Identificacin de bacterias Introduccin: Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad

de un organismo. Es el ejercicio prctico en el que se ejercen las pruebas de identificacin bacteriana. En la medicina general es comn que llegue un paciente con sntomas de alguna infeccin bacteriana, el determinar un diagnstico y poder interpretar qu bacteria caus la molestia al paciente es aventurado, pues hay muchas bacterias que causan las mismas enfermedades, por eso es conveniente realizar pruebas de identificacin, que son sumamente importantes para un buen diagnstico de cualquier patologa. Cada gnero, inclusive especie, tiene diferentes reacciones cuando se les enfrentan diferentes reactivos, esto se hace a partir de un cultivo puro, ya la bacteria aislada, con estas pruebas podremos decir casi con exactitud de que gnero y qu especie es esta bacteria. A estas pruebas se les ha como primarias, secundarias y Complementarias.

OBJETIVOS:

Identificar y describir morfolgicamente a las bacterias. Realizar e interpretar la prueba de la catalasa. Conocer acerca da prueba de la oxidacin- fermentacin. Efectuar e interpretar pruebas para investigar el metabolismo de los carbohidratos y compuestos nitrogenados.

PROCEDIMIENTO: Estudio morfolgico de las colonias bacterianas

El

crecimiento

bacteriano

en

una

superficie

slida

presenta

caractersticas de cultivo llamadas: morfologa colonial. Una colonia se define como una masa visible de microorganismos, todos originados de una sola clula madre, de manera que una colonia constituye clones de bacterias, todas genticamente similares. Los siguientes adjetivos pueden usarse para describir la morfologa colonial o caractersticas de cultivo: 1) Tamao: medido en milmetros; pequeo, mediano, grande, y muy grande o extendida en forma de velo invadiendo toda la superficie del medio. 2) Forma: Circular, Irregular, Filamentosa, Rizoide puntiforme y Ondulada 3) Margen: (la forma del contorno de la colonia): Entero, ondulada, lobada, irregular, concntrica, arrugado, circular irradiado, Filamentoso (filiforme), ciliado. 4) Propiedades pticas: Opaca, translcida y transparente y brillante (mucoide). 5) Elevacin: Elevada, Convexa, Plana, gotiforme (forma de gota), embonada, crateriforme. Colonias de bajo crecimiento 6) Textura: Suave, Granular, Tenaz, Mucoide. 7) Pigmento: Hialino a colores blanquecinos, y de amarillos a rojos.

MORFOLOGA COLONIAL BACTERIANA. Cuando tienes un cultivo en agar (caja Petri) siempre es relevante

anotar la morfologa colonial (colonias aisladas) de la cepa bacteriana para facilitar la identificacin, los siguientes datos te sern de utilidad:

Generalmente se reporta la morfologa colonial tal como uno la percibe, por ejemplo si se ves que las colonias bacterianas son como puntitos, pues reportan que son puntiformes, si son lisas pues reportan que son lisas, si observas que estn como moco, pues reportan que estn mucosas, si su color es amarillento pues reportan que son de color amarillento, y as sucesivamente., tambin puedes agregar caractersticas que consideres importante para identificarlas, por ejemplo el olor., Aun as checa las siguientes imgenes para orientarte. Estudio morfolgico de la colonia bacteriana. Determinar el tamao, forma borde, elevacin consistencia, aspecto, y color de la colonia bacteriana A) Tamao: mediano. B) Forma: circular. C) Bordes: entero D) Elevacin: plana. E) Aspecto: pastosa. F) Color: pigmentada de color crema.

PRUEBA DE LA CATALASA

Fundamento de la pruebe de catalasa. El perxido de hidrgeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta va metablica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo. La acumulacin del perxido es muy toxico por lo que la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando a Estreptococos sp. Producen una enzima llamada catalasa que degrada el perxido de hidrgeno obteniendo agua y oxigeno gas. Mtodo del portaobjetos Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos. Tcnica e interpretacin de la prueba. El reactivo utilizado en la prueba es el perxido de hidrogeno al 30%, Hay diferentes tcnicas para realizar la prueba la ms comn es poner una gota de perxido en el portaobjetos y posteriormente con un palillo plano tomar un poco de bacteria a partir de una colonia aislada, si se observa el burbujeo generalmente intenso significa que hay produccin de oxgeno por lo tanto se entiende que hay presencia de la enzima catalasa., hay bacterias que dan una reaccin positiva dbil aunque son las menos.

OXIDACIN-FERMENTACIN (PRUEBA DE HUGH Y LEIFSON) Esta prueba realiza para la determinacin del metabolismo oxidativo o fermentativo de los carbohidratos. MEDIO DE CULTIVO Medio base de Hugh y Leifson

Triptona Extracto de levadura Prpura de Bromocresol Agar Agua destilada

PROCEDIMIENTO

10,0 1,0 0,04 2,0 1000,0

g g g g mL

Para cada microorganismo a identificar, se inoculan por puncin dos tubos de medio. En uno de los dos tubos se cubre la superficie con parafina estril para crear condiciones de anaerobiosis. Se incuba a 35C hasta por 14 das. RESULTADOS La produccin de cido se evidencia por el cambio de color de prpura a amarillo. Los microorganismos fermentadores producen cido en ambos tubos, los microorganismos oxidadores (respiradores) slo lo producen en el tubo sin parafina.

METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS

procesos bioqumicos de formacin, ruptura y conversin de los carbohidratos en los organismos vivos. Los carbohidratos son las principales molculas destinadas al aporte de energa, gracias a su fcil metabolismo. El carbohidrato ms comn es la glucosa; un monosacrido metabolizado por casi todos los organismos conocidos. La oxidacin de un gramo de carbohidratos genera aproximadamente 4 kcal de energa; algo menos de la mitad que la generada desde lpidos.

Objetivos generales:

Investigar la fermentacin de la lactosa, sacarosa y glucosa (agar TSI), formacin de acidez (medio RMVP), utilizacin del citrato como fuente de energa (medio de citrato Simmons) e hidrolisis de almidn (agar almidn).

Agar (T.S.I.) (Agar triple azucar de hierro)_ (color anaranjado -rojizo)

Un medio para la diferenciacin de Enterobacteriaceae basado en la produccin de sulfuro de hidrgeno y fermentacin de lactosa, sucrosa y dextrosa. Composicin

COMPOSICIN Mezcla de peptona Extracto de levadura Extracto de carne Lactosa Sacarosa Dextrosa Cloruro de sodio Citrato frrico amonio Tiosulfato de sodio i Fenol rojo Aqai pH final: 7.4 0.2

CONCENTRACI N DEL MEDIO: 18 0q litro 3 Og litro - Og litro 10.00/litro 10.0g litro 1 0q litro 5 Og litro de 0 3q/litro 0.3g/litro 0.025o/litro I4.0g/litro

Fundamento En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Siembra A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio. Incubacin A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis. Resultados 1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.

Medio MR-VP (Rojo de metilo- Voges Proskauer)

Medio utilizado para la realizacin del ensayo de Rojo de Metilo y Voges Proskauer. Es particularmente til para la clasificacin de enterobacterias. Fundamento En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la glucosa es el hidrato de carbono fermentable. La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas vas metablicas. Segn la va utilizada, se originarn productos finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico), o productos finales neutros (acetil metil carbinol). Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un indicador como rojo de metilo, para revelar la presencia de productos cidos, y por la adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros. Voges y Proskauer, describieron una coloracin rojiza que apareca despus de adicionar hidrxido de potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloracin se debe a la oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.

COMPOSICION: Frmula (en gramos por litro) Polipeptona Glucosa Fosfato dipotsico 7.0 5.0 5.0

Siembra Por inoculacin directa, a partir del cultivo en estudio. Incubacin, en aerobiosis, a 35-37C por 3 das. Revelado de pruebas bioqumicas a-Prueba del rojo de metilo: Aadir unas gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%, observar el color del medio. Procedimiento: Inocular el medio a partir de una colonia aislada. Incubar a 352C durante 48 horas. Para realizar la prueba RM, transferir 2.5 mL del medio a un tubo de 13x100mL y adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo. Observar la formacin de color. Para la prueba VP, transferir 2.5mL del medio a un tubo de 13x100mL, adicionar 6 gotas del reactivo de alfa-naftol al 5% y 2 gotas del reactivo de KOH al 40%. Agitar y dejar reposar por 10 minutos. Observar el cambio de color.

RESULTADO Prueba Reaccin positiva M R Color rojo brillante V P Color Rojo Reaccin negativa No hay desarrollo de color El medio no cambia de color

MEDIO CITRATO DE SIMMONS

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa Fundamento En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El

desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

Frmula (en gramos por litro)

Citrato de sodio Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Fosfato monoamnico Sulfato de magnesio Azul de bromotimol Agar PH

2.0 5.0 1.0 1.0 0.2 0.08 15.0 6.9

Mtodo: Suspender 24.2 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin inclinada. Procedimiento: 1. Obtener un cultivo puro del microorganismo a ser probado. 2. Tomar una colonia bien aislada a partir de un medio slido. 3. Sembrar por estra slo la superficie inclinada del medio. 4. Incubar los tubos con las tapas flojas a 35 0.2C durante 18 - 48 hrs.

Una reaccin positiva se observa por el crecimiento en el medio con un intenso color azul. Una reaccinnegativa es indicada por la ausencia, o pobre crecimiento sin cambio de color en el medio que permanece verde. Almacenamiento: 2-30 C. Caducidad: 4.5 aos en frasco cerrado. Presentacin: Frasco con 450 g Caja con 20 sobres para un litro Medio preparado en caja con 10 Tubos Resultados -Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

AGAR ALMIDONN

Composicin Agar nutritivo Almidn

g/L 100 mL 1.0

Fundamento El almidn es un polmero complejo que se reacciona con el Lugol (yodo) formando un complejo de color azul. Cuando las bacterias hidrolizan el almidn a molculas ms simples como la maltosa y la glucosa, estas ya no reaccionan con el Lugol y no se forma una coloracin azul. Tcnica Sembrar por el mtodo de estra en un tubo contenido de agar almidn inclinado. Incubar a 37 por 24 horas. adicionar dos gotas de Lugol. Observar o o la presencia de una color azul.

Lectura En una hidrolisis positiva del almidn, despus de adicionar el lugol no se observara coloracin alguna. Por el contrario, en una hidrolisis negativa despus de adicionar el lugol se observara una coloracin azul.

METABOLISMO DE LOS COMPUESTOS NITROGENADOS

OBJETIBOS GENERALES: Investigar la descarboxilacion de la lisina Investigar la formacin del indol (caldo peptonado)

AGAR LIA (AGAR LISINA HIERRO) El Agar de Hierro y Lisina es un medio utilizado para la diferenciacin de microorganismos entricos en base a su capacidad para desaminar o descarboxilar la lisina y de producir sulfuro de hidrgeno. Este medio tambin es conocido como LIA. Frmula Peptona de gelatina Extracto de levadura Glucosa Lisina Tiosulfato de sodio Prpura de Bromocresol Agar (en gramos por litro) 5.0 3.0 1.0 10.0 0.5 0.04 0.02

Citrato de hierro y amonio 15.0

pH final

: 6.7 0.2

Fundamento En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de Bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada. Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 h de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Mtodo: Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto. Dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar en posicin horizontal. Procedimiento: 1. A partir de una colonia aislada sembrar el medio por picadura en el fondo y por estra en la superficie. 2. Incubar a 35 2C durante 18 a 48 horas. 3. Examinar los tubos para observar cambios de color y ennegrecimiento Resultados 1- Decarboxilacin de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

Medio caldo peptonado

Frmula (en gramos por litro) Peptona de carne 10.0 Cloruro de sodio PH final: 7.2 0.2 Reactivo de Kovac: alcohol amlico o isoamilico puro 150 p- dimetilaminobenzaldehido HCl concentrado 10 50 5.0

Fundamento Medio de enriquecimiento no selectivo, recomendado para ser utilizado en lugar de solucin fisiolgica para recuperar clulas de enterobacterias daadas por procesos fisicoqumicos, a los que ha sido sometido el alimento. Si es utilizado como medio base para la fermentacin de hidratos de carbono, se debe adicionar el indicador de Andrade y el hidrato de carbono en cuestin. Siembra Por inoculacin directa del material en estudio. Como diluyente: realizar las diluciones 1:10 y 1:100, dependiendo del uso que se le quiera dar.

Tcnica Inocular el caldo peptonado con el microorganismo en estudio. Incubar a 37C durante 24 h. Agregar por la pared del tubo cinco gotas de reactivo de Kovac.

Incubacin Aerbica, a 35-37 C durante 18-24 horas.

Lectura Observar la formacin de un anillo coloreado en la zona de reaccin (color rojo) = indol (+).

Con la prctica realizada en el laboratorio de microbiologa general aprendimos a interpretar tanto el metabolismo de los carbohidratos y de los compuestos nitrogenados. Tambin aprendimos a designar el reactivo adecuado para cada medio, para su correcta reaccin.