por debajo de la columna con ayuda de tubos de ensayo. Una vez sale todo el azul de metileno y se ha vaciado la columna de etanol, se rellena sta con agua destilada a la que se le ha aadido una gota de amoniaco. Se observar entonces avanzar la franja amarilla correspondiente a la fluorescena. Se procede de la misma manera, recogiendo el lquido que sale en tubos de ensayo. RESULTADOS Obtener de forma independiente los colorantes que componen la mezcla problema.

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PRACTICA 5.2.- ESTUDIO DE LOS PIGMENTOS DE LAS ESPINACAS INTRODUCCIN En este conjunto de prcticas se va a realizar un estudio de los principales pigmentos que se encuentran en las hojas de los vegetales. Esos compuestos captan la energa luminosa del sol y, a travs de reacciones de transferencia electrnica, emplean esta energa para la realizacin de la fotosntesis. Los principales pigmentos son la clorofila (tipo A y tipo B), ambos son de color verde, los carotenos, de color anaranjado, y las xantofilas, que son amarillentas. Esta prctica se puede dividir en cinco partes: 1) Obtencin de los pigmentos 2) Determinacin de humedad de la muestra 3) Determinacin espectrofotomtrica de la clorofila A y B y de los carotenos. 4) Cromatografa en capa fina de los pigmentos vegetales. 5) Separacin por cromatografa en columna de los distintos pigmentos. OBJETIVOS Conocer los fundamentos de la cromatografa en capa fina bidimensional. Manejar los conceptos de humedad absoluta y relativa. Peso seco y peso fresco. Saber el color y las principales caractersticas estructurales de los pigmentos vegetales. Cuantificar a travs de ecuaciones empricas. Conocer la estructura de todos los reactivos empleados.

1 OBTENCIN DE LOS PIGMENTOS REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIO Reactivos: Acetona. Disolucin de amoniaco 0,05M. Sulfato sdico anhidro. ter etlico. Material: Mortero. Embudo decantacin. Probeta. Rotavapor. Vasos de precipitados.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Pesar las hojas de espinacas (ver determinacin de la humedad, segunda parte). 2. Trocear las hojas en trozos pequeos y/o picar en mortero. 3. Macerar con amoniaco:acetona (reservar parte del extracto para realizar la tercera parte) 4. Extraer con ter en embudo de decantacin. 5. Secar con sulfato sdico y concentrar en rotavapor.

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Se trocean unos 10 g de hojas de espinacas (el peso se debe determinar con exactitud) en pequeos trozos con la ayuda de unas tijeras. Se machacan fuertemente en un mortero para conseguir la destruccin de las clulas vegetales y la liberacin de los pigmentos. Se introducen una vez machacadas completamente en una disolucin compuesta de un 80% de acetona y un 20% de amoniaco 0.05M (se debe conocer exactamente el volumen). Se deja la disolucin toda una noche en la nevera en un recipiente tapado. - Importante: Realiza en el mismo da la parte 2 de la prctica, para conseguir que las hojas tengan todava el mismo porcentaje de humedad Al da siguiente se filtra la disolucin. Se guarda una pequea cantidad de filtrado para cuantificar los pigmentos espectrofotometricamente (parte 3). Seguidamente se extrae la solucin resultante con ter (1 vez con 50 ml es suficiente) y se deja secar con sulfato sdico anhidro. Al cabo de un tiempo se elimina la mayor parte del ter con la ayuda del rotavapor. Obtenemos de esta forma una disolucin concentrada de los pigmentos y se guarda la disolucin en la nevera hasta el momento de ser utilizada.

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8 2 DETERMINACIN DE HUMEDAD DE LA MUESTRA Material: Balanza termo gravimtrica

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Una balanza termo gravimtrica nos permite medir el contenido de humedad de una sustancia. Consiste en una balanza de precisin provista de una resistencia que es capaz de calentar la muestra hasta eliminar el agua y otras sustancias voltiles que contiene. Una vez puesta en marcha, la balanza va midiendo continuamente el peso. El programa se detiene automticamente al detectar dos pesos iguales. Tomar una muestra de 5 gramos. Esparcir sobre un platillo de la balanza comprobar previamente que ste limpio y seco. Durante el proceso de clculo, el equipo va mostrando el porcentaje de peso perdido hasta ese instante (o peso residual), frente al tiempo. Anotar este dato durante un periodo de tiempo, por ejemplo 10 segundos y representar la prdida de peso frente al tiempo. Los resultados se pueden representar en una tabla como el siguiente ejemplo:

Peso muestra fresca Muestra n1 Muestra n2 Muestra n3 Resultados medios

Peso muestra seca

Humedad

% de Humedad

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3 DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA DE LA CLOROFILA Y DE LOS CAROTENOS Esquema de la prctica 1) Preparar una muestra llamada blanco de acetona:amoniaco 0.05M (80:20) 2) Realizar un barrido con el espectofotometro correspondiente a la emisin de la luz visible que emite a una longitud de onda comprendida entre 400-700 nm con el blanco. 3) Realizar un barrido con el espectofotometro de 400-700 nm con la muestra problema. 4) Determinar las absorbancias a las longitudes de onda . 5) Determinar los pigmentos de la muestra. Precauciones a tener en cuenta: - Utilizar para las mediciones cubetas de cristal o cuarzo. - Realizar el blanco y la medida en las mismas condiciones. - Si la seal es muy grande, diluir, conociendo la dilucin realizada. REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIO Reactivos: Amoniaco Acetona

Material: Espectrofotmetro de barrido Cubetas de cuarzo Probeta Vaso de precipitados PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL INTRODUCCION TERICA Como se ha comentado en el esquema de la practica los pigmentos vegetales que queremos conocer, absorben en las longitudes de onda correspondientes a la luz visible (400-700 nm). La absorbancia de estos compuestos es proporcional a la concentracin en la disolucin (ley de Lambert-Beer). Todos ellos presentan mximos a longitudes de onda diferentes, pero sus espectros de absorcin se superponen, de modo que la absorbancia a una determinada longitud de onda se debe a la contribucin de varios de estos compuestos. Para calcular la concentracin de cada pigmento se deben eliminar los efectos de los restantes. Esto se podra hacer de varias maneras, como podra ser aislar cada uno de ellos, calcular los coeficientes de absorcin de cada compuesto a las longitudes de onda deseadas, o, como haremos en nuestro caso, restar el efecto de las sustancias que interfieren por medio de ecuaciones experimentales. Wellburn y Lichtenthaler obtuvieron las siguientes ecuaciones que nos da la cantidad de clorofila A, clorofila B y carotenos, expresados en miligramos por gramo de peso fresco, en funcin de la absorbancia de la muestra a 3 diferentes longitudes de onda:

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a 11.78 abs(664) 2.29 abs(647)

clor. a V a mg (hojas)

10

b 20.05 abs(647) 4.77 abs(664)

clor.b V b mg (hojas)

c 1000 abs(470) 327 . a 104b

carot . V c 229 mg (hojas)

V = volumen empleado en la extraccin de los pigmentos en ml Las absorbancias se determinarn en el medio en que se ha realizado la extraccin de los pigmentos (acetona-amoniaco 0.05M, 80:20). 1) Utilizando el espectofotometro de barrido medir el espectro visible completo del la disolucin llamada blanco entre 400 y 700 nm 2) Utilizando el mismo espectofotometro de barrido medir el espectro visible completo de la muestra problema entre 400 y 700 nm. 3) Medir las absorbancias con un espectofotometro a 470, 647 y 664 nm y a partir de la anteriores ecuaciones se calculan los mg. de pigmento por gramo de peso fresco de la muestra de espinacas. Atencin: en el supuesto caso que la muestra problema tenga una excesiva concentracin y de problema el equipo de medida de la absorbancia, se debe realizar una dilucin con la misma mezcla acetona:amoniaco utilizada como blanco. 4) Calcular la porcin de clorofila por gramo de muestra seca, para ello es necesario utilizar el porcentaje de humedad de las hojas calculado en el punto 2 de esta practica 647 nm

470 nm Absorbancia (A) % Humedad de la espinaca =

664 nm

Peso Fresco Clorofila A Clorofila B Carotenos

Peso Seco

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11 4 CROMATOGRAFA EN CAPA FINA DE LOS PIGMENTOS VEGETALES Esquema de la prctica 1 Cortar 4 placas de gel de slice de dimensiones 1x5cm. 2 Realizar cromatografas en capa fina de los pigmentos. 3 Medir los Rf. 4 Analizar resultados obtenidos. 5 Realizar una cromatografa bidimensional con los diluyentes adecuados. REACTIVOS Y MATERIAL NECESARIO Reactivos: Acetato de etilo. Eter etlico. Hexano. Material: Placas de gel de slice. Cmara fotogrfica. Capilar. Probeta. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL INTRODUCCION TEORICA CONSTANTES RF La constante Rf (ratio of front) es simplemente una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente.

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10 para que los rf sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra) el mximo valor de Rf que se puede alcanzar es de 1, lo perfecto es un Rf entre 0,65 y 0,7 . Para saber si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes, una vez desarrollados se calculan los Rf y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los Rf son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. Si los dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separacin mnima. En este caso no se pueden usar reveladores qumicos, ya que alteraran los compuestos, sino indicador ultravioleta.

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Se toma una placa de gel de slice y a 1 centmetro del borde inferior de la misma se coloca una pequea porcin (una gota) de nuestra disolucin problema con la ayuda de un capilar o una pipeta Pasteur. Se introduce la placa en la cmara cromatogrfica, donde previamente se ha introducido nuestro eluyente. Como eluyente se pueden tomar diversos disolventes: a) Hexano-ter proporcin (50:50) b) Hexano-ter (25:50) c) Eter d) Acetato de etilo. Se deja ascender el disolvente hasta que llegue a la parte superior de la placa. Se extrae entonces sta con cuidado y se deja secar. Se observan los diferentes colores de los pigmentos. Se identifica cada uno y se mide su Rf. Los resultados se indican en una tabla de este tipo: Pigmento Color Rf disolvente a) Rf disolvente b) Rf disolvente c)

12

Una variante sera la cromatografa bidimensional. Se prepara una placa cuadrada de gel de slice (aproximadamente 5 x 5 cm) y se colocan unas gotas de los pigmentos en la esquina inferior izquierda . Se eluye la placa con el primer eluyente en una direccin. Se saca la placa, se deja secar y se introduce en una segunda cmara cromatogrfica conteniendo otro eluyente, pero girando esta vez la placa 90, de modo que las manchas queden el lado inferior de sta primera.