VALIDACIN DE LA TCNICA DE PETRIFILMTM PARA LA DETECCIN DE Listeria spp. EN CARCASAS DE POLLO. QUIZ SEMINARIO. ELABORACIN ANTEPROYECTO.

Entregar el 31 de mayo en medio fsico e impreso. MR=Mauricio rodriguez y esta escrito es por me toca a mi, esta en rojo para resaltar, esta en azul para que vea que es lo que toca hacer!! 1. El Ttulo es correcto o que le adicionara o quitara DG 2. Con el texto entregado formule una introduccin y justificacin DG 3. Formule el objetivo general y los objetivos especficos (revisar la metodologa para organizarlos). DG 4. Haga un marco terico de dos hojas e donde relacione la temtica con ttulos, subttulos y numeracin. MR subttulos, cambiar sinnimos 5. Formule los resultados esperados MR 6. Formule un cronograma de actividades. DG 7. Elabore una bibliografa de acuerdo a la informacin o prrafos tomados para elaborar este anteproyecto. MR NOTA: Deben referenciar los prrafos citados dentro del texto. TABLA DE CONTENIDO.

1. INTRODUCCION 2. JUSTIFICACION 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GENERAL 3.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 4. MARCO TERICO 4.1. GENERALIDADES DEL GNERO DE Listeria spp. 4.1.1. Clasificacin taxonmica 4.1.2. Requerimientos nutricionales 4.1.2.1. Temperatura 4.1.2.2. pH 4.1.2.3. Sales 4.1.2.4. Actividad de agua (aw)

3 6 9 9 9 10 10 11 12 14 15 15 16

4.1.3. Actividad bioqumica 4.1.4. Constitucin antignica 4.1.5. Hbitat donde puede aislarse L. monocytogenes 4.1.5.1 Fuentes ambientales 4.1.5.2. Plantas de produccin y procesadoras de alimentos 4.1.5.3. Carne de pollo 4.2. LISTERIOSIS HUMANA 4.2.1. Listeriosis invasiva 4.2.2. Listeriosis no invasiva (Gastroenteritis Listerial) 4.2.3. Epidemiologa de la listeriosis 4.3. INCIDENCIA DE L. monocytogenes EN CARNE DE POLLO 4.4. PREVENCION Y CONTROL 4.5. MTODOS DE IDENTIFICACIN DE Listeria spp. 4.5.1. Mtodos tradicionales para la identificacin de Listeria spp. 4.5.2. Mtodos alternativos (rpidos) para la identificacin de Listeria spp. 4.5.2.1. Mtodos fenotpicos 4.5.2.2. Mtodos genotpicos 4.6. MTODOS PARA EL MUESTREO MICROBIOLGICO DE SUPERFICIES 4.7. PLACAS PETRIFILMTM PARA MONITOREO DE Listeria EN AMBIENTES 4.8. VALIDACIN DEL PETRIFILMTM 4. 8.1. Protocolo de validacin 4.8.2. Mtodos cualitativos protocolo tcnico para valoracin 4.8.3. Protocolo de medicin 4.8.4. Clculos e interpretacin 5. MATERIALES Y MTODOS 5.1. DISEO DE LA INVESTIGACIN 5.2. MTODOS 5.2.1. Contaminacin artificial de las carcasas de pollo 5.2.2. Anlisis microbiolgico tradicional

16 17 19 19 22 26 29 30 33 33 35 36 42 42 44 44 45

46

48 49 54 54 55 56 58 58 58 58 59

5.2.3. Anlisis rpido (PETRIFILMTM) 6. 7. 8. 9. RESULTADOS ESPERADOS CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES PRESUPUESTO REFERENCIAS

59 61 62 63 64

ESTA PARTE LES PUEDE SERVIR PARA ELABORAR ALGUNAS PREGUNTAS

L. monocytogenes es un microorganismo que se considera un problema de salud pblica, porque a pesar de ser patgeno para un pequeo grupo de la poblacin es un microorganismo zoo notico, que puede causar listeriosis en humanos a partir de animales que presenten la enfermedad. Una de las fuentes principales de trasmisin son los alimentos contaminados por este microorganismo (Moreno, 1976).

L. monocytogenes es un microorganismo reconocido como patgeno emergente en alimentos de consumo regular, difiere en muchos aspectos de los dems patgenos trasmitidos por alimentos: es propagado, es resistente a condiciones ambientales diversas tales como pH bajo y las concentraciones elevadas de NaCl, siendo adems microaeroflico (Doyle et al. 2001).

Los distintos modos a travs de los cuales la bacteria es capaz de entrar a las plantas de tratamiento de alimentos, la capacidad de sobrevivir durante perodos prolongados en el ambiente (tierra plantas, y agua), la capacidad para crecer a temperaturas muy bajas (de 2 a 4C) y sobrevivir en el interior o en la superficie de los alimentos durante perodos prolongados en condiciones adversas, la habilidad de adherirse a las superficies formando biopelculas, y la resistencia que tiene a los procesos de limpieza y a los desinfectantes, han

hecho que L. monocytogenes se convierta en una preocupacin para la industria agroalimentaria en la ltima dcada (Doyle et al. 2000; Membr et al. 2004).

Esta bacteria en las personas, afecta con mayor frecuencia el tero grvido, el Sistema Nervioso Central (SNC) y el torrente sanguneo; las manifestaciones de listeriosis incluyen bacteremia, meningitis, encefalitis, endocarditis, meningoencefalitis, aborto espontneo, enfermedad neonatal, nacimiento prematuro, enfermedad prodrmica en mujeres embarazadas, septicemia y muerte prenatal (Basser et al. 1995; Alpas et al. 1999). En el ao 2000 en Colombia la produccin de pollo fue de 502.459 toneladas, de las cuales Santander produjo 93.099 toneladas, equivalentes al 18.53% de la produccin nacional, ubicndose como el segundo productor despus de Cundinamarca (Fonavi y Fenavi, 2000). En Colombia, la carne de pollo es un alimento de consumo masivo, de importancia econmica que puede vehiculizar a Listeria. Durante las cadenas de matanza, procesado y empacado, las carcasas de pollo pueden contaminarse con materia fecal, con los contenidos estomacales y la piel. Fuentes adicionales de contaminacin microbiana son los utensilios y equipos, contacto humano y contacto entre carcasa y carcasa (Capita et al. 2004). El mantenimiento estricto de buenas prcticas higinicas en mataderos y expendios en la produccin de carne de pollo es de importancia crucial en la prevencin de la contaminacin microbiana de las carcasas, en el inters de asegurar la calidad de la carne y la proteccin de la salud (Zweifel y Stephan, 2003).

La implementacin del Sistema de Anlisis de Riesgos y los Puntos Crticos de Control (HACCP) en los mataderos no lleg sino hasta el ao 2002 en Estados Unidos (Rivas y Sevilla, 2004). Adicionalmente, aunque existe una poltica de cero tolerancia para L. monocytogenes en carnes crudas de pollo, el control de este microorganismo slo se logra con la coccin adecuada, manipulacin, refrigeracin y almacenamiento (Chen 2003). et al.

Uno de los problemas que contribuyen con la escasa investigacin de L. monocytogenes en alimentos es el largo tiempo que se requiere para realizar la identificacin microbiolgica de este patgeno. Por este motivo en la actualidad se buscan tcnicas rpidas y sensibles que permitan detectar el microorganismo en materiales crudos, para llevar un control eficiente del proceso de elaboracin, monitorear las prcticas de limpieza e higiene y tomar decisiones a corto plazo (Gray y Killinger, 1966). Recientemente en Colombia se valid la tcnica de PCR para la deteccin rpida sensible y confiable de L. monocytogenes en leches crudas, quesos frescos, carne de res y carne de pollo, basada en la especificidad de los primers LI1 y U1 que reconocen el gnero Listeria amplificando un fragmento de 938pb correspondiente una secuencia del rDNA 16S y a los primers LF y LR que reconocen el gen hlyA de L. monocytogenes, amplificando un fragmento de 750pb (Zamora et al. 2000; Burbano et al. 2003; Sierra et al, 2004a; Sierra, 2004b Torres et al, 2004b; Torres, 2004c). Por tal motivo, es necesario validar otros mtodos rpidos, especficos y sensibles para la deteccin de Listeria spp., en este caso en superficies de pollo.

La listeriosis es una enfermedad ocasionada por Listeria monocytogenes y forma parte de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), los cuales actan solamente como vehculo en la penetracin del microorganismo en el organismo (Allman et al. 1995; Da Silva y Tibana 1995; Boerlin et al. 1997).

La listeriosis es una enfermedad de origen alimentario atpica, de gran inters para la salud pblica a causa de la gravedad y el carcter no entrico de la enfermedad (meningitis, septicemia, aborto), la proporcin elevada de muerte (20-30%), el tiempo de incubacin frecuentemente largo, y la predileccin por individuos con enfermedades subyacentes que conducen al deterioro de la inmunidad mediada por las clulas T (Doyle et al. 2001).

Desde 1926, se ha sabido de la existencia de L. monocytogenes, este microorganismo fue aislado a causa de una epidemia que afect a conejos y cobayos. Sin embargo slo en la dcada de 1980 cobra real importancia al ser el agente causal de brotes epidmicos en

Nueva Escocia, Canad, Estados Unidos y Europa. Estos brotes fueron ocasionados por el consumo de leche pasteurizada, quesos y vegetales (Cormac et al, 1996; Blais et al. 1997).

Dentro de los grupos de mayor riesgo figuran los nios recin nacidos (10 casos por 100,000 habitantes) y personas mayores de 60 aos (1.4 casos por 100.000 habitantes) con mayor predominancia en hombres (Schlech y Walter, 2000). Otro grupo corresponde a mujeres embarazadas, pacientes inmunodeprimidos, con cncer, y pacientes con SIDA (FDA, 2003), as como las personas sometidas a transplantes de rganos y malignidades hematolgicas, hemacromatosis, diabetes mellitus, cirrosis y falla renal que han sido tratadas con hemodilisis o dilisis peritoneal (Schlech y Walter, 2000).

Los reportes de listeriosis en mujeres embarazadas en Estados Unidos indicaron 12 a 17% de casos, mientras que en Europa se report una incidencia de 0.5 a 3% (Escarcega, 1999). En Colombia, no existen estadsticas oficiales, slo hay reportes aislados como los ocurridos en 1992 por el Hospital Central de la Polica de Bogot (2 casos de listeriosis menngea aguda supurativa y romboenceflica) (Snchez et al. 1992); en 1994 por el Hospital Universitario del Valle (3 casos de listeriosis neonatal) (Payn y Astudillo, 1994); en 1999 por la Fundacin Clnica Valle del Lili (19 casos: 10 en adultos inmunosuprimidos, 2 en mujeres embarazadas, 6 en neonatos y un adolescente, la mayora con septicemia) (Crespo et al. 1999); y en el 2001 por el Hospital Central de la Polica de Bogot (1 caso de listeriosis perinatal) (Snchez et al. 2001).

En los ltimos aos el nmero de casos de Listeriosis reportados mundialmente ha aumentado, debido al perfeccionamiento de las tcnicas microbiolgicas, al incremento de nmero de personas con el riesgo de adquirir esta enfermedad y a la tendencia de ingerir alimentos como leches crudas y sus derivados, carnes, pollo, pescados y vegetales, que por sus caractersticas se prestan con ms facilidad para ser los vehculos de trasmisin (Crandall y Montville, 1988; Blais y Phillippe, 1993). L. monocytogenes es una bacteria patgena humana que ha sido asociada con productos crudos de pollo (posible vector en la transmisin de la listeriosis). Mientras su morbilidad es baja, este microorganismo puede causar alta mortalidad en comparacin con

Salmonelosis o Campylobacteriosis. Listeria puede estar presente dentro de la planta procesadora y puede en algn momento llegar a contaminar las superficies de contacto con los alimentos, y al producto mismo. Franco et al, 1995 encontraron que el 96% de muestras evaluadas fueron positivas para Listeria spp. Genigeorgis et al, 1989 reportaron que el 36.7% de las pieles de pollo muestreadas fueron positivas y Cox et al. 1997, recuperaron cerca de 26% de carcasas crudas. Sin embargo en Colombia no se han realizado estudios de la presencia de este microorganismo sobre carcasas de pollo, de ah la importancia de implementar un mtodo rpido y fiable para la deteccin de Listeria spp. en superficies (Berrang et al. 2004).

4. MARCO TEORICO.

4.1. GENERALIDADES DEL GNERO DE Listeria spp.

Listeria spp. es un microorganismo que est distribuido ampliamente en la naturaleza, y tiene caractersticas que le permiten sobrevivir y crecer en un rango amplio de condiciones ambientales (Doyle et al. 2001).

En general, Listeria spp., corresponde a un grupo de bacilos Grampositivos o coco bacilos Grampositivos (0.5 de dimetro y 1-2 de longitud), con bordes redondeados. Las clulas se pueden encontrar aisladas o en parejas, formando cadenas cortas o agrupadas en formas de V o Y. En cultivos viejos las clulas pierden la habilidad de retener la tincin de Gram y puede que se confundan con otros gneros. Clulas largas, delgadas y filamentosas pueden aparecer en los cultivos viejos. Listeria spp. no produce esporas y no forma cpsulas (Farber y Peterkin, 1991; Ryser y Marth, 1999). Listeria spp. forma colonias brillantes observadas a iluminacin normal, y con una transmisin de luz oblicua se observan de color verde-azul (Seeliger et al. 1986). Listeria spp. posee flagelos pertricos, presentando motilidad a un rango de temperatura de 20 a 25C, pero no a 37C, debido a que la produccin de flagelina se reduce a esta temperatura. En medio semislido produce una forma tpica de sombrilla (pino invertido), creciendo cerca de un centmetro y medio de la superficie porque es un organismo microaeroflico (Farber y Peterkin, 1991).

Es facultativo en cuanto a temperatura, sus lmites de crecimiento estn entre 1 y 45C, con temperatura ptima entre 30 y 37C, es psicrfilo, crece y sobrevive a temperaturas de refrigeracin (Hough et al. 2002).

4.1.1. Clasificacin taxonmica.

Anteriormente, el gnero Listeria estaba incluido dentro de la familia Corynebacteriaceae. Actualmente el Manual de Bergey incorpora el gnero Listeria en el grupo de bacilos no esporulados Grampositivos. El gnero Listeria incluye siete especies que son: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri, L. ivanovii, L. grayi, L. denitrificans; pero solamente son aceptadas seis especies, ya que se considera a L. denitrificans morfolgica, bioqumica y serolgicamente diferente. Estudios de cidos nucleicos indican que L. denitrificans no corresponde al gnero Listeria y por lo tanto ha sido considerada dentro del nuevo gnero Jonesia (Seeliger y Jones, 1986; Bell y Kyriakides, 2000), (Tabla 1). Taxonmicamente la posicin de la especie L. grayi, es controversial, ya que fenotpicamente es similar a L. monocytogenes y a las dems especies del gnero Listeria, pero diferente en la habilidad de fermentar el manitol (Seeliger y Jones, 1986; Bell y Kyriakides, 2000). Resultados de hibridizacin del ADN y secuenciacin en el ARNr 16S y 23S, muestran que las especies del gnero Listeria han sido divididas en dos lneas de descendencia: (I) L. monocytogenes (patgena para hombre y animales) y las especies cercanamente relacionadas L. inocua (no patgena), L. ivanovii (patgena en animales), L seeligeri (patgena, responsable de abortos en ovejas) y L. welshimeri (no patgena); (II) L. grayi (Collins et al. 1991; Sallen et al. 1996; Vzquez-Boland et al. 1996; Allerberger, 2003). El gnero Listeria pertenece a la sub-rama Clostridium, junto con Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus y Bronchothris. Esta posicin filogentica de Listeria es

consistente con su contenido de G + C (36 al 42%). Se han identificado 2853 genes (35.3% de stos no se les conoce funcin), (Allerberger, 2003).

Tabla 1. Miembros del gnero Listeria. Especies de Listeria monocytogenes innocua welshimeri Nombre anterior Bacterium monocytogenes Origen del hombre Alta produccin de monocitos Inocua/inofensiva En honor a H.J. Welshimer, bacterilogo norteamericano En honor a H.P.R. Seeliger, bacterilogo alemn En honor a M.L. Gray, bacterilogo norteamericano En honor a I. Ivanov, bacterilogo blgaro

seeligeri

Grayi

L. murrayi

ivanovii L. ivanovii spp. ivanovii L. monocytogenes spp. londoniensis Serovariedad 5 Tomado de: (Bell y Kyriakides, 2000).

El anlisis de la secuencia de los genomas de L. monocytogenes y L. innocua revelan una relacin filogentico con Bacillus subtilis, lo que sugiere un origen comn para las tres especies. Por otra parte L. innocua posee un nico cromosoma circular de 3.011.209pb con un contenido de G + C del 37%. Dentro del gnero Listeria, stas dos especies presentan un alto grado de homologa en la secuencia del ARNr 16S, siendo los de mayor cercana taxonmica (Collins et al. 1991; Sallen et al. 1996; Rocourt, 1999; Glaser et al. 2001), (Figura 1).

4.1.2. Requerimientos nutricionales.

Las necesidades nutricionales de Listeria son similares a las de otras especies de bacterias Grampositivas. Crecen en medio simples tales como infusin cerebro-corazn (BHI) y en caldo tripticasa. En sus requerimientos nutricionales, necesita por lo menos de cuatro

vitaminas del grupo B, biotina, rioflavina, tiamina y cido teicoico y de algunos aminocidos como, cisterna (Cys), glutamina (Glu), isoleucina (Ile), leucina (Leu) y valina (Val), as como carbohidratos (glucosa). El crecimiento ptimo se produce en una atmsfera constituida por 5% (v/v) de oxgeno y entre 5-7% (v/v) de CO2 (Pinner et al. 1992; ODriscoll et al. 1996; Garca et al. 2000; Hill et al. 2001; Jay, 2002). Ancestro de Gnero Listeria

Incorporacin de LIPI-I

Listeria grayi Listeria seeligeri Listeria ivanovii Listeria monocytogenes Listeria innocua Listeria welshimeri Figura 1. Parentesco taxonmico de las especies de Listeria con base en los datos de la secuencia del RNAr 16S. LIPI-I (isla 1 de patogenicidad de Listeria). Adaptado de: (Vzquez-Boland et al. 2001a). El crecimiento de Listeria spp. es estimulado por el hierro (Fe+3) y fenilalanina (Phe). La glucosa y Glutamina son requeridas como fuentes primarias de carbono y nitrgeno (Seeliger y Jones, 1986; Ryser, y Marth, 1999).

4.1.2.1. Temperatura.

En relacin a la temperatura, Listeria spp. sobrevive y se multiplica a temperaturas de -2 hasta 42C (Moltz y Martin, 2005; Ribeiro et al. 2005). Es psicrtrofo, aunque entre 4C y 5C el crecimiento es ms lento; crece y sobrevive a temperaturas de refrigeracin. Es microaeroflico, con crecimiento ptimo en presencia de 5% (v/v) de oxgeno y 5-10% (v/v) de CO2 (Taormina y Beuchat, 2001; Hough et al. 2002). Este organismo resiste durante varias semanas a -18C en varios sustratos. En condiciones cidas y en los medios de laboratorio, la supervivencia es ms corta (ICMSF, 1996a).

La resistencia al calor de Listeria monocytogenes ha sido estudiada a raz de un brote de listeriosis ocurrido en Estados Unidos por el consumo de leche pasteurizada; lo que origin diversas opiniones referentes a que la pasteurizacin clsica puede o no destruir el microorganismo (Doyle et al. 1987; Santiago et al. 1999).

Algunas de las teoras principales son las siguientes: Barber, 1939 afirma que Listeria monocytogenes es destruda a 55C durante 60 minutos. Potel, 1955, sostiene que la bacteria puede resistir a temperatura de pasteurizacin. Barza, 1985, considera la teora no comprobada de la supervivencia de Listeria monocytogenes en la leche pasteurizada y propone que se debe a que la bacteria es englobada por los leucocitos. Bradshaw, 1985, informa que el tratamiento trmico de la leche a 71.7 C y que 9 segundos de tiempo es suficiente para que la leche est libre de Listeria monocytogenes. Doyle, 1987, manifiesta que Listeria monocytogenes sobrevive a temperatura de pasteurizacin HTST utilizando 71.7C por 15.4 segundos (Doyle et al, 1987).

Algunos investigadores dicen que la termoresistencia de Listeria monocytogenes no resulta afectada por su ubicacin intracelular. La Organizacin Mundial de la Salud (WHO) en 1988, concluye que la pasteurizacin es un proceso seguro el cual reduce el nmero de

Listeria spp.en la leche cruda a niveles en los cuales no representa un riesgo para la salud humana, sin embargo se recomienda realizar ms estudios al respecto (Hayes et al. 1986; Garca et al. 2000). 4.1.2.2. pH.

Todas las cepas de Listeria crecen a pH neutro o ligeramente alcalino y tienen una escala amplia de pHs para el crecimiento, siendo el lmite superior aproximadamente 9.2 y el inferior 4.6-5.0, pasado estos lmites se inhibe el crecimiento, pero puede sobrevivir (ICMSF, 1996; Nuez de Gonzlez et al. 2004). El pH ptimo para Listeria spp. es 7.5 0.2 (Johansen et al. 1996; Hough et al. 2002; Taormina y Beuchat, 2001).

Experimentalmente, la presencia de 0.1% (v/v) de los cidos actico, ctrico y lctico en caldo triptosa, inhiben el crecimiento de Listeria spp., aumentando la inhibicin a medida que la temperatura de incubacin disminuye. La actividad de estos cidos contra Listeria est relacionada con su grado de disociacin, siendo el cido ctrico y lctico menos perjudiciales que el cido actico a un pH equivalente (Doyle et al. 2001). 4.1.2.3. Sales. L. monocytogenes es capaz de sobrevivir a concentraciones de 25% (p/v) de NaCl, puede desarrollarse a concentraciones de 10% (p/v) e incluso hasta un 20% (p/v) de NaCl. La concentracin ptima de NaCl para el crecimiento de L. monocytogenes a 10C es de 2 a 2.5% (p/v). En la preservacin de los alimentos la sal y los nitritos por separado no son buenos inhibidores del microorganismo, pero s lo son, cuando se utilizan en combinacin en cantidades permitidas para nitratos y concentraciones de sal al 3% (p/v) (Buchanan et al. 1989; Cole et al. 1990; Nolan et al. 1992; Smith, 1996; Duche y Tremoulet, 2002).

4.1.2.4. Actividad de agua (aw). El lmite de valores de actividad de agua que afectan el crecimiento de las bacterias del gnero Listeria es de aproximadamente 0.90 a 30C cuando se utiliza el glicerol para

controlarla. Las actividades de agua bajas con temperaturas de 4C aumentan el efecto bacteriosttico (Tapia de Daza et al. 1991; Farber et al. 1992). 4.1.3. Actividad bioqumica.

Listeria spp. es homofermentativa y posee actividad glucosa oxidasa (E.C. 1.1.3.4.) y NADH+H oxidasa (E.C. 1.6.99.3.). Todas las cepas crecen en glucosa formando lactato, acetato y acetoina como productos finales bajo condiciones aerbicas. Anaerbicamente, slo las hexosas y las pentosas soportan el crecimiento. Todas las especies de Listeria producen cidos a partir de celobiosa, fructosa, manosa, maltosa, glicerol, dextrinas, entre otras. El catabolismo de la glucosa procede de la va de Embden-Meyerhof en ambos casos aerbico y anaerbico (Muoz y Daz, 1998; Ryser y Marth, 1999), (Tabla 2).

Todas las especies de Listeria spp. son fenotpicamente similares pero pueden ser distinguidas por pruebas como la hemlisis. L. monocytogenes es -hemoltica en agar sangre formando zonas claras alrededor de la colonia, la reaccin de CAMP es positiva frente a Staphylococcus aureus en forma de sombrilla, pero negativa frente a Rhodococcus equi. En paralelo se produce un fenmeno ltico en el cual hay interaccin de al menos 2 factores con la membrana del eritrocito. En tal caso ocurre un primer paso en el que la esfingomielinasa (primer factor del eritrocito) de Staphyloccoccus fragiliza la membrana del glbulo dejndola vulnerable a la accin del segundo factor, la listeriolisina O (LLO), resultando en la ruptura de la clula. La hemlisis es la caracterstica clave para la especiacin de aislamientos y tambin la ms complicada de detectar (Junttila et al. 1998; Ryser y Marth, 1999), no obstante hay cepas que no producen hemlisis ni son patgenas para el hombre, como es el caso de L. innocua (Allman et al. 1995). 4.1.4. Constitucin antignica.

La

composicin

lipdica

de

L.

monocytogenes

comprende

fosfatidiglicerol,

difosfatidiglicerol, galactosiglucisildiaglicerol. Los cidos grasos principales son el 14 metil hexadecanico (anteiso C17:O) y el 12 metil tetradecanico (anteiso C15:O). La clula est compuesta aproximadamente por 35% de peptidoglicano formado por enlaces de

cido meso-diaminopimlico. Los carbohidratos restantes consisten en cidos teicoicos con polmeros covalentes enlazados en sitios especficos en el peptidoglicano, compuestos por glicerol o ribitol, azcares neutros, N-acetilamina y fosfatos (Kaneda, 1991; Edgcomb, 2000). Basados en los antgenos somticos (O) y flagelar (H), se han identificado hasta el momento 13 serovariedades (a, b, c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7), siendo las ms frecuentes, las de tipo a, b y 4b, las cuales han sido aisladas en ms del 95% de los casos de listeriosis humana (Farber y Peterkin, 1991; Schuchat et al. 1991; Low et al. 1993; Brosch et al. 1994). Adems, la mayora de los brotes han involucrado un pequeo nmero de cepas relacionadas genticamente del serotipo 4b. Otras serovariedades como la c, son relativamente raras en aislamientos clnicos humanos, pero son encontradas frecuentemente como contaminantes de alimentos. Algunas de estas serovariedades son compartidas por L. innocua y por L seelegeri. L. innocua est representada por slo 3 serovariedades y se considera una variante no patgena de L monocytogenes (MacGowan et al. 1993; Swaminathan et al, 1995). Las especies no patgenas a excepcin de L. welshimeri, muestran uno o ms antgenos somticos comunes (Menudier et al. 1991; Gray y Killinger, 1966), (Tabla 3). Tabla 2. Pruebas bioqumicas entre especies del gnero Listeria. Pruebas
monocytogenes

Especies del gnero Listeria

innocua ivanovii seeligeri welshimeri grayi murrayi

Iluminacin Henry Movilidad en fresco Catalasa Oxidasa Bacilos Grampositivos Hemlisis Hidrlisis Urea Reduccin Nitratos Movilidad SIM Voges - Proskauer TSI cido SH2

+ + + + + + + -

+ + + + y + + + -

+ + + + fuerte + + + -

+ + + + Dbil + + + -

+ + + + y + + + -

+ + + + y + + + -

+ + + + y + + + -

Rojo metilo Fermentacin de: Dextrosa Esculina Maltosa Ramnosa Manitol Xilosa

+ + + + + -

+ + + + v -

+ + + + +

+ + + + +

+ + + + v +

+ + + + + -

+ + + + v + -

+= positivo. - = negativo. v = variable. y = no hemoltico. Tomado de: (Pascual y Caldern, 1999). Entre las serovariedades asociadas a listeriosis, las cepas 4b causan entre el 50% y el 70% de los casos en todo el mundo, pero las cepas de grupo antignico a, b y c predominan en los aislamientos de alimentos (Boerlin y Piffaretti, 1991); esto sugiere que las cepas serotipo 4b estn ms adaptadas a tejidos de hospederos mamferos que las cepas del serogrupo (Schonberg et al. 1989; Kathariou, S. 2002). Tabla 3. Serotipos de las diferentes especies de Listeria spp. Microorganismo L. monocytogenes L. ivanovii L. innocua L. weishimeri L. seeligeri Tomado de: (Swaminathan et al. 1995). Serotipo a, b, c, 3a,3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d,4e, 7 5 4ab, 6a, 6b 6a, 6b 2b, 4c, 4d, 6b

Los serotipos a, b, c, 3a, 3b y 3c de L. monocytogenes necesitan identificacin de ambos antgenos O y H; mientras los serotipos 4a, 4ab, 4c, 4d, 4e y 7 tienen los mismos antgenos H, slo necesitan la identificacin de antgenos O (Lukinmaa, S. 2003), (Tabla 4).

La combinacin de patrones de ribotipificacin y genes alelos de virulencia, separaron a L. monocytogenes en tres linajes distintos que parecen tener diferentes potenciales patognicos. El linaje I (serotipos b, 4b, 3b y 3c) es comn entre casos de listeriosis

humanas y brotes, que entre casos animales. El linaje II (a, c y 3a) contiene aislamientos humanos y animales pero aparentemente no hay aislamientos asociados con brotes espordicos. El linaje III (serotipos 4a y 4c) es ms comn entre casos de listeriosis animal que entre casos humanos (Weidmann et al. 1997; Jeffers et al. 2001; Kathariou, 2002; De Jess y Whiting, 2003; Doumith et al. 2004; Gray et al. 2004; Bruhn et al. 2005; Jeffers et al. 2001; Kathariou, 2002; Weidmann et al. 1997). 4.1.5. Hbitat donde puede aislarse L. monocytogenes Dos propiedades de L. monocytogenes contribuyen en su distribucin amplia: a) a pesar de no formar esporas, es capaz de sobrevivir durante perodos prolongados en diferentes medios y b) es un microorganismo psicrtrofo. Por tal motivo, el alimento se puede contaminar en cualquier eslabn de la cadena alimentaria, y el almacenamiento en fro no inhibe el crecimiento de Listeria (Doyle et al. 2001). Tabla 4. Serotipos de L. monocytogenes y sus antigenos O:H. Serotipo Antigenos O AB ABC BD AB ABC BD ABC ABC ABC ABC ABC ABC ABC Antigenos H

a I, II (III) b I, II (III) c I, II (III) 3a II, (III), IV 3b II, (III), IV, (XII), (XIII) 3c II, (III), IV, (XII), (XIII) 4a (III), (V),VII, IX 4ab (III), (V),VI, VII, IX, X 4b (III), V, VI 4c (III), V, VII 4d (III), V, VI, VIII 4e (III), V, VI, (VIII), (IX) 7 (III), XII, XIII Tomado de: (Lukinmaa, S. 2003).

4.1.5.1 Fuentes ambientales. Las maneras diversas en que L. monocytogenes puede contaminar el medio ambiente y sobrevivir en condiciones extremas y el hecho de ser una entidad infecciosa que involucra

peces, aves, bovinos y cerdos adems, de humanos, incrementa considerablemente las posibilidades de diseminacin y contaminacin de los alimentos (Gallego et al. 2003). Esta bacteria es capaz de sobrevivir y crecer en agua dulce, agua salada, aguas de desecho crudas o tratadas, suelos, polvo ambiental, silos, fertilizantes y vegetacin en descomposicin (Watkins y Sleath, 1981; MacGowan et al. 1994); ha sido aislada de heces fecales de humanos y de animales sanos y asintomticos (Weis y Seeliger, 1975; Schuchat et al. 1993; Grif et al. 2001; Grif et al. 2003), de alimentos para animales, alimentos crudos de origen animal, includos aves frescas y congeladas, carnes rojas y productos crnicos; pescado; productos lcteos crudos como leche, quesos y helados; frutas y vegetales crudos (MacGowan et al. 1994; Leclerc et al. 2002).

L. monocytogenes se encuentra con ms frecuencia en suelos no cultivados que en los cultivados, aunque se le ha encontrado en tierra de jardn. Las plantas son reconocidas como un reservorio importante del microorganismo y se han propuesto como fuente de infeccin. Este microorganismo se ha aislado a partir de maz, frjol de soya, hierbas silvestres, hojas de arbustos (MacGowan et al. 1994).

An no se ha resuelto el punto bsico acerca de si L. monocytogenes surge primero del suelo o se origina en los animales que excretan las bacterias en sus heces. Sin embargo en la actualidad se considera que el hbitat primario de L. monocytogenes es el suelo y los vegetales en descomposicin, en los que se puede desarrollar en forma saprfita (McCarthy, 1990; Fenlon, 1999).

La contaminacin de los vegetales con L. monocytogenes, se produce directamente del suelo o por contacto con fertilizantes orgnicos. El almacenamiento prolongado de los vegetales en fro y la coccin deficiente hace que la ingestin de los productos contaminados favorezca la colonizacin del tracto gastrointestinal de las personas ms susceptibles. La prctica habitual de conservar en fro, durante cierto tiempo despus de su distribucin por los mayoristas, permite que un inculo inicial pequeo de L. monocytogenes prolifere, o bien que el fro cause la muerte de los microorganismos competitivos (Torres et al. 2004a).

Este microorganismo se ha aislado en ms de 40 especies de mamferos, incluyendo ganado bovino y ovino, as como en 17 especies de aves domsticas y silvestres, y ha sido recuperado de anfibios, peces, pulgas, garrapatas y crustceos (Weis y Seeliger, 1975; Kampelmacher y Van Noorle Jansen; 1980; Mead, 1982; Fenlon, 1989; Carosella, 1990; Fthenakis et al. 1998). Los animales de granja, principalmente las aves, son reconocidos como reservorios de este patgeno. Las aves silvestres son una fuente de contaminacin de Listeria para el ensilaje, representando una fuente indirecta de listeriosis en animales de granja y humanos (Bracket, 1988; Hublek, 2003).

Entre los productos alimenticios ms importantes, causantes de la presentacin de la enfermedad en seres humanos, se encuentra la leche y subproductos lcteos, los cuales pueden contaminarse por todo tipo de suciedad medio ambiental portadora del microorganismo y ms en vacas con mastitis, las cuales pueden excretar hasta 103 UFC/ml (Gallego et al. 2003).

As mismo es importante mencionar se indican algunos modos mediante los cuales se disemina L. monocytogenes, junto con las diversas procedencias del organismo para las personas (Figura 2).

4.1.5.2. Plantas de produccin y procesadoras de alimentos.

Por sus caractersticas psicotrficas, es posible encontrarla en muestras ambientales de fbricas de alimentos particularmente en depsitos de aguas a temperaturas relativamente bajas, incluyendo sistemas de enfriamiento, canales de drenaje y el agua acumulada en las bandejas de refrigeracin (Pascual y Caldern, 1999).

Adems se encuentra en suelos, aire acondicionado, en las proximidades de pasteurizadores y enfriadores de leche, gotas de condensacin, piensos de mala calidad microbiolgica, industrias de carne y mataderos (Pascual y Caldern, 1999).

Las superficies de los utensilios y los equipos en contacto con el producto en las fases finales del proceso del desposte de las reses, tienen una gran importancia como fuentes de contaminacin por Listeria durante todo el proceso de transformacin de los productos (Franco et al. 1995; Fenlon et al. 1996; Chasseignaux et al. 2001; Lundn et al. 2002).
SECRECIN Y EXCRECIN DE LOS ANIMALES Heces, secreciones de tero y vagina, placenta, membranas

Contaminacin area ANIMAL Enfer./colonizacin intestinal

MEDIO AMBIENTE TIERRA AGUA

Contaminacin area HOMBRE Enfer. Colonizacin intestinal

Cieno y agua

Hortalizas (col, plantas, ensilado)

Aguas Residuales, ro

PRODUCTOS ANIMALES Leche, carne, canales, productos lcteos

Figura 2. Modos mediante los cuales L. monocytogenes se disemina en el ambiente, en los animales y en las personas. Las principales fuentes de contaminacin de L. monocytogenes dentro de las plantas procesadoras de alimentos son:

Empleados (A travs de su ropa, batas; por el contacto directo del producto con la piel o por el polvo en los zapatos). Animales que excretan la bacteria o presentan contaminacin cutnea, por medio de vegetales crudos. Limpieza y desinfeccin inadecuados del equipo. En el medio ambiente (a travs de bacterias que flotan en la humedad generada en las reas de trabajo, y que pueden ser transportadas por el aire y el roco). Falla en la cadena de fro de los productos. Contaminacin cruzada del alimento durante el procesamiento y empaque (Hudson y Mead, 1989; Schofield , 1992; Nesbakken et al. 1996; Unnerstad et al. 1996; Johansson, 1998; Johansson et al. 1999).

L. monocytogenes puede crecer en ambientes hmedos y fros, como los que se encuentran en cualquier rea de procesamiento, en los refrigeradores o en los pisos de los cuartos donde se efecta el sacrificio de animales (contaminacin por materia fecal). Entre el 11 % al 52% de animales son portadores fecales sanos. Se ha aislado L. monocytogenes de ganglios retrofarngeos de ganado vacuno. En los mataderos este microorganismos ha sido recuperado en las zonas donde desuellan las reses y en las maquinas desplumadoras de aves (Bunci, 1991).

L. monocytogenes sobrevive a diversas tecnologas de procesamiento de alimentos, por ejemplo, es halotolerante, resiste pH relativamente bajos y es capaz de multiplicarse a temperatura de refrigeracin (Lou y Yousef, 1999). Este microorganismo puede sobrevivir en ambientes adversos gracias a la capacidad de respuesta a cambios ambientales, habilidad que es regulada transcripcionalmente. En L. monocytogenes se ha identificado el factor sigma () involucrado en la resistencia a pH bajos, criotolerancia, limitacin de carbono y resistencia al estrs oxidativo (Gardan et al. 2003).

L. monocytogenes acumula intracelularmente solutos osmoprotectores (carnitina y betana) bajo peso molecular y alta solubilidad, los cuales regulan las diferencias de presiones osmticas con el medio exterior. La sntesis y el control de estas sustancias estn reguladas por el factor el factor (Gardan et al. 2003). El crecimiento de Listeria a bajas temperaturas es mediado por la lipoprotena OppA bacteriana que favorece el transporte de oligopptidos en dichas condiciones de refrigeracin (Borezee, 2000).

El saneamiento inadecuado y/o la eliminacin incompleta de la carne o grasa del equipo de procesamiento, pueden permitir el desarrollo de biopelculas (biofilms). Los biofilms son comunidades microbianas que existen sobre superficies bitica y algunas veces abiticas. Estas biopelculas brindan nutrientes y un lugar de acceso para el crecimiento de diversas bacterias incluida L. monocytogenes (Poulsen, 1999; Djordjevic et al. 2002; Hassan et al. 2004).

Cuando la bacteria coloniza las superficies cambia el fenotipo, desarrolla resistencia a desinfectantes e incrementa la produccin de exopolisacridos para la formacin de biofilms. La cantidad de microorganismos transferidos de una superficie inerte a un alimento depende de las propiedades del biofilm: densidad de la superficie de la poblacin microbiana, estructura, capacidad para producir exopolisacridos, y la potencia del ataque de las clulas microbianas (Midelet y Carpentier, 2002).

La adherencia de L. monocytogenes a las superficies de materiales inertes es el resultado de reacciones fisicoqumicas entre las superficies y el microorganismo (Meylheuc et al. 2002). Estas interacciones, principalmente de van der Waals, Lewis y de tipo electrosttico, son dependientes de las propiedades hidrofbicas o hidroflicas (Magnusson, 1982; Rosenberg y Kjellerberg, 1987), de las caractersticas donador-receptor de electrones (VanOss, 1993), del potencial de superficie del sustrato receptor (VanLoosdrecht et al. 1987) y de la clula bacteriana (Absolom et al. 1983).

L. monocytogenes se adapta fcilmente en los ambientes de produccin y procesamiento de alimentos por la adquisicin de resistencia a sanitizantes. Esta resistencia puede ser una propiedad natural intrnseca del microorganismo o adquirida a travs de plsmidos o transposones, integrones y/o secuencias de insersin. Como una adaptacin a ambientes adversos, la bacteria puede usar una bomba de flujo multimedicamento (multidrug) que fuerza la salida de protones para eliminar y evitar los efectos de la acumulacin de qumicos en el interior (Frank y Koffi, 1995; Romanova et al. 2002).

Para garantizar que el crecimiento de L. monocytogenes no suceda, un producto debe tener al menos una de las siguientes caractersticas: Una actividad del agua de 0.85 o menos. Un pH de 4.6 o menor cuando este valor es tomado a 9.6C. Que haya sido empacado en un recipiente sellado, que el sello no muestre violaciones y que sea comercialmente estril a temperatura ambiente. Que la composicin natural del producto no permita el crecimiento de los microorganismos (USDA-FSIS, 2001)

4.1.5.3. Carne de pollo.

La carne de pollo como alimento es una excelente fuente de aminocidos esenciales, respecto al contenido vitamnico, destaca la presencia del cido flico y la Vitamina B3 o niacina. Entre los minerales, el nivel de hierro y de zinc es menor que en el caso de la carne roja, aunque supone una fuente ms importante de fsforo y potasio (Hall, 1993).

Una caracterstica especialmente de la carne de pollo es la escasa concentracin de grasa, especialmente en las partes magras, como la pechuga, donde la proporcin de lpidos es inferior al 1%. Si a esto sumamos que las aves son susceptibles de modificar la composicin de su grasa con la dieta recibida, se podra conseguir que esta grasa no fuese excesivamente saturada, mejorando su calidad. Estas caractersticas convierten al producto en un concentrado proteco de elevada eficacia nutricional, ya que las protenas son fcilmente digeribles y de alta calidad biolgica (Fonavi y Fenavi, 2000), (Tabla 5).

Las aves de corral (pollo tipo broiler, listo para comer, precocido, refrigerado o congelado) tambin son contaminadas frecuentemente (Berrang et al. 2002). Durante el transporte de las aves desde las granjas a los mataderos tiene lugar la contaminacin directa y la cruzada. La aglomeracin de animales y las malas condiciones climticas durante el transporte generan estrs en los animales dando lugar a excreciones ms frecuentes de materia fecal. Al colgar y degollar a las aves puede tener lugar una contaminacin cruzada adicional; las sacudidas de las alas dan origen a polvo y aerosoles que se transfieren a las canales de transporte ms prximas dentro del matadero (Siliker et al. 1980).

Tabla 5. Composicin nutricional (c/100g de porcin comestible de carne de pollo).

Alimento Agua (ml) Kcal (n) Protena (g) Grasas (g) Zinc (mg) Sodio (mg) Vit. B1 (mg) Pollo con piel 70.3 167.0 20.0 9.7 1.0 64.0 0.10 Vit. B2 (mg) 0.15 10.4 3.2 4.4 1.5 110.0 N (mg) AGSM (g) AGM (g) AGP (g) C (g)

Pollo filetes

en

75.4

112.0

21.8

2.8

0.7

81.0

0.10

0.15

14.0

0.9

1.3

0.4

69.0

AGS: grasas saturadas, AGM: grasas monoinsaturadas, AGP: grasas poliinsaturadas.

Tomado de: (Fonavi y Fenavi, 2000).

Existen diversas fuentes de contaminacin que pueden promover el crecimiento y desarrollo de ste microorganismo en la carne de pollo, es probable que estas fuentes estn presentes desde la fase de produccin primaria (cuando el animal vivo es contaminado intestinalmente, o por fatiga del animal, el estrs, el ayuno prolongado e inclusive la ingestin de alimentos); sin embargo los mayores riesgos se presentan durante las operaciones en que la carne de pollo es manipulada y no se tienen los cuidados relacionados con el acondicionamiento de la atmsfera alrededor de ella. Otras fuentes de contaminacin pueden provenir de las malas prcticas de higiene y desinfeccin y al diseo inadecuado, deficiencia de limpieza y desinfeccin de los equipos utensilios y de instalaciones (Fonavi y Fenavi, 2000).

La contaminacin de carnes, de embutidos y de productos animales es exgena, es decir se produce en cadenas de sacrificio, procesado, empacado y almacenamiento, entre otros (Cox et al, 1999).

El pollo crudo, precocido, refrigerado o congelado tambin es contaminado frecuentemente (Carpenter y Harrison, 1989; Cantoni et al. 1990; Rijpens et al. 1997; Berrang et al. 2002). Dentro de la cadena agroalimentaria de carne de pollo se pueden identificar diversas fuentes de contaminacin (Thomas y McMeekin, 1980; Hudson y Mead, 1989; Ramrez, 1999; Berrang et al 2002; Chasseignaux et al 2002): Pollo en pie: desinfeccin deficiente de galpones, bebederos y comederos antes de la llegada del lote de pollos y acumulacin de gallinaza en las camas de las aves. Transporte de las aves desde las granjas a los mataderos: contaminacin directa y cruzada. La aglomeracin de animales y las malas condiciones climticas durante el transporte generan stress en los animales dando lugar a excreciones ms frecuentes de materia fecal y de contenido cecal.

Recepcin y colgado: contaminacin de equipos y utensilios. Al colgar y degollar a las aves puede tener lugar una contaminacin cruzada adicional. Insensibilizacin y sangra: exposicin a exudados intestinales contaminados. Escaldado: escaldado a medias o contaminacin por la entrada del pollo vivo inhalando el agua del escaldado Desplume: contaminacin de equipos y utensilios, cada de pollo al suelo Escaldado de patas: presencia del patgeno en las patas, equipos y utensilios contaminados por el microorganismo. Pelado y corte de patas: La cada de la canal del gancho o por el inadecuado manejo del operario. Revirado: cada del ave al suelo y mala manipulacin del operario. Eviscerado: presencia de heces que presentan el patgeno en la superficie del ave, contaminacin cruzada por ruptura del intestino. Lavado final y pre-enfriamiento (Pre-chiller): presencia del microorganismo en el agua-hielo. Enfriamiento (Chiller): presencia del microorganismo en el agua-hielo y monitoreo incorrecto de la temperatura. Escurrimiento y clasificacin: ambiente en malas condiciones (entrada de polvo, goteras de tubera sobre el producto, poca circulacin de aire, temperatura ambiental elevada, mal colgado de la canal, entre otros), contacto de la canal con el manipulador y contaminacin de canastillas o mesas de escurrido.

Desposte: utilizacin de equipos y utensilios contaminados, manipulacin incorrecta del operario. Empaque: contaminacin del embudo de empaque, manipulacin incorrecta del operario. Almacenamiento refrigerado: la presencia constante en el cuarto de personas o animales como vectores o del aire, prdida de la cadena de fro, monitoreo incorrecto de la temperatura y desinfeccin incorrecta de los cuartos de almacenamiento.

Transporte refrigerado: mal almacenamiento durante el transporte y deficiencia en la desinfeccin de los furgones.

Exhibicin y venta: manejo inadecuado de temperatura de almacenamiento, contacto con cortes contaminados de diferentes carnes, frutas y verduras utilizadas para decoracin.

4.2. LISTERIOSIS HUMANA.

Se ha dado el nombre de listeriosis al grupo general de desrdenes causados por L. monocytogenes, y se define clnicamente cuando el microorganismo es aislado de sangre, LCR (lquido cefalorraqudeo) o de otros sitios que normalmente son estriles como la placenta (Low y Donachie, 1997).

L. monocytogenes es un organismo intracelular que afecta tpicamente pacientes donde la inmunidad celular ha disminuido. Listeria causa las ms severas enfermedades en pacientes con VIH, cncer, diabetes melitus, falla renal, alcoholismo y embarazadas (DiMaio, 2000).

Se pueden distinguir dos formas bsicas de sintomatologa presentada por la Listeriosis, segn el riesgo que represente para la salud: la listeriosis invasiva, y la no invasiva. La primera se caracteriza por la diseminacin severa de la infeccin o una infeccin local en el SNC, pudiendo causar la muerte. Dentro de ste gnero se encuentran la listeriosis prenatal y la listeriosis en pacientes adultos. Por el contrario, en la no invasiva o listeriosis gastrointestinal existe la infeccin pero no representa un alto riesgo para la salud (DiMaio, 2000).

La infeccin usualmente ocurre despus de la ingestin de comidas contaminadas. El periodo de incubacin est entre 2 y 6 semanas. Las manifestaciones clnicas incluyen sepsis, meningitis, cerebritis, meningoencefalitis, cerebritis, granulomatosis infantosptica y una variedad de infecciones focales (DiMaio, 2000).

4.2.1. Listeriosis Invasiva.

La listeriosis invasiva puede tener un largo perodo de incubacin (hasta tres meses) y una amplia gama de sntomas. Entre las manifestaciones severas causadas por L. monocytogenes se incluye: bacteriemia, meningitis bacteriana, conjuntivitis, infeccin del SNC, infeccin cutnea, encefalitis, endocarditis, meningoencefalitis, aborto, enfermedad neonatal, osteomielitis, peritonitis, infeccin pleural, pulmona, nacimiento prematuro, septicemia, y prdida del feto (Gellin, 1989; Amstrong, 1995; DiMaio, 2000).

Infeccin en el embarazo.

La infeccin por L. monocytogenes puede ocurrir en cualquier trimestre del embarazo, pero es ms frecuente durante el tercer trimestre. Listeria puede proliferar en la placenta y puede escaparse de los mecanismos usuales de defensa (Ray, 1964; Klatt et al. 1986).

Los pacientes suelen presentar: fiebre, escalofro, dolor dorsal. Dos tercios de las embarazadas presentan un sndrome prodrmico similar a la gripe que coincide con la bacteriemia, momento ptimo para realizar hemocultivos (Ray, 1964; Klatt et al. 1986).

La listeriosis materna puede precipitar el trabajo de parto y esto puede provocar un aborto fetal o un parto pretrmino de un feto infectado. Dado que los cultivos bacterianos no son rutinariamente obtenidos en los abortos espontneos o en los bitos es difcil obtener una estimacin de la proporcin de prdida fetal atribuible a la infeccin por L. monocytogenes (Ray, 1964; Klatt et al. 1986).

Sepsis.

La sepsis sin una infeccin localizada es la ms comn en pacientes con deficiencias en el sistema inmune, ocurriendo en el 21-43% de los casos. El paciente tiene nauseas, vmito. La sepsis puede progresar diseminando la coagulacin intravascular. Las caractersticas clnicas de la sepsis listerial son similares a otros tipos de sepsis bacterial y su diagnstico se basa en un cultivo de sangre positivo (DiMaio, 2000).

Granulomatosis infantisptica.

La transmisin transplacentaria es responsable de este cuadro, el lactante presenta abcesos o granulomas diseminados en mltiples rganos (hgado, bazo, pulmones, riones y encfalo). Puede haber evidencia de amnionitis o lquido amnitico teido de meconio. Es posible el desarrollo de insuficiencia respiratoria y circulatoria, en estas circunstancias se debe cultivar el meconio, el lquido amnitico, hemocultivos del lactante y de la madre y los loquios maternos. La mortalidad en este sndrome ha sido cercana al 100% en algunas series (Southwick y Purich, 1996; Koneman et al. 1999; DiMaio, 2000; Nardone et al. 2003). Meningoencefalitis.

Al igual que la sepsis, se presenta en el perodo neonatal tardo y en adultos con comorbilidad. La enfermedad en el adulto es con mayor frecuencia subaguda. Los pacientes son meningitis sin abceso enceflico han mostrado signos neurolgicos focales, con compromiso de pares craneanos y/o hemiplejia (Koneman et al. 1999; Nardone et al. 2003).

El lquido cefalorraqudeo (LCR) se caracteriza por la presencia de ms de 1000 clulas/mm3 pudiendo encontrarse segn la evolucin del cuadro polimorfonucelares; la proteinorraquia baja en la mitad de los casos. El aspecto del LCR rara vez es purulento. El microorganismo puede observarse o no al Gram, pero habitualmente desarrolla en los cultivos (Koneman et al. 1999; Nardone et al. 2003). Cerebritis.

Se reconoce e informa con mayor frecuencia. El paciente puede presentar slo cefalea y fiebre, o presentarse con grados variables de parlisis que simulan un ataque cerebrovascular. Se han comunicado casos de romboencefalitis que comienzan con fiebre, cefalea, nuseas, vmitos seguidos de varios das despus por parlisis progresiva simtrica de los pares craneanos, depresin de conciencia y signos cerebeloso, en ocasiones convulsiones y hemiparesia. La mayora de los pacientes son inmunodeprimidos y la mortalidad es alta (Laciar et al. 2000).

El (LCR) puede tener escasa celularidad, proteinorraquia y glucorraquia normal, gram y cultivo negativos. El diagnstico se efecta cuando el hemocultivo es positivo. Requiere como mnimo 6 semanas de tratamiento (Laciar et al. 2000).

Infecciones focales.

Las lesiones cutneas se observan en asociacin con granulomatosis infantisptica, en veterinarios como resultado del contacto directo con animales infectados, y trabajadores de laboratorio, como resultado de inoculacin directa accidental. No existe nada caracterstico en las lesiones ulcerosas y es necesario el examen directo y cultivo para establecer el diagnstico (DiMaio, 2000). 4.2.2. Listeriosis no invasiva (Gastroenteritis Listerial).

Ocurre en hospederos normales que consumen alimentos contaminados con L monocytogenes. Una evidencia de este hecho surge de un brote en IIlinois (USA) en 1994 donde pacientes manifestaron diarrea y fiebre luego de la ingesta de leche chocolatada que se encontraba contaminada con L. monocytogenes (con un inculo de 109 UFC/ml), encontrndose el agente etiolgico tanto en la leche como en las heces de los pacientes (Dalton et al. 1997).

La frecuencia de la gastroenteritis causada por L. monocytogenes es indeterminada as como la dosis infectante y las caractersticas del husped que se asocia con esta enfermedad (Dalton et al. 1997).

Los sntomas tpicos de la infeccin gastrointestinal estn relacionados con: escalofros, diarrea, dolor de cabeza, dolor y calambres abdominales, nuseas, vmito, fatiga, y mialgia. Debido a que los sntomas no se presentan como severos, existe un gran potencial de que no se reporten los casos de Listeria gastrointestinal (Dalton et al. 1997).

4.2.3. Epidemiologa de la listeriosis.

El descubrimiento oficial de L. monocytogenes data de 1926 cuando Murray y colaboradores aislaron este microorganismo como el agente etiolgico de una enfermedad sistmica en conejos y cobayos en Cambridge (Murray et al, 1926). Posteriormente, se aisl de ovejas, cabras, cerdos, ratas y moscas. Los primeros casos de listeriosis humana fueron

reportados en 1936 por Burn, quin aisl el microorganismo de cadveres de neonatos e implic la bacteria como causa de meningitis en adultos (Burn, 1936), y por Nyfeldt en Dinamarca en 1937, quin aisl la bacteria a partir de sangre de pacientes que sufran una enfermedad parecida a la mononucleosis infecciosa (Nyfeldt, 1937). Sin embargo el primer cultivo de L. monocytogenes data de 1921, cuando la bacteria fue aislada en Francia por Dumont y Cotoni de un paciente con meningitis (Dumont y Cotoni, 1921).

Durante muchos aos, los aislamientos clnicos de Listeria fueron espordicos, y la epidemiologa de la enfermedad no era conocida. El primer brote epidemiolgico de listeriosis reconocido ocurri en 1981 en Canad y el agente etiolgico asociado fue una ensalada. Otros brotes de listeriosis humana han sido asociados con leche, queso fresco, pat, carne de cerdo y otros alimentos de origen animal o vegetal (Cormac et al.1996; Blais et al. 1997).

El mayor brote epidmico de listeriosis en humanos descrito en Alemania entre los aos 1949 y 1951 se relacion directamente con el consumo de leche cruda (Gray y Killinger, 1966). Hasta 1960 slo se haban comunicado 500 casos de listeriosis en todo el mundo, alcanzando en 1981 la cifra de 10.100 (Ralovich, 1984; Bryan, 1988). L. monocytogenes cobra importancia en la dcada de los ochenta al estar implicada como agente causal de una serie de brotes epidmicos ocurridos por el consumo de alimentos en Amrica del Norte y Europa (Schlech et al. 1983; Bean y Griffin, 1990; Jones, 1990; O' Driscoll et al. 1996; Torres et al. 2004a).

Entre los aos 2000 y 2002 se presentaron en los Estados Unidos y Francia brotes. El primero relacionado con el consumo de carnes de pollo y pavo contaminadas y queso casero estilo mexicano contaminado (CDC, 2001; Hof, 2003) y el segundo relacionado con el consumo de gelatina de lengua de cerdo (Goulet et al. 2000). En el transcurso del ao 2004 se han presentado casos espordicos en Estados Unidos (Bera, 2004). Los reportes de listeriosis en mujeres embarazadas en Estados Unidos indican 12 a 17% de casos, mientras que en Europa se reporta una incidencia de 0.5 a 3%. En Colombia, hay

disponibles algunos datos con respecto a la epidemiologa de la listeriosis, debido posiblemente al subregistro clnico e industrial (Escarcega et al. 1999). En sentido general, el porcentaje de mortalidad por listeriosis es del 30% (Lorber, 1997) y puede llegar a ser el 50% de la poblacin neonatal (MacGowan et al. 1991). La mayora de los casos se concentran en la poblacin inmunosuprimida, menores de un mes y mayores de 60 aos (Lorber, 1997). En situaciones epidmicas, la incidencia en la poblacin de riesgo se increment en factor de 3 a 10 (Schwartz et al. 1989). El aumento mundial de los casos de listeriosis se puede deber a varios factores: Adaptacin microbiana Cambios demogrficos, aumento de la poblacin susceptible (entre ellos los pacientes con SIDA) y la poblacin de ancianos. Cambios en la produccin y distribucin de alimentos: aumento de alimentos procesados listos para usar y que se pueden almacenar por tiempo prolongado. Carencia de recursos e infraestructura en las entidades de Salud Pblica. Aumento de oportunidades de viaje y actividades comerciales que favorecen la diseminacin de esta enfermedad a nivel local, regional y mundial (Rocourt y Cossart, 1997). 4.3. INCIDENCIA DE L. monocytogenes EN CARNES DE POLLO. Las toxiinfecciones alimentarias producidas por L. monocytogenes en los aos anteriores a 1989 se asociaban a alimentos como vegetales crudos, ensaladas de col, leche cruda o queso fresco estilo mexicano, pero fue en 1989 cuando por primera vez se describi un caso de L. monocytogenes asociado a productos de aves de corral contaminados (Johnson et al. 1990). Los primeros brotes alimenticios fueron descritos en Canad en 1981, Estados Unidos 1983, Suiza 1983-1987, Estados Unidos 1988, Reino Unido 1989-1994, y Francia 1993-1995 (Roberts, 1994; Kozak et al. 1996). Los alimentos involucrados fueron aquellos que venan listos para comer y que eran conservados en refrigeracin durante un tiempo prolongado, contaminados con ms de 100UFC de L. monocytogenes por gramo (Kozak et al. 1996; McLauchlin, 1996; Rocourt y Cossart, 1997), (Tabla 5).

El pollo ha sido implicado como vector de trasmisin de Listeriosis humana. Bailey et al. 1989 recuperaron L. monocytogenes del 23% de carcasas de pollo, siendo el serotipo es ms frecuente. Pollo cocinado fro y pavo, han sido confirmados como vehculos de infeccin de Listeria en Inglaterra y Estados Unidos, durante 1988 y 1999. Genigeorgis, C. et al. 1989 reportaron que un 36.7 % de pieles de pollo fueron positivas para Listeria spp. , Lawrence, et al, 1994 encontraron una prevalencia del 15% de L. monocytogenes en muestras de pollo crudo, MacGowan et al, 1994, aislaron 66% y 38% de L. monocytogenes a partir de carne de pollo y res respectivamente, Franco, et al, 1995 encontraron que el 96% de muestras evaluadas fueron positivas para Listeria spp., y Cox, et al, 1997, encontraron una prevalencia del 26% de L. monocytogenes en carcasas de crudas de pollo.

En Colombia, aunque se ha comprobado casos de listeriosis humana, los estudios no han demostrado la relacin directa de dicha enfermedad con la ingestin de L. monocytogenes en carne de pollo (Ramirez y Urquijo, 2002).

4.4. PREVENCION Y CONTROL.

La tendencia actual es controlar los alimentos y el agua que consumen los animales, debido a que cada vez ms, patgenos como L. monocytogenes tienen un reservorio animal y son verdaderas zoonosis que se diseminan rpidamente (Foster, 1997; Chin, 2000). Tabla 5. Predominio de L. monocytogenes en carnes de pollo Muestras Alimento +/ Muestras Totales Gallina Pollo fresco 7/22 23/50 Estados Unidos Reino Unido 1988 (McClain y Lee, 1988) (Pini y Gilbert, 1988) Pas Ao Ref.

Pollo congelado Pollo precocido

27/50 5/21 (Kerr et al. 1988) (Skovgaard 1988) (Lowry y Tiong, 1988) (Breer y Breer, 1988) (Lawrence Reino Unido 63/527 9/16 17/100 21/90 17/100 12/80 27/102 8/16 1/21 Australia Reino Unido Taiwan China 1990 Estados Unidos (Genigeorgis et al. 1989) (Varabioff, 1990) (Kerr et al. 1990) (Wong et al. 1990) (Wang et al. 1992) National Committee Advisory on Canad 1989 1994) (Gilbert et al. 1989) (Farber et al. 1989) (Genigeorgis et al. 1989) (Bailey et al. 1989) y Gilmour, y Morgen,

almacenado en fro Cuero de pollo crudo

8/17

Dinamarca Nueva Zelanda Suiza

Pollo en presas Gallina Pollo asado Pollo precocido listo

12/25 14/56 13/60

para comer Pernil de pollo Cuero de pollo asado Alas, perniles e hgados frescos de pollo Pollo congelado Pollo precocido

almacenado en fro Cuero de pollo Pollo Costillas asadas Cuellos de pollo asados de pollo

448/2072 280/1730 Estados Unidos

Microbiology Criteria for Foods, L. monocytogenes in Meat, Poultry and

Gallina precocida

22/1580

Fishery Products. Pollo en canal 32/100 27/100 Blgica Francia y 1992 1993 (Uyttendaele et al. 1997)

Presas de pollo

42/67

Malasia

(Arumugaswamy 1994) 1994 1996 1997 (Lawrence 1994) y

et al.

Pollo crudo Pollo Presas de pollo Pollo Pollo picado Gallina Pollo crudo Pollo procesado

34/58 19/120 8/24 16/324 17/46 32/100 16/65 36/255

Reino Unido

Gilmour

Colombia

(Moreno y Pulido, 1996) (Bernal, 1997) (De Simn, M., Ferrer,

Espaa Japn Espaa Portugal Colombia 2000 2004 1999

2002) (Satoshi et al. 2000) (Capita et al. 2001) (Guerra, 2001) Fonseca y Correa, 2004

Tomado y modificado: (Torres et al. 2004a).

Debido a que Listeria se encuentra ampliamente distribuida en el medio ambiente, es indispensable que en las operaciones de procesamiento de alimentos se evite contaminar los alimentos crudos o sin procesar, y evitar la recontaminacin de los productos precocidos (Broome, 1993; Ministere de la Sante, 1995; Ministere de la Sante, 1996; Tauxe, 1997).

El Servicio de Seguridad e Inspeccin de los Alimentos del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (FSIS) es el responsable de inspeccionar los mataderos y/o plantas de procesamiento de carnes de res y aves. Ninguna de las agencias permite L. monocytogenes en alimentos cocidos listos para comer. Esto se llama "Tolerancia Cero". Por lo tanto, las agencias federales estn trabajando con la industria para identificar y corregir las reas con problemas potenciales (Tompkin, 2002).

Adems, el FSIS requiere ahora que los mataderos y las plantas de procesamiento de carne y aves, utilicen el sistema HACCP para reducir bacterias peligrosas en los alimentos. El sistema requiere que la industria de produccin de alimentos identifique los puntos crticos en donde los alimentos puedan contaminarse y seguir los pasos necesarios para prevenir la contaminacin (Tompkin, 2002).

El FSIS juega un papel activo en las investigaciones con los Control Desease Center (CDC) y la Food and Drug Administration (FDA) si se identifica un problema de produccin de alimentos o una epidemia que estn relacionados con carnes. Si es necesario, la agencia evitar que estos productos alimenticios vayan a los almacenes, restaurantes, y otras operaciones de servicios alimentarios; puede parar la operacin de una planta; y trabajar con los productores para retirar alimentos que se hayan enviado a los estantes de almacenes o a las casas (Tompkin, 2002).

Nuevos aditivos alimentarios que inhiben L. monocytogenes debern ser introducidos y llegar a ser ampliamente usados en alimentos. Las polticas actuales de USDA-FIS proveen pocas opciones para inhibir el crecimiento de Listeria en pollo y carne res. Los aditivos ms empleados son el lactato de sodio, diacetato de sodio, y combinaciones de los dos (Tompkin, 2002). Las siguientes estrategias pueden ayudar a prevenir o reducir el riesgo de listeriosis transmitida por alimentos (Rados, 2004).

A nivel domstico.

1. Lavar las manos con agua caliente y jabn despus de manipular estos tipos de alimentos listos para comer. (Lvarse las manos por lo menos 20 segundos.) Adems, lavar las tablas de cortar, platos y utensilios. Lavar meticulosamente ayuda a eliminar cualquier bacteria de los alimentos que pudiese haber llegado a sus manos u otras superficies antes de ser recalentados. 2. Evitar la contaminacin cruzada. Los alimentos listos para comer y las carnes, aves y mariscos crudos pueden contener bacterias peligrosas. Por lo tanto, se deben mantener estos alimentos separados de vegetales, frutas, panes, y otros alimentos que ya se encuentran listos para comer. 3. No comprar carnes cocidas que estn refrigeradas junto con las carnes crudas. 4. Cocinar cuidadosamente los alimentos de origen animal 5. Calentar los platos precocinados antes de consumirlos. 6. Comprar productos cuyos envases no se encuentren rotos y deformados.

7. Descartar cajas hinchadas, enmohecidas o daadas. 8. Colocar las carnes separadas en recipientes plsticos para prevenir la contaminacin. 9. Chequear y controlar la fecha de vencimiento indicada en los envases de carnes, huevos, entre otros. 10. No dejar comida en vehculos expuestos a altas temperaturas o directamente a la luz solar. 11. Las carnes descongeladas en el microondas deben cocinarse inmediatamente, las que se descongelaron en refrigeracin deben cocinarse en mximo 24 horas. Los refrigeradores deben mantenerse a una temperatura de 4C y los congeladores a -18C y limpiarlos regularmente. 12. Permitir la circulacin correcta de aire en el refrigerador, estableciendo espacios entre los alimentos (Rados, 2004). Alimentos crnicos a evitar.

1. Pat comercial 2. Carnes fras industrialmente preparadas y no empacadas al vaco, rebanadas distribuidas en salsamentarias, pollo desmechado y producido en volumen para emparedados. 3. Comidas de mar crudas o ahumadas. Los ejemplos de pescados ahumados incluyen: salmn, trucha, coregono, bacalao, atn y caballa que con frecuencia se rotulan como ahumado, ahumado en fro y nova-style entre otros. Estos pescados se encuentran en la seccin refrigerada o se venden en los mostradores de las tiendas de comestibles. Los productos enlatados como los salmones y el atn pueden consumirse con seguridad. 4. Perros calientes, o carnes en el almuerzo, a menos que se hiervan hasta que la temperatura interna alcance los 165F. La administracin de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos no recomienda que se cocinen los perros calientes en los hornos microondas (Rados, 2004). A nivel industrial.

Es de vital importancia que las empresas productoras de alimentos adopten los principios del sistema de control de calidad preventivo HACCP, como medidas para prevenir la contaminacin post-proceso a travs del traslado, almacenamiento, servicios de comida y almacenes; pues por medio de este se detectan errores en la manipulacin y en los procedimientos de elaboracin de los alimentos que sirven de vehculos de transmisin para

L. monocytogenes y otros microorganismos indeseados, se efecta una pronta correccin de estos y se definen las estrategias preventivas (USDA-FSIS, 1996). Cuando no se cuenta con evidencia epidemiolgica sobre un riesgo microbiolgico, se debe obtener informacin tcnica sobre todos los aspectos relativos a la produccin, procesamiento, almacenamiento, distribucin y empleo de un determinado alimento que pudieran constituir un riesgo. Independientemente del sistema de control utilizado, cada elemento involucrado de la cadena alimentaria como el productor de las materias primas, el fabricante del los productos, el distribuidor de los productos, el comprador minorista, el manipulador y el consumidor juegan un rol y una responsabilidad en el control de la calidad y de la seguridad o inocuidad (Tompkin, 2002).

Efectuando pruebas microbiolgicas del medio ambiente y de las superficies de contacto (Listeria genrica o especies de Listeria (spp.) o las pruebas de bioluminiscencia de ATP), se pueden conocer la efectividad de un plan de saneamiento y ubicar los sitios que se pueden convertir en fuentes potenciales de contaminacin (Tompkin, 2002).

A nivel de mataderos y expendios de carne.

En los mataderos est reglamentado el decomiso total de la canal y de las vsceras, despus de haber sido inspeccionado y dictaminado como inadecuado para el consumo humano, as como la adopcin de precauciones especiales para impedir que se infecten los manipuladores de la carne. En caso de sospechar listeriosis, se debe realizar la retencin de la canal y las vsceras hasta tanto se obtenga el resultado de laboratorio (MNS, 1982).

4.5. MTODOS DE IDENTIFICACIN DE Listeria spp.

4.5.1. Mtodos tradicionales para la identificacin de Listeria spp.

Los mtodos para la deteccin e identificacin de Listeria spp. fueron desarrollados por primera vez para su uso en laboratorios clnicos desde mediados de los aos 80, cuando L. monocytogenes fue reconocido como patgeno importante para el hombre, vehiculizado a travs de los alimentos, en todo el mundo se han desarrollado gran cantidad de mtodos

para determinar la manera ms efectiva de aislar al microorganismo a partir de muestras clnicas y de alimentos y su consiguiente identificacin (McBride y Girard, 1960).

Las industrias alimentarias utilizan normalmente mtodos convencionales para la deteccin e identificacin de L. monocytogenes. Las pruebas de ausencia /presencia en 25g son los ms comnmente utilizados, pero tambin se realizan recuentos por gramo, cuando es necesaria una investigacin sobre un riesgo concreto para la salud pblica. Con muestras del entorno normalmente se aplican las pruebas de presencia/ausencia mediante el hisopaje en superficies (Frazier y Westhoff, 1993).

Los medios de seleccin utilizados para Listeria spp. estn constituidos por caldos de enriquecimiento selectivo como: Caldo de enriquecimiento para listeria de la FDA, caldo LBE sin taponar o taponado BLBE, caldo de enriquecimiento primario y secundario de la universidad de Vermont, caldo fraser y half fraser, seguido por el aislamiento en agares selectivos como: agar LPM, agar Oxford, agar PALCAM (Bell y Kyriakides, 2000).

La tcnica de los caldos y medios slidos de enriquecimiento se desarrolla mediante la integracin de sustancias que como los antibiticos, suprimen o inhiben el crecimiento de la mayor parte de la microbiota competitiva sin impedir el desarrollo de Listeria. Como sustancias integradoras de los distintos medios se pueden citar el feniletanol (inhibe la poblacin Gram-negativa); el cloruro de litio (LiCl2) (inhibe la microbiota Gram-negativa y Gram-positiva distinta de L. monocytogenes), glicina (Gly) (Tiene un efecto similar al LiCl2). Adicionalmente dichas sustancias integradoras pueden estar conformadas por antibiticos tales como el moxalactam, cido nalidixico, basitracina y otros, los cuales son selectivos para Listeria y suprimen la mayora de los gneros bacterianos de origen alimenticio (Pascual y Caldern, 1999).

Las colonias que crecen en los agares selectivos y muestran morfologa tpica de Listeria spp., en ese medio son designadas como presuntas (sospechosas) Listeria spp., y se realiza una posterior identificacin a nivel de especie mediante el anlisis de las caractersticas bioqumicas y hemolticas (Curtis y Lee, 1995; Bayles et al. 1996).

Los mtodos tradicionales para la identificacin de Listeria suelen ser dispendiosos y laboriosos, arrojando frecuentemente resultados de carcter negativo en perodos de tres a cuatro das. Por ejemplo si las colonias en agar selectivo muestran caractersticas morfolgicas tpicas de Listeria se necesitarn de dos a siete das adicionales para confirmarlas e identificar subsecuentemente que especie est presente (Klein et al. 1997).

4.5.2. Mtodos alternativos (rpidos) para la identificacin de Listeria spp.

4.5.2.1. Mtodos fenotpicos. Los mtodos fenotpicos detectan la presencia o ausencia de actividades metablicas o biolgicas expresadas por los microorganismos. Muchos de estos mtodos son disponibles, y relativamente baratos (Lukinmaa, 2003). Biotipificacin: La biotipificacin incluye actividades metablicas expresadas por un aislamiento y pueden incluir reacciones bioqumicas especficas, morfologa de las colonias y tolerancias al medio ambiente. La biotipificacin tiene solo una habilidad limitada para diferenciar cepas dentro de especies, y tiene relativamente pobre poder de discriminacin en estudios epidemiolgicos (Lukinmaa, 2003). Serotipificacin: La tipificacin serolgica est basada en diferentes variaciones de determinantes antignicos expresados sobre la superficie celular, incluyendo lipopolisacridos (LPS), polisacridos capsulares, protenas de membrana y organelos extracelulares (fimbrias y flagelos). La serotipificacin ha sido una herramienta clsica para estudios de caso epidemiolgicos y espordicos (Graves et al, 1999; Lukinmaa, 2003). Tipificacin de fagos: La tipificacin de fagos est basada en la capacidad de un grupo estndar de virus que lisan e infectan clulas bacterianas. La tipificacin de fagos es usualmente disponible en laboratorios de referencia. Este es un mtodo rpido y econmico (Graves et al, 1999; Lukinmaa, 2003).

4.5.2.2. Mtodos Genotpicos. Los mtodos genotpicos cuentan con anlisis basados en el ADN de elementos genticos cromosomales o extracromosomales.

Ribotipificacin: La ribotipificacin utiliza las similitudes y diferencias encontradas en los genes ribosomales. Estos genes son altamente conservados y varan en nmero y posicin dentro del genoma de la bacteria. El ADN cromosomal es aislado y digerido con enzimas de restriccin, luego los fragmentos de ADN llevan genes ARNr, son separados de otros fragmentos por electroforesis sobre genes de agarosa y detectados por hibridizacin (Lukinmaa, 2003).

Amplificacin del ADN: Esta tcnica es aplicable a la identificacin de microorganismos transmitidos por alimentos, que en la actualidad no pueden ser detectados por procedimientos ms rpidos. La PCR ha sido utilizada para detectar cepas de L. monocytogenes en pases de Europa y Norteamrica. La PCR ha probado ser un mtodo rpido sensible y especfico para la deteccin de patgenos en alimentos, sus diversas modificaciones han ampliado su aplicacin, tanto para la industria alimentaria como la clnica diagnstica y epidemiolgica, reduciendo as su tiempo de anlisis y el costo de prueba (Brakstad y Meland, 1995; Blais et al. 1997; Govan et al. 1999; Jersek et al. 1999; Klein et al. 1999; Norton, 1999; Nogva et al. 2000).

El objetivo de esta tcnica es la amplificacin directa de un gen o un fragmento de ADN, presentes en mezclas de diversas fuentes (a partir de homogenatos, extractos crudos de tejido, sangre completa, mezcla de fragmentos de ADN producidos con enzimas de restriccin, muestras resultantes de la extraccin y aislamiento del ADN), en muchos casos sin la necesidad de una purificacin previa de la muestra original. Por esta capacidad de amplificacin, la PCR es un mtodo adecuado para amplificar cidos nucleicos (Luque y Herrez, 2001).

4.6. MTODOS PARA EL MUESTREO MICROBIOLGICO DE SUPERFICIES.

Sobre un perodo de 100 aos muchas tcnicas han sido desarrolladas para enumerar microorganismos sobre las superficies de carcasas de carne y pollo. Las ventajas y las limitaciones de los principales mtodos de muestreo son varias (Capita et al. 2004) (Tabla 6).

Los mtodos de excisin y arrastre por escobilln son de amplia aceptacin porque son fciles de usar y requieren solo de pequeas cantidades de material especializado y porque los datos son generalmente ms reproducibles. La excisin es considerado el mtodo ms exacto, y el escobilln uno de los ms prcticos (Reid et al. 2002).

Debido a que la tcnica de excisin es costosa y no muy prctica para monitoreo de HACCP, tcnicas no destructivas han sido usadas generalmente en EU para coleccin de datos de superficies de carcasas (Fliss et al. 1991).

Correlaciones entre los resultados de mtodos destructivos y no destructivos (arrastre por escobilln) debern ser establecidos para cada planta de carne y pollo y para varias circunstancias, por ejemplo: tcnica de muestreo, especie de carcasa, grupo microbiano, estado y tiempo de muestreo, tipo de tejido, y localizacin del rea a muestrear (Capita et al. 2004). Tabla 6. Ventajas y limitaciones de los principales mtodos de muestreo para enumerar superficies de carcasas. Tipo de ensayo Ventajas Limitaciones Destructivo Provee la ms fiable y Naturaleza destructiva, rea de Excisin menor variabilidad en muestreo limitada, tiempo y habilidad los conteos, porque (No es propio para muestreos recupera casi rutinarios de carcasas). completamente la bacteria fuertemente adherida. Destructivo Provee la ms fiable y Naturaleza destructiva, rea de *Escobilln menor variabilidad en muestreo limitada, tiempo y habilidad los conteos, porque (No es propio para muestreos recupera casi rutinarios de carcasas).

completamente la bacteria fuertemente adherida. *Mtodos de contacto (platos No hay dao de RODAC, cintas superficies, posibilidad adhesivas) de examen directa en el microscopio. Simple y rpida, requiere pocos materiales. Inaplicable cuando los conteos bacterianos son mayores a 100UFC/cm2, porque la superficie de contacto est muy cubierta; los conteos no son precisos y frecuentemente menor a 1% de aquellos obtenidos con excisin o mezcla. Impropio para superficies regulares (excepcin: Mtodos de cinta adhesiva); porque grandes reas no pueden ser muestreadas, un suficiente nmero de sitios debe ser muestreado para obtener datos representativos.

*Mezclar agitar diluyentes

y en Poco o ningn dao de las superficies, se Solo es conveniente para carcasas de remueve 10 veces ms pollo y pequeos cortes de carne. que con el escobilln.

Tomado de: (Capita et al. 2004).

4.7. PLACAS PETRIFILMTM PARA MONITOREO DE Listeria EN AMBIENTES. Las Placas PetrifilmTM para monitoreo de Listeria en ambientes son un medio de cultivo listo para usarse que contiene agentes selectivos, nutrientes, un agente gelificante soluble en agua fra y un indicador cromognico que facilita la deteccin de las colonias. Las placas pueden ser utilizadas para la identificacin o conteo de Listeria en muestras de ambientes y/o superficies (3M, 2004). Las Placas de PetrifilmTM detectan las siguientes especies de Listeria: L. monocytogenes, L. innocua, L murrayi y L. welshimeri, sin embargo no diferencian estos organismos entre s. Las condiciones ambientales o los sanitizantes pueden atravesar y/o daar a los microorganismos. El agua de peptona tamponada (BPW) se utiliza como caldo de

reparacin en conjunto con la Placa Petrifilm. Dicho paso de reparacin en agua de peptona tamponada no es un paso de enriquecimiento (3M, 2004). El mtodo de Placa PetrifilmTM puede ser utilizado como una prueba cualitativa, semicuatitativa o cuantitativa.

Interpretacin cualitativa: Se ha detectado Listeria en esta placa. Interpretacin semi-cuantitativa: el nivel de Listeria debe registrarse con categoras que tengan un significado para las reas de muestreo y los estndares individuales de su planta (por ejemplo: grado bajo, mediano, alto; aceptable o inaceptable).

Interpretaciones cuantitativas: Nmero de colonias de Listeria en esta placa. Se debe utilizar un procedimiento consistente cada vez que se tome la muestra (usar el mismo tipo de dispositivo de toma de muestra, rea de plantilla, tcnico y tcnicas de muestreo.

El tamao del rea de muestreo deber basarse en regulaciones, estndares internos, y/o ubicacin de la toma de la muestra. Por ejemplo, se puede muestrear un rea ms grande en un a lnea de producto terminado, debido a que nmero de bacterias que se espera encontrar es bajo (3M, 2004).

Son diversas las ventajas y beneficios que presenta la Placa Petrifilm con respecto al Mtodo Tradicional (Tablas 7 y 8).

4.8. VALIDACIN.

Los protocolos de validacin alternos incluyen la definicin clara del sistema a validar, la identificacin de las variables operativas y los probables parmetros de control. En ellos se deben describir: el proceso a validar, los objetivos de la validacin, los mtodos y el personal responsable, al igual que indicar el nmero de replicaciones que se consideran

adecuadas para la evaluacin de un determinado parmetro, haciendo que los resultados sean estadsticamente confiables (ICONTEC, 2001).

La validacin de dichos mtodos alternos precisa un protocolo confiable que sea comn a los proveedores/productores de los mtodos mismos a la industria alimentara, a las autoridades de servicios de la salud pblica y otras autoridades. Los datos generados pueden tambin ser la base para que una organizacin independiente certifique un mtodo (ICONTEC, 2001).

Un mtodo alterno es un mtodo de anlisis que demuestra la presencia o estima la concentracin, para una categora dada de productos, el mismo analito que se mide en el correspondiente mtodo de referencia Gold Stndard (mtodo internacionalmente reconocido y de amplia aceptacin). Validacin: Es la consecucin de evidencia suficiente y su respectiva documentacin para proporcionar una seguridad razonable que el proceso considerado produce o producir lo que pretende o se espera (ICONTEC, 2003). La validacin de un mtodo para el anlisis de una muestra o para el seguimiento de un proceso en particular, no garantiza que el mtodo pueda utilizarse indiscriminadamente para cualquier clase de muestra o proceso. Su aplicacin permite obtener informacin estadsticamente confiable, lo cual constituye una evidencia para tomar decisiones, respecto a la adecuacin de una operacin o procedimiento dentro del proceso que se est validando (ICONTEC, 2001).

El mtodo de anlisis validado es un factor crtico en la validacin de un proceso. Los atributos del mtodo que configuran el proceso de validacin y que le confieren las caractersticas que lo califican generalmente son: especificidad o selectividad, la cantidad mnima detectable o lmite de deteccin, la cantidad mnima cuantificable o lmite de cuantificacin, la sensibilidad, la precisin, la exactitud, linealidad, y la robustez o solidez de un mtodo (OMS, 2000; Hernndez y Vsquez, 2002).

Tabla 7. Ventajas y beneficios de las Placas PetrifilmTM. Caractersticas Ventajas Lo que significa... Para el usuario Para la organizacin Reduccin de Tiempo Incremento en tiempo de disponible para productividad preparacin de otras actividades cultivos No requiere uso Ahorro en de baos de Mayor seguridad gastos de agua En el laboratorio operacin y necesidades Disminucin de del laboratorio uso de autoclaves Facilidad de Ahorro en No requiere manejo tiempo y trabajo personal pre-laboratorio altamente calificado Reduccin en Exactitud., Mayor calidad variacin de precisin y de anlisis resultados consistencia de Reduccin de resultados rechazos de producto Mejor Recuentos recuperacin precisos y Incremento de productividad bacteriana confiables Requiere menor Mayor espacio Ahorro de espacio de en laboratorio, espacio y incubacin y mayor capacidad costos de almacenaje para aumentar el energa, nmero de limpieza y anlisis mantenimiento Ideales para Incremento en la realizar anlisis eficiencia del microbiolgicos anlisis con mnima inversin e infraestructura Menor volumen Mayor capacidad Disminucin de desperdicio para al en los gastos eliminacin de de eliminacin desechos de desperdicios Beneficios

Agente gelificante soluble en fro

No es necesario esterilizar ni fundir agares

No somete la muestra a choque de temperatura

Medios cultivo pelculas laminadas

de Compactas en

Lista colocar muestra

Calidad estandarizada

Mayor capacidad de anlisis con mismos recursos Garanta de Disminuye la funcionamiento variabilidad del en un mismo tcnico lote y entre lotes

para la

Optimizacin de Aumento en la los recursos de eficiencia y laboratorio productividad del laboratorio Reproducibilidad Adecuadas y y repetibilidad confiables para programas de certificacin (HACCP, entre otros)

Tomado de: (3M, 2004).

Tabla 8. Placas Petrifilm vs. Mtodo Tradicional

Placas petrifilm Medio de cultivo Deshidratado, usarse listo Mtodo tradicional para Es necesario preparar los medios y la mayora deben esterilizarse Reproducibilidad resultados de Reproducibilidad al 100%. Riesgo de variabilidad entre Slo variabilidad del tcnica analista para la preparacin de los medios. Riesgo de contaminacin Tiempo invertido en 50% de ahorro en tiempo de El correspondiente a su

preparacin de muestras

reparacin contra el mtodo preparacin. tradicional

Espacio

Son

pelculas

laminadas Cada caja petri tiene 1.5 cm de alto y 15 cm de dimetro en fro, a Agar, que necesita calentarse

compactas Componentes gelificantes Se disuelven

temperatura ambiente y evita para disolverse y agregarse a el choque trmico Indicadores qumicos la placa en caliente (45-50C) se cuenta con

Contenido en todas las placas. No Algunas indicador placas de

contienen indicadores. Mayor Riesgo constante de errores

pH.

facilidad para identificacin y en los conteos

conteo de colonias Desechos Mnimos Lo correspondiente a cada caja de petri, adems el medio de cultivo que se utiliz Necesidades de capacitacin No requiere de personal Requiere calificado producto Materia de terminado, ambientes prima, producto de de personal

altamente calificado Aplicaciones Materia terminado, prima,

monitoreo

monitoreo

ambientes y superficies

Tomado de: (3M, 2004)

Se pueden aplicar varios criterios y formas para evaluar cada uno de los atributos que permiten validar el mtodo, cualquiera que sea la modalidad debe ser exigente y rigurosa y deber definir de manera clara y precisa el procedimiento a seguir, el tratamiento estadstico y los criterios de aceptacin. Debido a la variabilidad de las respuestas que se pueden obtener en cada uno de los procedimientos seguidos para la validacin del mtodo, es necesario hacer una validacin estadstica de los resultados obtenidos, la cual depender del diseo experimental utilizado (Hernndez y Vsquez, 2002).

Mtodo alterno: Es un mtodo de anlisis que demuestra o estima, para una categora dada de productos el mismo analito que se mide con el correspondiente mtodo de referencia. El mtodo puede ser patentado o no comercial y no se necesita que cubra un procedimiento completo de anlisis, es decir, desde la preparacin de muestras hasta el informe de ensayo.

El mtodo alterno muestra atributos adecuados a las necesidades de los usuarios, por ejemplo: * Velocidad de anlisis y/o respuesta * Facilidad de ejecucin y/o automatizacin * Propiedades analticas (precisin, exactitud, lmite de deteccin entre otros) * Miniaturizacin * Reduccin de costos

Mtodo de referencia: Es un mtodo internacionalmente conocido y de amplia aceptacin. Para Listeria se toman procedimientos Ausencia/ Presencia dadas por la USDA (Departamento de Agricultura de los Estados unidos) y La FDA (Schlegelova et al. 2002).

Validacin de un mtodo alterno: Es la demostracin con un adecuado grado de confianza, que los resultados obtenidos por el mtodo alterno son comparables a los obtenidos por el mtodo de referencia.

Analito: Es el componente medido por el mtodo de anlisis, puede ser el microorganismo.

Mtodo cualitativo: Es un mtodo de anlisis cuya respuesta indica la presencia o ausencia del analito detectado directa o indirectamente en cierta cantidad de muestras.

Estudio de comparacin de Mtodos: Es el estudio llevado a cabo por el laboratorio organizador, del mtodo alterno contra el mtodo de referencia (ICONTEC, 2001).

4. 8.1. Protocolo de validacin.

El protocolo de validacin comprende dos fases: *Un estudio de comparacin del mtodo alterno contra el mtodo de referencia. *Un estudio nter laboratorios de los dos mtodos. Si el mtodo alterno ya ha sido validado y cumple con los requerimientos establecidos por otra organizacin, se estipulan reglas especficas para tomar en cuenta los resultados de esta validacin previa. (ICONTEC, 2001). 4.8.2. Mtodos cualitativos protocolo tcnico para valoracin.

Exactitud relativa: se define como el grado de concordancia entre la respuesta obtenida por el mtodo de referencia y la respuesta obtenida por el mtodo alterno con muestras idnticas. (ICONTEC, 2002).

Desviacin positiva (PD): El mtodo alterno se convierte en un falso positivo cuando presenta una desviacin positiva, si suministra un resultado positivo cuando el mtodo de referencia da un resultado negativo.

La desviacin positiva se convierte en un falso positivo cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es negativo. La desviacin positiva se considera como un verdadero positivo cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es positivo (Hernndez y Vsquez, 2002).

Desviacin negativa (ND): El mtodo alterno presenta una desviacin negativa si suministra un resultado negativo cuando el mtodo de referencia da un resultado positivo. La desviacin negativa se convierte en un falso negativo cuando se puede demostrar que el resultado verdadero es positivo. (ICONTEC, 2001).

Sensibilidad relativa (SE): La sensibilidad relativa es la capacidad del mtodo alterno para detectar el analito cuando se detecta por medio del mtodo de referencia (ICONTEC, 2001).

Especificidad relativa (SP): La especificidad relativa es la capacidad del mtodo alterno para no detectar el analito cuando el mtodo de referencia no lo detecta (Hernndez y Vsquez, 2002).

4.8.3. Protocolo de medicin.

Es conveniente que las muestras de alimentos provengan de la ms amplia variedad de fuentes, para as reducir cualquier sesgo derivado de especialidades locales alimentarias y ampliar el rango de validacin (ICONTEC, 2001).

Cuando se analicen muestras contaminadas naturalmente el rango y distribucin de la contaminacin debe ser representativa de los niveles usualmente encontrados en los productos, pero con nfasis en recuentos bajos. Debe ser imposible adquirir un nmero suficiente de alimentos contaminados naturalmente para cada una de las categoras, es permisible la contaminacin artificial de las muestras de alimentos (ICONTEC, 2001).

El mtodo y los niveles de contaminacin deben generar muestras de caractersticas similares al de muestras contaminadas naturalmente. La fraccin recobrada se consigue cuando algn nmero pero no todos de las muestras de ensayo determinadas son positivas por uno o ambos mtodos alterno o de referencia, pero es deseable producir aproximadamente el 50% de los resultados como positivos y 50% como negativos. Esto es sin embargo una recomendacin, no un porcentaje absoluto, con tal que algn nmero de las muestras ensayadas sean positivas o negativas de algn tipo de alimento (ICONTEC, 2001) 4.8.4. Clculos e interpretacin. Tratamiento de datos: se tabulan los datos de los pares de resultados obtenidos con los mtodos de referencia y alternos, para luego calcular los parmetros en cada categora de alimentos (Tabla 10).

Los resultados se deben efectuar con un nmero de resultados negativos obtenidos con el mtodo de referencia, que para los resultados de la tabla 1 no pueden ser mas del doble del nmero de resultados positivos, de ser necesario, se seleccionan los resultados negativos inmediatamente despus de un resultado positivo en el orden de anlisis de las muestras (ICONTEC, 2002).

Los tres criterios se expresan de la siguiente manera:

Exactitud relativa:

AC

( PA NA) *100% N

(1)

Especificidad relativa:

SP

NA *100% N PA *100% N

(2)

Sensibilidad relativa:

SE

(3)

Tabla 10. Pares de resultados obtenidos con el mtodo de referencia y con el mtodo alterno. Respuestas Mtodo de referencia positivo Mtodo de referencia negativo (R+) Mtodo alterno +/+ concordancia positiva (PA) (R-) -/+ desviacin positiva (PD) (R/A+)

positivo (A+) Mtodo

alterno +/- desviacin negativa (ND) (A- -/- concordancia negativa (NA) /R+)

negativo (A-)

A: Mtodo alterno; R: mtodo referencia; PA: concordancia positiva; PD: desviacin positiva; ND: desviacin negativa; NA: concordancia negativa. Tomado de (ICONTEC, 2001).

5. MATERIALES Y MTODOS. 5.1. DISEO DE LA INVESTIGACIN. Tipo y lugar de estudio.

Este es un estudio estadstico y ser realizado en el laboratorio de Microbiologa de Alimentos del Grupo de Biotecnologa Ambiental e Industrial del Departamento de Microbiologa. Facultad de Ciencias. Pontificia Universidad Javeriana. Bogot D.C.

Poblacin de estudio y muestra.

Se har en carcasas de pollo tradas de expendios de pollo procesados ubicado en un municipio de la Sabana de Bogot. El nmero de carcasas de pollo a muestrear se determinar segn la frmula de kappa ponderada donde: Error tipo I: 5% Error tipo II: 20% Probabilidad de clasificacin correcta: 60% Kappa de Ho: 0.85 Kappa de H1: 0.75. De acuerdo con estos datos el tamao de la muestra es 179.

Para el clculo de las caractersticas operativas se calcular especificidad, sensibilidad y valores predictivos.

5.2. MTODOS. 5.2.1. Contaminacin artificial de las carcasas de pollo.

La carcasa se contaminar por inmersin, a travs de un ensayo a ciego (empleando una baja concentracin). Las cepas a utilizar incluir: Salmonella, L. monocytogenes y L. innocua, para ello se preparar una suspensin de cada microorganismo con una concentracin de 102 UFC/ml; la inmersin se har durante una hora y posteriormente las muestras se refrigerarn durante 24 horas antes de su procesamiento (Snchez, 2005).

5.2.2. Anlisis microbiolgico tradicional.

La carcasa de pollo se remover aspticamente y se colocar en bolsas de plstico estriles, luego se adicionar 300 ml de agua peptonada tamponada a la bolsa y se agitar unas cincuenta veces.

Alcuotas de 25 ml de agua peptonada tamponada se adicionarn a 225ml de caldo de enriquecimiento Listeria - LEB (Oxoid, UK). Las muestras se incubarn por 4 horas a 30C, se adicionarn suplementos selectivos (SR 140E, Oxoid) y las muestras se incubarn por 20h. Posteriormente 0.1 ml de LEB ser transferido a 10 ml de caldo Fraser (FB) y se incubar a 30C por 24 a 30 horas. Una asada del caldo ser estriada en agar Palcam e incubada a 35C por 48h.

Tres colonias aisladas tpicas sern estriadas en Agar TSAYE (Agar triptona de soya extracto de levadura), se incubarn a 35C por 24 horas, y se sometern a identificacin bioqumica (Prueba de Iluminacin de Henry, Catalasa y Gram). 5.2.3. Anlisis rpido (PETRIFILMTM). Se tomar la muestra de la carcasa del pollo (100cm2), utilizando hisopos con 10ml de agente diluyente. Se adicionar aspticamente 5ml de agua peptonada tamponada estril (20-30C) a la muestra. Se homogenizar la muestra durante 1 minuto. Se dejar que la muestra permanezca a temperatura ambiente (20-30C) durante 1 hora, mximo 1.5 horas. Se colocar la placa PETRIFILMTM en una superficie plana y nivelada y se levantar la pelcula superior. Con la pipeta, perpendicular a la placa de PETRIFILM TM, se colocar 3 ml de la muestra en el centro de la pelcula. Se dejar caer la pelcula superior sobre la muestra. Se colocar suavemente el dispensador plstico sobre la lmina superior, cubriendo el inculo. Se levantar el dispersor y se esperar al menos 10 minutos para

permitir que el gel se forme. Se incubar las placas durante 28h +/-2 a 35C +/- 1C o a 37C +/-1C. Las interpretaciones del PETRIFILMTM podrn ser: cualitativa, semicuantitativa o cuantitativa.

Para calcular el nmero de unidades formadoras de colonias se tiene: UFC/rea: (nmero de colonias*ml solucin de hidratacin + ml agua peptonada tamponada 3ml) rea muestreada. (4)

Como control negativo se emplearn carcasas de pollo (unas enriquecidas en caldo Palcam y otras enriquecidas en agua peptonada tamponada), para la posterior deteccin de Listeria spp. segn el mtodo tradicional (Gold Stndard) y el mtodo rpido (PetrifilmTM).

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Recientemente, han aparecido nuevas tendencias en la conservacin de alimentos, que incluyen el uso de bioconservadores, el envasado al vaco y las atmsferas modificadas (Doyle et al. 2001). Se ha demostrado el efecto antagonista de la nisina (bacteriocina) sobre L. monocytogenes. La actividad antimicrobiana de la nisina depende de factores como el tipo y nmero de microorganismos presentes, la cantidad de nisina, el nivel de pH, condiciones de aplicacin y composicin de los componentes de los alimentos (Franklin et al. 2004).

Las pediocinas (bacteriocinas similares a la nisina) inhiben el crecimiento de L. monocytogenes (Franklin et al. 2004). Las pediocinas de Lactobacillus bavaricus afectan a L. monocytogenes en carnes, especialmente a temperaturas bajas. Sin embargo un inconveniente del uso de las bacteriocinas es la aparicin de mutantes resistentes, como se ha observado con el uso de la bavaricina A y la nisina (Doyle et al. 2001). VALIDACIN DE LA TCNICA DE PETRIFILMTM PARA LA DETECCIN DE Listeria spp. EN CARCASAS DE POLLO.