VECTORES

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Vectores Vectores utilizados utilizados Plasmdeos Fagos Cosmdeos Fagemdeos vectores

Outros

na construo de uma biblioteca genmica na construo de uma biblioteca de cDNA

Os vectores de clonagem molecular so molculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cpias, a informao gentica que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vectores possuindo cada um particularidades que lhe so prprias. PLASMDEOS Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA de cadeia dupla, que contm os elementos necessrios sua replicao e um gene que confere resistncia a um antibitico. Podem estar presentes em duas ou mais cpias na clula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este plasmdeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles inserido, so utilizados como vectores de clonagem. Para isso, tm que possuir certas propriedades: ter uma origem de replicao, que consiste numa sequncia de DNA que permite a replicao do vector na clula hospedeira; possuir Mltiplos Stios de Clonagem (MSC), ou seja, vrios locais nicos de clivagem para endonucleases de restrio, os quais constituem o stio de insero no vector de clonagem; conter um gene que codifique uma substncia que possa distinguir uma clula transformada de uma no transformada. Muitas vezes, so utilizados genes que conferem resistncia a um antibitico, destacandose, devido sua grande utilizao, o gene que confere resistncia ampicilina. Assim, as clulas que possuem este gene so capazes de crescer em meios com ampicilina, enquanto que as restantes no sobrevivem.

 Figura D1: Plasmdeo.Plasmdeo com sequncias que conferem resistncia ampicilina e tetraciclina. Apresenta ainda uma origem de replicao (ori) e stios de restrio para a EcoRI, SalI e PstI. Fonte: Passarge,
Color Atlas ofGenetics; pgina 57.

Estes vectores constituem parte essencial no processo de clonagem, sendo necessria a actuao das enzimas de restrio para ligar o DNA a ser clonado ao DNA do vector, atravs da produo de extremidades coesivas complementares (ou extremidades abruptas). Seguidamente, a molcula hbrida resultante inserida numa clula hospedeira, muitas vezes bactrias, por um processo denominado transformao. O vector pode assim sofrer replicaes e proceder consequente amplificao do nmero de cpias. Como foi referido anteriormente, estas clulas so identificadas devido a novas caractersticas concedidas pelo plasmdeo (por exemplo, sobreviver num meio contendo um dado antibitico para o qual o plasmdeo confere resistncia).

Figura D2: Clonagem em plasmdeos. Um plasmdeo uma pequena molcula circular que contm uma origem de replicao (ori), gene que confere resistncia a um antibitico (no exemplo ampicilina, Amp) e stio(s) de restrio (no exemplo, stio de restrio para a EcoRI), o qual pode ser usado para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido ligado ao vector e os plasmdeos recombinantes so transformados em bactrias, tais como a E. coli. As bactrias so plaqueadas em meios contendo o antibitico para o qual o plasmdeo confere resistncia, como forma de seleccionar as bactrias resistentes (ou seja, transformadas). Desenvolvem-se ento colnias de bactrias com o plasmdeo recombinante. Fonte: Cooper, G.M. and Hausman, R.E. 2003. The Cell: A Molecular
Approach. 3d ed. Amer. Soc. Microbiol., Washington and Sinauer Assoc., Sunderland, MA.pgina 110.

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FAGOS O fago mais utilizado na clonagem molecular o bacterifago que se comporta como um vrus da E. coli. assim, uma partcula viral constituda por protenas e DNA em igual quantidade, e que se apresenta como uma molcula linear de cadeia dupla (cerca de 48.500 pares de bases). injectado na clula hospedeira por possuir a particularidade das suas extremidades (stio cos) serem de cadeia simples, constitudas por cerca de 12nucletidos que, sendo complementares na sequncia de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma circular antes da sua insero. O genoma do fago codifica para 50 protenas, aproximadamente.

Figura D3: Clonagem em bacterifagos . O vector contm um stio de restrio (por exemplo, para EcoRI) para insero do DNA clonado. Adicionalmente, stios cos, necessrios para o empacotamento do DNA nos fagos, esto presentes em ambas as extremidades do vector de DNA. O DNA inserido ligado ao vector e as molculas recombinantes so empacotadas nos fagos. Os fagos recombinantes so ento usados para infectar bactrias, tais como a E. coli. Cada fago recombinante, que carrega um fragmento nico do DNA clonado, forma uma placa nica no interior da cultura bacteriana. Fonte: Cooper, G.M. and Hausman, R.E. 2003. The Cell: A Molecular
Approach. 3d ed. Amer. Soc. Microbiol., Washington and Sinauer Assoc., Sunderland, MA.pgina

O fago usado na clonagem molecular por possuir certas vantagens: O DNA inserido empacotado in vitro. A eficincia do empacotamento somente de 10% aproximadamente, no entanto, uma vez empacotado, a eficincia de insero na clula E. coli hospedeira de 100%; Mais eficiente que a transformao bacteriana com plasmdeos, pois esta na melhor das hipteses tem 10 8 transformantes por g de DNA, o que significa que menos de 1 em 1000 plasmdeosso transformados. Existem vrios derivados do fago , salientando-se os vectores de substituio e os vectores de insero. Vectores de substituio: possuem um ou mais locais de restrio na regio de recombinao, o que facilita a sua substituio por outro DNA. Como exemplo deste tipo de vector temos o EMBL3, cuja regio de recombinao limitada por enzimas de restrio, nomeadamente a EcoRI, a BamHI e a SalI. Estas, aquando da sua clivagem, podem receber variados fragmentos de DNA entre 10,4 e 20 kb. Vectores de insero: nestes vectores, o DNA a ser inserido no pode

ter mais de 7 kb de tamanho, para no ocorrerem alteraes nos processos de empacotamento do genoma do fago. Topo

COSMDEOS O aparecimento da clonagem em cosmdeos deu-se para ultrapassar algumas limitaes da clonagem em fagos e plasmdeos. No fago , os fragmentos de DNA a serem inseridos no podem ultrapassar os 15 kb, e, apesar de, por vezes, ser o suficiente para conter um gene completo com as suas sequncias limitadoras, na maior parte das vezes, os genes so de maiores dimenses (35 a 40 kb) o que torna impossvel a sua insero. Os cosmdeos so assim, plasmdeos (com origem de replicao e genes que conferem resistncia a antibiticos), que contm um fragmento de DNA do fago incluindo o local cos. So utilizados como veculos de clonagem molecular atravs do empacotamento in vitro (tcnica j referida na clonagem em fagos, que, neste caso, reconstitui a estrutura do fago em cabea e cauda, sendo assim utilizado para infectar a clula hospedeira). As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distncia de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos passveis de serem empacotados. Assim, o DNA clivado com uma enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA que se vo ligar ao cosmdeo anteriormente clivado com uma enzima semelhante. Numa situao ideal, cada fragmento de DNA genmico possui um local cos nas suas extremidades que, durante o empacotamento, vo ser reconhecidos por enzimas (caso estes locais estejam situados a uma distncia de 49 kb). Seguidamente, uma vez injectado no interior da clula hospedeira, vai circularizar e replicar como um plasmdeo normal, sem exprimir qualquer funo do fago, sendo igualmente reconhecido com base na resistncia adquirida a um antibitico especfico.

Figura D4: Esquema de clonagem em cosmdeo. Fonte: http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

Topo FAGEMDEOS Os fagemdeos foram desenvolvidos de modo a juntar as vantagens do fago e do plasmdeo. So particularmente teis na clonagem de cDNA e apresentam algumas caractersticas principais:

Apresentam uma zona verstil de mltiplos locais de clonagem (MSC), o que permite a clonagem de genes grandes, sem muita dificuldade, destacando-se igualmente a ordenao espacial dos stios de restrio, propriedade interessante no sequenciamento de DNA; Possuem uma combinao estratgica de stios de restrio que permitem a obteno progressiva e controlada de fragmentos, os quais aps re-circularizao se tornam apropriados para o sequenciamento, facilitando-o. Topo

OUTROS

TIPOS

DE

VECTORES

Derivados do bacterifago P1: permitem a insero de fragmentos de DNA entre 70 e 100 kb, contendo sequncias que deixam as molculas recombinantes ser empacotadas in vitro em partculas de fago P1, e depois replicadas em plasmdeos em E. coli. PAC (cromossoma artificial P1): contm tambm sequncias de bacterifago P1, mas estas so introduzidas directamente em plasmdeos em E. coli, permitindo a insero de fragmentos de tamanho compreendido entre 130 e 150 kb. BAC (cromossoma artificial bacteriano): derivado de plasmdeos naturais de E. coli, denominado de factor F. A origem de replicao e as outras sequncias do factor F, permitem a sua replicao enquanto plasmdeos estveis, possuindo inseres de 120-300kb. Devido sua estabilidade, capacidade de aceitar grandes fragmentos de DNA e facilidade de manuseamento, so agora os vectores de clonagem preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos. YAC ( cromossoma artificial de levedura): contm origens de replicao de leveduras e outras sequncias (centrmeros e telmeros), que permitem a sua replicao como molculas lineares do tipo cromossmico em clulas de levedura.

 Figura D5: YAC. Os YAC (Yeast Artificial Chromossome) permitem a clonagem de molculas de DNA relativamente grandes. TEL, CEN e ORI correspondem a telmero, centrmero e origem de replicao, respectivamente, para a levedura Saccharomycescerevisiae. BamHI e EcoRI correspondem a stios de restrio para as respectivas enzimas de restrio. As sequncias A e B codificam enzimas que servem como marcadores de seleco, permitindo um fcil isolamento das leveduras que apresentarem o cromossoma artificial. Fonte: Alberts, B., et.al. 2002. Molecular Biology of the Cell. 4th ed. New York. Garland Science. pgina 502.

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VECTORES UTILIZADOS BIBLIOTECA GENMICA

NA

CONSTRUO

DE

UMA

Actualmente, os vectores mais utilizados na construo de bibliotecas genmicas so fagos e cosmdeos. Em ambos os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por fragmentao aleatria, ligam-se ao DNA do vector para poderem ser empacotados em partculas de fago . As bibliotecas construdas com vectores so armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. Estes vectores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais. O fragmento ou brao esquerdo, codifica as protenas da cpsula, e o brao (fragmento) direito, tem a origem de replicao do fago e promotores de outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braos esto os stios de restrio usados na clonagem, orientados inversamente SalI, BamHI, EcoRI . A extremidade de cada brao apresenta um segmento de cadeia simples (cos). Estes segmentos so complementares entre si, permitindo assim a

recircularizao da molcula e consequente replicao do fago dentro da clula hospedeira.

Figura

D6:

Estrutura

do

vector

EMBL3.

S=SalI;

B=BamHI;

E=EcoRI.

Fonte:

http://morpheus.fmrp.usp.br/td/download_apostila.php

Este tipo de vector chamado vector de substituio porque, no processo de clonagem, a parte central do DNA do fago substituda pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando deste modo a molcula recombinante. Os fragmentos clonados so ligados aos braos do fago, previamente preparados com BamHI, sendo esta mistura empacotada in vitro em partculas vricas. Para se seleccionar apenas os fagos recombinantes, estes so infectados numa bactria lisognica. A suspenso de fagos resultante pode ser armazenada durante vrios anos num frigorfico, com algumas gotas de clorofrmio para prevenir o crescimento bacteriano, embora a concentrao do nmero de partculas infecciosas v baixando gradualmente. A biblioteca tambm pode ser armazenada por congelamento da mistura de ligao (fragmento de DNA/ vector). Na clonagem em cosmdeos, as partculas virais servem apenas como veculos para introduzir o DNA recombinante dentro da bactria e uma vez dentro dela o cosmdeo comporta-se como um plasmdeo grande. Os cosmdeos podem aceitar inseres de cerca de 45kb, quase 2 vezes o tamanho das inseres clonveis num fago . Assim, quando um cosmdeo utilizado como vector, apenas so necessrios 350.000 recombinantes para se atingir 99% de probabilidade de uma sequncia de cpia nica estar presente numa biblioteca genmica de mamfero. No entanto, as bibliotecas de cosmdeos so mais difceis de construir e de manter que as bibliotecas de fagos. Assim, os cosmdeos so utilizados quando o gene de interesse muito grande ou quando se deseja uma regio extensa de DNA; o uso de vectores mais recomendado no isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em circunstncias em que a biblioteca vai ser utilizada muitas vezes. O mtodo utilizado para isolamento de clones genmicos especficos tem sido frequentemente o de rastreio por hibridizao com uma sonda, normalmente uma sonda de cDNA. A amplificao directa de fragmentos de DNA por PCR agora igualmente comum. Topo

VECTORES UTILIZADOS NA CONSTRUO DE UMA BIBLIOTECA DE cDNA

Aps ter sido obtido o cDNA, necessrio prepar-lo para ser inserido num vector de clonagem, processo que depende do vector escolhido: plasmdeo ou fago. O fago mais utilizado devido sua elevada eficincia: comparativamente com os plasmdeos, requer cerca de 16 vezes menos cDNA por g do vector para produzir um nmero equivalente de clones recombinantes; As bibliotecas de fagos so mais fceis de manipular que as bibliotecas de plasmdeos; No entanto, os fagos no so favorveis para procedimentos de sequenciamento de DNA e de mutagnese dirigida. Para ultrapassar esta limitao idealizaram-se os fagemdeos que so plasmdeos contendo pores do genoma do fago, reunindo assim as vantagens dos dois vectores. Para efectuar a ligao entre o vector e o cDNA so necessrios alguns procedimentos preparatrios, como por exemplo polir as extremidades das molculas de cDNA de cadeia dupla com a enzima Klenow, de maneira a ficarem blunt e ligadas a locais blunt de vectores de clonagem. No entanto, este processo no se revela muito eficiente, existindo outros que transformam as extremidades do cDNA em extremidades coesivas, compatveis com a ligao ao local de clonagem de um vector. Estes processos consistem na adio de adaptadores, sendo o seguinte mtodo um exemplo destes: 1- Metilao dos stios de EcoRI com o tratamento do cDNA com EcoRI, na presena de S-adenosil metionina. essencial para proteger os stios de EcoRI que possam existir no cDNA, contra a digesto da EcoRI, que se vai realizar uns passos frente; 2- Adio de adaptadores, com o stio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Estes adaptadores so pequenos oligo-nucleotdeos que tm uma extremidade em cadeia dupla, ligando-se s extremidades do cDNA, e tm outra extremidade coesiva, igual produzida por uma enzima de restrio, permitindo a ligao a um vector preparado com a mesma enzima de restrio. Esta adio de adaptadores resulta na obteno de molculas de cDNA com adaptadores mltiplos ligados nas duas pontas; 3- Apenas produzido um stio de EcoRI em cada ponta do cDNA pela digesto com EcoRI, libertando o excesso de adaptadores ligados na molcula. No ocorre digesto interna do cDNA devido metilao previamente efectuada; 4- Atravs da filtrao em colunas de Sephadex, o cDNA separado do excesso de adaptadores, antes de ser inserido no vector; 5- A T4 ligase permite a ligao das molculas de cDNA ao vector; 6- O produto da ligao junta-se com as protenas que formam o capsdeo

do

fago;

7- Os fagos assim produzidos vo infectar bactrias de uma linhagem que favorea o crescimento dos recombinantes; 8- A biblioteca obtida aps infeco da bactria com os cDNA recombinantes, devendo conter cpias de todas as sequncias de mRNA da populao original. 9- Pode depois ser congelada ou ser submetida a um processo de isolamento do clone de um determinado gene de interesse. Considerando que as molculas de cDNA representam o mRNA total de um organismo ou tecido especfico -expresso gentica estas bibliotecas so muito teis para obter genes diferencialmente expressos. Para isso, procede-se ao isolamento de genes expressos apenas em determinados tecidos, ou de genes expressos em estdios especficos de desenvolvimento ou em determinadas condies ambientais. Pode-se assim construir bibliotecas atravs de hibridizao subtractiva. Estas bibliotecas so enriquecidas em genes expressos diferentemente em determinadas condies seleccionadas: Obtm-se preparaes de duas populaes de mRNA (ligeiramente)diferentes como por exemplo, clulas do mesmo tipo mas cultivadas a temperaturas diferentes; A primeira cadeia de cDNA de uma das populaes de mRNA preparada e depois hibridada com um excesso da outra populao de mRNA; Ocorre a formao de hbridos entre o cDNA e mRNA complementares, respeitantes a genes das duas populaes; A cromatografia em colunas de materiais que ligam especificamente molculas de cadeia dupla, permitir a remoo dos hbridos; O cDNA especfico da primeira populao permanece em cadeia simples e no se liga coluna; Depois utilizado para a preparao de uma biblioteca de cDNA enriquecida em determinados genes especficos ou marcado radioactivamente para ser utilizado directamente como sonda, para se proceder ao rastreio de uma biblioteca de genes.