Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Biotecnologa de enzimas: Inmovilizacin

Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Catlisis enzimtica heterognea

Para combinar las ventajas de la catlisis homognea y heterognea, se desarroll la heterogenizacin de la catlisis homognea Las enzimas inmovilizadas son enzimas fsicamente confinadas o localizadas en una cierta regin definida de espacio con la retencin de sus actividades catalticas, que pueden ser usadas repetidamente y continuamente Los mtodos ms comunes de inmovilizacin de enzimas Heterogenizacin de enzimas solubles a travs del acoplamiento de un soporte insoluble mediante: adsorcin o enlace covalente, por entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o en microcpsulas

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa Las propiedades de las enzimas inmovilizadas estn gobernadas por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material del soporte
Enzima Soporte

Propiedades bioqumicas Tipo de reaccin y cintica

Caractersticas qumicas Propiedades mecnicas

Mtodo de inmovilizacin Efectos de transferencia de masa Estabilidad operacional Rendimiento (%) Eficiencia () # de ciclos Comportamiento Consumo de enzima (U/kg producto) Productividad (kg producto/U)

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Inmovilizacin de enzimas Costo de la enzima Grado de purificacin requerido de la enzima Costo del proceso de inmovilizacin Estabilidad de la enzima Efectos de inhibicin y envenenamiento

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Pros y contras de la Inmovilizacin

PROS Alta estabilidad y resistencia al esfuerzo cortante y a la contaminacin Fcil de desarrollar procesos continuos Rpidas tasas de reaccin Fcil separacin de los productos Uso repetitivo del catalizador CO TRAS Existencia de la resistencia a la transferencia de masa Necesidad del proceso de inmovilizacin Costos adicionales de reactivos para la inmovilizacin Prdida de actividad durante la etapa de inmovilizacin

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Inmovilizacin de enzimas
La inmovilizacin es la restriccin espacial de la movilidad de la enzima

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Mtodos de inmovilizacin
A A: Mtodos de enlace a soportes a) Enlace covalente; b) Adsorpcin fsica; c) Fuerzas electrostticas C B: Entrecruzamiento C: Atrapamiento

Enzyme in Industry: Production and Applications, pg 66.

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Atributos ideales de un soporte Alta rea superficial Permeable Insoluble Alta rigidez Regenerable Resistente a ataque microbiano y qumico Estable mecnicamente y trmicamente Hidrofobicidad controlada

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Mtodos de inmovilizacin claves

Unin Covalente
Glutaraldehido CNBr-activacin cidos cclicos (glicoproteinas) Carbodimidas

Ms comn para enzimas

Adsorcin
Intercambio inico Hidrofobicidad

Entrecruzamiento Encapsulacin
Geles polimricos Liposomas y otras bicapas

Ms comn para clulas

Mtodos emergentes
Avidin/streptavidin y biotin Oligonucletidos-protein fusions Materiales biocatalticos Silicones/silicatos/sol-geles

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Mtodos de inmovilizacin: Soportes

Tipos de enlace Enlace covalente Adsorcin fsica Enlace inico Tipos de Soporte Inorgnicos: p.ej. Slica, Vidrio poroso Orgnicos: p.ej. Poliamida, Poliacrilamida Biolgicos: p.ej. Celulosa, Quitosano

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Enlace Covalente

El soporte en este caso es amino alkoxy silano

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Enlace Covalente

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Adsorcin Fsica Los biocatalizadores enlazan a los soportes por interacciones fsicas tales como interacciones hidrofbicas, fuerzas de van der Waals, etc. Frecuentemente se usan soportes inorgnicos. Actualmente, estn disponibles varios materiales naturales que tienen fuertes capacidades de adsorcin.

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Unin a un soporte por adsorcin fsica

El mtodo se basa en la adorcin fsica de las molculas de enzima en la superficie de una matriz slida, poniendo en contacto una solucin acuosa de enzima con el soporte.

Mtodos de adsorcin fsica

Procedimiento esttico Electrodeposicin Proceso de reactor Bao con agitacin

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Mtodos de inmovilizacin : Atrapamiento El mtodo de atrapamiento de inmovilizacin est basado en la localizacin de una enzima dentro de un enrejado de una matriz polimrica o membrana de tal forma que previene la liberacin de proteina mientras permite la penetracin de substrato.
- La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz del gel o a la membrana.

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Mtodos de inmovilizacin : Entrecruzamiento Definicin: Formacin de enlaces covalentes entre las molculas de enzima, por medio de reactivos bi- o multifuncionales, formando agregados entrecruzados tridimensionales. Mtodos: Adicin de una cantidad apropiada de agente entrecruzante a una solucin de enzima bajo condiciones que den un aumento en la formacin de enlaces covalentes mltiples.

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Mtodos de inmovilizacin: Entrecruzamiento (cont)

Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas inmovilizadas

J s = k L ( Sb S s ) =
Da

Vm S s K m + Ss

V maximum rate of reaction = m maximum rate of diffusion k L Sb

Da<<1 Da1 Da>>1

Da

Limitado por reaccin Reaccin y difusin resistencias comparables Limitado por difusin

= mero de Damhkler

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Factor de efectividad
Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la tasa de reaccin aparente es frecuentemente expresada en trminos de un factor de efectividad,

reaction with diffusional limitations = intrinsic reaction rate

Para una reaccin enzimtica que sigue la cintica de Michaelis-Menten

rsurface

Vm S s = K m + Ss

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Limitaciones difusionales para enzimas inmovilizadas en pellets porosos

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Perfil de concentracin en estado estacionario en pellets porosos Consideraciones:

Cintica de Michaelis-Menten Enzima uniformemente distribuida a travs del pellet No hay particin de substrato entre el interior y el exterior del pellet Ecuaciones gobernantes:

d 2 S 2 dS Vm S De 2 + = r dr K m + S dr S ( R) = S s dS dr =0
r =0

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Adimensionalizacin
Definir variables adimensionales:

Km S r S = ,r = , = Ss R Ss

Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera

d2S 2 dS S 2 + = 2 r dr S dr 1+

dS S (1) = 1, dr

r =0

Vm K m = 0, = R De

A menos que la reaccin sea de 1er orden, el sistema no tiene solucin analtica con la cintica de Michaelis-Menten

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Grfica versus en el sistema Michaelis-Menten

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Diseo de pellets inmovilizados

Minimizar el radio de partcula dentro las limitaciones mecnicas Optimizar la carga de la enzima
Alto contenido de enzima incrementa la tasa intrnseca de la reaccin pero disminuye el factor de efectividad Bajo contenido de enzima incrementa el factor de efectividad pero disminuye la tasa intrnseca de la reaccin

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Reactores enzimticos

Discontnuos (Enzimas libres e inmovilizadas) Tipos de reactores

Contnuos (Enzimas inmovilizadas)

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Reactores discontnuos

Tipo tanque agitado con paletas que incluyen enzimas inmobilizadas

Tipo tanque agitado con mamparas que incluyen enzimas inmobilizadas

Reactor de lecho empacado con reciclado total

Reactor de lecho fluidizado con reciclado total

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Reactores contnuos

Reactor de lecho empacado

Reactor de lecho fluidizado

Reactor de fibra hueca

Tipo tanque agitado con recuperacin por ultrafiltracin

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Reactor de tanque agitado contnuo

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Reactor de lecho empacado

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Reactor de lecho fluidizado

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Reactor de membrana

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Tecnologa de enzimas comerciales

High fructose corn syrup (xylose isomerase) L-Amino acids (amino acylase, amino acid dehydrogenases, lyases) D-Amino acids (hydantoinase) L-Aspartic acid (aspartase) L-Malic acid (fumarase) Glycidyl butyrate (lipase) Cis-dihydrodiols (dioxygenase) Muconic acid, chiral amines (aminotransferase) Semisynthetic penicillins and cephalosporins (penicillin amidase) Acrylamide (nitrile hydratase) Phenolic resins (peroxidase) Food applications (many) Industrial enzyme market ca. $1.5 billion Chiral market estimated at $5-10 billion Discovery markets - ??? (pharma spends ca. $15B/yr)

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Aplicaciones industriales Glucosa isomerasa inmovilizada Informacin estructural

GI es un tetrmero de 4 unidades idnticas de cerca de 45,000 kDa Compuesto como un dmero de dmeros Cada monmero est compuesto de aproximadamente 16 hlices alfa y 15 lminas beta La interface monmeromonmero es 3 veces ms grande y fuerte que la interface dmero-dmero 2 Mn2+ son necesarios para la actividad xilosa y 2 Co2+ para la actividad glucosa isomerasa

From Bacillus Coagulans, Isolated by Novozyme, Inc.

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Aplicaciones industriales Glucosa isomerasa inmovilizada

La isomerizacin de glucosa a jarabes de maz de alta fructosa (HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para soluciones de sacarosa y azcar invertida Background: Altas temperaturas de reaccin para altos rendimientos de fructosa pH 7 para la actividad y estabilidad de la enzima PERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fcilmente se descomponen a cidos orgnicos y subproductos coloreados El tiempo de reaccin debe ser minimizado

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Aplicaciones industriales Glucosa isomerasa inmovilizada

Condiciones del proceso: En reactores de lecho fijo contnuos Temperatura: 55-60 oC pH: ptimo pH de la enzima Los grnulos de la enzima deben ser suficientemente rgidos para prevenir la compactacin durante la operacin

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Aplicaciones industriales Glucosa isomerasa inmovilizada

Rendimiento Mtodo de Inmovilizacin 1. La enzima, despus del aislamiento y purificacin, es covalentemente inmovilizada sobre un soporte inerte 2. Entrecruzamiento de clulas que contienen las enzimas deseadas 3. La enzima parcialmente purificada es inmovilizada sobre resinas de intercambio inico
(kg producto seco/ kg enzima)

20,000 2,000-4,000

7,000- 10,000

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Conclusiones

La inmovilizacin permite el uso repetitivo de la enzima lo que significa un ahorro significativo en los costos La seleccin de los mtodos de inmovilizacin debern estar basados en los requerimientos tcnicos especficos y en el marco global de su aplicacin comercial