UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE CIDO CTRICO Y CIDO ASCRBICO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA POLIFENOL OXIDASA EN PULPA DE MANZANA (Malus domestica) LICUADA VARIEDAD PACHACAMAC

AUTORES:

ATOCHE MOSCOSO MIGUEL AVILA GAMBOA MANUEL LEYVA RODRIGUEZ MARLON LOPEZ CALDERON ROBINSON MEDINA SILVA IVAN TACANGA RAMIREZ WILLIAMS Msc. GABRIELA BARRAZA JAUREGUI TRUJILLO PER 2012

ASESOR:

PROYECTO DE INVESTIGACIN EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE CIDO CTRICO Y CIDO ASCRBICO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA POLIFENOL OXIDASA EN PULPA DE MANZANA (Malus domestica) LICUADA VARIEDAD PACHACAMAC.

1. PERSONAL INVESTIGADOR:

1.1. Nombres y Apellidos

Atoche Moscoso, Miguel vila Gamboa, Manuel Medina Silva, Ivn Leyva Rodrguez, Marlon Lpez Caldern, Robinson Tacanga Ramrez, Williams

1.2. Departamento 1.3. Facultad 1.4. Categora

: : :

Ciencias Agroindustriales Ciencias Agropecuarias Alumnos

2. ASESOR:

2.1. 2.2. 2.3.

Apellidos Y Nombre Facultad Escuela

: : :

Barraza Juregui, Gabriela Ciencias Agropecuarias Ingeniera Agroindustrial

3. TIPO DE INVESTIGACIN:

3.1. De acuerdo a la orientacin 3.2. De acuerdo a la tcnica de contratacin

: Aplicada. : Experimental.

4. RGIMEN DE INVESTIGACIN: Libre

II

5. INSTITUCIN A LA QUE PERTENECE EL PROYECTO:

Escuela

de

Ingeniera

Agroindustrial

de

la

Facultad

de

Ciencias

Agropecuarias de la Universidad Nacional de Trujillo.

6.

LOCALIDAD E INSTITUCIN DONDE SE EJECUTAR EL PROYECTO: 6.1 Institucin : UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Ubicacin: Ciudad Universitaria Av. Juan pablo II s/n, Trujillo, Per.

7. CRONOGRAMA DE EJECUCIN DEL PROYECTO: MESES Setiembre Octubre Noviembre Diciembre X X X

ETAPAS Recoleccin y revisin de informacin Formulacin y sustentacin del proyecto Pruebas experimentales (o Revisin Bibliogrfica) Evaluacin e interpretacin de resultados Redaccin y correccin del informe Presentacin y sustentacin

X X

8.

DURACIN

: 4 meses

FECHA DE INICIO FECHA DE TRMINO

: :

06/09/12 11/12/12

9.

HORAS SEMANALES DEDICADAS AL PROYECTO: a. Semanas b. Horas/Semana c. Total de horas : 13 : 6 : 78

III

10. RECURSOS

10.1. Personal: Autor : Atoche Moscoso Miguel vila Gamboa Manuel Leyva Rodrguez Marlon Lpez Caldern Robinson Medina Silva Ivn Tacanga Ramrez Williams

Asesor

: Msc. Gabriela Barraza Juregui

10.2. Locales :

Laboratorio Multifuncional, Laboratorio de Tecnologa de los Productos Agroindustriales de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Trujillo

10.3. Materiales y Equipos

10.3.1. Materia prima:

Manzana Pachacamac (Malus domestica)

10.3.2. Materiales de vidrio:

Pipetas (10,5 y 1 ml) Vasos de precipitacin (50ml) Matraz Erlenmeyer (100 ml) Fiola (50ml) Embudo de vidrio pequeo

IV

Tubos de ensayo. Probeta (100 ml)

10.3.3. Equipos

Licuadora de 5 velocidades Centrifuga Espectrofotmetro

10.3.4. Reactivos

cido ctrico cido ascrbico EDTA Catecol 0.1 M Buffer fosfato pH7 0.2 M Agua destilada

10.3.5. Otros

Cuchillos Peladores manuales Cucharas Tapers de Polietileno de 8 Oz Etiquetas Gradillas para tubos de ensayo Cubetas para espectrofotmetro Mortero

11. PRESUPUESTO:

PRECIO MATERIAL CANTIDAD UNITARIO (S/.) Manzana Pachacamac. 16 kg 4.00

PRECIO TOTAL (S/.) 64 8.00 2.5 3.60 15.00 15.00 10.00 1.50

Tapers de plstico. 50 unidades cido Ctrico. cido Ascrbico. EDTA. Catecol Buffer Fosfato. Etiquetas Papel filtro Agua destilada Pasajes TOTAL 250 g 125 g 15 g 50 ml 50 ml 1 paquete 22 unidades 4 litros 0,4 1

8.80 4 40.00 172.40

12.

FINANCIAMIENTO: Propio

VI

DEDICATORIA

Con un inmenso cario a nuestros padres por su apoyo y comprensin constante que nos dan la fuerza para cumplir la meta trazada

A la vida, que nos da la oportunidad de conocer.

VII

AGRADECIMIENTO

Con gratitud: A nuestra familia, por su confianza, comprensin y paciencia

Al Msc. Guillermo Linares Lujan por sus valiosas enseanzas y consejos para el logro del presente trabajo, y por su aporte para la realizacin este

Asimismo un agradecimiento especial a los docentes de la Escuela de Ingeniera Agroindustrial por sus enseanzas y el apoyo incondicional y constante.

VIII

RESUMEN

El presente trabajo de investigacin tuvo como finalidad, evaluar el efecto de diferentes concentraciones de cido ctrico y cido ascrbico, sobre la actividad enzimtica de la Polifenol Oxidasa, enzima responsable del pardeamiento de la manzana. Estas concentraciones de aplicaron a pulpa licuada de manzana variedad Pachacamac, se trabaj con concentraciones de 1000 ppm, 1291 ppm, 2000 ppm, 2709 ppm, 3000 ppm de cido ctrico y con concentraciones de 500 ppm, 791 ppm, 1500 ppm, 2209 ppm, 2500 ppm de cido ascrbico. Se trabajaron en total 11 tratamientos, para ello se envaso la pulpa licuada en tapers de polietileno de 8 onzas, cada una de acuerdo a las concentraciones del modelo del diseo estadstico. Luego se refrigero por 4 horas con la finalidad de mantener bien conservada la muestra, para la lectura de actividad enzimtica se sigui el modelo de Potig & Joslyn (1948) con algunas modificaciones. La lectura en el espectrofotmetro se realiz 24 horas despus de la primera refrigeracin, en l se midi la absorbancia para luego graficar su respectiva curva, de ella se extrajo la pendiente la cual sera la actividad enzimtica, expresada en UPFO/ml-min. Luego del anlisis estadstico se determin que la nica variable significativa fue el cido ctrico y la variable cido ascrbico no tuvo efectos significativos sobre la actividad enzimtica de la enzima.

IX

ABSTRACT

The present research was aimed to evaluate the effect of different concentrations of citric acid and ascorbic acid on the enzymatic activity of polyphenol oxidase, the enzyme responsible for browning of apple. These concentrations applied to apple pulp liquefied variety Pachacamac worked with concentrations of 1000 ppm, 1291 ppm, 2000 ppm, 2709 ppm, 3000 ppm of citric acid and with concentrations of 500 ppm, 791 ppm, 1500 ppm, 2209 ppm, 2500 ppm of ascorbic acid. It worked in total 11 treatments, for it liquefied pulp was packed in polyethylene tapers 8 ounces each concentration according to the statistical design pattern. Then cooled for 4 hours in order to maintain the sample well preserved for reading enzymatic activity was followed and Joslyn & Potig model (1948) with some modifications. The reading on the spectrophotometer was carried out 24 hours after the first cooling, the absorbance was measured for the respective graph curve then, it was extracted slope which would be the enzyme activity, expressed in UPFO / ml-min. After statistical analysis it was determined that the only significant variable was citric acid and ascorbic variable had no significant effect on the enzyme activity of the enzyme.

INDICE
CAPTULO I ................................................................................................................................................. 14 INTRODUCCIN ........................................................................................................................................ 14 1.1. 1.2. 1.3. PROBLEMA ................................................................................................................................. 14 HIPOTESIS .................................................................................................................................. 14 OBJETIVOS ................................................................................................................................. 14 Objetivo General ............................................................................................................... 14 Objetivo Especfico ........................................................................................................... 14

1.3.1. 1.3.2. 1.4.

JUSTIFICACIN ......................................................................................................................... 14

CAPTULO II................................................................................................................................................ 16 MARCO TEORICO ..................................................................................................................................... 16 2.1. MARCO TEORICO CONCEPTUAL ............................................................................................. 16 2.2. ANTECEDENTES ........................................................................................................................... 17 2.3. DEFINICION DE CONCEPTOS ................................................................................................... 19 2.3.1. PARDEAMIENTO ENZIMATICO .......................................................................................... 19 2.3.2. POLIFENOLOXIDASA (PPO) ................................................................................................ 19 2.3.3. MECANISMO DE REACCION DE LA POLIFENOLOXIDASA ......................................... 22 2.3.4. CONTROL DE PARDEAMIENTO ENZIMTICO ............................................................... 22 2.3.4.1. Agentes anti-pardeamiento ............................................................................................. 24 2.3.4.1.1. Acidulantes ................................................................................................................. 24 2.3.4.1.2. Agentes Reductores ................................................................................................. 25 2.3.4.1.3. Agentes Quelantes ................................................................................................... 25 2.3.5. CIDO ASCRBICO .............................................................................................................. 26 2.3.6. ACIDO CITRICO ...................................................................................................................... 26 CAPTULO III............................................................................................................................................... 27 MATERIALES Y METODOLOGA ........................................................................................................... 27 3.1. MATERIALES .............................................................................................................................. 27 Materia prima .................................................................................................................... 27 Materiales de vidrio .......................................................................................................... 27 Equipos .............................................................................................................................. 27 Reactivos ........................................................................................................................... 27 Otros ................................................................................................................................... 28 Esquema experimental .................................................................................................... 28 Descripcin de procesos ................................................................................................. 30 Diseo estadstico ............................................................................................................ 32 3.1.1. 3.1.2. 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3.

METODOLOGA ......................................................................................................................... 28

CAPITULO IV .............................................................................................................................................. 34 RESULTADOS Y DISCUSIONES ............................................................................................................ 34 4.1. 4.2. 4.3. CARACTERIZACIN DE LA MATERIA PRIMA. ................................................................... 34 APLICACIN DEL DCCR ......................................................................................................... 35 GRFICOS DE SUPERFICIE DE RESPUESTA ................................................................... 39

CAPITULO V ............................................................................................................................................... 41 XI

CONCLUSIONES ....................................................................................................................................... 41 CAPITULO VI .............................................................................................................................................. 42 RECOMENDACIONES .............................................................................................................................. 42 CAPITULO VII ............................................................................................................................................. 44 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ........................................................................................................ 44

XII

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CAPTULO I INTRODUCCIN

1.1.

PROBLEMA

Cul ser el efecto de la concentracin de cido ctrico y cido ascrbico sobre la actividad enzimtica de la polifenol oxidasa en pulpa de manzana (Malus domestica) variedad Pachacamac licuada?

1.2.

HIPOTESIS

El incremento de la concentracin del cido ctrico y el cido ascrbico, disminuir la actividad enzimtica de la polifenol oxidasa de la pulpa de manzana licuada.

1.3.

OBJETIVOS

1.3.1. Objetivo General

Evaluar el efecto de las diferentes concentraciones de cido ctrico y ascrbico en la actividad enzimtica de la polifenol oxidasa

1.3.2. Objetivo Especfico

Caracterizar la pulpa licuada de manzana, tomando su actividad enzimtica inicial, antes de agregarle los cidos antipardeamiento

1.4.

JUSTIFICACIN

La manzana se caracteriza por presentar un alto ndice de oxidacin. En las industrias procesadoras y productoras de derivados de manzana el pardeamiento enzimtico causa cambios en el aroma y sabor (amargo,

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astringente), y puede reducir la calidad del producto, lo que representa prdidas en la produccin.

Por lo tanto, el pardeamiento enzimtico puede ser un problema significante, limitando la vida til de muchas materias primas procedentes de frutas u hortalizas, las cuales no han tenido un tratamiento trmico durante el procesado Los cidos retardan o detienen el pardeamiento. Las frutas cidas, con un pH bajo 5, como naranjas y limones, por tanto no se pardearan. Por consiguiente el jugo de limn, otros cidos, previenen el pardeamiento cuando son esparcidos sobre frutas frescas cortadas o licuadas. Es por ello que para este experimento hemos decidido utilizar factores naturales antipardeamiento que se encuentran comnmente en las frutas acidas, los cuales son: el cido ctrico y el cido ascrbico. Estos cidos, son considerados aditivos alimentarios antioxidantes o sinrgicos de antioxidante naturales, por ello su importancia de utilizacin para evitar problemas en la salud (Cubero 2002)

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CAPTULO II MARCO TEORICO

2.1. MARCO TEORICO CONCEPTUAL La Polifenol oxidasa, PPO, es una de las enzimas ms estudiadas en la industria de los alimentos ya que es la responsable de las reacciones de pardeamiento enzimtico en frutas y verduras. Una de las razones por las cuales es importante su estudio es porque comercialmente es indeseable, ya que modifica las propiedades sensoriales, nutricionales y en general de calidad que perjudica la comercializacin de un producto. La importancia del control de la polifenol oxidasa (PPO) radica en que determina en gran medida la calidad y valor econmico de las frutas y vegetales cosechados, almacenados y procesados. Las magulladuras, el troceado y otros procedimientos mecnicos daan las paredes de las frutas y vegetales lo cual permite que el oxigeno penetre, dando como resultado el oscurecimiento o las reacciones pardeamiento enzimtico. Esto ocurre con frutas como la manzana, la pera, el pltano y con otros alimentos como las patatas o los championes, etc. En la reaccin interviene como catalizador una enzima, la polifenoloxidasa (PPO), por la cual los fenoles se combinan con el oxgeno para transformarse en quinonas, que se polimerizan o reaccionan con grupos amino de diferentes compuestos formando compuestos coloridos que reciben el nombre de melaninas y que tienen propiedades antimicrobianas, y que podran ser un mecanismo de defensa de los vegetales contra infecciones. (Carlos Herrera, et al. Qumica de los alimentos 2003)

Para que ocurra una reaccin enzimtica de oscurecimiento, se requieren de elementos esenciales: la presencia de PPO activa, oxgeno y sustratos fenlicos. La prevencin del pardeamiento es posible, por lo menos temporalmente, a travs de la eliminacin de sustratos y/o inhibicin enzimtica. Algunos tipos actan directamente como inhibidores de PPO, otros propician un medio inadecuado para el desarrollo de la reaccin de oscurecimiento, y otros

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reaccionan con los productos de la reaccin de PPO antes de que lleguen a formar los pigmentos oscuros.

Tradicionalmente, el procesamiento convencional de alimentos logra prevenir el pardeamiento a travs de la inactivacin de PPO con calor, como en el caso del escaldado y la coccin de alimentos. La inactivacin con calor es un mtodo efectivo para prevenir el pardeamiento y la PPO se considera como una enzima de baja termo estabilidad, a pesar de que se han reportado diferencias en la estabilidad trmica para diferentes cultivos e isoformas de PPO (Zawistowski et al., 1991).

Bajo un pH 2,5 cesa la actividad enzimtica, que es ptima entre 5 y 7. Aunque luego se vuelva al pH original de la fruta, la enzima no se recupera, impidindose as el pardeamiento. Entre los cidos ms usados est el ctrico, que se agrega al prensar la fruta: caso de la manzana; tambin se usa, pero en menor proporcin, el cido ascrbico y el bisulfito de sodio.

Los compuestos utilizados tradicionalmente para inhibir la PPO son los sulfitos. Sin embargo, su empleo en la industria alimentaria ha sido restringido por causar reacciones alrgicas, especialmente en individuos asmticos.

Consecuentemente, se est evaluando la utilizacin de otros compuestos como potenciales inhibidores de la PPO, que garanticen productos frescos y seguros. En este trabajo, se evalu la actividad enzimtica de la PPO, medida por espectrofotometra.

2.2. ANTECEDENTES GUERRERO, 2009. Midi el efecto inhibidor del Isoespintanol, el cido ascrbico y mezclas de ambos sobre la actividad de la Polifenoloxidasa (PPO) en el banano, la cual es una enzima responsable de las reacciones de pardeamiento enzimtico en frutas y verduras. Utilizando un espectro colormetro X-RITE

modelo SP60, se midi el color sobre 10 gramos de pulpa al ser tratada con los antioxidantes a diferentes concentraciones cada hora por un lapso de 24 horas, obtenindose como resultado que el isoespintanol presenta una buena
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capacidad

para

inhibir

la

actividad

de

la

polifenoloxidasa

actuando

individualmente, las mezclas de ambos inhibidores no funcionan como mecanismo para la inhibicin.

CJUNO, 2009. Estudio el control del pardeamiento enzimtico de las frutas causada por la Tirosina, utilizando los inhibidores de quelatacin (EDTA), polimrico (quitosano) y enzimtico (papana). La actividad enzimtica de la tirosinasa se ha visto sustancialmente afectada por los tres inhibidores seleccionados, siendo el ms eficaz la papana seguido por el EDTA y en menor medida por el quitosano. La efectividad inhibitoria de la papana se atribuye a su accin hidroltica sobre los sitios activos 176G y 182E de la tirosinasa.

FLORES, 2010. Evalu el efecto del jugo de naranja cida (Citrus aurantium L) para inhibir el oscurecimiento enzimtico en anillos de manzana antes y despus de almacenados en congelacin por 21 das. La textura (firmeza) fue analizada nicamente despus de los 21 das de almacenamiento. Se aplicaron 3 tratamientos donde solo vario el tiempo de inmersin de las muestras experimentales 5, 15 y 30 minutos. Los tratamientos consistieron en la inmersin de los anillos de manzana en jugo de naranja cida, solucin de cido ascrbico al 2% y agua destilada (blanco). Por cada tratamiento se determin color y textura a cuatro anillos. Las pruebas analticas fueron mediciones instrumentales de color (parmetros a* y L*) y textura (firmeza). Los anillos de manzana Red Delicious tratados con jugo de naranja cida, independientemente del tiempo de inmersin (5, 15 y 30 min) de los tratamientos que recibieron, presentaron una mejor inhibicin del oscurecimiento enzimtico durante los 21 das de almacenamiento en congelacin.

BLACH, 2005. Estudia los cambios en la actividad peroxidasa (POD) y polifenoloxidasa (PPO) en rodajas de carambolo fresco cortado almacenado en atmsfera modificada. Se usaron rodajas de 5 mm de espesor en estado de madurez 5, carta de color, con aplicacin de tratamiento qumico previo, para posterior almacenamiento en atmsfera modificada y a granel, como contraste, durante 28 das a 7 C y 90% de HR. Se encontr que la actividad POD

aumenta en relacin a la disposicin de oxigeno presente en el empaque

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mostrando su mxima concentracin a los das 7 para granel y 14 para atmsfera modificada, diferencia que no se aprecia en la enzima PPO la cual alcanza su mximo el da 14 para los dos empaques. La inactivacin de esta enzima se relacion con el proceso de respiracin donde se mostr un punto mximo para el da 14 y 21 en granel y atmsfera modificada, respectivamente; con un cambio significativo en la concentracin de CO2, la acidez y la disminucin del pH, factores que inciden sobre la actividad de la enzima

permitiendo as la reduccin del oscurecimiento de las rodajas de carambolo, manteniendo su color verde por ms tiempo.

2.3. DEFINICION DE CONCEPTOS

2.3.1. PARDEAMIENTO ENZIMATICO Se conoce con el nombre de pardeamiento enzimtico a una alteracin qumica, aunque enzimtica en sus primeras etapas, que tiene como sustratos a los compuestos fenlicos que transforman en estructuras polimricas poco aclaradas, por lo general con coloraciones pardas. (Bello, 2000)

2.3.2. POLIFENOLOXIDASA (PPO) Las polifenol oxidasas (denominado abreviadamente como PPOs) son enzimas (encontradas principalmente en plantas y hongos) que catalizan una reaccin que transforma o-difenoles en o-quinonas. Las o-quinonas son muy reactivas y atacan a una gran variedad de componentes celulares, favoreciendo la formacin de polmeros negro-marrn. Estos polmeros son los responsables del oscurecimiento de tejidos vegetales cuando se daan fsicamente. Esto se observa fcilmente en pltanos o patatas, que tienen altos niveles de PPOs.

Cuando la clula se encuentra sana e intacta, las PPOs y sus sustratos, los fenoles, se encuentran en compartimientos separados (cloroplastos y vacuolas, respectivamente). Sin embargo, cuando la clula se desorganiza al envejecer, o como resultado de dao fsico o infeccioso, las enzimas y sustratos se juntan y

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sucede la reaccin descrita. El oscurecimiento producido por estas enzimas causa grandes prdidas a la industria agropecuaria. Por esto, el contenido de polifenol oxidasas, y su nivel de actividad son muy importantes para determinar la calidad de frutos y vegetales. (Boyer, R.F. 2000) La Comisin de Enzimas (EC) clasifica la polifenol oxidasa, con el nmero 1.10.3.1. Dentro de la clase de las Oxidoreductasas, actuando sobre difenoles con oxgeno como aceptor (Nevin-Ridley 2009).

La polifenol oxidasa conocida como tirosinasa, fenolasa, catecol oxidasa, odifenoloxidasa, monofenol oxidasa cresolasa, fue descubierta y aislada inicialmente de championes; ella acta sobre dos tipos de sustratos: monohidroxifenoles como por ejemplo el p-cresol hidroxilandolos en posicin orto con respecto al grupo hidroxilo original y sobre los dihidroxifenoles tales como el catecol, oxidndolos a benzoquinona por remocin de hidrgenos del grupo hidroxilo, (Ramrez et al.2003). La figura 1 muestra las dos actividades que ella presenta:

Figura 1. Reaccin generalizada de la PPO en plantas. Fuente: Gacche et al. (2003). La polifenol oxidasa requiere un pH ptimo de 5 a 7 y es inhibida a pH menores de 4, por lo tanto el ajuste con cidos puede usarse para controlar el pardeamiento enzimtico siempre y cuando se pueda tolerar la acidez. Es asimismo sensible a los cambios de temperatura, estando su actividad
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correlacionada a la temperatura de oxidacin. Se observa desnaturalizacin a partir de los 60 C, siendo la inhibicin completa a 80C. Reacciona como todo sistema enzimtico a bajas temperaturas, observndose una disminucin significativa en su actividad por debajo de los 8 C y a temperaturas de congelacin su actividad decrece notablemente, quedando en un estado latente para manipularse luego, de manera abrupta, durante la etapa de descongelacin (Vigyazo, 1981) La caracterstica estructural ms importante de la PPO es la presencia en su centro activo de dos tomos de cobre, unidos a histidinas; alrededor de los cobres, se sitan aminocidos hidrofbicos, con anillos aromticos importantes para la unin de los sustratos (Calvo 2007).

Los sitios activos muestran una estructura piramidal trigonal coordinadas por las esferas formadas por los tres ligandos de histidina y la molcula del solvente como puente. El tomo de azufre de la cistena 92 no se liga al centro del cobre pero est unido covalentemente al tomo del carbono de la histidina 109, ver figura 2 (Klabunde et al. 1998).

Figura 2. Geometra de los centros activos de la PPO. Fuente: Klabunde et al. (1998).

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2.3.3. MECANISMO DE REACCION DE LA POLIFENOLOXIDASA El mecanismo de reaccin de la PPO, se basa en la catlisis de dos etapas: oxidacin de un monofenol a o-difenol y la subsiguiente oxidacin de ste a oquinona, actividad cresolasa y catecolasa respectivamente. Siguiendo un mecanismo ordenado, la enzima liga primero el oxgeno y despus el monofenol. Se produce un cambio de valencia de los iones de cobre de Cu1+ a Cu2+ formndose un complejo que tiene un enlace O - O bien polarizado donde se produce la hidroxilacin a o-difenilo. La oxidacin del o-difenol a o-quinona finaliza el ciclo (Belitz & Grsosh 1997).

La polifenol oxidasa es capaz de catalizar reacciones de oxidacin de compuestos polifenlicos en presencia de oxgeno molecular y la presencia de los compuestos oxidados por la enzima son precursores de las reacciones de pardeamiento que ocurren en los procesos de pos-recoleccin y manipulacin de frutas y hortalizas (Ayaz et al.2007).

2.3.4. CONTROL DE PARDEAMIENTO ENZIMTICO El pardeamiento enzimtico se puede controlar a travs del uso de mtodos fsicos y qumicos, y, en la mayora de los casos, se emplean ambos. Los mtodos fsicos incluyen la reduccin de temperatura y/o oxgeno, uso de empaque en atmsferas modificadas o recubrimientos comestibles, tratamiento con irradiacin gama o altas presiones. Los mtodos qumicos utilizan compuestos que inhiban la enzima, eliminen sus sustratos (oxgeno y fenoles) o funcionen como un sustrato preferido.

Antes de que la FDA (Food and Drug Administration) revocara su estado GRAS (Generally Recognized As Safe) en 1986 debido a su riesgo potencial a la salud expuesto por consumidores sensibles (Taylor, 1993), los sulfitos se utilizaron ampliamente para controlar tanto el pardeamiento enzimtico como el no enzimtico. Debido a que se prohibi su aplicacin en frutas y verduras para consumo en crudo, se pens en otros qumicos para prevenir el pardeamiento enzimtico.
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A pesar de que se utilizaron diferentes inhibidores PPO (inhibidor de la pro toporfirinogen oxidasa) durante la investigacin (Vmos-Vigyz, 1981; McEvily et al., 1992; Iyengar y McEvily, 1992; Sapers, 1993), slo se discutirn a continuacin la aplicacin potencial de inhibidores para frutas y verduras cortadas en fresco. Es importante sealar que algunos qumicos utilizados en la investigacin no cumplen con los estndares de seguridad y plantean riesgos txicos, otros pueden impartir efectos sensoriales no deseables a los alimentos y otros han demostrados ser efectivos nicamente en jugos de frutas pero no en superficies cortadas.

Tradicionalmente, el procesamiento convencional de alimentos logra prevenir el pardeamiento a travs de la inactivacin de PPO con calor, como en el caso del escaldado y la coccin de alimentos. La inactivacin con calor es un mtodo efectivo para prevenir el pardeamiento y la PPO se considera como una enzima de baja termo estabilidad, a pesar de que se han reportado diferencias en la estabilidad trmica para diferentes cultivos e isoformas de PPO (Zawistowski etal., 1991).

No obstante, el uso de calor tambin tiene el potencial de causar la destruccin de algunos atributos de calidad del alimento, como la textura, el sabor y prdidas nutricionales. Se considera que si se aplica calor en productos frescos cortados, ste se debe minimizar y no causar el cese de la respiracin.

En lugar, o adems del uso de calor para controlar el pardeamiento enzimtico, frecuentemente se utilizan diferentes tipos de qumicos, generalmente referidos como agentes anti-pardeamiento. Para que ocurra una reaccin enzimtica de oscurecimiento, se requieren de elementos esenciales: la presencia de PPO activa, oxgeno y sustratos fenlicos. La prevencin del pardeamiento es posible, por lo menos temporalmente, a travs de la eliminacin de sustratos y/o inhibicin enzimtica.

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2.3.4.1. Agentes anti-pardeamiento Se utilizan varios tipos de qumicos para el control del pardeamiento. Algunos tipos actan directamente como inhibidores de PPO, otros propician un medio inadecuado para el desarrollo de la reaccin de oscurecimiento, y otros reaccionan con los productos de la reaccin de PPO antes de que lleguen a formar los pigmentos oscuros.

2.3.4.1.1. Acidulantes Mientras que se reporta un pH ptimo para PPO que flucta entre cido y neutral, en la mayora de frutas y vegetales la actividad de PPO ptima se observa a un pH de 6.0-6.5; se puede detectar poca actividad por debajo de un pH de 4.5. Tambin se ha reportado que una inactivacin irreversible de PPO se puede lograr a un pH menor a 3.0 (Ricardos y Hyslop, 1985).

Sin embargo, tambin se ha reportado que el PPO de la manzana es muy tolerante a la acidez y a un pH 3.0, retiene 40% de su actividad mxima (Nicols et al., 1994).

El uso de qumicos que bajan el pH del producto, o acidulantes, se pueden aplicar ampliamente para controlar el pardeamiento enzimtico. El acidulante comnmente utilizado es el cido ctrico.

Los acidulantes frecuentemente se usan en combinacin de otros tipos de agentes antipardeamiento, ya que es muy difcil lograr una inhibicin completa del oscurecimiento nicamente con el control del pH.

Adems, hay variaciones en el efecto de diferentes cidos sobre PPO; como un ejemplo, se ha reportado que el cido mlico es ms eficiente para prevenir el oscurecimiento del jugo de manzana que el cido ctrico (Ponting, 1960)

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2.3.4.1.2. Agentes Reductores Este tipo de agente antipardeamiento causa le reduccin qumica de las quinonas incoloras como resultado de la reaccin de PPO de regreso a odifenoles (Iyengar y McEvily, 1992).

Cuando todo el agente reductor aadido se oxida, las quinonas de la reaccin PPO pueden sufrir reacciones de oxidacin posteriores (sin involucrar PPO) y finalmente una rpida polimerizacin produciendo la formacin de pigmentos oscuros. Debido a la naturaleza oxidativa del pardeamiento enzimtico, los agentes reductores tambin se pueden aplicar para la prevencin de cambios en el color.

El cido ascrbico es probablemente el ms ampliamente utilizado como agente antipardeamiento, y adems a sus propiedades reductoras, disminuye ligeramente el pH. El cido ascrbico reduce a las venzo-quinonas, difenoles, y tambin tiene un efecto directo en PPO (Whitaker, 1994; Golan-Goldhirsh et al., 1992).

Los compuestos que contienen tioles, como la cistena, tambin son agentes reductores que inhiben el oscurecimiento enzimtico. Sin embargo, para un control completo del oscurecimiento, la cantidad requerida de cistena es muchas veces incompatible con el sabor del producto (Richard-Forget et al., 1992).

2.3.4.1.3. Agentes Quelantes Al complejar el cobre del sitio activo del PPO, los compuestos quelantes, como el cido tetraactico de la etilenediamina (EDTA) puede inhibir el PPO, que es un metal enzima que contiene cobre en su sitio activo. El Sporix (hexametafosfato de sodio cido) es un quelante poderoso y tambin un acidulante.

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La prevencin del oscurecimiento en el jugo de manzana y superficies cortadas se obtuvo con las combinaciones de Sporix y cido ascrbico (Sapers etal., 1989).

2.3.5. CIDO ASCRBICO Es el ms recomendado para evitar o minimizar el pardeamiento enzimtico, por su carcter vitamnico inofensivo. El cido ascrbico por s mismo no es un inhibidor de la enzima: acta sobre el substrato, de modo que puede adicionarse despus de haberse formado las quinonas. Tiene la propiedad de oxidarse a cido dehi-hidroascrbico, reduciendo la quinona a fenol. Esto lo hace hasta que se haya transformado totalmente en dehidroascrbico que ya no puede reducir las quinonas, de manera que stas continan, entonces, su oxidacin hasta la formacin de melanoides. El cido

dehidroascrbico an puede ser perjudicial al formar, en la esterilizacin posterior, melanoides con los aminocidos presentes; por eso la adicin de cido ascrbico no es eficaz en cerezas, ciruelas y frutillas. Sin embargo, si se agrega a otras frutas exceso de cido ascrbico para inactivar totalmente la enzima, se logra prevenir el pardeamiento en forma efectiva y permanente.

2.3.6. ACIDO CITRICO El cido ctrico es un cido orgnico tricarboxlico que est presente en la mayora de las frutas, sobre todo en ctricos como el limn y la naranja. Su frmula qumica es C6H8O7. Es un buen conservante y antioxidante natural que se aade industrialmente como aditivo en el envasado de muchos alimentos como las conservas de vegetales enlatadas. El cido ctrico ejerce un efecto inhibidor sobre la polifenoloxidasa mediante dos mecanismos: por quelacin del cobre (necesario para el funcionamiento de la enzima) y por acidulacin, disminuyendo el pH y por tanto la actividad de la misma. (Jiang, Fu, Zauberman, & Fuchs, 1999)

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CAPTULO III MATERIALES Y METODOLOGA 3.1. MATERIALES

3.1.1. Materia prima

Manzana Pachacamac (Malus domestica)

3.1.2. Materiales de vidrio

Pipetas (10,5 y 1 ml) Vasos de precipitacin (50ml) Matraz Erlenmeyer (100 ml) Fiola (50ml) Embudo de vidrio pequeo Tubos de ensayo. Probeta (100 ml)

3.1.3. Equipos

Licuadora de 5 velocidades Centrifuga Espectrofotmetro pH-metro

3.1.4. Reactivos

Acido ctrico cido ascrbico EDTA Catecol 0.1 M Buffer fosfato pH7 0.2 M Agua destilada
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3.1.5. Otros Cuchillos Peladores manuales Cucharas Tapers de Polietileno de 8 Oz Etiquetas Gradillas para tubos de ensayo Cubetas para espectrofotmetro Mortero

3.2.

METODOLOGA

3.2.1. Esquema experimental

VARIABLES DE ENTRADA: CONCENTRACION DE ACIDO ASCORBICO CONCENTRACION DE ACIDO CITRICO -

PULPA LICUADA DE MANZANA

pH ACTIVIDAD PPO

INHIBICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

VARIABLE RESPUESTA: ACTIVIDAD POLIFENOLOXIDA SA

PULPA LICUADA DE MANZANA INHIBIDA

Figura 3. Esquema experimental para la caracterizacin de la actividad enzimtica en la pulpa licuada de manzana

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Se realizaron 11 ensayos para concentraciones de cido ctrico de 10003000 ppm y cido ascrbico de 500-2500 ppm se efectuaron los siguientes pasos:

Se pesaron cido ctrico, cido ascrbico conforme al modelo estadstico, adems se agreg EDTA a una concentracin constante de 200 ppm para todos los ensayos. Se adicion 75 mL de agua destilada para la disolucin de los cidos a cada taper de 8 oz. Luego de ello se procedi a adicionar una cantidad estndar de 230 g de pulpa de manzana licuada a cada uno de los 11 envases.

Luego de haber pesado y dosificado a cada uno de ellos, se procedi a una agitacin manual por 30 segundos. Despus de esto se almacenaron los envases bien tapados en refrigeracin a 4 C por 4 horas.

En el anlisis en espectrofotmetro se realiz siguiendo el mtodo de Potig y Joslyn 1948, con algunas modificaciones. Pasadas las 4 horas, se procedi a extraer de cada taper 7 gr de pulpa licuada de manzana y se le adiciono 7 ml de agua destilada para su posterior centrifugacin, este proceso se realiz durante 10 minutos a 5000 rpm. Se extrajo el sobrenadante y se procedi a filtrar, el filtrado se guard en refrigeracin a 4 C durante 24 horas

Luego de 24 horas, se llevaron las muestras a un espectrofotmetro de luz visible para determinar la actividad de la polifenol oxidasa. En un tubo de ensayo aparte se adiciono 2 mL de catecol al 0.1 % diluido y 2 mL de buffer fosfato a pH 7. A este tubo se aadi 1 mL de extracto de manzana. Se agito manualmente y de esta solucin se verti en la celda espectrofotomtrica. Se hizo 10 lecturas cada 30 segundos para cada uno de los 11 ensayos.

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3.2.2. Descripcin de procesos

MANZANA PACHACAMAC (MALUS DOMESTICA)

Recepcion

Seleccion

Lavado

Pelado

Licuado

Envasado

Almacenamiento

Figura 4. Flujograma de procesos para la medicin de la actividad enzimtica

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El flujograma del proceso se muestra en la Figura 4 cuyas operaciones se detallan a continuacin:

Recepcin: se realizara un pesado precio.

Seleccin: se realizara una inspeccin visual de los frutos, eliminando aquellos picados por insectos, roedores y que hayan sufrido daos o con signos de descomposicin.

Lavado: se realiza con la finalidad de eliminar cualquier tipo de partculas extraas, suciedad y restos de tierra que pueda estar adherida a la materia prima. Posteriormente se procedo a una desinfeccin clorada (40 ppm) con el fin de reducir la carga microbiana.

Pelado: los frutos sern pelados en forma manual con cuchillo, separando la cascara de la pulpa.

Licuado: se licuo el fruto pelado y cortado en una licuadora elctrica Oster de 5 velocidades

Envasado: se envasara en tapers de polietileno de 8 oz.

Almacenamiento: se almacenaran en refrigeracin a 4C, 90 % HR por 4 horas, para luego aislar la enzima

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3.2.3. Diseo estadstico Para evaluar el efecto en la actividad de la polifenol oxidasa (PPO), se realiz un diseo compuesto central rotacional (DCCR); en primer lugar se dise en planeamiento factorial completo 22, incluido 4 puntos axiales y 3 repeticiones en el punto central, totalizando 11 ensayos.

Diseo compuesto central rotacional (DCCR) En el cuadro 1 se describe los valores de las 2 variables independientes con sus respectivos niveles mnimos, centrales y mximos.

Las variables utilizadas son las siguientes:

X1: concentracin de cido ctrico = 1000-3000 ppm X2: concentracin de cido ascrbico = 500-2500 ppm Cuadro1. Codificacin de variables Variables independientes Variable codificada Nivel Nivel bajo alto Concentracin de cido ctrico -1.41 1.41 (ppm) Concentracin de cido ascrbico -1.41 1.41 (ppm) Variable natural Nivel Nivel bajo alto 1000 3000 500 2500

Los valores del cuadro 2, son utilizados para desarrollar el planteamiento del cuadro 3 teniendo en cuenta como respuesta la actividad de la polifenol oxidasa (Y1) Cuadro 2. Valores utilizados en DCCR para las tres variables seleccionadas Variables independientes X1 X2

-1,41 1000 500

-1 1291 791

0 2000 1500

1 2709 2209

1,41 3000 2500

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Cuadro 3. Valores codificados de respuestas de la actividad de polifenol oxidasa (Y1) X1(Ac. Citrico) ppm ENSAYOS CODIGO REAL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 1 -1 -1 -1.41 1.41 0 0 0 0 0 2709 2709 1291 1291 1000 3000 2000 2000 2000 2000 2000 X2 (Ac. Ascrbico) ppm CODIGO REAL 1 -1 1 -1 0 0 -1.41 1.41 0 0 0 2209 791 2209 791 1500 1500 500 2500 1500 1500 1500 Act. Enz (Y1) UPFO/mLmin

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CAPITULO IV RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1.

CARACTERIZACIN DE LA MATERIA PRIMA. En la caracterizacin de la pulpa licuada de manzana se determin el pH y la actividad enzimtica de la PPO con la finalidad de conocer las condiciones iniciales de trabajo. Como se muestra en el cuadro 4 el pH y la actividad enzimtica estn en 6.1 y 15 UPF/ml.min respectivamente. Estos parmetros fueron calculados por el pH-metro y el mtodo de Potig y Joslyn 1984 modificado (Anexo 1). Cuadro 4. Caractersticas fsico-qumicas de la pulpa licuada de manzana Pachacamac (Malus domestica) pH 6.1 Actividad enzimtica 15 UPFO/ml.min Las caractersticas sensoriales de la pulpa licuada de manzana que se emple en esta investigacin se muestran en el cuadro 5 Cuadro 5. Caractersticas sensoriales de la pulpa licuada de manzana Pachacamac (Malus domestica) Sabor Olor Textura Color Estado Madurez Tpico a manzana fresca, dulce Caracterstico, fragante, exento de olores extraos Suave con presencia de grumos Verde claro, de Maduro

Diferentes estudios han informado que la actividad de dela PPO en frutas como la manzana se encuentra principalmente en el centro de la fruta y

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de forma secundaria cerca de la cascara. As mismo la relacin de la PPO en cuanto a su ubicacin dentro de la clula y el momento de maduracin de la fruta, siendo que cuando esta est ms madura la PPO se localiza en vacuolas dentro de la clula mientras que en la fruta inmadura se localiza en organelos diversos (Lamikanra,2002).

En el caso de la manzana conforme avanza en su maduracin la actividad de la PPO aumenta en l cascara y disminuye en la pulpa, sin embargo el tiempo de maduracin no es una influencia primordial en cuanto al obscurecimiento de la fruta. (Lamikanra, 2002). 4.2. APLICACIN DEL DCCR Cuadro 6. Respuesta de la matriz con datos reales y codificados de DCCR para la actividad enzimtica de la PPO. X1(Ac. Citrico) ppm ENSAYOS CODIGO REAL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 1 -1 -1 -1.41 1.41 0 0 0 0 0 2709 2709 1291 1291 1000 3000 2000 2000 2000 2000 2000 X2 (Ac. Ascrbico) ppm CODIGO REAL 1 -1 1 -1 0 0 -1.41 1.41 0 0 0 2209 791 2209 791 1500 1500 500 2500 1500 1500 1500 Act. Enz (Y1) UPFO/mLmin 6.1 7.9 14.4 10.8 8.2 5.3 8 5.6 6.6 5.4 6.9

En el cuadro 6 los valores reales y codificados con su respectiva respuesta (Actividad enzimtica). La actividad de la PPO en

UPFO/ml.min para los 11 ensayos vari entre 5.3 y 14.4.

En el cuadro 7 se muestran los efectos de las combinaciones de las variables estudiadas, para la actividad enzimtica, bajando el valor de alfa hasta un 0.1, obtenemos que el nico valor significativo es el cido ctrico (p<0.1).
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Weller et al (1997) trataron la carambola con concentraciones de cido ctrico reportando que un mayor contenido de cido ctrico en solucin acuosa incrementa el tiempo de vida til del producto, estabilizando el pardeamiento enzimtico. En el ensayo 6 con alta concentracin de cido ctrico se obtiene el nivel ms bajo de polifenol oxidasa (5.3 UPFO/mLmin), comparando con los ensayos 3 y 4 donde se obtiene una alta actividad enzimtica (14.4 y 10.8 UPFO/mL-min) y la concentracin de dicho acido es baja.

Dentro de los antioxidantes naturales que posee la manzana estn el cido ascrbico o vitamina C, as como distintos flavonoides. A travs de varios estudios se ha demostrado que el cido ascrbico evita el oscurecimiento producido por la enzima polifenol oxidasa; sin embargo, su concentracin en la pulpa de la manzana no es suficiente para evitarlo de manera natural.

Lozano et al. (1994) estudio el pardeamiento en pulpa de manzana atribuyendo que concentraciones altas de cido ascrbico causa una tasa lenta de pardeamiento en un periodo inicial de tiempos cortos. Las

concentraciones de cido ascrbico trabajadas en esta investigacin pudieron no ser las adecuados, por ello no es una variable lo suficientemente significante.

La sinergia cido ascrbico-cido ctrico indica que su efecto es no significativo al inhibir la PPO al analizar su actividad. El cido ascrbico reduce el pardeamiento de la PPO convirtiendo las o-quinonas a

compuestos fenlicos antes que ellos se transformen a pigmentos marrones. No obstante el cido ascrbico es consumido en el proceso y consecuentemente provee solamente temporal proteccin en contra del pardeamiento (Vamos-Vigyazo, 1992), es por eso que la actividad del cido ascrbico no es significativa tanto individualmente como en mezclas con bajas concentraciones de cido ascrbico.

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Cuadro 7. Coeficientes de regresin para la respuesta de la actividad enzimtica Actividad Enzimtica FACTOR Media (1) Ac. Citrico (L) Ac. Citrico (Q) (2) Ac Ascrbico (L) Ac. Ascrbico (Q) 1L by 2L Coef. Regresin 16.49567 -0.00656 0.00000 -0.00097 0.00000 -0.00000 Error Puro 12.10760 0.00895 0.00000 0.00784 0.00000 0.00000 P 0.231224 0.074747 0.375065 0.825204 0.364066 0.313704

Los coeficientes de regresin para la actividad enzimtica (y) del cuadro 10 permitieron elaborar un modelo matemtico de primer orden donde fueron considerados los siguientes factores.

Y=16.49567 - 0.00656X1 - 0.00097X2

Dnde: Y = Actividad Enzimtica X1 X2 = Ac. Ctrico (ppm) = Ac Ascrbico (ppm)

En el cuadro 8 observamos que en la mayora de las desviaciones fueron altas indicando la poca confiabilidad del modelo para describir el comportamiento de la variacin de la actividad enzimtica de la PPO.

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Cuadro 8. Valores de la actividad enzimtica experimentales y previsto por el modelo y su desviacin relativa

ENSAYOS Actividad Actividad Desvio enzimtica enzimtica relativo (%) experimental previsto 1 6.1 -3.43470151 156% 2 7.9 -2.05248287 126% 3 14.4 5.87055936 59% 4 10.8 7.252778 33% 5 8.2 8.47128145 3% 6 5.3 -4.65320496 188% 7 8 2.88380457 64% 8 5.6 0.93427193 83% 9 6.6 1.90903825 71% 10 5.4 1.90903825 65% 11 6.9 1.90903825 72%

12 10 8 Valores Predichos 6 4 2 0 0 -2 -4 2 4 6 8 10 12 14 16 y = 0.951x - 4.0024 R = 0.3916

Vaores observados

Figura 5. Valores predichos y valores observados para la actividad enzimtica.

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El error cuadrtico estadstico indica que el modelo ajustado explica en un 61.098% la variabilidad de la Actividad enzimtica. Con esto deducimos que el modelo no es adecuado para describir el comportamiento de la actividad enzimtica.

Gutirrez y de la Vera (2004) indican que los modelos adecuados son aquellos que presentan R2 ajustado mayores a 70 %, y el valor de R2 ajustado obtenido lo podemos observar en el cuadro 9 es de tan solo 22.196% Cuadro 9. Valores de R2 y R2 ajustado R2 R2 ajustado 61.098% 22.196%

En la figura 7 se observa el cambio de la absorbancia entre el valor medido entre el tiempo inicial y los tiempos medidos estipulados en el esquema experimental. Se aprecia en el sistema claramente que la lnea inferior correspondiente al tratamiento 6 (T6) presenta una menor pendiente y por ende una menor actividad enzimtica, siendo el tratamiento al que se le aplic mayor concentracin de cido ctrico y el que obtuvo mejor resultado en el proceso inhibitorio de la PPO. As mismo, el tratamiento 3 (T3), ubicado en la parte superior de la figura, fue el que obtuvo mayor actividad enzimtica, pero no fue precisamente el tratamiento al que se le agreg menor cantidad de cido ctrico, lo que pudo ocurrir es que no existi buena sinergia entre las cantidades de cidos aadidos al tratamiento . 4.3. GRFICOS DE SUPERFICIE DE RESPUESTA Del anlisis anterior, el modelo es significativo solo para la variable del cido ctrico, para la respuesta actividad enzimtica.

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Se construy un diagrama de superficie de respuesta incluyendo ambas variables, las cuales permitieron definir las condiciones mas adecuadas que minimicen la actividad enzimtica de la polifenol oxidasa.

Como fue obvio, la actividad disminuyo cuando mayor es la concentracin de los cidos, en el caso del cido ascrbico, las concentraciones utilizadas fueron muy bajas y en el caso del acido ctrico, se verifica que cuando los valores oscilan entre 2500 3200 ppm, la actividad enzimtica alcanza un valor mnimo de 6 UPFO/mLmin

Figura 6. Superficie de respuesta y curvas de contorno para la actividad enzimtica en funcin del cido ctrico y ascrbico

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CAPITULO V CONCLUSIONES

Comparando la actividad enzimtico inicial (15 UPFO/mL-min) con las actividades enzimticas de todos los ensayos, podemos decir que esta disminuyo con la adicin de los cidos ctrico y ascrbico (14.4 a 5.3 UPFO/mLmin)

De acuerdo con los resultados estadsticos la variable significativa fue el cido ctrico

La mayor actividad enzimtica (14.4 UPFO/mL-min) se dio a concentraciones de 1291 ppm de cido ctrico y 2209 ppm de cido ascrbico, mostrndonos que no hubo una relacin coherente entre ambas variables.

La menor actividad enzimtica se dio a concentraciones de 3000 ppm de cido ctrico y 1500 ppm de cido ascrbico, mostrndonos que la nica variable significativa fue el cido ctrico

41

CAPITULO VI RECOMENDACIONES

No se pudo medir el pH, debido a que no estaba disponible el pH-metro. Se recomienda hacerlo ya que esto hubiera permitido establecer rangos de pH en la cual fue efectiva la inhibicin

El modelo estadstico, no fue adecuado para relacionar las variables, debido a su baja aceptacin y bajo valor nivel de confiabilidad. La nica variable significativa fue el cido ctrico. Durante el procedimiento, el factor que pudo haber sido la causa de esta incoherencia entre variables, fue el momento de envasado, debido a que la unin entre el contenedor y su tapa no fue muy fuerte, permitiendo el acceso de oxgeno, lo cual se evidencia al observar la muestra nmero 4 y 6 las cuales al extraer su extracto, presentaron una coloracin oscura, a comparacin de las otras muestras que presentaron una coloracin verde clara casi transparente. La utilizacin de envases hermticos seria adecuada para evita este inconveniente adems de utilizar un rango mayor de concentraciones para el cido ascrbico.

Realizar estudios con otras materias, para comparar la efectividad d estos inhibidores y establecer los niveles ptimos sobre la actividad de la polifenoloxidasa.

Se considera que es necesario realizar estudios ms detallados sobre stos enzimas, por medio de la determinacin de parmetros cinticos que aporten mayor informacin.

Estudiar la vida til a partir de pulpa de manzana inhibida para determinar su aceptabilidad y tiempo de almacenamiento en refrigeracin, cono insumo alimentario.

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Aplicar otros agentes qumicos aprobados por la norma alimentaria sobre la manzana para determinar el porcentaje de inhibicin de la polifenoloxidasa

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CAPITULO VII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS MORALES V. Fresh-cut Fruits and Vegetables Science, Technology and Market. USA, 2002. AVALLONE, c, Cravzov, A; Montenegro, SY Pellizari, E.2002.Estudio de la actividad de peroxidasa, pectinesterasa y polifenoloxidasa en extracto enzimtico de sanda. Facultada de Agroindustrias UNNE Argentina. Badul, S.1996.diccionario de tecnologa de alimentos .Edicin Alambra Mexicana .Mxico. CAMPOS,R;Deffilippi,B;romero ,,P;Valds,H;Robledo,P;Prieto,H.2008.Effect of harvest time and L-cysteinas as an antioxidant on flesh browning of fresh-cut cherimoya (Annona cherimola Mill.),Chilean JOURNAL OF Agricultural Research 68(3);217-227. CASSANAVE, M.1980.Extraccin, Caracterizacin de Pulpa de manzana .Tesis para optar el ttulo en industrias alimentarias .unalm.Lim-PER. CERDAS, m; Umaa, G.y Castro, j.2007.Manula de Manejo Pos cosecha de Anona.Pp1-66 CHEFTEL, J Y Cheftel, H.1999.introduccin a la Bioqumica y Tecnologa de los alimentos Volumen Editorial Acribia S.A. CHIRALT, A.1998.Cambios en las propiedades pticas durante el procesado de Vegetales. Departamento DE Tecnologa de Alimentos. Instituto de Ingeniera de Alimentos para el desarrollo .Universidad Politcnica de Valencia-Espaa. FENNENA, o.199.Quimica de los alimentos, II Edicin .Editorial Acribia S.A.Zaragoza, Espaa. FERNANDEZ, J.2004.Tecnologia de alimentos. Tema 6.Escaldado y Pelado al vapor .Pp3-12. HILLER, d.d.2001.Quimica de los alimentos. Manual de Laboratorio .Editorial Limusa.S.A.de C.V. Mxico D.F OLIVAS, G; Barbosa-Canovas, G.2004.Edible coating for fresh cut fruits. Critical review in Food science and Nutrition, 45:657-670

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ANEXOS ANEXO 1 Mtodo de Potig y Joslyn 1948,

Para medir la actividad enzimtica de las muestras, estas se llevan a un espectrofotmetro de luz visible y se trabaja con en una longitud de onda de 420 nm

En un tubo de ensayo aparte se adiciono 2 mL de catecol al 0.1 % diluido y 2 mL de buffer fosfato a pH 7. A este tubo se aadi 1 mL de extracto de manzana. Se agito manualmente y de esta solucin se verti en la celda espectrofotomtrica. Se hizo 10 lecturas cada 30 segundos para cada uno de los 11 ensayos.

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ANEXO 2

AJUSTE DE REGRESION PARA LOS DATOS EXPERIMENTALES

T(MIN) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10

T1 0.078 0.089 0.096 0.101 0.106 0.112 0.116 0.121 0.125 0.128 0.126 0.128 0.13 0.133 0.136 0.137 0.14 0.142 0.144 0.146 0.149

T2 0.196 0.205 0.214 0.218 0.223 0.229 0.234 0.24 0.244 0.245 0.249 0.252 0.257 0.26 0.263 0.267 0.27 0.272 0.275 0.277 0.279

T3 0.189 0.211 0.226 0.239 0.253 0.263 0.276 0.291 0.297 0.304 0.31 0.314 0.319 0.323 0.327 0.331 0.335 0.338 0.34 0.343 0.345

T4 0.192 0.206 0.224 0.229 0.238 0.243 0.255 0.265 0.271 0.273 0.276 0.280 0.285 0.291 0.293 0.295 0.298 0.300 0.305 0.310 0.312

T5 0.176 0.186 0.194 0.201 0.207 0.213 0.218 0.223 0.227 0.231 0.236 0.239 0.242 0.246 0.248 0.252 0.254 0.257 0.26 0.261 0.262

T6 0.009 0.013 0.017 0.019 0.022 0.023 0.029 0.032 0.038 0.041 0.042 0.044 0.048 0.049 0.05 0.053 0.055 0.057 0.057 0.059 0.061

T7 0.186 0.196 0.204 0.210 0.215 0.221 0.226 0.232 0.236 0.238 0.243 0.246 0.250 0.253 0.256 0.260 0.262 0.265 0.268 0.269 0.271

T8 0.043 0.050 0.056 0.059 0.063 0.067 0.071 0.075 0.080 0.083 0.083 0.085 0.087 0.090 0.092 0.093 0.096 0.098 0.099 0.101 0.103

T9 0.117 0.125 0.133 0.136 0.141 0.146 0.150 0.155 0.160 0.161 0.163 0.166 0.169 0.172 0.175 0.177 0.180 0.182 0.183 0.186 0.188

T10 0.162 0.172 0.179 0.183 0.188 0.194 0.198 0.203 0.207 0.209 0.210 0.212 0.214 0.218 0.220 0.222 0.225 0.227 0.229 0.231 0.234

T11 0.109 0.118 0.125 0.130 0.135 0.140 0.145 0.149 0.150 0.157 0.159 0.162 0.165 0.168 0.170 0.173 0.175 0.178 0.179 0.181 0.183

46

ANEXO 3

ABSORBANCIA VS TIEMPO

0.4

0.35

T1 T2 T3 T5 T6 T4 T7 T8 T9
0 2 4 6 8 10 12

0.3

Absorbancia

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

Tiempo (min)

T10

Figura 7. Tiempo vs Absorbancia medida en el espectrofotmetro.

47

ANEXO 4

CURVA Y PENDIENTE DE CADA ENSAYO Una unidad de Polifenoloxidasa (UPFO) es 0.001 y se expresa en UPFO /ml.min Ensayo UPFO/ml.min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 6.1 y = 0.0079x + 0.2069 7.9 y = 0.0144x + 0.2221 14.4 y = 0.0082x + 0.1891 10.8 y = 0.0053x + 0.0126 8.2 y = 0.0108x + 0.2144 5.3 y = 0.008x + 0.198 8 y = 0.0056x + 0.0518 5.6 y = 0.0066x + 0.1272 6.6 y = 0.0064x + 0.1744 5.4 y = 0.0069x + 0.1201 6.9 Curva y = 0.0061x + 0.0925

48