BALOTARIO DE LABORATORIO Normas de seguridad de trabajo de laboratorio. No fumes, comas o bebas en el laboratorio.

Utiliza una bata y tenla siempre bien abrochada, as protegers tu ropa. Guarda tus prendas de abrigo y los objetos personales en un armario o taquilla y no los dejes nunca sobre la mesa de trabajo. No lleves bufandas, pauelos largos ni prendas u objetos que dificulten tu movilidad. Procura no andar de un lado para otro sin motivo y, sobre todo, no corras dentro del laboratorio. Si tienes el cabello largo, recgetelo. Dispn sobre la mesa slo los libros y cuadernos que sean necesarios. Ten siempre tus manos limpias y secas. Si tienes alguna herida, tpala. No pruebes ni ingieras los productos. En caso de producirse un accidente, quemadura o lesin, comuncalo inmediatamente al profesor. Recuerda dnde est situado el botiqun. Mantn el rea de trabajo limpia y ordenada. Normas para manipular instrumentos y productos Antes de manipular un aparato o montaje elctrico, desconctalo de la red elctrica. No pongas en funcionamiento un circuito elctrico sin que el profesor haya revisado la instalacin. No utilices ninguna herramienta o mquina sin conocer su uso, funcionamiento y normas de seguridad especficas. Maneja con especial cuidado el material frgil, por ejemplo, el vidrio. Informa al profesor del material roto o averiado. Fjate en los signos de peligrosidad que aparecen en los frascos de los productos qumicos. Lvate las manos con jabn despus de tocar cualquier producto qumico. Al acabar la prctica, limpia y ordena el material utilizado. Si te salpicas accidentalmente, lava la zona afectada con agua abundante. Si salpicas la mesa, lmpiala con agua y scala despus con un pao. Evita el contacto con fuentes de calor. No manipules cerca de ellas sustancias inflamables. Para sujetar el instrumental de vidrio y retirarlo del fuego, utiliza pinzas de madera. Cuando calientes los tubos de ensayo con la ayuda de dichas pinzas, procura darles cierta inclinacin. Nunca mires directamente al interior del tubo por su abertura ni dirijas esta hacia algn compaero. (ver imagen)

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Todos los productos inflamables deben almacenarse en un lugar adecuado y separados de los cidos, las bases y los reactivos oxidantes. Los cidos y las bases fuertes han de manejarse con mucha precaucin, ya que la mayora son corrosivos y, si caen sobre la piel o la ropa, pueden producir heridas y quemaduras importantes. Si tienes que mezclar algn cido (por ejemplo, cido sulfrico) con agua, aade el cido sobre el agua, nunca al contrario, pues el cido saltara y podra provocarte quemaduras en la cara y los ojos. No dejes destapados los frascos ni aspires su contenido. Muchas sustancias lquidas (alcohol, ter, cloroformo, amonaco...) emiten vapores txicos. Smbolos de los reactivos usados en laboratorio, que indiquen sus caractersticas para su manejo en el laboratorio.

INFORME N 01 MICROSCOPIA INTRODUCCION La biologa celular se inici con la microscopia ptica. Una clula animal tpica mide entre 19 y 20 m de dimetro, es decir, unas veces menos que la menor partcula visible. Por esta razn, la disposicin de buenos microscopios pticos a principios de siglo XIX permiti determinar que todos los tejidos vegetales y animales son agregados de clulas (teora celular de schleiden y shwann, 1838). Se considera que el primer microscopio compuesto fue construido por los holandeses H. Jansen y Z. Jansen en 1590.
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La invencin del microscopio en el siglo XVII posibilit la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio ptico simple, examin un corte de corteza, encontr que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cmaras, que llam clulas, en realidad slo vi las paredes celulares, ya que este tejido est muerto a la madurez y las clulas ya no tienen contenido. Mas tarde, Hoock y algunos de sus contemporneos observaron clulas vivas. El tipo de microscopio ms utilizado es el microscopio ptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio ptico ms simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios pticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo est compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios estn dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a travs del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. 1.- Definicin de los siguientes trminos: LIMITE DE RESOLUCIN: El lmite de resolucin de un microscopio ptico viene determinado por la longitud de onda de la luz con la que se ilumina el objeto. El lmite de resolucin puede disminuirse si emplea una radiacin con una menor longitud de onda (l). La longitud de onda efectiva de un haz de electrones fuertemente acelerados es muchos rdenes de magnitud menor que la de la luz visible e incluso que la de la luz ultravioleta (0.004 nm a 100 kV frente a los 800-200nm de la luz). La ventaja que tienen los electrones sobre otras partculas de pequea l es que los electrones son fcilmente acelerados mediante una diferencia de potencial y adems es posible, al estar cargados, modificar su trayectoria en presencia de campos elctricos o magnticos. Recomendaciones Levantar y transportar el microscopio por el brazo. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al inicio y final de la sesin prctica. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin. La cantidad de luz que ingresa por el condensador va ha depender del objetivo que estemos utilizando, a mayor aumento mayor cantidad de luz. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En nuestro caso podemos hacer uso de pauelos que no dejen pelusa. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. Mantener seca y limpia la platina del microscopio.

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PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO

Sistema ptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecnico SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, .. REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. Para realizar el enfoque: Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se
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corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. Empleo del objetivo de inmersin: Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable).
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En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos. APERTURA NUMRICA: expresin matemtica que describe la forma en que la luz es concentrada por el condensador y captada por el objetivo. AN = n x sen n = ndice de refraccin del medio entre las lentes y la muestra (1.0 para el aire; 1.56 para el aceite de inmersin). = ngulo formado por el eje ptico y los rayos de luz ms externos que son captados por el objetivo

PODER DE RESOLUCION: El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio (o el ojo humano, etc.) de percibir por separado dos puntos pequeos, adyacentes y cercanos. Vale decir, es la capacidad para percibir detalles. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos. Es decir, si dos puntos distan 1cm uno del otro y yo los veo como un solo punto borroso (aparte de necesitar urgente un oculista) tendr menor poder resolutivo que alguien que los distingue por separado o que distingue perfectamente puntos que distan de 0,5cm entre si. El poder resolutivo del microscopio no guarda relacin alguna con el aumento del mismo. Depende principalmente de la apertura numrica de la lente y de la longitud de onda de la luz utilizada. Sin abocarnos demasiado a definir "apertura numrica" podemos decir que es un valor determinado, entre otras cosas, por el dimetro de la lente.

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INDICE DE REFRACCIN: Se llama ndice de refraccin a la relacin que existe entre la velocidad de la luz en el vaco y su velocidad en cualquier otro material. Cuanto mayor es la densidad de un material, mayor ndice de refraccin posee. Por ejemplo, el ndice de refraccin del agua pura (a temperatura ambiente) es 1,33, lo que significa que la luz viaja 1,33 veces ms despacio en el agua que en el vaco. 2.- Con que fin se usa el aceite de inmersin en microscopa? USO DEL ACEITE: En los momentos en que se realiza observaciones de muestras con objeto de inmersin 100X, el aire que se encuentra entre el objetivo y el cubreobjeto provoca una distorsin de la imagen de la muestra, esto es debido a la diferencia que existe entre los ndices de refraccin del vidrio y del aire. Entonces para poder solucionar este problema se utilizan los objetivos que contienen aceite para la transmisin de la luz completando el sistema con el uso de una gota de aceite de inmersin que se coloca entre el objeto y el cubreobjeto de manera que se igualen los ndices de refraccin. El aceite de inmersin utilizado es el aceite de cedro que tendr por misin concentrar los rayos luminosos que llegan del preparado al objetivo logrando una mayor nitidez de la imagen. 3.- Explique el uso y el mecanismo de accin de los microscopios estereoscopico, de contraste de fases y el microscopio de fluorescencia MICROSCOPIO ESTEREOSCOPICO: El diseo de este instrumento es distinto al del diagrama de ms arriba y su utilidad es diferente, pues se utiliza para ofrecer una imagen estereoscpica (3D) de la muestra. Para ello, y como ocurre en la visin binocular convencional, es necesario que los dos ojos observen la imagen con ngulos ligeramente distintos. Obviamente todos los microscopios estereoscpicos, por definicin, deben ser binoculares (con un ocular para cada ojo), por lo que a veces se confunden ambos trminos. Existen dos tipos de diseo, denominados respectivamente convergente (o Greenough) y de objetivo comn (o Galileo).
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El diseo convergente consiste en usar dos microscopios idnticos inclinados un cierto ngulo uno con respecto a otro y acoplados mecnicamente de tal forma que enfocan la imagen en el mismo punto y con el mismo aumento. Aunque es un diseo econmico, potente y en el que las aberraciones resultan muy fciles de corregir, presenta algunas limitaciones en cuanto a modularidad (capacidad de modificar el sistema para poner accesorios) y la observacin durante tiempos largos resulta fatigosa. El microscopio estereoscpico es apropiado para observar objetos de tamaos relativamente grandes, por lo que no es necesario modificar los objetos a ver, (laminar) ni tampoco lo es que la luz pase a travs de la muestra. Este tipo de microscopios permite una distancias que van desde un par de centmetros a las decenas de ellos desde la muestra al objetivo, lo que lo hace muy til en botnica, mineraloga y en la industria (microelectrnica, por ejemplo) como en medicina (microscopios quirrgicos) e investigacin, fundamentalmente en aplicaciones que requieren manipular el objeto visualizado (donde la visin estereoscpica es esencial). En la fotografa se aprecia una concha de 4 cm de dimetro. Objetivos *Localizar y describir la funcin de cada parte del microscopio de diseccin. *Aprender a usar correctamente el microscopio de diseccin. Reconocimiento y uso del microscopio de diseccin Coloque en la platina del microscopio el objeto que va a estudiar, con los tornillos del enfoque mueva los objetivos tan abajo como sea posible y despus vaya subindolos hasta que el objeto aparezca en foco. Mientras examina al objeto, muvalo hacia la izquierda y hacia la derecha.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES: El microscopio de contraste de fases proporciona una imagen clara y detallada de clulas vivas sin teir. En un microscopio ptico ordinario, el contraste se debe a que los materiales distintos absorben diferentes cantidades de luz. Sin embargo, en el microscopio de contraste de fases se debe a los distintos ndices de refraccin entre las partes de los microorganismos y el fondo. Las nicas diferencias estructurales entre un microscopio ptico ordinario y uno de contraste de fases son los

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sistemas de las lentes del objetivo y del condensador, que en el segundo estn dotados de unos anillos opacos especiales. El microscopio de contraste de fases se fundamenta en el hecho conocido de que las ondas de luz viajan a distintas velocidades en los materiales que poseen ndices de refraccin diferentes. Por tanto, los rayos de luz que pasan a travs del espcimen no se encuentran en la misma fase que los que pasan a su alrededor. Imaginemos las olas del ocano viniendo haca la playa desde diferentes direcciones. Las olas se suman o anulan unas a otras, dependiendo de que sus crestas lleguen al mismo tiempo o no. De forma similar, el microscopio de contraste de fases combina los rayos de luz procedentes del espcimen y los que llegan de sus alrededores. Los rayos se suman o se anulan unos a otros produciendo diferentes intensidades de luz y aumentando, en consecuencia, el contraste. Se denomina interferencia al resultado de la combinacin de rayos de luz de distinta fase. La mayor ventaja que ofrece la microscopa de contraste de fases consiste en poder estudiar el movimiento y las estructuras celulares internas, que mediante esta tcnica no son distorsionadas por la fijacin y tincin. El contraste de fases proporciona considerable detalle interno. Su inconveniente es que la imagen aparece rodeada por un halo de luz, que es una consecuencia inevitable del fenmeno de interferencia, que genera el contraste MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA: En la microscopia de fluorescencia el contraste se aumenta por medio de la fluorescencia. sta es la propiedad que tienen algunos materiales de absorber luz de una determinada longitud de onda y devolverla con una longitud de onda mayor. Cuando se iluminan materiales fluorescentes con luz ultravioleta de longitud de onda corta (invisible), devuelven luz visible, intensamente brillante contra un fondo oscuro. A diferencia de las microscopias de contraste de fases y de campo oscuro, este tipo de microscopia depende de una propiedad del propio espcimen, no del microscopio. Sin embargo, el microscopio debe modificarse con filtros especiales para iluminar la preparacin con luz ultravioleta de longitud de onda corta. Algunos microorganismos, entre los que se incluyen algunas bacterias fotosntticas y algas, son fluorescentes por s mismos pero en la mayor parte de los casos hay que teir con unos colorantes denominados fluorocromos. Algunos fluorocromos se unen directamente a los microorganismos. Otros han de unirse qumicamente a anticuerpos, protenas producidas por el sistema inmune capaces de unirse a microorganismos especficos. Por este motivo, la microscopia de fluorescencia puede utilizarse tanto para identificar como para observar microorganismos. El diagnstico mediante anticuerpos fluorescentes, o inmunofluorescencia, es una de las aplicaciones ms importante de esta microscopia.

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INFORME N 02 BIOMOLECULAS

1.Explique el mecanismo de accin de cada uno de los reactivos indicados para el reconocimiento de biomolculas empleados en la prctica. REACTIVO DE BENEDICT: Solucin de 17.3 g de sulfato de cobre cristalizado, 173 g de citrato de sodio o potasio, 200 g de carbonato de sodio en 1.000 ml de agua destilada, para la determinacin cualitativa de azcar en la orina. Las aldosas y tambin las cetosas en medio alcalino son capaces de oxidarse a cidos aldnicos con lo que pueden reducir determinados reactivos. Entre las mltiples posibilidades son muy comunes las reacciones de reduccin del ion cprico (azul intenso en medio alcalino) a in cuproso (rojo ladrillo insoluble). Este reactivo es empleado en el anlisis de glucosa en la orina. REACTIVO DE BIURET: La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO4 en solucin acuosa alcalina. La reaccin se basa en la formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del Nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos. Para que se de dicha reaccin se necesitan dos o ms uniones peptdicas para que se forme el complejo coloreado La reaccin o prueba de BIURET es un mtodo que detecta la presencia de compuestos con dos o ms enlaces peptdicos y, por tanto, sirve para todas las protenas y pptidos cortos. El reactivo del biuret (sulfato de cobre en una base fuerte) reacciona con los enlaces del pptido y cambia el color cuando entra en contacto con otra sustancia, tornndose VIOLETA. Mientras ms cantidad de protena est presente en la solucin, ms oscuro es el color. Por ejemplo cuando se calienta la urea a 180 celsius, se descompone transformndose en un compuesto llamado "biuret", el cual en presencia de Cu2+ en solucin alcalina forma un complejo color violceo ya que reconoce los enlaces peptdicos de las protenas, no es especfico para identificacin de protenas con dos o ms enlaces peptdicos.
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REACTIVO DE LUGOL: Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta caracterstico se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul-violeta. Reaccin del Lugol: Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta caracterstico. Poner en un tubo de ensayo unos 3 cc. del glcido a investigar. Aadir unas gotas de lugol. Si la disolucin del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reaccin es positiva. Fundamento: La coloracin producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molcula de almidn. No es por tanto, una verdadera reaccin qumica, sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul violeta. REACTIVO DE SUDAN III: Los cidos grasos resultan del alargamiento de la molcula de acido actico por adicin sucesiva de grupos CH2, los cuales confieren caractersticas hidrofbicas. Mediante la reaccin de Sudan III se puede observar la afinidad de este compuesto por tales molculas. El Sudan III forma una suspensin heterognea en agua o soluciones alcohlicas, sin embargo, este compuesto es muy soluble en aceite separndose por tanto de la solucin alcohlica si se aade un acido graso. La densidad del aceite es menor que la del alcohol etilico y por ello en la fase superior de una mezcla aceite aparecer un color rojo cereza. Reaccin del Lugol: Este mtodo se usa para identificar polisacridos. El almidn en contacto con unas gotas de Reactivo de Lugol (disolucin de yodo y yoduro potsico) toma un color azul-violeta caracterstico. Poner en un tubo de ensayo unos 3 cc. del glcido a investigar. Aadir unas gotas de lugol. Si la disolucin del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reaccin es positiva. Fundamento: La coloracin producida por el Lugol se debe a que el yodo se introduce entre las espiras de la molcula de almidn. No es por tanto, una verdadera reaccin qumica, sino que se forma un compuesto de inclusin que modifica las propiedades fsicas de esta molcula, apareciendo la coloracin azul violeta. REACCION XANTOPROTEICA La reaccin xantoproteica es un mtodo que se puede utilizar para determinar la cantidad de protena soluble en una solucin, empleando cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos aromticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali, se torna color amarillo oscuro.

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Segn las guas qumicas es una reaccin cualitativa, mas no cuantitativa. Por ende determina la presencia o no de protenas. Para cuantificar se usa otra reacccin, como la de Biuret, y se hace un anlisis espectro fotomtrico.

Reaccion Xantoproteica:
Es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteinas con aminocidos portadores de grupos bencnicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali vira a un color anaranjado oscuro. La reaccin XANTROPROTEICA es un mtodo que se puede utilizar para determinar la cantidad de protena soluble en una solucin. El espectrofotmetro se puede entonces utilizar para medir la intensidad del color que se produjo. Este test especfico es para reconocer enlaces peptdicos, por lo tanto requiere de la presencia de al menos en tetrapptido para que de positivo. Los reactivos utilizados son NaOH y SO4Cu.5H2O. Opera a travs del ion Cu2+ el que en reaccin alcalina interacciona con los iones de N-3 de los grupos amino formando un complejo color violeta. Cada tomo de Cu2+ reacciona con dos tomos de N y establece una resonancia de electrones con otros dos N formando un complejo color violeta y es as como podemos catabolizar una reaccin anastrfica de la mayor enzima llamada octatriona. Se obtuvo bajo forma cristalina, una sustancia extrada de las paratiroides de la vaca que tiene los siguientes caracteres: polipptido compuesto de muchos aminocidos, todava no determinados, y probablemente unidos a una protena; da las reacciones de las protenas por investigacin qumica (reaccin xantroproteica); contiene trazas de fierro y azufre; su pH es de 4.8; insoluble en las grasas y en el ter, algo soluble en el alcohol y muy soluble en el agua acidulada; es destruida por los fermentos digestivos y por esta causa no se administra por la va digestiva. Tecnicas Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de solucin problema (clara de huevo ). Aadir 1 cc. de HNO3 concentrado. Calentar al bao mara a 100: C.. Enfriar en agua fra Aadir gota a gota una disolucin de sosa al 40%.

Reaccion de Biuret
La producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptdico (- CO- NH -)que se destruye al liberarse los aminocidos. Cuando una protena se pone en contacto con un lcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada biuret, de frmula: que en contacto con una solucin de sulfato cprico diluda, da una coloracin violeta caracterstica.

Tecnica
Tomar un tubo de ensayo y poner unos 3 cc. de albmina de huevo. Aadir 2cc. de solucin de hidrxido sdico al 20%. A continuacin 4 5 gotas de solucin de sulfato cprico diluida al 1%.
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Debe aparecer una coloracin violeta-roscea caracterstica.

Reaccion de los aminoacidos azufrados

Se pone de manifiesto por la formacin de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se basa esta reaccin en la separacin mediante un lcali, del azufre de los aminocidos, el cual al reaccionar con una solucin de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.

Tecnica
Poner en el tubo de ensayo de 2 a 3 cc. de albmina de huevo (clara de huevo). Aadir 2 cc. de solucin de hidrxido sdico al 20%. Aadir 10 gotas de solucin de acetato de plomo al 5%. Calentar el tubo hasta ebullicin. Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizndose el azufre de los aminocidos, lo que nos sirve para identificar proteinas que tienen en su composicin aminocidos con azufre. 2.Indicar dos mtodos adicionales para el reconocimiento de protenas, carbohidratos y cidos grasos. Cual es el mecanismo de accin del reactivo de salawinof. RECONOCIMIENTO DE PROTEINAS REACCIN DE MILLN El anillo fenlico tiene un compartimiento caracterstico frente a las sales de Mercurio a pH cido, formando complejos color rojo ladrillo con el anillo fenlico de la tirosina y las protenas que la contienen.

REACCION CON LA NINHIDRINA El grupo alfa-amino de los aminocidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayora de los aminocidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y caf para la asparagina que tiene un grupo amino en la cadena lateral. Esta reaccin tambin identifica los grupos alfa-amino libres presentes en pptidos y protenas RECONOCIMIENTOS DE CARBOHIDRATOS REACCIN DE FEHLING Se basa en el carcter de los monosacridos y de la mayora de los disacridos (excepto la sacarosa). Si el glucido que se investiga es reductor, se oxidara dando lugar a la reduccin del sulfato de cobre, de color azul, oxido de cobre, de color rojo anaranjado. ENSAYO DE MOLISCH Este ensayo es un ensayo para el reconocimiento general de carbohidratos en el que los polisacridos y disacridos se hidrolizan con acido sulfrico concentrado hasta monosacrido y se convierte en derivados de furfural o 5-hidroximetil furtural los cuales reaccionan con anaftol formando un color prpura violeta. ENSAYO DE BARFOED
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ETA prueba permite diferenciar entre monosacridos y disacridos reductores, tambin contiene ion cuprico que se reduce hasta oxido cuproso mas rpidamente con los monosacridos que con los disacridos. RECONOCIMIENTO DE ACIDOS GRASOS SAPONIFICACIN Las grasas reaccionan en caliente con el hidrxido sdico o potsico descomponindose en los 2 elementos que la forman: glicerina y los cidos grasos. Estos se combinan con los iones Na o K del hidrxido para dar jabones, que son las sales sdicas o potasitas de los cidos grasos. SOLUBILIDAD Las grasas son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequesimas gotitas formando una emulsin de espacio lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo, por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que por su menor densidad se sita sobre la de agua. Por el contrario, las grasas son solubles en los llamados disolventes orgnicos como el ter, benceno, xilol, cloroformo, etc. MECANISMO DE ACCIN DEL REACTIVO DE SALAWINOF Se basa en la formacin de un compuesto de color variable, de rosa a rojo, entre hidroximetilfurfural y resorcinol en medio clorhdrico. Es especfico de hexosas. Como las cetosas se deshidratan mucho ms rpidamente que las aldosas, puede distinguirse entre ellas por la velocidad de aparicin de color, a igual concentracin de azcar. Las propiedades reductoras tambin son interesantes para identificar a azcares. El grupo carbonilo de los hidratos de carbono es fcilmente oxidable por diversos reactivos, aunque el poder reductor de estos compuestos depende de la entidad que el grupo tenga en la molcula, o sea, de la naturaleza mono-, di- o poli- sacrida del azcar y la posicin en que se encuentren los posibles enlaces glicosdicos. El agente oxidante suave ms empleado en este tipo de reacciones es el catin Cu(II), cuyas sales son de coloracin azul. En todos los casos, este in se reduce a Cu(I), formndose xido cuproso, lo que origina turbidez en el medio de reaccin, que concluye con la aparicin de un precipitado marrn-rojizo. Es esta aparicin la que indica que el glucido tiene carcter reductor. INFORME N 03 Y 04 OBSERVACION DE CELULAS Y ORGANELAS CELULARES 1.Explicar el mecanismo de accin del verde janus y del rojo neutro.

ROJO NEUTRO: (cloruro de dimetildianofenacina; rojo de toluileno) Este colorante es usado en los lisosomas por que reacciona con su fosfatasa acida adems el pH es un factor que influye determinadamente en esta reaccin en la que se produce una coloracin rojiza Su formula es (CH3) 2NC6 H3 N2 C6 H2 CH3 NH2 ClH VERDE JANUS: (azocolante bsico) Se utiliza para el reconocimiento de las mitocondrias a travs de las reaccin con su citocromo oxidasa, originando un color verde azulado, que mantiene al colorante en su forma oxidasa, sea, coloreada. Por el contrario en el citoplasma que la rodea, el colorante es reducido a su forma leucobase incolora.

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Es un colorante bsico, se emplea como colorante supravital, por que tie organismos vivos. 2.Explicar el mecanismo de accin de los colorantes empleados para observar las siguientes lminas fijas (epiddimo, rin, papanicolau, grnulos de nissl) COLORACIN DE VERDE JANUS (LMINA DE RION): Es un colorante bsico. Se emplea como colorante supra vital, por que tie organismos vivos. Utilizan para reconocer las mitocondrias, reacciona con el citocromo oxidasa de estas mitocondrias proporcionndole un color intermedio de verde azulado que mantiene a un colorante en su forma oxidasa o sea colorada en cambio en el citoplasma que las rodea dicho colorante es reducido a una forma simplemente incolora. COLORACIN DE PAPANICOLAU: La coloracin estndar usada en diagnstico de cncer y para evaluar el ciclo hormonal es la Coloracin de Papanicolau, que utiliza la solucin 1a, 1b, y solucin policrmica. En ginecologa se prefieren las soluciones.Policrmicas EA31 y EA50 para diagnstico de cncer. El resultado es una intensidad de color diferente en las clulas escamosas y el citoplasma. La solucin EA65 se una especialmente en extendidos mucosos, como esputo y secrecin bronquial, de estmago o intestinal. Difiere del efecto de color.

COLORACIN AZUL DE TOLUIDINA (GRNULOS E NISSL): El Azul de Toluidina es un colorante catinico perteneciente a los denominados colorantes de Nissl. El nucleolo, el ergastoplasma y los grumos de Nissl se tien de color azul-violeta sobre fondo incoloro; algunas mucinas tambin se tien metacromticamente de rojo prpura. Como las denominadas tinciones de Nissl, se teir de azul-violeta el nucleolo, ergastoplasma y grumos de Nissl de las clulas, fcilmente visibles en las grandes motoneuronas.

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INFORME N 05 PERMEABILIDAD CELULAR 1.- Defina los siguientes trminos: plasmolisis, turgencia, cremacin, hemlisis, presin osmtica, difusin, osmosis. PLASMOLISIS: Es la reaccin de la membrana citoplasmtica respecto de la pared rgida suprayacente. Proceso de distribucin de una clula por lisis de su protoplasma por un mecanismo de deshidratacin al pasar el lquido intracelular a un medio externo. TURGENCIA: (Del latn turgere; hinchar): Determina el estado de rigidez de una clula, es el fenmeno por el cual las clulas al absorber agua, se hinchan, ejerciendo presin contra las membranas celulares, las cuales se ponen tensas. De esto depende que una planta este marchita o firme.

CRENACIN: La crenacin es le proceso por el cual las clulas se secan, o sea, estando en un medio hipertnico ocurre Crenacin (el agua sale hacia el exterior). O sea es un cambio de forma que muestra los hemates cuando son sometidos a una solucin hipertnica, debido a la perdida de agua debida a un fenmeno de osmosis. Los glbulos rojos quedan arrugados con los bordes estrellados. Es el fenmeno inverso a la hemlisis. HEMOLISIS: Es la degradacin de los hemates con la liberacin de la hemoglobina se produce normalmente final del hemate pero puede desencadenar de forma patolgica en diversas circunstancias como reacciones antgeno-anticuerpo, alteraciones metablicas del hemate que acortan de forma significativa su periodo de vida y agresiones mecnicas como los que se producen en la hemodilisis, la exposicin a venenos de serpiente y con el empleo de prtesis
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cardiacas. Tambin produce la hemlisis, la dilucin de la sangre mediante la administracin intravenosa de cantidades excesivas de soluciones hipotnicas que determinan la hinchazn progresiva con eventual rotura del hemate.

PRESIN OSMTICA Es la misma presin necesaria para impedir el paso de las molculas del disolvente puro hacia una disolucin a travs de una membrana semipermeable. Si una disolucin se pone en contacto con su disolvente, o con una disolucin mas diluida, a travs de una membrana semipermeable que solo deje de pasar las molculas mas diluida, a homogeneizacin del sistema no se puede realizar y tiene lugar un flujo neto de disolventes hacia la disolucin mas concentrada. Este fenmeno se conoce como smosis directa y la presin mnima necesaria para detener el flujo de disolventes puro a travs de la membrana semipermeable es la presin osmtica. La presin osmtica es una magnitud que depende fundamentalmente de la (molar) de la disolucin y, en menor extensin, de la T, y es independiente de la naturaleza del disolvente y del soluto, es decir, es una propiedad coligativa. Para una disolucin de n moles en un volumen V la temperatura absoluta T, la presin osmtica P viene dada por la expresin: P=nRT/V donde R es la constante de los gases DIFUSIN: La difusin es un proceso fsico irreversible, en el que partculas materiales se introducen en un medio que inicialmente estaba ausente de ellas aumentando la entropa del sistema
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conjunto formado por las partculas difundidas o soluto y el medio donde se difunden o disolvente. La membrana permeable puede haber paso de partculas y disolvente, siempre tambin a favor del gradiente de concentracin. La difusin, proceso que no requiere aporte energtico es frecuente como forma de intercambio celular. OSMOSIS: Es el paso de un componente de una disolucin a travs de una membrana que impide el paso del resto de los componentes de dicha disolucin. Numerosos principios de la fsica y qumica intervienen en el fenmeno de la osmosis en animales y plantas. En la osmosis, un disolvente (a menudo agua) se mueve desde una zona de baja concentracin hacia una zona de alta concentracin a travs de una membrana semipermeable.

2.Cmo ingresa agua desde el

el medio extracelular al medio intracelular?

Por Osmosis el agua pasa a la clula por medio de unos poros o canales proteicos, denominados acuaporinas. Las porinas son poros no especifico, que pueden ser atravesados por pequeas molculas hidrofilicas, tienen una lamina B en lugar de una hlice a como estructura transmenbranosa primordial, su estructura fue determinada mediante cristalografa de rayos x , tiene forma de un barril B tubular que atraviesa la bicapa lipdica y contiene un canal lleno de agua en su centro, el barril esta formado a partir de 16 cadenas antiparalelas de lamina B, que se curvan lo suficiente como para formar una estructura cilndrica.

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CELULAS VEGETALES Y ANIMALES OBSERVADAS DESDE EL MICROSCOPIO COMPUESTO Las clulas animales y vegetales son clulas Eucariotas( eu=verdadero, carion= ncleo), presentan un ncleo bien organizado formado por una doble membrana que separa el contenido nuclear del citoplasma considerada como la 2 barrera de permeabilidad selectiva entre el ncleo y el citoplasma, la Carioteca o Envoltura nuclear. Las clulas animales se caracterizan por lo siguiente: 1- Son clulas desnudas desprovistas de una pared celular. 2- Son Hetertrofas o Consumidoras, ya que al no poseer organelos membranosos, los Plastidios y carecer de pigmentos Fotorreceptores( clorofila y carotemoides) son incapaces de sintetizar sus propios alimentos, incorporan los nutrientes de los alimentos que poseen otros seres vivos. 3- Presentan Lisosmas funcionales para la Digestin intra y extracelular( endocitosis y exocitosis). 4- Poseen un organelo no membranoso el ster formado por un par de centrolos, llamado tambien Centrosoma o centro celular encargado de formar las Fibras del Aparato del Huso Mittico, Acrosmico o Acromtico mediante las cuales los cromosomas quedan adheridos a las fibras por sus correspondientes Centrmeros, la denominacin de ster es porque cuando la clula animal entra en Mitosis adquiere el aspecto estrellado parecido a un Sol o estrellas por las irradiaciones de Tubulina. 4- Possen Glucgeno, el nico polisacrido que las clulas vegetales no sintetizan por Fotosntesis. 5- Presentan Cilios, centrolos y Flagelos, este ltimo para la locomocin formado por fibrillas de tubulina mltiples. Las clulas vegetales se caracterizan por lo siguiente: 1- Presentan una pared celular de naturaleza celulsica ( pared celular primaria y secundaria) que acta como elemento de proteccin a la membrana plasmtica y le da el aspecto de Cluloas geomtricas( polidricas, isodiamtricas, etc). 2- Presentan organelos membransos de suma importancia los Plastidios( leucoplastos, cromoplastos, cloroplastos activos en la Fotosntesis), encargados de transformar los Fotones de luz solar en energa qumica( ATP/ NAPDH2), que sern utilizadas para la sntesis de molculas orgnicas de mayor complejidad( azcares, lpidos, protenas). 3- Poseen Vacuolas muy desarrolladas, pueden ser numerosas como en las clulas meristemticas o bien ser 1 sola y ocupar el 90% de la cavidad o lmen celular desplazando al sistemas de emdomembranas y el ncleo hacia la periferia. 4- Son Auttrofas, Fottrofas o Productoras, ya que por Fotosntesis transforman sustancias de baja energa potencial como el CO2, sales minerales y el H2O mediante la intervencin de la clorofila y otros pigmentos auxiliares o accesorios los Carotenoides en sustancias orgnicas de alta energa potencial. 5- No presnetan Cilios, flagelos ni centrolos. Las 2 clulas en comn poseen la particularidad de presentar todos los organelos membransos y no membransos, salvo los Plastidos propio de las vegetales y el centrosoma propio de las animales, el sistemas de endomembranas y la divisin celular por Mitosis o Cariocinesis en clulas Somticas o formadoras del cuerpo y por Meiosis las clulas germinales o gametas( vulo y espermatozoide). Las clulas bacterianas se caracterizan por ser: 1- Clulas primitivas, con pared celulr no celulsica constituda por una variedad de cidos
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orgnicos que sintetizan ellas mismas, entre ellos el Pteichoico y otros mas. 2- No poseen organelos membranosos, salvo las bacterias coloreadas( verdes) que presentan un organelo membranoso parecido a los Plastidios de los vegetales superiores los Cromatforos, el nico organelo que es comun en ambas clulas son los ribosomas. 3- Si bien no presentan Lisosomas , el espacio periplsmico ubicado entre la pared celular y la memnbrana plasmtica cumple funciones similares al de ellos. 4- No presnetan Sistemas de Endomembranas o Sistema Vacuolar Citoplasmtico, estructura nica de las eucariotas, este sistema est integrado por la carioteca, los 2 retculos endoplsmicos( rugoso/ liso) y el complejo de Golgi. 5- La cadena oxidativa constituda por unos corpsculos en forma de peques hongos con un tallo fino y ua cabeza ensanchada los Oxisomas esta asociada a la membrana plasmtica, en cambio, en las eucariotas esta cadena oxidativa esta presente nicamente en las Mitocondrias ubicada en el lado interno de las Crestas Mitocondriales. 6- No presnetan una verdadera organizacin nuclear de ahi el nombre de Procariotas( pro= falso, carion= ncleo), es decir, no presentan un ncleo membranoso, falta por completo la Carioteca o Membrana nuclear.Si bien esto es correcto, al microscopio electrnico presentan una regin mas claar que el Citoplasma llamada Nucleoide, este es el ncleo primitivo o rudimentario donde el nico ADN esta compactado y plegado dentro del mismo. 7- Las funciones de Endocitosis y Exocitosis estas ausentes. 8- Presentan Cilios y flagelos para su locomocin o traslado formado por una sola fibrilla ncia. 9 Se dividen por Amitosis o divisin directa. 10- Son Auttrofas solo las bacterias coloreadas( rojas, verdes) Hetertrofas la mayora y Quimiosinttica solo aquellas bacterias que oxidan sustratos inorgnicos como sales minerles, xidos, cidos, bases, ejemplo, las bacterias del Hierro, del Azufr, del Hidrgeno. Saludos. IMAGENES
Clula fijada con KMnO4 D:Golgi pd:Plasmodesmos CW:Pared Clular N: Ncleo V: Vacuola Ch: Cloroplasto M:Mitocondria I: Espacio Intercelular Nu: Nuclolo Clula fijada con Os O4

Se observa nuclolo

Cloroplastos despues de la divisin.

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Cloroplasto en divisin

CW:Pared Clular M:Mitocondria

Cloroplastos con almidn

S: Almidn

Cloroplastos con abundantes granas

G: Grana P: Glbulo de Grasa

Clula animal y clula vegetal

Las clulas son la porcin ms pequea de materia viva capaz de realizar todas las funciones de los seres vivos, es decir, reproducirse, respirar, crecer, producir energa, etc. Existen dos tipos de clulas con respecto a su origen, clulas animales y clulas vegetales: En ambos casos presentan un alto grado de organizacin con numerosas estructuras internas delimitadas por membranas. La membrana nuclear establece una barrera entre el material gentico y el citoplasma. Las mitocondrias, de interior sinuoso, convierten los nutrientes en energa que utiliza la planta.

Diferencias entre clulas animales y vegetales

Tanto la clula vegetal como la animal poseen membrana celular, pero la clula vegetal cuenta, adems, con una pared celular de celulosa, que le da rigidez. La clula vegetal contiene cloroplastos: organelos capaces de sintetizar azcares a partir de dixido de carbono, agua y luz solar (fotosnteis) lo cual los hace auttrofos (producen su propio alimento) , y la clula animal no los posee por lo tanto no puede realizar el proceso de fotosntesis. Pared celular: la clula vegetal presenta esta pared que est formada por celulosa rgida, en cambio la clula animal no la posee, slo tiene la membrana citoplasmtica que la separa del medio.

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Una vacuola nica llena de lquido que ocupa casi todo el interior de la clula vegetal, en cambio, la clula animal, tiene varias vacuolas y son ms pequeas. Las clulas vegetales pueden reproducirse mediante un proceso que da por resultado clulas iguales a las progenitoras, este tipo de reproduccin se llama reproduccin asexual. Las clulas animales pueden realizar un tipo de reproduccin llamado reproduccin sexual, en el cual, los descendientes presentan caractersticas de los progenitores pero no son idnticos a l.

Imagen comparativa entre clula animal y clula vegetal

FUNDAMENTO Y TECNICA DE LA COLORACIN GRAM Tincin de Gram

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram.

Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas). La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una
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primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa. OBJETIVOS Recoger muestras Hacer el extendido en espiral Dejar secar a temperatura ambiente Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las clulas gram positivas y gram negativas se tien de color azul-purpura. Enjuagar con agua. Agregar lugol y esperar entre 30 segundos y 3 minutos Enjuagar con agua. Agregar acetona y/o alcohol y esperar entre 15 y 20s Enjuagar con agua. Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1-2 min Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. Enjuagar con agua. Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin Explicacin El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas). El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina) Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los
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representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas. Teoras Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente: El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas, los lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular. Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn (1923) bas la suya en una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias, Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y con los bsicos en medio alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el punto isoelctrico. Como los microorganismos contienen ms de una protena, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye ms bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones: . Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez. . Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad. . Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad. . Los microorganismos de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.

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. En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante. . Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples, sino ms bien una dbil combinacin de sustancias protenicas con otras lipoideas o grasas. . La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin mucho mayor de cidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter ms cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos. . El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos dbilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reaccin se vuelve cida en el curso del desarrollo. Gianni (1952) comprob que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban negativamente el Gram cuando los cultivos databan de dos a tres horas. Luego se desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reaccin. Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de un ncleo gramnegativo. Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reaccin grampositiva depende de que se forme una combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las protenas de la pared celular, sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios fsicos retuviesen este tinte, ya que ese tratamiento no podra cambiar el carcter qumico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los grmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman negativamente el Gram. La pared celular de los microorganismos grampositivos y gramnegativos es permeable al violeta cristal. Sin embargo, la de los primeros no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la clula. Los resultados experimentales obtenidos con una difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin grampositiva consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de una cantidad apreciable de complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el disolvente. La pared celular de los microorganismos grampositivos, a diferencia de la de los gramnegativos, sera prcticamente impermeable al violeta cristal. Los microorganismos aparecern teidos despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminar sin dificultad el complejo formado despus del tratamiento con yodo. Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han influido especficamente en el mecanismo del colorante de Gram. Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloracin. Tcnica de la coloracin gram Fijar un frotis Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el
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asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano. Tincin Con violeta cristal o violeta de genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C. Enjuague Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un centmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina en posicin inclinada hacia abajo... Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias Decoloracin Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita. Tincin de contraste Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica. Bacterias resistentes a la tincin Gram La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva, tien como gramnegativas: Mycobacterias (estn encapsuladas) Mycoplasmas (no tienen pared) Formas L (prdida ocasional de la pared) Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente) Utilidades En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin.
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Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor nmero de formas bacterianas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin. A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos). Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibriones. Fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gram negativo Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea. [editar] Causas que alteran la tincin de Gram I: Edad de la bacteria. II: Errores del operador. III: Uso de antibiticos A pesar de la gran utilidad del la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas y la tcnica empleada, por ella junto a la muestra deben teirse controles con grampositivas y gramnegativas.

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EAP/MEDICINA HUMANA