Unidad de Habilitacin No. 2 Deteccin de transgenes en alimentos Introduccin.

La poblacin del mundo en expansin y las tierras agrcolas desapareciendo, los especialistas estn conscientes acerca de la capacidad mundial para producir suficiente alimento para la poblacin. Los ambientalistas estn conscientes acerca del sobre uso de los plaguicidas y herbicidas y el efecto a largo plazo de estos qumicos en el ambiente y la salud humana. Puede haber una solucin a estos problemas? La industria biotecnolgica piensa que si. Estas propuestas se basan en los organismos genticamente modificados (GMOs), particularmente de plantas modificados genticamente puede resolver ambos problemas. La manipulacin gentica de plantas cultivadas no es nueva. Los agricultores han tenido cultivos modificados genticamente por siglos y el mejoramiento de cultivos se basa en caractersticas especficas, tales como alto rendimiento, que es una de las partes importantes en la agricultura hoy en da. Sin embargo, ahora existe la opcin de colocar genes para caractersticas seleccionadas directamente dentro de plantas cultivadas. Estos genes no tienen su origen de la misma especie cultivada, de hecho, no tiene que ser de plantas. Una clase popular de cultivos GM tienen un gene de la bacteria del suelo Bacillus thurigiensis (Bt) insertado en sus genomas. Los cultivos Bt producen una protena llamado delta-endotoxina que es letal a las brocas de maz Europeo una plaga comn en las plantas de maz. Los agricultores que cultivan plantas Bt no tienen que aplicar plaguicidas porque las plantas producen la protena txica en el interior de sus clulas. Cuando las brocas del maz se alimentan sobre las plantas modificadas genticamente, estas mueren. Independientemente de la posicin que se tome en el debate de los GMOs, sera benfico ser capaces de evaluar los alimentos en cuanto a presencia de GMOs. Uno de los mtodos ms valiosos para este anlisis es el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa(PCR)para buscar una secuencia de DNA comn a todos los alimentos GMOs. Objetivos. Extraer DNA genmico de Cereales comerciales Realizar PCR para amplificar GMO y secuencias de DNA de plantas naturales Realizar electroforesis a las muestras amplificadas para visualizar el DNA y conocer si tu muestra contiene GMOs.

Materiales y mtodos Micropipeta de 100-1000 L Micropipeta de 10-200 L Micropipeta de 1-10 L Mortero con pistilo Esptula Tubos de 2ml 6 Tubos de 0.5 ml 4 Puntas azules 8 Puntas amarillas 16 Puntas blancas 4 Para todo el grupo Vortex Termoblock Micro centrfuga Caja de pesado (para pesar PVP) Esptula

EXTRACCIN DE DNA DE Jatropha curcas L. Centro de Biociencias de la Universidad Autnoma de Chiapas Mtodo SemiMicro modificado de Doyle y Doyle (1987) a) Pesar 0.100 g de tejido foliar joven y colocarlo en un microtubo, estril, de 2 mL. b) Agregar 0.060 g de PolivinilPirrolidona (PVP). c) Agregar Nitrgeno lquido y triturar con una varilla de vidrio estril, hasta obtener un polvo fino. d) Aadir 1 mL de buffer CTAB 1x (TrisHCl 50 mM; EDTA 5 mM; NaCl 1.5 M; CTAB bromuro de cetiltrimetilamonio0.1 %; mercaptoetanol 0.1 %). Nota: Agregar el mercaptoetanol al momento de usar la solucin. e) Incubar a 65C durante 15 min agitndolo constante y suavemente. f) Mientras transcurren los 15 min, agregar a un microtubo nuevo de 2 mL, 0.95 mL de cloroformo/alcohol isoamilco (24:1 v/v). Mantener en hielo. g) Transferir 0.95 mL de la mezcla al tubo que contiene cloroformo/alcohol isoamilco. h) Mezclar en vortex durante 2 min. i) Centrifugar a 10000 rpm por 10 min a 10 C. j) Mientras se centrifuga el tubo, agregar a un microtubo nuevo de 2 mL, 400 L de NaCl 5 M y 800 L de Isopropanol fro. Mantener en hielo. k) Transferir 800 L de la fase acuosa (superior) del tubo centrifugado, al tubo con NaCl/Isopropanol. l) Incubar 8 horas a 0C para ayudar a la precipitacin de los cidos nucleicos (sustituya este paso por incubacin a 32C durante 30 minutos). m) Centrifugar a 10000 rpm durante 13 min a 10 C. Debe verse una pastilla blancotranslcida en el fondo. n) Con mucho cuidado, descartar el sobrenadante, dejando la pastilla en el fondo del tubo. o) Lavar la pastilla con 100 L de etanol al 70%. La pastilla usualmente se desprende del fondo. Transferir todo el contenido a un tubo nuevo de 0.5 mL. p) Invierta el tubo sobre papel absorbente para eliminar el alcohol, cuidando que la pastilla no se pierda. q) Secar en un concentrador centrfugo al vaco por 5 min a 30 C. r) Resuspender las pastilla en 100 L de buffer TE. s) Si va a guardar por largo tiempo el DNA extrado, almacenar a 20C.

PURIFICACIN DEL DNA a) Aadir 3 L de ARNasa (RNAsa ONE Ribonuclease, Promega, 5 U/L) incubando a 37C por 40 min, mezclando suavemente a intervalos regulares. b) Aadir 100 L de fenol/cloroformo/alcohol isoamlico (25:24:1 v/v). Mezclar por inversin, suavemente. c) Centrifugar por 4 min a 6500 rpm a 10 C. d) Transferir la fase acuosa (superior) a un tubo nuevo de 0.5 mL. e) Agregar 100 L de acetato de amonio 2.5 M y 200 L de Etanol absoluto fro. Mezclar por inversin , suavemente. f) Incubar 2 h a 32C. g) Centrifugar a 7000 rpm por 10 min; obtendr una pastilla al fondo. h) Lavar la pastilla con 100 L de etanol al 70%. i) Invierta el tubo sobre papel absorbente para eliminar el alcohol, cuidando que la pastilla no se pierda. j) Secar en un concentrador centrfugo al vaco por 5 min a 30 C. k) Agregar 60 L de buffer TE 1x. l) Incubar a 37 C por 15 min. m) Si va a guardar por largo tiempo el DNA purificado, almacenar a 20C.

INTEGRIDAD Y CANTIDAD DNA a) Realizar un corrido electrofortico en gel de agarosa al 1%, en buffer TAE o TE por 30 min a 80 V, revelado con Bromuro de Etidio. b) Mezclar las muestras (6 L) con 4 L de colorante de carga. c) Colocar las muestras en cada celda. d) El cido nucleico aparecer como una banda intacta de color naranja, producida por la fluorescencia del bromuro de etidio, con una migracin no mayor a 1 cm. e) Usando una muestra purificada, diluir el DNA 1:100 (10 L de DNA en 990 L de agua miliQ o buffer TE). f) Transferir a una celda de cuarzo. g) Determinar la absorcin de luz en espectrofotmetro de ultravioleta a 230, 260 y 280 nm. h) Divida los valores de absorbencia A260/A280; un valor entre 1.8 y 2.0 indica un alto nivel de pureza. i) La absorbencia a 230 nm revela coprecipitacin de protenas, por lo que se prefiere un valor bajo. j) La cantidad de DNA en ng/L se encuentra multiplicando el valor a 260 nm por 50 por la dilucin (en este caso: 100). (Una unidad de absorbencia, OD, equivale a 50 ng/L de DNA)