78 Biotecnologa vegetal esto requiere de gran cantidad de mano de obra y que el costo de produccin de mi-cropropgulos es muy superior al de las

plntulas producidos por metodologas tradicionales. Debido a esto la micropropagacin comercial se ha desarrollado con especies de alto valor agregado principalmente ornamentales como flores de corte y follaje o de algunas verduras. Principales aplicaciones de la micropropagacin Todas las especies vegetales pueden beneficiarse de la micropropagacin a travs de la produccin de lineas clnales. Pero, las especies que ms se benefician de este proceso son aquellas que poseen mecanismos reproductores ineficientes o ciclos de vida demasiado largos, por ejemplo, las especies arbreas pinceas o los agaves. Se dice que la micropropagacin produce plantas de gran calidad y homogeneidad pero esto no es algo inherente al proceso sino a la forma en la que es utilizado: la clave de la micropropagacin est en su empleo empezando por la seleccin de plantas madres lite seguido por el manejo de miles de individuos por medio de resiembras sucesivas en un medio de cultivo hasta su transplante a tierra lo que permite una continua seleccin de individuos que da como resultado final una mayor calidad y homogeneidad. Adicionalmente, el proceso de micropropagacin est estrechamente ligado a la produccin de plantas libres de patgenos por lo que los materiales micropropagados, son por lo general materiales sanos. Una ventaja adicional que puede surgir del proceso de micropropagacin, que si es inherente al mismo, es el fenmeno de rejuvenecimiento. Las plantas micropropagadas son en muchas ocasiones ms vigorosas y se desarrollan ms rpidamente incrementando as la productividad. La maduracin temprana, sin embargo, puede representar un serio problema en el manejo posterior del cultivo. Prcticamente todos los grupos de plantas pueden ser propagadas in vitro por una u otra tcnica y con mayor o menor dificultad. La revisin ms completa sobre este temase encuentraen el libro de George y Sherrington (1984). Produccin de semiilas artificiales Muchas plantas de inters comercial y las nuevas variedades que estn siendo producidas por las metodologas aqu descritas no pueden ser propagadas por semilla ya que la reproduccin sexual producira la prdida de las caractersticas deseables. La propagacin asexual, es por lo tanto, la nica opcin; sin embargo, tanto las tcnicas de micropropagacin como las de multiplicacin en invernaderos presentan desventajas para su empleo. Las primeras, como yahemos dicho, son costosasy las segundas tienen un potenchlmultiplicativo limitado. Una opcin para combinar elevados volmenes de produccin con bajos costos de propagacin es la produccin de semillas artificiales (Fujii et al., 1987). Una semilla artificial es un embrin producido in vitro embebido en una cubierta protectora artificial que lo mantiene vivo fuera del tubo de ensaye y lo nutre durante el proceso de germinacin. Los principales tipos de semilla artificial producidos hasta ahora consisten en: a) Embriones encapsulados en geles hidratados. b) Embriones encapsulados en geles deshidratados. c) Embriones deshidratados no encapsulados. El encapsulamiento en geles de alginato de sodio es muy adecuado por su simplicidad ya que al pasar la suspensin de embriones en alginato a un bao con sales

Produccin de plantas sanas 79 de ellas un embrin. Redenbaugh etal. (1986) han logrado frecuencias de germinacin entre 85% y 100% en embriones de alfalfa y apio, con 30% y 65%, respectivamente, de formacin de plantas de calidad. En otras especies los porcentajes obtenidos han sido menos exitosos. Las semillas deshidratadas pueden resolver el problema del almacenamiento y, muy probablemente, estimulen tambin procesos de maduracin del embrin, tal como ocurre en las semillas verdaderas. Un ejemplo de esto sonlos embriones somticos deshidratados de uva, 28% de los cuales germinan y producen plantas completas al ser rehidratadas mientras que slo 5% de los no deshidratados logran germinar. Aunque an pueden ser considerados bajos los ndices de sobrevivencia y de conversin a plantas, se han logrado mejoras en su tolerancia a la desecacin y en su vigor mediante la optimizacin de la metodologa para su obtencin (Anandarajah y McKersie, 1990). Algunas de las aplicaciones que se vislumbran de esta metodologa son: la rpida propagacin de hbridos Fl de arroz, la propagacin de cultivares sanos y/o nuevos de papa y ajo o la sustitucin de semillas verdaderas de costo muy elevado como el pepino sin semilla. La investigacin en este campo se encuentra an en sus etapas iniciales y ser necesario optimizar mtodos eficientes de embriognesis somtica en biorreactores y lograr un elevado porcentaje de germinacin antes de emplearla comercialmente. La idea de producir semilla genticamente homognea es muy atractiva no slo por los beneficios que ofrece a especies que no producen semilla sino porque servira de puente para unir el trabajo de laboratorio con el de campo. PRODUCCIN DE PLANTAS SANAS La dispersin de los patgenos El monocultivo intensivo de muchas especies es un riesgo potencial en la diseminacin de las enfermedades y las plagas. Las tcnicas de propagacin vegetal y el comercio internacional han contribuido tambin a incrementar este problema. Cuando se multiplica un cultivar enfermo por tcnicas de propagacin vegetativa, todas las plantas derivadas de un individuo estarn enfermas tambin. Los horticultores deben, por lo tanto, mantener materiales parentales sanos en medios ambientales protegidos de insectos transmisores de virus y bajo condiciones lo ms aspticas posibles para evitar la infec c i n por hongos, bacterias o nemtodos, e inspeccionar y seleccionar rutinariamente los materiales. Esto no siempre es suficiente ya que muchos virus, por ejemplo, y en especial tos viroides, no producen sntomas detectables por medio de una inspeccin visual. Las plantas enfermas, aun en los casos en que la enfermedad no sea letal, crecen ms lentamente o producen menores rendimientos que las plantas sanas. Deteccin y eliminacin de patgenos El control de la diseminacin de patgenos, particularmente de virus y viroides, requiere por lo tanto de tcnicas auxiliares tanto par a su deteccin como para su eliminacin (Lawson, 1986). Las tcnicas de deteccin escapan a los objetivos de este captulo por lo que solamente se enlistan como referencia en la Tabla 4.

80 Biotecnologia vegetal

La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 2 Tabla 4 Mtodos de identificacin de fitopatgenos en plantas. Mtodo de deteccin e identificacin Referencias 1) Anlisis microscpico de los tejidos i 2) Incubacin en cmaras hmedas para inducir especulacin 3) Aislamiento, cultivo e identificacin del patgeno Grogan, R.0,1981, The Science and art of plant disease diagnosis. Ann. Rev. Phytopatol., 19:333-351 Tue, J., 1969, Plant Pathological Methods-fungi and bacteria. Borgess, Minneapolis Es necesario hacer hincapi en la importancia de la indexacin de los materiales producidos por cultivo de meristemos antes de multiplicarlos ya que sin esta verificacin fitosanitaria la micropropagacin podra incrementar el problema en lugar de resolverlo. Algosos tratamientos como la termoterapia, que consiste en incubar plantas completas en activo crecimiento a una temperatura de 35 a 40 C, eliminan a ciertos virus y micoplasmas. Sin embargo, no todos los virus son inactivados por calor y es por ello que las tcnicas de cultivo in vitro contribuyen considerablemente a la eliminacin de patgenos, sobre todo en cultivos que son propagados vegetativamente. El cultivo de pices meristemticos es la principal herramienta ya que sus clulas estn libres de virus o viroides aun en plantas severamente infectadas. Aunque el cultivo de meristemos apicales ha sido empleado con xito en la limpieza de muchos cultivos, ha fallado en otros; por ello ahora se combina rutinariamente con la termoterapia. LA GENERACIN DEPLANTAS CON NUEVAS CARACTERSTICAS GENTICAS Esta rea de la b iot ecnologa vegetal repre sen ta una verdadera revolucin tecnolgica ya que no slo est cambiando dramticamente las estrategias del mejoramiento gentico y las prcticas agronmicas empleadas hasta ahora sino que se espera que incremente de manera notable la produccin de alimentos a travs de la generacin de variedades genticas totalmente nuevas. Las metodologas empleadas hasta ahora por los fitomejoradores han utilizado la variacin natural presente en las poblaciones silvestres y la han mezclado con variedades cultivadas por medio de la reproduccin sexual. De esta manera, las caractersticas de, por ejemplo, resistencia a un hongo o la tolerancia a sequa presentes en una especie silvestre, pueden ser transferidas a una variedad de la misma especie susceptible a la enfermedad o a la sequa pero que posee una elevada productividad. Sin embargo, este flujo de genes est condicionado a la existencia de la caracterstica deseada en una especie sexualmente compatible (filogenticamente cercana) con el cultivo que se desea mejorar. Otra estrategia ha sido inducir y seleccionar variacin gentica en las especies cultivadas por medio de tratamientos con agentes mutagnicos. El gran potencial de la biotecnologa consiste en que elimina las barreras reproductivas existentes entre especies genticamente incompatibles e incrementa enormemente el pool gentico del que disponen los fitomejoradores para producir nuevas combinaciones en las especies cultivadas. De hecho permite disponer no slo de los genes de otras plantas sino de aquellos de microorganismos (virus, bacterias y hongos), o animales (peces, ratas, etc.) por lo que las posibilidades son ilimitadas. Esto se puede lograr a travs de cinco estrategias cuyo principio y metodologas son muy diferentes pero que en conjunto ofrecen un enorme potencial apUcativo debido a su complementariedad. Las tecnologas para la generacin de variabilidad genrica y sus caractersticas estn resumidas en la Tabla 5, a continuacin discutiremos el potencial y las limitaciones de cada una de ellas. Seleccin in vivo versus seleccin in vitro

Patgeno Hongos

Bacterias

1) 2)

Los 3 puntos anteriores Anlisis serolgico ELISA

Schaad, N.W., 1979 Serological identification of plant pathogenic bacteria. Ann. Rev. Phytopatol., 17:123-147 Van Regenmonel, M.H.V., 1982, Serological and immunochemistry of plant virases. Academic Press, Nueva York Milne, R.G. y E Luisoni, 1977, Rapid immune electron microscopy of virus preparations, pp. 265-281 Gould, A.R. y R.H. Symons, 1983, A molecular biological approach to relationship among viruses. Ann. Rev. Phytopatol, 21:179-199

VTrusy viroides

Viroides

1) Inoculacin de plantas indicadoras (susceptibles a un amplio espectro de viras con extractos de plantas de prueba) 2) Diagnsticos inmunolgicos con anticuerpos mono y policlonales. La tcnica de ELISA se ha convertido en el procedimiento ms importante para la deteccin y diagnstico de enfermedades virales en plantas 3) Anlisis por microscopa electrnica e inmunomicroscopia electrnica 4) Hibridizacin de ARN viral con 1) Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Hoist, R.K. y S.O. Kawamoto, 1980, Use of polyacrilamide gel electrophoresis for detection of Chrysanthemum stem viro id in infected tissues. Plant Dis., 64: 186-188

K. Maramorosch y H. Koprowski (comps.), Methods in virolegy>voL 6' Academic Press, Nueva York.

La principal ventaja que ofrece la biotecnologa vegetal en la generacin de lneas o plantas mulantes es la posibilidad de seleccionar nuevas caractersticas in vitro. En d tubo de ensaye

3 Biotecnologia vegetal Tabla 5 Estrategias de mejoramiento gentico en vegetales. Estrategia Obtencin de variantes genticos Mtodos Variacin somaclonal Variacin gametoclonal Por induccin qumica (PEO, Ca~,DMSO) Por induccin fsica (pH, temperatura, etc.) Electro-fusin (en campo elctrico) Cultivo in vitro de embriones cigticos en los primeros estadios posfertilizacin Cultivo de vulos Cultivo de anteras o polen Cultivo nodriza de polen Incorporacin de organelos Ventajas Rapidez, muestreo de grandes poblaciones de individuos en espacios reducidos, un mayor control de los agentes selectivos. Eliminacin de barreras precigticas al permitirla hibridacin interespecfica, intergenrica y entre taxa superiores. .. Elimina barreras poscigticas por incompatibilidad entre las cruzas hbridas. Regeneracin de plantas haploides con la posibilidad de diploidizar stas para obtener lineas homcigas. Introduccin de caracteres citoplsmicos.

La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 83 cada clula se convierte en un individuo y es, por lo tanto, posible muestrear millones de ellos en un tiempo y espacio limitados. En el laboratorio bastan unos cuantos das en una incubadora mientras que a nivel de campo o invernadero se requeriran meses y una meticulosa observacin de miles de plantas sembradas en varas hectreas de tierra (Figura 2). In vitro es posible, adems, controlar con precisin las "presiones de seleccin" tales como los factores de estrs ambiental, microorganismos patgenos o sus fitotoxinas, etc. Al igual que en la seleccin de cepas mutantes bacterianas, el crecimiento bajo condiciones limitantes fsicas o qumicas es indicio de mxotroa, tolerancia o resistencia a dicho factor (Maliga, 1984). En la tabla 6 se incluyen algunos ejemplos de lineas celulares seleccionadas in vitro a diversos factores de importancia agrcola. Variacin somaclonal Desde hace varios aos empez a hacerse patente que las plantas derivadas de clulas somticas cultivadas in vitro no son genticamente idnticas y en 1981 Larkin y Scowcroft propusieron que esta variacin somaclonal podra ser empleada como una importante fuente de nuevas caractersticas genticas para programas de f-tomejoramiento. No sabemos con certeza si esta variacin existe ya (por acumulacin de mutaciones somticas) en las clulas vegetativas y slo se pone de manifiesto cuando stas son cultivadas invitro o si algunas caractersticas de los medios de cultivo (por ejemplo, elevadas concentraciones de 2,4-D) sean la causade la alta incidencia de mutantes; muy posiblemente ambas causas operen (Karp y Bright, 1985), lo cierto es que la variacin somaclonal generada o manifestada in vitro puede ser empleada en la obtencin de una gran cantidad de variantes genticos de cultivos establecidos. Una variante a esta estrategia es la regeneracin de variantes genticos a partir de cultivos de clulas haploides lo que ha recibido el nombre de variacin gametoclonal. Para una revisin de este campo vase Evans y Sharp (1986) y Evans 089). Ventajas de la variacin somaclonal 1) Produce nuevos tipos de variantes no detectadas previamente en programas de fitomejoramiento pormutagnesis.

Plantos crecidos en condiciones estriles

Explante

Hibridacin somtica

Induccin de callo

Clulas en suspensin

Rescate de embriones

M ufo gnesis opcional

Obtencin de haploides

Plaqueo en medio con agente selectivo

o0

Seleccin de callos tolerantes

Fusin con liposomas Rescate gentico Transformacin gentica Micro inyeccin Endocitosis Electroporacn Geminivirus Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes Aceleracin de partculas Empleo en todo tipo de explantes. Garantiza la incorporacin y expresin de los genes introducidos. Alta frecuencia de incorporacin.

Segundo paso de seleccin

Regeneracin de plantos de clulas tolerantes

Anlisis gentico por entracruzamianto

Produccin de variedades tolerantes

Figura X Estrategia general para la seleccin in vitro.

84 Biotecnologia vegetai Tabla 6 Lineas celulares in vitro bajo condiciones selectivas de inters Caracterstica agrcola. Especie Empl Tipo de Regene Hereda Referencias ee de explante racin bilidad mutagen o. Tolerancia Sorghum bicolor No Callo S N.R. Smith H.R. etal, 1982, a sequa Lycopersicon esculentum Tolerancia a salinidad Citrus sinensis Citrus aurantium Sorghum bicolor Saccharum officinarum Lycopersicon esculentum Cher arietinum No No No No Callo Callo Suspensi r Callo S NR. Si NJt S NJt Si NJt Oriza sativa No No Suspensi i i Callo No NJt Si NJt p. 489 Handa AX era/., 1983, Plant Physiol. 72:645 YanoS.efa, 1982, p. 495' Kochba J. er a/., 1982, Z. Pflanzenphysiol. 106:111 Kochba J. etal., 1982, Z. Pflanzenphysiol. 106:111 Bbaskaran S. er a/., 1986. J. Physiol. Plant 122:205 NaikR.G.&BabuH., 1988, Curr. Sci. 57:432. Bressan AJt etal., 1981. Plant Sci. Lett. 21-23 Pandey R. & Ganapathy S.P., 1984. Plant Cell Rep. 3:45 Pua EX. & Thorpe , 1986. J. Plant Physiol. 123:241 McCoy JX, 1987. Plant Cell Rep. 6:417 Chandler S.F.& Thorpe ., 1987. Plant Cell Rep. 6:176 YeMJ.eraf., 1987, Theor. AppL Genet. 74:426 Chen RW. etal, 1982, p. 4851 Templeton S.K.M. etal,
\ 1 181 .

La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 4 Caracterstica Especie Tabla 6 {Continuacin) Empleo Tipo de Rege Hered de muexplante era-c a tagenes in bilidad No No No Manga Daucus carota neso 2,4-E * Citrus sinensis Azula m . Tolerancia Apium graveolens No Callo No a NJt Referencias

Tole- Alumi Lycopersicon esculentum rancia nio Daucus carota ameSorghum bicolor tales

Meredith P.C., 1978, Plant Sci. Lett. 12:25 Ojima K. & Obira K., Suspensi S Si S NJt 1982, p. 475' SmithH.R. etal, 1983, Plant Cell Callo Rep. 2:129 Suspensi i No i N.R Ojima K.&OhiraK., 1983. Plant Cell Phys, 24:789 Kochba J. etal., 1980, p. 1873 Merrick A.M.M.& Collin A.H., 1981, Plant Sci. Lett. 20:291 NafeingerD.Refa/., 1984. Plant Physiol. 76:571 King J. & Maretzki A^ 1983. PhysioL Plant 53:457 WeberG.fi,1984.J. Plant Physiol. 117:338 CellaR.e/fl/.,i984,X Exp. Bot. 35:1390 Hughes W.K., 1978, p. 874 2. Theor. Appl. Genet. 63:169 Lukes N. & Ninnemann H. 1982. Plant Sci. Lett 24:231 Nielsen E. etal., 1980, p. 1513 WershunG. etal, 1987, Theor. Appl. Genet 74:480 Wershun G.etaL, 1987 Theor. Appl. Genet 74:480 SwansonBJB.rfdL.198 8. Plant Cell Rep. 7:83

Callo -----1 NJt Rayos gamma No Suspensi Si No NJt r

Gyph Daucus carota o-sato Saccharum officinarum

No

Suspensi No

NJt

No No

Suspensi r Callo

No NJt No NJt

EMS a herbicidas
]

No

NJt NJt NJt NJt

Beta vulgaris

No

Callo

No NJt

Metho Glicinemax -trexat o Daucus carota Paraqu Glicinemax at Ciana- Solanum mida tuberosum i bzeti-ii Daucus carota na MCPA Solanum tuberosum tanidel Solanum tuberosum hlorsul Brassica napus f -iiron

UV No

No Suspensi No n

Medicago sativa Brassica napus

No No

Callo Callo

Si NJt No NJt

No

Suspensi Callo No

No

Suspensi No n Suspensi No n suspensi S n uspensi Si n N crospor Si as

NJt

Scale cereale

No

Anteras

Si NJt

No No i No

NJt NJt

Heladas

Saccharum officinarum Daucus carota

No

Suspensi n

No NJt S N.R.

EMS Suspensi on

NJt

Z. Planzenphysiol. 103:139 Tole* Lycopersicon No Suspensi n No NJt Bennetzen L.J. & Adams L.T. 1984. Plant Cell Rep. 3:258

No

Sf

tan esculentum cia ame- Cadmi tales o

5 Biotecnologa vegetal Tabh 6 (Continuacin) Revene- Hereda-b Tipo du rucian expiante illdad Cilio Callo Callo SI S Si N.R. N.R. N.R.

La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 87 Referenda^ 2) Permite un proceso doble de seleccin in vitro (cuyas ventajas anteriormente discutimos) e in vivo, 3) Produce lneas clnales derivadas de una clula por lo que no se generan mosaicos genticos. 4) Pese a su elevada frecuencia, las nuevas variantes generalmente no son acompaadas de otras mutaciones indeseables como ocurre por efecto de agentes muta-gnicos. Esto permite obtener nuevas caractersticas deseables en cultivos probados de alto rendimiento sin riesgo de perder las ventajas ya existentes. Varias caractersticas agronmicas importantes han sido seleccionadas en variantes soma-clonales (vase Tabla 7) y sin duda este mtodo contribuir de manera importante en ios programas de fitomejoramiento de muchos cultivos. Produccin de lineas hamcigas (dobles haploides) En las especies propagadas por semilla la produccin de nuevas variedades hbridas requiere necesariamente de varias retrocruzas sexuales con uno de los progenitores hasta lograr una homogeneidad gentica total en el carcter que se desea transferir. ste es un proceso largo que toma un nmero variable de aos dependiendo de la especie de que se trate. Una alternativa a este problema la ofrece la produccin de lneas homcigas a travs del cultivo in vitro de clulas haploides. Durante los aos sesenta Guhay Maheshwari (1964) y Bourgin y Nitsch (1967) reportaron la formacin de embriones haploides a partir del cultivo in vitro ees mcrosporas de Datura y Nicotiana respectivamente. Estos mtodos permitieron la produccin de plantas haploides, de un gran nmero de cultivos. El mtodo consiste, como vimos anteriormente, en cultivar polen u vulos producto de la meiosis en los rganos reproductores y genera clulas haploides. Un tratamiento con colchicna, la cual inhibe la divisin celular sin afectar la duplicacin cromosmica, genera a su vez dobles haploides que, consecuentemente, son hom-cigos en todos sus genes (Figura 3).
s^__ j Cultivo de anteras

Patgeno

Especle

Fusarium oxisporum (cido isrico)

Solanum tuberosum Medicago sativa Hordeum vulgare

BchnlceM.,1980.Z. Pflanzcnzch, 85:254 Arcioni S. et al., 1987, Theor. Appi. Genet. 74:700 Chawla S.H.& Wenzel G., 1987. Plant Breed. 99:159 Behnke M., 1980. Theor. Appi. Gen. 56:151

Inflorescencias do plonto diploide hetsrciga

Phytophtora Solanum tuberosum infestaos hhwthospo-ri Zeamays um may dis H. victoriae ~] Avena sativa

Callo

Si

N.R.

Aislamiento de yemas florales

Callo

Si

Alelo Gengenbach G.B.& cito-plsm Green B.C. 1975. Crop. ico Sco. 15:645 Alelo recesivo Rules N.W. & Luke HR, 1985. Theor. Appi Genet 71:16 LingH.D. et al., 1985. Theor. Appi Genet 71:133 Chawla Su & Wenzel G., 1987. Theor. AppL Genet 74:841 Chawla S.H.& Wenzel G., 1987. Theor. Appi Genet 74:841 Larkin J.P. & Scowcroft, 1983. Plant Cell Tissue &Org. Cult 2:111 Barden K.A. et al, 1986. Plant Sci. 45:209 PaulyM.H.tfa,1987. Crop. Sci. 27:340

Aislamiento da anta ras

Callo

Si

H-oryzae

Oriza sativa

Cano

Si

H. sativum

Triticum aestivum Hordeum vulgare

f
Cultivo de polen

Callo

N.R.

'i-at agi1 Collo haploide Formacin de embriones asexuales

Callo H. sacchari Saccharum officinarum Callo

Si Si

NJL S

TMV Lycopersicon Pseudomonas esculentum syringae Triticum aestivum

Hoja Callo

Si Si

Si NJt

' BK Fujiwara A. (comp.). Proceedings of the 5th International Congress of Ptont Tissue and Cell Culture. Toldo, Japn.

En: Sharp R.W. et al (comps.). Plant Cell and Tissue Culture: Principles and applications. Ohio State Univ. Press, Columbus, Ohio.

Planto diploide homciga

'En: SalaF.efa/. (compi.). Plant Cell Cultures: Results and perspectives. HsevietWoruVHolland Bioroed. Press, Amsterdam, Holanda.

Figura 3. Estrategia general para la obtencin de plantas homcigas mediante el cultivo de haploides.

88 Biotecnologa vegetal La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 6 Tabla 7

i Caraclersticc
Fertilidad

Variantes clnales con modificacin de algunas caractersticas de inters agronmico. Especie Tipo de Referencias
explante Zea mays Lactuca sativa Lycopersicon escukntum Oriza sativa Trilicum aestivum Glicine max Hordeum vulgare Suspensin j Protoplastos Callo Suspensin Suspensin Callo Callo haploide Suspension Callo Callo haploide Suspensin Callo haploide Callo haploide Earle DP. & Gracen E. V., 1985, p. 1391 Engler E.D. & Grogan G.R., 1984. J. Hered. 75:426 Evans A.D. et al, 1984. Am. J. Bot 71:759 Fnkui K., 1983. Theor. Appl. Gen. 5325 Larlcin l.P. et al, 1984. Theor. Appl Gen. 67:943 Barwale B.U. & Widholm M.J. 1987. Plant Cell Rep. 6:365 PovreH W.etal., 1984. Heredity 52:19
1

Tabla 7 Caracterstica Morfologia y color del uto y hojas Especie Rubussp.

(Continuacin)
Referencias Swartz J.H. et al., 1983. J. Amer.Soc, Hort. Sei. 108:285

Tipo de explante Meristemos

Saccharum qffieinarum Solanum tuberosum Glycine max Brassica napus

Callo Suspensin Callo Callo haplode

Lourens G.A. & Martin A.F., 1987. Crop. Sei 27:793 Creissen P.G. &. Karp A., 1985. Plant Cell Tissue & Org. Cult. 4:171 Barwale B.U. & Widholm M.J., 1987. Plant Cell Rep. 6:365 Hofimazm V.etaL, 1982. Theor. Appl. Gen. 61325

Tiempo de antesis

Zea mays Lycopersicon esculentum Oryza sativa Triticum aestivum Hordeum vulgare Brassica napus

Earle D J. & Gracen E.V., 1985, p. 139 1 SibiM.1982,p.2282 Shaeffer W.G. et al, 1984. Theor. Appl. Gen. 67:383 Larldn J.P. etal., 1984. Theor. AppL Gen. 67:943 Powell W. etal, 1984. Heredity 52:19 Hoffmann F. et al., 1982. Theor. Appl. Gen. 61:225 Earle D.F. & Gracen E.V., 1985, p. 1391 Shaeffer W.G. etal., 1984. Theor. Appl. Gen. 7:383 Chen H.H.T. et al, 1987. J. Plant Physiol. 130-27 Earle D.F. & Gracen E.V., 1985, p. 139
1

En: Henkke R.R. et al. (comps.). Tissue culture in forestry and agriculture, Plenum Press, Nueva York. En: Earle D.E. y Demarly Y. (comps.), Variability in plants regenerated from tissue culture, Praeger Press, Nueva Yode.

Propiedades dsl grano

Zea mays Oriza saliva Triticum aestivum

Suspension Callo haploide Callo

La generacin de dobles haploides puede tomar entre 10 y 14 meses dependiendo de la especie, lo que acortara entre 3 y 5 aos un programa tradicional de mejoramiento gentico. Muchas nuevas variedades certificadas de arroz, trigo y cebada han sido producidas por este mtodo y se han producido ya dobles haploides de nabo, esprrago, berenjena, pimiento, remolacha, girasol y meln (Bolln y Raquin, 1987). Sin embargo, existen an limitantes al empleo de esta metodologa ya que no ha sido posible regenerar plantas a partir de clulas .haploides de muchas especies de importancia econmica. Fusin de protoplastos y produccin de hbridos somticos Los protoplastos son clulas "desnudas" que carecen dla rgida pared celular que envuelve a las clulas vegetales. Esta propiedad temporal permite que dichas clulas puedan ser fusionadas con otros protoplastos de lamismao de diferente especie. La fusin de protoplastos permite por lo tanto mezclar los genomas de especies distantes eliminando las barreras reproductoras precigticas que las separan en la naturaleza y que limitan la disponibilidad de germoplasma para los fitomejoradores (Figura 4). Los mtodos de fusin Las membranas de los protoplastos se encuentran cargadas negativamente por lo que se repelen unas a otras. Una modificacin rpida del medio ambiente inico (Ca^SO mM + mantol 0.4 mM a p H= 10.5) produce una neutralizacin del plasmalemayconsecuentemente una agregacin celular que conduce a la coalescencia de las membranas y a la fusin de los citoplasmas. Este mtodo empleado con protoplastos de dos lneas imitantes de tabaco condujo a la obtencin de los primeros hbridos somticos (Carlson, 1973; Power et al, 1973). Apartir de entonces se han desarrollado otros mtodos de fusin entre los que sobresalen el empleo de polietilenglicol de bajo peso molecular [1500 a 6000,20 a 40% (w/v)] y ms recientemente, de corriente elctrica. Este mtodo de electrofusin (Vienken etal, 1981), utiliza unaconiente alterna para estimular a que los protoplastos entren en estrecho contacto.

Peso y vigor de la planta o hio

Zea mays Lactuca sativa Lycopersicon esculentum Oriza sativa Solanum tuberosum Triticum aestivum Sorghum bicolor Hordeum vulgare

Suspensin Protoplastos Callo Callo haploid Suspension Callo Callo Callo haploide Protoplastos Callo Callo haploide

Engler E.D. & Grogan G.R., 1984. J. Hered. 75:426 SibiM., 1982, p. 228* Shaeffer W.G. et al., 1984. Theor. Appl. Gen. 67:383 Creissen P.G. & Karp A., 1985. Plant Cell Tissue & Org. Cult. 4:171 ChenH.H.T. etal, 1987. J, Plant Physiol 130-27 Bhaskaran S. et al., 1987. Plant Cell Tissue & Org. Cult 9:189 Powell W. et al, 1984. Heredity 52:19 Engler E.D. & Grogan G.R., 1984. J. Hered. 75:426 SflriM., 1982, p. 2282 Shaeffer W.G, et al, 1984. Theor Appl. Gen. 67383

Morfologa y color del uto y hojas

Lactuca sativa Lycopersicon esculentum Oriza sativa

90 Biotecnologa vegetal

La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 7 La fusin se induce posteriormente por medio de un pulso de alto voltaje (500 V cm*') de microsegundos de duracin. Seleccin de hbridos Como resultado de la fusin se obtiene una mezcla de clulas no fusionadas, clulas fusionadas del mismo tipo celular (homocariones) y clulas hbridas (heterocariones). Es, por tanto, de gran importancia disponer de algn mtodo de seleccin de heterocariones. Se han empleado mtodos tan variados como: a) La seleccin visual de productos de fusin de clulas verdes (con cloroplastos) y clulas albinas; tinciones con colorantes vitales, particularmente fluorescentes en donde un ncleo es de un color y otro de otro, etc. Los heterocariones identificados son pipeteados y cultivados independientemente. b) La complementacin entre protoplastos tratados con diferentes inhibidores meta-blicos. c) Mtodos automticos de separacin celular empleando un rayo lser. Este mtodo permite separar las clulas de una mezcla de fusin por medio de la diferente carga de las membranas. Aplicaciones de la hibridacin somtica La obtencin de hbridos par asexuales se limita a aquellas especies en que se pueden regenerar plantas de protoplastos (vase Tabla 8). Algunos hbridos somticos con caractersticas agronmicas de inters han sido obtenidas en el gnero Nicotiana. En la papa (Solanum tuberosum) que es propagada por tubrculos y es por lo general sexualmente infrtil, la disponibilidad de otros mtodos de mejoramiento gentico son de gran importancia. Los logros han sido muy limitados debido principalmente a la incapacidad de regenerar muchos cultivares y a la carencia de mtodos de seleccin adecuados. Pese a esto, Helgesone/a/. (1986) emplearon la hibridizacin somtica para transferir resistencia al virus del enrollamiento de la hoja y al tizn tardo de S. brendens a S. tuberosum, dos especies que son sexualmente incompatibles en la naturaleza. Transformacin gentica A diferencia de la hibridacin somtica en donde se mezclan los genomas completos de dos variedades o especies, la transformacin permite transferir un solo gene especfico a una clula receptora. Ms importante an, dicho gene puede proceder de cualquier tipo de organismo vegetal, animal, bacteria u hongo lo que ampla enormemente la fuente de germoplasma disponible para el mejoramiento gentico. La transformacin es el proceso por medio del cual un ADN: 1) penetra al interior de una clula receptora, 2) se integra al genoma de sta y 3) es transcrito y traducido formando asi protenas funcionales que confieren una nueva funcin o caracterstica a dicha clula. La introduccin del ADN transformante no constituye ningn problema y puede lograrse por medio de los diversos mecanismos ilustrados en la Figura 5. Integracin y expresin de genes transformantes La parte ms complicada del proceso de transformacin consiste en aislar los genes que codifican para el carcter deseado. Sin embargo, para que sea funcional dentro de la clula

Seleccin de hbridos

Crecimiento de eolios hbridos

Regeneracin plantos

de

Andlisis gen tfico entrecruza mientos

por

Produccin de vari ed o des hbridos

Figura 4.

Estrategia general para la hibridacin somtica.

8 Biotecnologia vegetal Tabla 8 Lneas celulares obtenidas por hibridacin somtica. Lneas celulares de cruzas intergenricas Parental 1 Glioms max Giicine max Glicine max Giicine max Vicia faba Glicinemax Daucus carota I Daucus carota I Daucus carota Lycopersicon esculentum Lycopersicon peruvianum Nicotiana tabacum Nicotiana tabacum Sorghum bicolor
i

La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 93 O

1

X ----------

Genoma de planto A Microinyeccion Desarrollo da da ovarios lo semilla Aislamient o ie un

Germinacin

Paren tal 2 x Nicotiana glauca x Nicotiana tabacum x Zea mays x Hordeum vulgare x Petunia hybrida x Vicia hojastana x Hordeum vulgare x Oriza sativa x Petunia hybrida x Solanum rickii x Petunia hybrida x Lycopersicon esculentum x Solanum chacoense x Zea mays x Lycopersicon esculentum x Giicine max x Poscinis trifoliata x Pennisefum americanum x Triticum aestivum x Brassica napus ]! Parental 2 x S. chacoense x S. brevdens x L. peruvianum xL.pinnelli x D. capillifolium xA.porrum x B. campestris s C. sinensis

Referenda Kao NX, 1977. Mol. Gen. Genet 150:225

1987. Mol. Gen. Genet 150:231 Kao NX etal, 1974. Planta 120:215 Kao NX. etal, 1974. Planta 120:215 Binding H. &NebJs R,, 1978. Mol. Gen. Genet 164:137 Consfanbel F. & Weber, 1977. CR. Acad. Sci Serv. 285:319 Dudits D. etal, 1976. Can. J. Gen. Cytol. | 18:263 SalaC. etal., 1985. J. Plant Physiol. 118:409 Reinert J, & Gsch G., 1976. Naturwissenschaften 11:534 O'Connell M.A. & Hanson MR, 1986. Theor. Appl. Genet 72:59 Tabaefeadeh Z. etal., 1985. Plant Cell Rep. 4:7 Evans A.D. etal., 1978, pp. 701 Gamborg L.O. et al, 1978, pp. 2653 Brar S.D. etal, 1980. Z. Pflanzenphysiol. 96:269 Melchers G. etal., 1978, Carlsberg Res. Commun. 43:203 Niiseki, 1981, Jpn. J. Breed. 31:161 Grosser W. J. etal., 1988, Plant Cell Rep. 7:5 TabaizadehZ, 1986. Proc. Ac. Sci. 83:5616 MatsuzawaY. & Sarashima M., 1986, Jpn. I Breed. 36:122 Marsuzawa V. & Sarashima M., 1986, Jpn. J. Breed. 36:122 Referenda Butenko G.R. & Kuchko A.A., 1980, p. 293 4 HelgesonPJ. etal, 1986. Plant Cell Rep. 3:212 Kinsara A. et al., 1986. J. Plant Physiol. 125:225 O'Connell M. & Hanson M.R., 1985. Theor. Appl. Genet 70.1 Dudits D., 1977, Theor. Appl. Genet 51:127 Opatmy Z. fcHavranekP,, 1977, pp. 471 * Schencfc R.H., 1982, pp. 6391 Grosser W. ]. etal., 1989. Sci. Horticul. 39:23-29

gan

Bombardeo hacia maiist$m9 o emoriones

Desarrollo in vitro

Cultivo

Organognesis Embriognasis

Planto Transformado

Solanum tuberosum Oriza sativa Citrus sinensis Saccharum officinarium Hordeum vulgare

Raphanus sativum

_______ |_
Parental I Solanum tuberosum Solanum tuberosum Lycopersicon esculentum Lycopersicon esculentum I 1 Daucus carota I Allium sativum 1 Brassica olercea Citrus aurantifolia , .

Lneas celulares de cruzas tnierespecificas

Fusin con Protoplastos Encapsuamienfo en liposomas

Figura 5. Mtodo general y vas para la transformacin gentica de clulas vegetales.

Llamadas de Tabla 8: ' Ere Fujiwara A. (comp.), Proceedings of the 5th International Congress of Plant Tissue and Cell Culture, Tokio, Japon. En: Proceedings of the 4th Congress International of Plant Tissue and Cell Culture, Calgary, Canada. 3 En: Proceedings of Symposium on plant tissue culture, Science Press, Pekin, China. 4 En: Ferenczy L. y Farkas L.G. (comps.), Advances in protoplast research, Pergamon Press, Oxford, G3. 1 En: Novak JJF. (comp.), Uae of Tissue Cultures in Plant Breeding, Czechoslovak Acad. Sci Inst Exp. Bot, Praga, Gheeoslovaqufa.
2

L_____ ----------------------------------------

94 Biotecnologia vegetal receptora, el ADN deber integrarse al genoma de sta pues slo as podr ser replicado y transmitido a las clulas bijas durante la divisin celular. La integracin tampoco basta para que el ADN transformante sea expresado, los nuevos genes debern estar adecuadamente combinados con regiones de regulacin que sean reconocidas por la maquinaria enzimtica de la clula para que puedan ser transcritos a ARN mensajeros y traducidos a protenas funcionales. El o los genes transformantes deben, por lo tanto, estar ligados a promotores eficientes y estar intercalados entre secuencias de nucletidos capaces de integrarse dentro del genoma de la planta (vase Kleeer ai, 1987y Mosesy Chua, 1988). Adicionalmente.es necesario incluir otros genes que permitan seleccionar in vitro las lneas celulares transformadas. Las tcnicas de formacin de ADNs recombinantes estn fuera del alcance de este trabajo pero pueden ser revisadas en Kingsman y Kingsman (1988) y Winnacker (1987), El sistema de Agrobacterlum El sistema ms ampliamente utilizado hasta ahora para la transformacin de clulas vegetales es el de los plsmidos de las bacterias Agrobacterium tumefaciens y A. rhbogenes. Este fenmeno natural de transformacin ofrece vectores moleculares, los plsmidos Ti y Ri, que poseen regiones de integracin, promotores y un mecanismo para transferir el ADN desde la bacteria hasta el ncleo de la clula receptora. Las agrobacterias son bacterias gramnegativas del suelo que infectan a ms de 330 gneros de plantas dicotiledneas adsorbindose a la superficie de clulas expuestas en una herida desde donde parte de su ADN, penetra a las clulas de la planta y se integra a su genoma (Braun, 1986). Las clulas transformadas por A. tumefaciens proliferan mimando un tumor denominado agalla (crown gall) mientras que A. rhizogenes induce la formacin de gran cantidad de raices (kairy roots). La virulencia de A. tumefaciens es conferida por un plsmido denominado Ti (inductor de tumores). Slo una parte del ADN del plsmido es transferido e intregado al genoma de la clula vegetal. ste es el 4Z)A^-r(transferible) cuyos genes confieren nuevas propiedades a la planta. El ADN-T codifica para la sntesis de enzimas que sintetizan auxinas y citocf-ninas que alteran el balance hormonal de los tejidos resultando en la proliferacin desordenada del tumor. Las clulas transformadas tambin producen compuestos nitrogenados (conjugados de aminocidos y cetocidos) llamados opinas que, tambin son codificados por el ADN-T. De esta forma, cualquier gene integrado por tcnicas de ADN recombinante en la regin del ADN-T ser integrado y expresado por las clulas vegetales transformadas. Los ingenieros genetistas han desarrollado plsmidos que carecen de los genes responsables de la formacin del tumor (plsmidos desarmados) y que poseen promotores que hacen muy eficiente o regulable la expresin de los genes transformados (Klee et al., 1987). Transformacin de tejidos organognicos o embriognicos La principal limitante que presentan las tcnicas antes descritas para la produccin de plantas que expresen y hereden las nuevas caractersticas genticas es la imposibilidad de regenerar plantas completas a partir de clulas en suspensin o de protoplastos de muchas especies. Esta dificultad, sin embargo, est siendo superada por la utilizacin de nuevos medios de cultivo y, principalmente, por medio del empleo de nuevas tcnicas para introducirel ADN a tejidos organognicos o embriognicos tales como embriones inmaduros, hojas cotiledonarias, meristemos, etc., de las que es fcil producir nuevas plantas.

La generacin de plantas con nuevas caractersticas genticas 9

Dos trabajos de gran relevancia, publicados conjuntamente en agosto de 1988 en la revista BioJTechnology, ilustran la exitosa regeneracin de plantas transformadas de frijol de soya (Glycine max). En un caso (Hinchee et al., 1988) los tejidos transformados fueron las hojas cotiledonarias de plntulas derivadas de semillas germinadas in vitro bajo condiciones aspticas. Una vez transformados los cotiledones fueron cultivados para inducirla formacin de brotes adventicios que se desarrollaron en plantas completas que expresaban resistencia a la kanamicina y tolerancia al herbicida glifosato. Para introducir el ADN a los cotiledones se emple el mecanismo natural de infeccin de Agrobacterium tumejaciens. La cepa empleada como mediadora haba sido previamente transformada con los genes para dichas caractersticas. En el segundo reporte (McCabe et al., 1988) los tejidos transformados fueron los meristemos de ejes embrionarios aislados de semillas inmaduras, los que una vez transformados fueron cultivados in vitro para inducirla formacin de embriones somticos de los que se desarrollaron plantas que expresan y heredan el gene para la neomicina fosfotransferasa que confiere resistencia a la kanamicina. El mecanismo de transformacin en este caso fue la herramienta ms novedosa y prometedora de la que disponen los ingenieros genetistas: el bombardeo con partculas aceleradas. La transformacin de tejidos organognicos requiere de mtodos especficos para introducir el ADN. La microinyeccin ha sido empleada con xito en la transformacin de vulos y meristemos pero este es un proceso laborioso que requiere de gran actividad manual. Por otro lado,y4. tumefaciens no infecta los tejidos de monocotiledones que comprenden a los cultivos alimenticios ms importantes del mundo: los cereales Transformacin por aceleracin de partculas Esta tcnica desarrollada recientemente por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (Klein et al., 1987), podra convertirse en el mtodo universal de transformacin: bombardear el ADN al interior de las clulas por medio de un can de partculas metlicas. Klein et al emplearon un acelerador por medio de descargas elctricas para disparar partculas de tungsteno de 4 micrones de dimetro (previamente cubiertas con molculas de ADN precipitadas sobre ellas) a clulas de epidermis de cebolla. ] rescate de embriones Otra contribucin importante del cultivo in vitro al fitomejoramiento es el cultivo de embriones cigticos producto del entrecruzamiento entre dos especies distantes que son genticamente incompatibles. En ocasiones los embriones producto de la fertilizacin del vulo de una especie con el polen de otra no se desarrollan debido, entre otras cosas, a la falta de nutrientes. Si estos embriones permanecen en el ovario abortarn por lo que es necesario "rescatarlos" de la flor y cultivarlos in vitro en un medio que contenga los nutrientes y reguladores necesarios para que germine. Esta metodologa ha permitido obtener progenie de cruzas amplias de un gran nmero de especies (Hu y Wang, 1986). Es muy importante destacar que las metodologas de fitomejoramiento tradicionales empleadas hasta ahora no han sido deficientes, de hecho esa travs de ellas que se produjeron todas las variedades de cereales, hortalizas, frutales, etc., que hoy alimentan a la poblacin mundial. Las nuevas tecnologas no reemplazan el trabajo del fitomejorador ni la seleccin a nivel de campo en donde la calidad de una nueva variedad es evaluada de manera definitiva, pero ofrecen una mayor plasticidad y

96 Biotecnologia vegetal Tabla 9 gentica en Itpode explante

Tabla 9

Conservacin de germe-plasma 10 Transformacin agronmico. Vehculo plantas de inters Referencia Especie Vehculo (Continuacin) Caracterstica Referencia

Especie

Caracterstica i Resistencia a

Tipo de explante

Solanum

A. tumefaciens Discos de

Sheermans & Bevan W.M, 1988, Plant Cell Rep. Michelmore 7:13 R.etal., 1987, Plant Cell Rep. 6:439 McCormick S., et al., 1986, Plant Cell Rep. 5:81 Nelson S.R. et al., 1988, Bio/Technol. 6:403 FillattiJ.J.efa/., 1987, Biot/Technol. 5:726 Fischhoff A.D. et ai., 1987, Bio/Technol. 5:807 Catlin D. et al, 1988, Plant CellRep. 7:100 Bytebier B. et a, 1987, Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:5345 Kohler F. et al, 1987, Plant CellRep. 6:313 TrulsonJ.A.era/., 1986, Theor. Appi. Genet. 73:11 New Scientist N 19,1988, p. 27

tuberosum tubrculo Lactuca sativa A. tumefaciens Cotiledones Lycopersicon A. tumefaciens esculentum A. tumefaciens A. tumefaciens A. tumefaciens Apium graveolens Asparagus officinalis Vigna aconitifolia Cucumis sativus Brassica napas A. tumefaciens A. tumefaciens

Kanamicina Resistencia a Kanamicina Discos de hoja Resistencia a Kanamicina Hojao Resistencia a cotiledones TMV Cotiledones Resistencia a glyphosato Discos de hoja Resistencia a insectos Pecolo Resistencia a Kanamicina Tallo Resistencia a Kanamicina

Lin um usitatiA. tumefaciens Callo ssimum Saccharum officinarium Endocitosis A. Protoplastos Malus prunus tumefaciens Discos de hoja

Resistencia a Kanamicina Resistencia a Kanamicina Resistencia a Kanamicina

Basiran N. er a'., 1987, Plant Cell Rep. 6:396. Chen W.H.e/a/., 1987, Plant Cell Rep. 6:297. James J.D. etal., 1987, Plant Cell Rep. 6:289.

Resistencia a Kanamicina Resistencias Kanamicina A. tumefaciens Discos de hoja Resistencia al herbicida Phosphinotricina Micro Embriones Resistencia a inmaduros Kanamicina inyeccin Brassica A. rhizogenes Plntulas Resistencia a olaracea Kanamicina Daucus carota A. tumefaciens Suspensin Resistencia a Kanamicina Axmoracia lapathifolia Zea mays Oriza sativa

Electroporaci Protoplastos n A. rhizogenes Hipocotilo

debido a una disponibilidad infinitamente mayor de genes y de tcnicas de seleccin y propagacin ms eficientes. Se considera que la generacin de variabilidad por las biotecnologas puede acortar a la mitad el tiempo que toma normalmente producir una nueva variedad que, como se muestra en los siguientes ejemplos es muy largo: jitomate, 8 aos; remolacha, 14 aos; caa de azcar, 14 aos; maz, 1S aos; caf, 16 aos (en todos los casos se trata de tiempos aproximados). Uno de los grandes problemas que habr que resolverpara que la biotecnologa vegetal tenga el impacto que se espera de ella es una integracin vertical desde el principio (laboratorio) hasta el campo en la que las estrategias sean definidas de manera raulti-disciplinaria (por genetistas, agrnomos, bilogos celulares y moleculares; fitopatlogos, etc.) para asegurar que lo que se genere en el laboratorio sea lo que se necesita en el campo. Finalmente, la Tabla 9 resume algunos ejemplos de transformaciones genticas efectuadas en plantas de inters agronmico.

Hordeum vulgare Glicine max Glicine max Glicine max <

Neuhaus G. et al, 1987, Theor. Appi, Gen. 75:30 David C.& Tempe J., 1988, Plant CellRep. 7:88 Scott J.R& Draper J., 1987, Plant MoLBiol. 8:265 A rhizogenes Discos de hoja Resistencia a Moda T. et al., 1987, Plant ] Kanamicina Cell Rep. 6:283. A tumefaciens Protoplastos desistencia a Rhodes C. et al, 1988, 1 1 Kanamicina Science 140:204 Electroporaci Protoplastos desistencia a roriyama K. et al, 1988, n 1 Kanamicina y Bio/Technol. 6:1072. aG4l8 Vicroinyecci rganos desistencia a )e la Pea A. et al, 1987, n 1 I florales Kanamicina Nature 325:274. A., tumefaciens Protoplastos desistencia a Jaldes R etal, 987, Plant Kanamicina Moi Biol. 9:135. ' I K. tumefaciens Cotiledones desistencia a iinchee AM. et al, 1988, 1 I glyphosato Bio/Technol. 6:915 Zan de Meristemos Lesisfencia a deCabe ED. et al, 1988, partculas f f glyphosato Bio/Technol. 6:92.

CONSERVACIN DE GERMOPLASMA
El problema del germopiasma El mejoramiento gentico de los cultivos est basado en la continua incorporacin de nuevas caractersticas genricas a las especies cultivadas que producen elevados rendimientos. Para ello se emplea la amplia variabilidad gentica que existe en las especies silvestres evolutivamente relacionadas con los cultivos y en las plantas domesticadas, no mejoradas genticamente, pero que son cultivadas en pequea escala en sistemas de agricultura de subsistencia. La preservacin de este pool gentico es de vital importancia para el futuro de la agricultura, y es por ello que constantemente se colectan nuevas variedades y especies relacionadas con los cultivos. Estas colecciones de germopiasma (bancos de germopiasma) han cobrado en los ltimos aos una especial importancia debido a que diversas actividades humanas (aumento en la actividad agrcola, la sobreexplotacin de bosques y selvas, incremento en la poblacin humana y su consecuente necesidad de expansin territorial, y la contaminacin de los ecosistemas) estn modificando o destruyendo los habitats en los que se encuentra este pool gentico. Por otro lado, el empleo de unas cuantas variedades de alto

11 Biotecnologia vegetal

La biotecnologa vegetal en Mxico 99 Aspectos agrogeogrficos Mxico tiene una superficie de 19S millones de hectreas, de las cuales se cultivan 23 millones. Sin embargo, se calcula que 30 millones de hectreas (15% del teritorio) son cultivables con la tecnologa actual (Wellhausen, 1976) quedando una reserva de aproximadamente 7 millones de hectreas para aumentar la produccin en un futuro cercano. El resto no es apto para la agricultura por ser demasiado seco, demasiado hmedo o montaoso. En trminos de superficie cultivada por habitante, considerando los 7 millones de hectreas potencales, nos da una cifra de 0.38 hectreas, muy por debajo de la de Estados Unidos, que es de 0.6 hectreas per cpita sin contar la superficie dedicada a las exportac iones (Pimentel, 1981). Por otro lado, los climas y los suelos del pas son menos favorables: Mxico tiene un alto porcentaje de zonas ridas y semiridas (94% del territorio nacional, Aceves Navarro, 1988) y 53% de los suelos considerados adecuados para la agricultura se localizan en estas zonas que solamente disponen del 7% del total de agua nacional. En la actualidad hay aproximadamente 5.7 millones de hectreas bajo riego, equivalentes al 25% de la superficie cultivada y de las cuales se obtiene 54% de la produccin total (Aceves Navarro, 1988). El otro 75% son zonas de temporal y producen el 46% restante. Las diferencias en los rendimientos obtenidos en algunos cultivos entre reas de temporal y de riego se observan con claridad en la Tabla 2. Lo anterior destaca la importancia del riego en el desarrollo de la agricultura mexicana que de hecho ha absorbido la mayor parte de la inversin en el sector desde los aos cuarenta. De estos datos agrogeogrficos de Mxico y con base en estudios de 1 a productividad de las plantas que comparan rendimientos rcord con rendimientos promedios (labia 2) podemos concluir que la baja productividad de la agricultura mexicana se debe en gran medida (hasta en 7094) a sus ambientes sicoquimicamente desfavorables, en particular a la deficiencia de agua. Como ya se ha discutido, la biotecnologa vegetal ofrece la posibilidad de producir nuevas variedades genticas ms tolerantes a estas condiciones desfavorables que tericamente permitirn ampliar la superficie cultivable, elevar los rendimientos y disminuir las prdidas producidas por enfermedades y estrs. Sin embargo, de la teora a la prctica existe un camino muy largo y con muchos obstculos an para los pases ricos. Para el desarrollo de la biotecnologa vegetal en el pas se requiere de satisfacer los siguientes puntos: 1) incrementar la infraestructura material y humana; 2) disponer de fuentes de financiamiento adecuadas; 3) producir cultivos diseados para satisfacer demandas reales del mercado nacional y extranjero a un costo competitivo y 4) la vinculacin con el resto de la cadena de produccin (ftomcjoradores, productores e industriales) que asegure la comercializacin de los productos. En ltima instancia sern las condiciones econmicas las determinantes del grado de aplicacin de esta tecnologa en Mxico. Investigacin y desarrollo en Mxico En los ltimos aos se han llevado a cabo varias encuestas sobre el estado de la investigacin en biotecnologa vegetal en Mxico (Lozoya, 1985; Roben y Leyla, 1985; Arroyo et al., 1989) que presentan un panorama optimista sobre el estado de este campo. Sin embargo, una revisin cuidadosa de los trabajos mencionados pone de manifiesto ciertas deficiencias y un nmero considerable de discrepancias en los datos que no son explicables por las diferentes

rendimiento ha hecho que muchos agricultores abandonen otras variedades tradicionales que, aunque de bajo rendimiento, representan una riqueza gentica que ase gura la sobrevivencia de los cultivos sobre todo bajo condiciones adversas. El cultivo in vitro puede contribuir en un futuro prximo a la conservacin de germoplasma ayudando a reducir el espacio de almacenamiento y las operaciones de mantenimiento que requieren algunos cultivos en los bancos de germoplasma. El Panel Internacional para la Preservacin de los Recursos Genticos de la FAO (International BoardforPlantGenetic Resources, IBPGR) ha recomendado su empleo para la preservacin de algunos cultivos; por ejemplo, papa, cassava o caa de azcar que producen semillas con muy baja viabilidad (recalcitrantes) por lo que tienen que ser almacenadas en forma vegetativa como colecciones vivas, lo cual no slo es costoso sino que incrementa el riesgo de contaminacin (IBPGR, 1986). . Aunque a largo plazo el almacenamiento de cultivos celulares a bajas temperaturas (-96* C) denominado criopreservacin parece ser la mejor opcin para muchos cultivos in-cluyendo aquellos que se propagan por semilla, esto requiere aun de gran cantidad de inves-tigacin y no lo discutiremos aqu. Sin embargo, la preservacin empleando otras tcnicas de cultivo in vitro ha sido ya lo suficientemente experimentada como para conocer su potencial. El cultivo bajo condiciones limitantes de crecimiento El almacenamiento a bajas temperaturas de cultivos de tallos o plntulas combina dos caractersticas importantes para la preservacin. Por un lado, mantiene la estabilidad gentica de las especies ya que se trata de cultivos derivados de meristemos y, por otro, reduce la frecuencia con que deben subcultivarse los materiales. Las temperaturas cercanas al punto de congelacin son las ms adecuadas para almacenar especies de climas templados pero para especies tropicales las temperaturas ptimas para un crecimiento mnimo se encuentran entre los 14 *C y los 18 *C. Otro parmetro fsico importante es la iluminacin ya que la incubacin en luz tenue o en la oscuridad reduce tambin el crecimiento. El incremento en la concentracin, o la adicin de sustancias que alteran el potencial osmtico del medio tambin disminuyen la velocidad de crecimiento de los cultivos. Concentraciones de sacarosa superiores al 4% previenen la divisin celular y ayudan a las clulas a tolerar temperaturas cercanas a los 0* C; por su parte, el manitol (> 200 mM) contribuye a mantener la integridad de las membranas y prevenir la prdida de solutos. Las concentraciones de nitrgeno y la presencia de inhibidores como el cido abscisico tambin contribuyen a mantener a las clulas en un estado latente pero la experiencia indica que lo ms adecuado es una mezcla de todos los factores en combinaciones y concentraciones que dependen de cada especie. Muchos cultivos importantes han sido mantenidos bajo condiciones de crecimiento limitado por periodos largos despus de los cuales se han desarrollado normalmente. Para una revisin sobre este campo vase Withers y Williams, 1980.

LABIOTECNOLOGAVEGETALENMXICO Dentro del panorama que hemos presentado aqui, cules son las oportunidades que la biotecnologa vegetal ofrece para Mxico? y, con qu recursos cuenta el pas para aplicarla de acuerdo con sus necesidades?

100 Biotecnologa vegetal

Bibliografa 101

Techas en las que fueron elaborados. En algunos casos existen errores y en otros es difcil evaluar y comparar la informacin debido a que los autores utilizan diferentes definiciones sin explicitar su terminologa. Por ejemplo, no se define qu es un proyecto y en ocasiones la investigacin bsica se considera parte de la biotecnologa vegetal y en otras no, etc. Por otro lado, y ms importante an, ninguno de los estudios intenta evaluar los proyectos en trminos de publicaciones derivadas, tecnologas desarrolladas o productos en el mercado, sino simplemente reporta los datos obtenidospo'r medio de encuestas. Es nuestra opinin que lo anterior ha resultado en una sobreestimacin del potencial cientfico-tecnolgico del pas en biotecnologa vegetal. La gran mayora de los proyectos hasta la fecha slo han producido tesis, unas cuantas publicaciones y, segn nuestros conocimientos, slo dos tecnologas han sido desarrolladas y aceptadas por industrias, pero no han sido an explotadas comercialmente. No se pone en duda la validez cientfica de los proyectos o su importancia en la formacin de recursos humanos, pero si se cuestionan las posibilidades de muchos de ellos de terminar en algn producto o servicio utilizable que despus de todo debe ser la medida para evaluar tecnologa. En el caso de algunas instituciones est claro que su infraestructura es inadecuada o que no hay suficientes recursos humanos altamente calificados para llevar a cabo la investigacin. En otras, los proyectos no estn vinculados con problemas especficos ni con grupos de productores por lo que el producto final difcilmente tendr las caractersticas necesarias para encontrar despus un mercado. No slo basta producir una planta nueva o modificada en el laboratorio, si sta no sobrevive y produce mejor en el campo no se podr vender y la mayora de los grupos ni siquiera tienen invernaderos y campos experimentales para probar el desempeo de sus plantas fuera del laboratorio. Consideramos que Mxico tiene en la actualidad un potencial, aunque limitado, para desarrollary explotar la biotecnologa vegetal ya que: l)exsten ncleos de recursos humanos preparados para adaptar o desarrollar las tecnologas de micropropagacin y de produccin de material libre de virus; 2) estas tecnologas no son exageradamente costosas; 3) un gran nmero de especies agrcolas y hortcolas se beneficiaran de la implementacin de las mismas; 4) en el rea de fitomejoramiento hay grupos de investigacin de alta calidad trabajando sobre variacin somaclonal e ingeniera gentica aunque el desarrollo de estas tecnologas tomar ms tiempo ya que no slo es una rea de investigacin y desarrollo ms sofisticada y costosa sino tambin requiere de un proceso lento de prueba y evaluacin en campo. No obstante esto ltimo, insistimos en que las investigaciones biolgicas slo se convierten en desarrollos biotecnolgicos cuando tengan la orientacin y vinculacin que se requiere para el desarrollo y comercializacin de un producto. Aadido a las dificultades en la fase de investigacin y desarrollo, la biotecnologa vegetal encuentra obstculos para su comercializacin. Mientras no exista una demanda real para los productos de la tecnologa, por cualquiera que sea la razn (falta de conocimientos de su potencial, falta de recursos econmicos para comprarlos, falta de asistencia tcnica para asesorar en su uso o simplemente debido a la existencia de alternativas tradicionales ms rentables), el potencial de la biotecnologa vegetal permanecer latente en nuestro pas. BIBLIOGRAFA 1. Aceves Navarro, E., "Uso y manejo del agua en la agricultura", Comercio Exterior, 38, pp. 570-577,1988. 2 . Anandarajah, K. y D.B. Mckersie, "Manipulating the desiccation tolerance and

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La tecnologa enzimtica

Eduardo Brzana Garca Agustn Lpez-Mungua Canales

La aplicacin de enzimas en la industria alimentaria es, sin duda, una de las reas de mayor impacto de la biotecnologa a este sector. En este captulo se presenta un panorama histrico, asi como una mirada al futuro de la aplicacin de la biocatlisis alos alimentos. El comn denominador de este capitulo son enzimas como aditivos o enzimas a procesos de transformacin.
LYTRODUCCIN

Hoy en da la tecnologa enzimtica ocupa un lugar preponderante dentro de la biotecnologa y especficamente dentro del sector alimentario. Alrededor de un 65% de las enzimas que se producen indus trialmente estn de una u otra manera relacionadas con la industria alimentaria, aunque es conveniente sealar que slo las proteasas alcalinas empleadas en detergentes ocupan25% del total de esta distribucin, el 10% restante corresponde a aplicaciones en las reas farmacutica y analtica. Desde un enfoque histrico podemos retroceder hasta 1883, cuando Payen y Persoz observaron que un precipitado al alcohol de extracto de malta poda, una vez redisuelto, transformar al almidn en azcar. Ms tarde, en 1878, Kuhne adopt el trmino "enzima'", del griego "en la levadura" y 48 aos despus Sumner cristaliz la ureasa, una de las primeras evidencias de la naturaleza proteica de las enzimas. Dentro de este periodo destacan los trabajos de Fischer sobre la complementaridad entre enzima y sustrato (1890) y de Vctor Henri y Leonor Michaelis (1900-1920) sobre cintica enzimtica. Entre 1930y 1940, Kunltz y Northrop confirmaron la naturaleza proteica de las enzimas, cristalizando las proteasas del sistema digestivo (afortunadamente sin requerimiento de cofactores o metales, lo que hubiese retardado aun ms el desarrollo). Este lento avance de la enzimologa contrasta con lo sucedido a partir de 1950. En la actualidad existen ms de 2000 enzimas perfectamente caracterizadas y registradas, se conoce la 103

104 La tecnologa enzimtica CARACTERSTICAS GENERALES Las enzimas son protenas que se comportan como catalizadores; es decir, aceleran la velocidad con laque las reacciones se llevan a cabo sin alterar el equil ibrio y son responsables de las transformaciones metablicas en los seres vivos.)Hay que ser cuidadosos al hablar de "catalizadores biolgicos" pues existen ya las llamadas "xenoenzimas", trmino empleado porNeidleman(l)para referirse a catalizadores proteicos creados en el laboratorio mediante algunas de las tcnicas que ms adelante se mencionan. Ms impactantes an son las "abzimas", anticuerpos monoclonales con actividad "enzimtica" (2) asi como el hecho reconocido de que tanto el ARN como la hemoglobina poseen actividades catalticas (3). Desde el punto de vista fisicoqumico, y como consecuencia de su estructura proteica, ' la actividad cataltica de las enzimas depende del pH y de la temperatura de reaccin,*' caracterstica que resulta de fundamental importancia en una aplicacin industrial. En la Tabla 1 se presentan algunos ejemplos que ponen de manifiesto la importancia que pueden adquirir estos dos parmetros en la aplicacin de enzimas en la industria alimentaria. Tabla 1 Algunos ejemplos de aplicaciones de enzimas en alimentos seleccionadas por su caracterstica de pH y temperatura. Enzima Glucosa isomerasa Aplicacin Su aplicacin en la isomerizacin de glucosa no ue posible sino hasta que se logr obtener una enzima que operase en medio no alcalino (para, evitar la isomerizacin espontnea de glucosa a psicosa). Gelatinizaciny licuefaccin simultneas delahnidn incrementando la productividad. " Aplicacin en el ablandamiento de carnes por su activacin durante el conocimiento. Aplicacin en panadera por su desactivacin durante el horneado. Aplicacin en leche por el pH ptimo de actividad. Aplicacin en suero de leche cido.

Impacto actual en la tecnologia de alimentos 105 peptidico entre la fenilalanina 105 y la metionina 106 de la K-casena provoca la total desestabilizacin de la casena en la leche. IMPACTO ACTUAL EN LA TECNOLOGA DE AUMENTOS Las enzimas intervienen en prcticamente todas las reas involucradas en la tecnologa de alimentos, por lo que el enzimlogo debe aprender a caracterizary aplicar enzimas exgenas, a activar o inhibir, dependiendo del alimento, enzimas endgenas, a aprovechar su termoestabilidad para asociar su desactivacin con tratamientos trmicos y emplearlas como parameos de control de calidad o simplemente, aprovecharlas como herramienta analtica. En la Tabla 2, se resumen las principales aplicaciones de enzimas en el procesamiento de alimentos. Como puede observarse, gran parte de estas aplicaciones son consecuencia de la disponibilidad de enzimas de origen microbiano. Aunque en ciertos casos las enzimas de origen vegetal (papina, bromelina, etc.) o bien obtenidas de algn rgano animal (quimosina, tripsina, etc.) siguen siendo importantes desde un punto de vista tecnolgico y comercial; sin ddala capacidad de produccin de enzimas mediante procesos de fermentacin ha permitido la expansin de esta rea. Es conveniente sealar algunas caractersticas y limitaciones relativas ala aplicacin de enzimas en alimentos: * La experiencia ha demostrado que se requieren de 5 a 10 aos para la realizacin industrial de un desarrollo enzimtico novedoso. La evolucin de este sector ha sido lenta y caracterizada frecuentemente por sustituciones ms que por verdaderas innovaciones: hidrlisis de almidn, inversin de sacarosa, sustitucin de quimosina por "cuajos microbianos", etctera. * Son escasos los procesos que realmente pueden llamarse enzimticos (produccin de glucosa y de jarabes de fructosa), ya que en la mayor parte de los casos las enzimas fungen un papel de aditivos con funciones como disminuir la viscosidad, mejorar la filtracin, evitar la turbidez, clarificar, mejorar la digestibilidad, mejorar la textura, evitar la cristalizacin y mejorar las caractersticas organolpticas, entre otras. 0 Por razones fundamentalmente toxicolgicas, un gran nmero de enzimas industriales son producidas por un nmero reducido de microorganismos (los reconocidos generalmente como seguros por la Administracin de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos). Vase el nmero de enzimas producidas por Bacillus subtilis y Aspergillus niger en la Tabla 2. Por razones de ndole energtica (no requiere cofactores), las reacciones enzimticas industriales son en su mayora de hidrlisis. Las reacciones de sntesis siguen siendo no viables fuera de la clula, ante la dificultad de producir y regenerar cofactores econmicamente, aunque existen varios desarrollos a nivel piloto (8,9). Por otro lado y aprovechando el conocimiento sobre las propiedades catalticas de las enzimas, asi como su relacin con la temperatura y el pH, encontraremos con frecuencia casos en la enzimologa alimentaria en los que se promueve o se reprime la accin de enzimas propias del alimento. Las Tablas 3 y 4 ejemplifican estos casos. De igual forma, algunas enzimas han sio propuestas como parmetros indirectos de control de calidad. El ejemplo de mayor repercusin es el de la fosfatasa alcalina cuya actividad en leche de vaca es destruida como consecuencia de la pasteurizacin, por lo que la deteccin de actividad residual es sintomtico de una pasteurizacin deficiente

a-Amilasa termorresistente Papana o Am lasas fngales Lactasa de levadura Lactasa funga!

La cintica de las reacciones enzimticas ha sido objeto de mltiples publicaciones: Segel (4), Dixon (5), Roberts (6), Lpez-Mungua y Quintero (7), por citar slo algunas. La mayor parte de las reacciones pueden ser descritas por el modelo clsico de Michaelis-Menten o bien por los modelos desarrollados para desviaciones tales como reversibilidad de la reaccin, inhibicin por exceso de sustrato y/o inhibicin por alguna sustancia que con frecuencia es producto de la misma reaccin. Finalmente destacan la eficiencia cataltica y la especificidad de las enzimas. As, una enzima como la catalasa de un peso molecular de 284 000 es capaz de descomponer una pequea molcula como el perxido de hidrgeno a un ritmo de 50 000 molculas por segundo por molcula de enzima, mientras que la quimosina con tan slo hidrolizar el enlace

106 La tecnologia enzimtica

Tabi. 2 Principales aplloaoionoi aotuolei y potencale* de enzimas en alimentos. Aplicacin Enzima (origen) TaWa 2

Impacto actual en la tecnologa de alimentos 107 (Continuacin)

Enzima (origen) Pronasa (Streptomyces griseus) Papana (papaya)

Aplicacin Hidrlisis total de protenas.

a-Amilasa (Bacillus Uchenlformls B, subtilis.B. amylolique/actens) a-Amilasa (Aspergillus oryzae, A. sojae, A.effusus) -Amilasa (malta, Bacilluspofymyxa circulans, B. cereus) Pululanasa (Aerobacter aerogenes, B. cereus) Amiloglucosidasa (Aspergillus niger, A oryzae, Rhizopus delemar) Glucosa isomerasa (Streptomyces actinoplanis, S. missouriensis, S. ribigenosus, S. oUvaceus, Bacillus coagulans) Ciclodextrinaglucosil transferasa (CGTasa) (Bacillus macerans, B.megaterium, B. circulans) Dextranasa (Penicilliumfunicuhsum, P, lilacinum, C. Gracilae) oc-Galactosidasa (Mortieretta vinacea) Invertasa (Saccharomyces cerevisaie, S. carlsbergensis) Isomaltulosa sintasa (Erwinia rhapontici, P.rubrum) Proteasa (Bacillus licheniformis: alcalasa, B. subUlis: neutrasa)

Licuefaccin do almidn para obtener hldrolizados con ED 8-12. Hidrlisis de almidn residual de almidn en jugo de caa. Aditivo de cervecera. Obtencin de hidrolizados de almidn con alto contenido do maltosa. Aditivo en panadera. Obtencin de hldrolizados de almidn con alto contenido de maltosa. Hidrlisis de enlaces (ctl-6) en almidn. Enzima de desramificacin.

Ablandamiento de carne de tes. Eliminacin de la turbidez en tro de la cerveza. Medicamento auxiliar digestivo. Aditivo en panadera. Aditivos en cerveceras.

Lipoxigenasa (soya) -Glucanasas (Penicillium emersonii, Aspergillus niger, Bacillus subtilis)

Obtencin de glucosa a partir de hldrolizados de almidn con amilasa. Aditivo en la elaboracin de cerveza ligera. Obtencin de fructosa a partir de jarabes de glucosa.

Pectinasas (Aspergillus niger) Nari ginin asa (Aspergillus niger) Tanasa (Aspergillus oryzae, A niger) Renia (teera, Mucor mihei, M. pusillus, Endona parasitica) Lactasa (Aspergillus niger, A. oryzae, Kluyveromycesfragilis) Lisozima (Clara de huevo, ltex de papaya) Glucosa oxidasa (Aspergillus niger)

Extraccin y clarificacin de jugos de fruta.

Eliminacin del sabor amargo enjugo de toronja.

Aditivo en la produccin de t instantneo.

Produccin de queso.

Produccin de alfa, beta y gama cic lodextrinas, a partir de hidrolizados de almidn con amilasa.

Hidrlisis de lactosa en leche y en suero de leche.

Eliminacin de dextranas en jugo de caa de azcar.

Aditivo en leches matemizadas. Aditivo como agente antibacteriano.

Hidrlisis de latinosa en jugo de azcar de remolacha. Produccin de azcar invertido.

5'Fosfodiesterasa (Penicillium citrium)

En combinacin con catalasa en la eliminacin de glucosa en clara de huevo. Estabilizante de alimentos por eliminacin de oxgeno (mayonesa, bebidas). I Produccin de mononucletidos potenciadores del sabor a partir de ARN. Proteasa usada en la sntesis enzimtica del aspartamo. Eliminacin del sabor a "cocido" de las leches esterilizadas.

Produccin de isomaltulosa.

Termolisina,Termoasa (Bacillus thermoproteoliticum) Sulfidril oxidasa (leche)

Obtencin de hidrolizados proteicos. Hidrlisis y decoloracin de hemoglobina. Obtencin de gelatina. Modificacin de propiedades funcionales de protenas.

108 La tecnologia enzimtica

Tabla 2 (Continuacin) Tabla 2 (Continuacin)

El mercado de las enzimas 109

Enzima (origen) Lipasas (pregstricas, Mucormihei, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae) Aspartasa (E.coll) Aspartate- decarboxilasa (Pseudomonas dacunhae) Fumarasa (Brevibacteriumflavum, B. ammoniagenes) Acetamidocinamato aminohidrolasa (Corynebacterium sp.) Aminotransferasa (Paracoccus denitrificans) Fenilalanina amonio liasa (Rhodotorulaglutinis) Catalasa (Aspergillus niger) Inulinasa {Aspergillus sp., Candida pseudotropicalis, K. marxianus) Celulasas y Hemicelul asas (Trichoderma viride, T. reesei, Aspergillus niger) Antocianinasa (A. niger) Enzima maloletica (Schizosaccharomyces pombe, Leuconostoc oenos, Lactobacillus delbruekif) Aminocasas (Aspergillus oryzae)

Aplicacin Maduracin acelerada de quesos. Reacciones de interesterificacin. Aditivo en alimentos para animales domsticos. Modificacin de grasas (produccin de sustituto de cocoa). Produccin de cido mlico a partir de cido romaneo. Produccin de alanina a partir de cido asprtico. Produccin de cido mlico a partir de cido fumrico.

Enzima (origen *) Hdantonasa (hgado de ternera) Diacetil reductasa (S. cerevisiae) Limonato deshidrogenan (Pseudomonas sp., A. globiformis) Alcohol oxidasa (levadura) Pepsina, tripsina (animaT)

Aplicacin Produccin de o-aminocidos.

Eliminacin de diacetilo en cerveza. Eliminacin de amargor en ctricos (jugo de naranja) causado por la limonina.

Aplicaciones similares a la glucosa oxidasa con etanol en vez de glucosa Hidrolizados proteicos. Medicamento auxiliar digestivo. Medicamento auxiliar digestivo Propuesta como antioxidante. Eliminacin de flatulencia en soya.

Produccin de cido fenilpirvico a partir de cido acetamidocinmico.

Bromelina Superxido dismutasa (bacterias marinas) Estaquiasa (Aspergillus niger)

Produccin de fenilalanina a partir de cido fenilpirvico. Produccin de fenilalanina a partir de cido cumrico.

Remocin de perxido de hidrgeno. Hidrlisis de polmeros de fructosa (mulina) de ciertos vegetales (por ejemplo, chicorea, alcachofa de Jerusaln, agave tequero...). Hidrlisis de vegetales y residuos agrcolas. Aditivos en la alimentacin animal. Aditivos en procesos de extraccin (alginatos). Varias. Decoloracin de jugos/vino. Fermentacin secundaria del vino. cuantificar ms de 30 sustancias, algunas de ellas de importancia en el control de calidad de alimentos; por ejemplo los cidos ascrbic o, lctico, ctrico y succ nico, almidn, colesterol, lactosa, lecitina, maltosa, sorbitol, rafnosa, glucosa, fructosa, etctera.

EL MERCADO DE LAS ENZIMAS El tamao del mercado actual de las enzimas es difcil de estimar, primeramente por razones de ndole puramente comercial y tambin por el hecho de que en varios procesos las enzimas son producidas y consumidas por la misma empresa. Es el caso de los procesos enzimticos de produccin de aminocidos y de algunas compaas productoras de jarabes glucosadosy fructosados. Sin embargo puede afirmarse que la produccin y consumo de enzimas crudas crece a un ritmo de 5% anual, habindose producido SO 000 toneladas de productos enzimticos en 1985; es decir, unas 4 000 toneladas de protenas activas. El valor del mercado oscila entre los 500 y 600 millones de dlares (13). La historia de la produccin mundial de enzimas presenta un abrupto crecimiento en las ventas a finales de los sesenta, pasando de menos de 10 hasta casi 150 millones de dlares anuales, volviendo a caer slo unos aos ms tarde a casi 50 millones de dlares, para reini-ciar el crecimiento hacia finales de los setenta. Esta situacin se debe al boom que tuvieron

Resolucin de mezclas racmicas de aminocidos.

110 La tecnologia enzimtica TiblO Algunos casos en loa que II actividad enzimtici endgena oit relacionada oon el deterioro do alimentai.
U.S.A. PAI S

Potencial de las enzimas en la biotecnologa alimentaria 111

Disminucin del valor nutritivo. Por ejemplo, tiimmt (tinmlnnia), vitamina C (cido ascrbico oxidasa), piridoxal fosfato (fOftlUtflOnB).., Generacin de sabores Indeseables. Por ejemplo, xantlna oxidan (loche). Generacin de colores indeseables. Por ejemplo, pollfonol oxidasa en mitas y vegetales. Deterioro de textura, labor y color en vegetales. Perxidos. Rancidez. Lipasa en leche.
Lpez-Munguia

JAPN
DINAMARCA FRANCIA R.PJL HOLANDA INGLATERR A SUIZA OTROS

(10).

Tabla 4 Algunos casos en los que la actividad enzimatica endgena en alimentos es deseada y activada. Accin de catepsinas en el ablandamiento natural de carne durante el almacenamiento, asi como de la colagenasa. Sntesis y reaccin de a y B amilasas durante el malteado de granos para hjdrohzar el almidn de reserva. Accin de anzimas pcticas durante la maduracin. Reaccin generadora del aroma en cebolla y ajo por las alinasas. Reaccin generadora del aroma en cruciferas por isotiocianasas. Lpez-Munguia (10), Neidleman (12). ias enzimas proteolticas en el mercado de ios detergentes y su caida ante los problemas de ndole toxicolgica generados, antes de desarrollar la presentacin actual libre de polvos. Este caso ha sido ampliamente descrito por Towalski (14). En las Figuras 1 y 2 se muestra la situacin del mercado internacional, de acuerdo con los datos publicados por Eveleigh (15), Towalski y Rothman (16) y Godfrey (17). Es impactante, por un lado, el hecho de que de ms de dos mil enzimas registradas slo unas 60 sean producidas comercialmente y de stas slo cinco cubran ms del 80% del mercado. Por otro lado, puede observarse que ms de la mitad del mercado lo ocupan Dinamarca y Holanda, con las compaas Novo y Gist Brocades, respectivamente. Otras compaas de importancia son Miles Laboratories (ahora Solvay), Pfizer, Rohm and Haas, Amano, etc. En Japn, la produc-cin de enzimas es una de las reas ms avanzadas siendo prcticamente los lderes en la produccin de enzimas en medio slido. Novo Industries estableci una planta en Brasil y actualmente en Mxico la compaa Enmex produce las principales enzimas con tecnologa de Miles Lab. y Pfizer produce amilasas y proteas as. Existen disponibles a travs de representaciones comerciales enzimas de Novo, Gist-Brocades, Rohm & Haas, Amano y Genencor.

ii|iiiiiiir
O 10 20 % del mercado 30 40 50

Figura 1. Distribucin del mercado occidental de produccin de enzimas microbianas. Bl mercado de enzimas microbianas en Mxico lo estimamos en 17 millones de dlares anuales. Las importaciones totales de productos enzimticos fueron de 3.816,2.412 y 3.13 millones de dlares en 1985, 1986 y 1987, respectivamente, de acuerdo con datos de la Secretara de Comercio y Fomento Industrial. POTENOAL DE LAS ENZIMAS EN LA BIOTECNOLOGA AUMENTARA Son varios los desarrollos cientficos y tcnicos que han incidido ya en la enzimologa alimentaria y que permiten prever una expansin importante en los prximos aos. Se ha afirmado que las enzimas son "una solucin en busca de problemas" y el impacto de diversas tcnicas que ms adelante describimos depender un tanto de la habilidad de tcnicos y cientficos para encontrar nuevas aplicaciones, para mejorar los productos existentes (por ejemplo, glucosa isomerasa insensible a iones calcio, mayor conversin en la reaccin) o bien lograr el aprovechamiento integral de materias primas (por ejemplo, residuos lignocelulsicos), sin descartar la produccin de nuevas materias primas (edulcorantes, sustitutos de sal, colorantes, etc.) o la sustitucin de procesos qumicos actuales de bajo rendimiento, baja especificidad y alto costo energtico.

12 La tecnologa enzimtica Potencal de las enzimas en ia biotecnologa alimentaria 113 ENZIM proteasa fungal pactinasa amilasa fungal cuajo microbiano glucoaa isomerasa amilasa bacteriana amiloglucosidasa proteasa bacteriana III|III|IIIIIII|III|MI 0 600 Produccin, (Ton/anuales) Figura 2. Produccin mundial de enzimas. Las tcnicas a las que hemos hecho referencia, no todas necesariamente recientes, son las siguientes: * Las tcnicas convencionales de seleccin de microorganismos. * La inmovilizacin de enzimas y clulas. * La modificacin qumica de enzimas. * La bsqueda de nuevos sustratos para enzimas existentes. * Biocatalizadores de microorganismos termoflicos. * La ingeniera gentica. * Reacciones enzimticas en fase no acuosa. 100 200 300 400 500 (A. aculeatus) Pululan asa acida (B. acidopullulyticus) Fructosil transferasa (B. subititi) a-amilasa acida (B-stearothermophihis) Ligninasas (Arthobacter ap.) Varas (Formitopsis pincola, Irpex lacteus) Enzima que degrada polisacridos solubles (procesamiento de frutas y vegetales) Sacarificacin de almidn Nuevos disacridos (neosugars) Produccin de jarabes de maltosa Degradacin de cascara de cacahuate Generacin de aroma en quesos tuir hasta en un 70% (en EUA) el consumo de quimosina de origen animal (terneras), por proteas as microbianas provenientes de microorganismos aislados a principios de los sesenta. Estos son slo algunos ejemplos de cmo a travs de procesos de seleccin tradicionales se han desarrollado nuevas industrias. Sin embargo, la tendencia actual en la investigacin parece orientada a optimizar el comportamiento y extender las aplicaciones del limitado nmero de los biocatalizadores disponibles o bien a incrementar su disponibilidad por medio de la ingeniera gentica. Probablemente en el desarrollo de antibiticos, la industria farmacutica es una excepcin a esta situacin. El pas con mayor experiencia y desarrollos tecnolgicos a naves de la laboriosa seleccin de microorganismos es Japn, donde prcticamente todo proyecto de investigacin en esta rea lleva involucrado un riguroso programa de seleccin de microorganismos. En la Tabla 5, se presentan algunos ejemplos de desarrollos recientes en el aislamiento de enzimas y microorganismos con potencial de aplicacin en la industria Tabla 5 Algunos ejemplos de desarrollos recientes de biocatalizadores y microorganismos, a travs de las metodologas clsicas de aislamiento, con potencial en la industria de alimentos (18). Termolisina Sntesis de aspartamo (fi. thermoproteolyticus)

Tcnicas convencionales de seleccin de microorganismos Aunque esta primera seccin pareciera contradictoria con el contenido del texto, tiene un objetivo muy claro: resaltar la importancia de la seleccin de microorganismos en el desarrollo de biocatalizadores. Es sabido que el primer Pe/nctf/z'u/w capaz de ser usado para producir penicilina en fermentadores provena de una toronja enmohecida de Preoria, Dlinois, y que hoy da las cepas industriales producen hasta 10 000 veces ms penicilina. De igual forma el primer microorganismo productor de cefelosporinas provino de aguas negras en Sarruma. Dentro de ia industria alimentaria, en la industria quesera se ha llegado a susti-

La Inmovilizacin de enzimas y clulas La inmovilizacin de enzimas es una tcnica que alcanz su mximo desarrollo durante los setenta. El objetivo de la tcnica consiste en retener una enzima por medio de diversos mecanismos como son: atraparla en la matriz de un polmero, de un gel o de unamicrocp-sula, adherirla a un soporte slido ya sea por mecanismos de adsorcin, por intercambio inico o bien por enlace covalente entre el soporte activado y algn grupo funcional de la enzima. En todos los casos se pretende recuperar la enzima al final de la reaccin para ser