ANLISIS DE VITAMINAS

VITAMINAS LIPOSOLUBLES:

Vitamina A, Retinol Vitamina E, Tocoferol Vitamina D Colecalciferol, ergocalciferol Vitamina K, Fitoquinona Vitamina B1: Tiamina Vitamina B2: Riboflavina Vitamina B6: Pindoxal, piridoxina Vitamina B12: Cianocobalamina Niacina: Ac Nicotnico y Nicotinamida Vitamina B3 cido Flico: Vitamina B9 Biotina: Vitamina B7 o H cido Pantotenico : Vitamina B5 Vitamina C : Ac ascorbico y Dehidroascorbico

VITAMINAS HIDROSOLUBLES:

VITAMINAS EN ALIMENTOS
Segn informacin bibliogrfica existen grandes variaciones de lo reportado en fuentes. En forma general: Vitamina Hidro Vegetales Vitamina Lipo Alimento origen animal Vitamina E ( oleaginosas, aceites vegetales) diferentes

(Excepciones

Vitamina K (Espinaca Coles) y

PROPSITOS DE LA DETERMINACIN DE VITAMINAS

Etiquetado nutricional - Tablas Comp. Qumica Propsitos Legales Verificar Rotulado Inters Tecnolgico Qu ocurre en el procesamiento? CARACTERISTICAS: 1. 2. 3. 4. 5. Las vitaminas no pertenecen a un grupo especifico de compuestos Estructura compleja Diferentes entre si Existencia de vitameros ( sustancias qumicas con accin vitamnica ) Se encuentran en cantidades muy pequeas

METODOS DE ANALISIS Qumicos : Reaccin especificas de coloracin o precipitacin. No son especficos, pueden dar falsos (+) para sustancia de Estructuras qumica similar pero sin actividades vitamnica. Algunos dan buenos resultados por ejem: Vitamina C en frutas. Son mtodos Rpidos y Econmicos

Fsicos :

Medicin directa de una propiedad ptica de la solucin problema Ej: Det Vitamina A por mtodo espectrofometrico en UV a 328 mm. Medicin de una propiedad fsica de la solucin problema que se desarrolla luego del tratamiento con reactivos qumicos especficos Ej: Vitamina B1 Mtodo fluorimetrico, generalmente implican mtodos de extraccin laboriosos y largos. Se encuentran en este grupo tcnicas por HPLC GLC

Fsicos Qumicos:

Mtodos Biolgicas: Se hace midiendo la accin fisiolgica de la vitamina en animales de experimentacin en los cuales se provoca una carencia vitamnica. Poco usados en alimentos Mtodos Microbiolgicos: Se basa en que un microorganismo no puede sintetizar una vitamina, que le es esencial y la necesita para su crecimiento, el cual ser proporcional a la cantidad de vitamina introducida en ese medios de cultivos se inocula el medio que tiene el microorganismo para crecer, menos la vitamina, con la muestra de alimento; que tiene vitamina y se mide el crecimiento por la turbidez del cultivo (Nefelometra) o la valoracin que de la cantidad de cido lctico producida por el microorganismo. Necesita de estndares para realizar curva de crecimiento VS concentracin de vitaminas. Mtodos laboriosos, largos y resultados dependen de la experiencia del analista o factores que afectan a los mtodos analticos. Metodos Cromatogrficos : Se basan en la utilizacin de Cromatografa liquida o gaseosa. La gran des ventajas de estos mtodos son la determinacin simultnea de isomeros y vitameros, incluso dos vitaminas diferentes en una sola corrida por otra parte su gran desventaja son las exhaustivas etapas de extraccin y purificacin.

Factores que afectan a los mtodos analticos: 9 9 9 9 9 Presencia impurezas Presencia de sustancias oxidantes o reductoras Presencia de aditivos Realizacin de Procesos rigurosos de purificacin Empleo de estndares internos

VITAMINAS LIPOSOLUBLES
Se encuentran en la materia grasa de los alimentos, vitamina altamente sensibles a factores como O2; luz, calor, humedad, pH, procesos como secado; blanqueado, molienda y altas temperaturas producen perdida de vitaminas liposolubles. Determinacin Analtica: Etapa previa para todas Extraccin Materia Grasa Ext. Insaponificable Aplicacin de un mtodo analtico cuantitativo

Procedimiento General: 1.Ext. Materia grasa sin aplicacin de calor

2.Saponificacin con KOH/alcohol (+ antioxidantes ) para eliminar a TG y obtencin del insaponificable que se somete a 3.Extraccin de solventes como Eteretilico/Eter de Petroleo, y finalmente obtencin del Insaponificable 4.Purificacin del Insap con columnas de Al2O3 o Cromatografia en placa fina u otro mtodo 5.Anlisis cuantitativo principalmente tal Qumicos-Fsicos HPLC-GLC Microbiologa VITAMINA A : 9 Retinol 9 Retinal 9 Acido retinoico

Fuentes : Animal : (Carnes, leche , etc) Tal como Vitamina A Vegetal (Zanahoria, Repollo , tomate, espinacas, durazno)

9 Beta Caroteno (provitaminicas) , mayor porcentajes 9 Alfa y gama caroteno y Carotenal) 0.6 B-caroteno 01 UI Vitamina A (0.344 mg) Principales Fuentes: Hgado, Productos animales (leche y derivados ), vacuno, cerdo) carne (pollo, pescado,

Deficiencia: Inhibicin del crecimiento y endurecimiento del epitelio. (Sistema visual especialmente), inhibicin de funciones Biolgicas (sntesis de matabolitos), ceguera nocturna y problemas de visin.

METODOS ANALITICOS

Etapa de Ext. Previa : Extraccin de grasa, saponificacin y obtencin insaponificable )

Tcnicas analticamente propiamente tal: 1. AOAC Mtodo espectrofotometrico: Retinol reaccin con cloruro de Antimonio (SbCl3) en cloroformo Compuesto de color Azul Abs a 625 mm. 2. Caroteno: Determinacin Espectrofotrometrico calibracin con B- Caroteno . directa a 451 mm., se realiza curva de

3. HPLC: Sirve para Retinol y carotenos Se utiliza fase reserva y detector de Fluorescencia a 344 y 372 o UV a 325nm. Mtodo con alta sensibilidad capaz segn condiciones de cuantificar todos los isomeros.

Problemas: utilizacin de proceso de purificacin adecuadas, patrones estables, se debe adicionar sustancias estabilizantes (antioxidantes) como BHA , cido ascrbico y trbajr con corriente de nitrgeno.

VITAMINA E Tocoferoles Tocotrienoles

Fuentes: Aceites vegetales, margarinas, cereales, salsas, mantequilla, huevos, leche, manzanas. Funciones : antioxidantes (la oxidacin esta presente en el deterioro de tejidos, enfermedades cardiovasculares, cncer, cataratas , etc) METODOS ANALITICOS Etapas previas de extraccin y saponificacin. 1. Mtodo calorimtrico (AOAC) Tocoferol + FeCl3 produce un derivado que absorve a a 534 mm.

2. Absorcin directa a 290 mm. (concentrados y premezclados y Materias primas) 3. HPLC en fase reversa con Detector UV VIS a 292 nm y Detector de fluorescencia 290 y 330, ventajas es que es capaz de cuantificar todos los isomeros de una corrida. 4. GLC con detector de FID, con obtencin de silil derivados.

VITAMINA D D2 D3
: :

Ergocalciferol Colecalciferol

Fuentes :

Colecalciderol : Huevos, leche, carne, hgado.

Ergocalciferol : Espinacas, cereales , margarina (fortificada) Adems es sintetizada en el organismo a partir de colesterol Funciones : participa en la absorcin de calcio por los huesos , deficiencia causa raquitismo y osteomalacia. Es una vitamina altamente inestable a la luz, agua, calor , pH. METODOS ANALITICOS: Etapa previa necesita de adicion de cido ascrbico o pirogalol como antioxidante y con la utilizacin de estandares Internos (D2 o D3). 1.HPLC Utiliza etapas de extraccin previas mas una etapa llamada de clean up, (se hace pasar por pequeas columnas polares que retienen a las impurezas o interferentes ) para logra purificacin , generalmente en fase Reversa con detector UV VIS a 265nm

VITAMINA K K1 Fitoquinona (en forma natural) (K1) K2 Menaquinona (vit K sintetizada por bacterias ) K3 Menadiona solo anillo (Vit K sinttica, adicionada a alimentos)

Fuentes: Sntesis propia por flora bacteriana en intestino Alimentos: Espinacas; brcoli, lechuga, porotos verdes, Bruselas, Alimentos infantiles.

adems se fortifica a

Funciones: Es un cofactor en la cascada de la coagulacin , deficiencia (por mala absorcin o enfermedades GI o en recin nacidos )) produce hemorragias externas e internas (piel, TGI, reproductivo, etc)

MTODOS ANALITICOS Necesita de saponificacin con lipasas

1. Mtodo colorimetrico: Para Menadiona , se basa en la reaccin con dinitro fenilhidrazina que forma un complejo que absorve a a 635 mm. (especialmente en alimentos en que se adiciona vit K) 2. Mtodo espectrometrica absorcin directa a 249 mm. (para soluciones puras o materias primas)

3. HPLC: Para vitamina K1 , K2 o K3 Necesita saponificacin con lipasas y etapa de clean up y luego cromatografa en fase reversa con detector UV a 254 mm o de fluorescencia , en algunas ocasiones cromatografa semipreparativa en fase normal

VITAMINAS HIDROSOLUBLES
9 Vitaminas especialmente presente en frutas y vegetales 9 Sus mayores perdidas se producen por la eliminacin de aguas de coccin 9 Y en algunos procesos a que son sometidos los alimentos como pasteurizacin, fermentacin, salado, congelado y deshidratacin..

ETAPA COMUN DE EXTRACCION Para todas las vitaminas del Complejo B a) Aislamiento y Extraccin Hidrlisis Con HCl 0.1 N por 30 min a 100C: para liberarlo de la matriz alimentaria (celulas) b) Enzimolisis: Hidrlisis Enzimatica con diastaza Y/o beta amilasa a 45 c por 3 horas para producir la desfosforilacin de la tiamina c) Purificacin : Realizada en columnas de intercambio inico, Oxido de aluminio o o con columnas C18 para lograr eliminar interferentes.

VITAMINA B1 Tiamina o monofosfato , difosfato o pirofosfato de Tiamina

Fuentes: Cereales, leguminosas, nueces, almendras, carne de cerdo. Funciones: Co enzima de la piruvatodeshidrogenasa y transketolasas , enzimas partes del metabolismo de hidratos de carbono, aminocidos y cidos nucleicos Deficiencia: enfermedad llamada Beriberi, caracterizada por fatiga, irritabilidad, perdida de la concentracin, hipotensin, taquicardias. Importante en adultos mayores y lactantes.

METODOS ANALITICOS 1.- Medicin fluorimetrica del tiocromo Formacin del tiocromo: al extracto obtenido en la extraccin se le hace reaccionar con ferrocianuro de potasio en medio bsico, para la formacin del tiocromo (derivado fluorescente) . Debe usarse blanco que es una muestra no oxidada. 2.- Mtodo por HPLC . Esta metdica incluye las etapas de extraccin anteriormente nombradas (hidrlisis cida y enzimtica solamente) y luego cromatografa en fase reversa, con detector UV a 254nmo de fluorescencia, previa obtencin del tiocromo. VITAMINA B2 Riboflavina difosfato

Tambin se encuentra fosforilada integrando el nucletido de la enzima adenina (FAD) y Flavina (FMN

Fuentes: Leche, Queso Huevo Carne , (hgado) y

Cereales (se suplementan con vitamina B2)

Funciones: Participan y regulan procesos metablicos a nivel celular (respiracin). Deficiencia se traduce en alteraciones de las mucosas (bucales y piel ) y sistema nervioso.

METODOS ANALTICOS 1. Mtodos por determinacin Fluorimetrica directa. La riboflovina presenta fluorescencia propia , sin embargo necesita etapa de extraccin y purificacin y la medicin directa al fluorometro. 2. Mtodos por HPLC en fase reserva y detector fluorimetrico. Se necesita etapa de extraccin y purificacin. Determina B1 y B2 en forma simultanea. 3. Mtodo Microbiolgico . Se utiliza a Lactobacillus ramnosis o Leuconostoc mesenteroides. El mtodo necesita la liberacin de la riboflavina desde el FAD o FMN con hidrlisis cida o enzimticoa, se mide crecimiento por produccin de cido lctico.

VITAMINA B6 Piridoxina , Piridoxal, piridoxiamina

Funciones : Es coenzima (presente en varias enzimas del metabolismo celular)de diversas reacciones metablicas a nivel celular (sntesis de protenas (AA), respiracin etc.). Deficiencia se traduce en depresion del sistema nervioso, piel, digestivo y otros. Fuentes: Vegetales: Brcoli, coliflor, zanahorias, Frutas: Plntanos, duraznos y Cereales como arroz y trigo. Carnes Es una vitamina relativamente estable (temperatura y pH)

METODOS ANLITICOS: 1. Mtodo Microbiolgicos: Se utiliza el Saccharomyces uvarum (responde a Piridoxina y Piridoxal ) Necesita de una etapa de Hidrlisis cida y posterior extraccin con solventes, se mide turbidez. Mide Vit B6 total. 2. Mtodos por HPLC en fase reserva y detector UV a 280 mm o de fluorescencia necesita etapa de hidrlisis cida y posterior purificacin. Se necesita de estandares internos como derivados de la piridina.

VITAMINA B12 Cianocobalamina

Funciones Es una coenzima de reacciones metablicas a nivel celular, participa en la sntesis de los eritrocitos, su dficit se traduce en anemias. Fuentes : Solo alimentos origen animal (carne, huevo, leche) , adems se pierde con facilidad en tratamientos trmicos. MTODOS ANALTICOS 1. Mtodo Microbiolgico: Se utiliza el Lactobacillus Leichmanni, Necesita extraccin con tampones con agentes antioxidantes para evitar oxidacin y destruccin. Se mide turbidez. 2. Mtodo por HPLC, en fase reserva, detectar UV. Aplicable a materia primas 3. Mtodo Espectrofometrico directo a 351 mm. Tambin para materia primas o vitamina pura. En alimentos lo ms utilizado es el mtodo microbiolgico.

NIACINA o Vitamina B3

Qumicamente corresponde al cido nicotnico, nicotinamida o niacinamida Funciones : Co-enzima de los nucletidos NAD y NADP, ambas encargadas de muchas reacciones metablicas (respiracin, sntesis ATP y otras) Deficiencia: Enfermedades llamada Pelagra Fuentes: Abundante en la naturaleza, cereales, carne, leche huevos, frutas METODOS ANLITICOS: 1. Mtodo Qumico: Determinacin colorimtrica por formacin de compuesto colorado con Bromuro de Clanogeno a las 436 mm. Incluye extraccin de hidrlisis cida en caliente a 121 C. Solo (+) cido nicotnico 2. Mtodo microbiolgico: Se utiliza lactobacillus Plantarum o lactobacillus mesenteroides, para extraccin con cido en autoclave, se mide turbidez. Ambas formas 3. Mtodo por HPLC en fase reversa con detector UV. Necesita de extraccin con HCl y H2SO4 con NaOH. Determina cido nicotnico y nicotinamida.

AC FOLICO o Vitamina B9

Presente en numerosas enzimas celulares y metablicas. Su deficiencia se manifiesta como anemias en poblaciones susceptibles como son embarazadas, y adultos mayores. Su consumo adecuado se relaciona con un menor riesgo de enfermedad del tubo neural y otras manifestaciones congnitas la nacer.

Presente en legumbres, citricos, espinacas y coles. Higado.

Anlisis 1. Mtodos microbiolgicos: Microorganismo Lactobacillus ramnomsis. El mtod incluye una digestin enzimtico y luego la incubacion y determinacin de turbidez 2. Para materias primas y algunos alimentos utiliza el HPLC , en fase reversa , detector de flourescencia. , con amplias fases de extracciones con enzimas y con precolumnas purificadoras.

BIOTINA o Vitamina B7

Funciones : Co-enzima en la sntesis de cidos grasos y de aminocidos a nivel celular., deficiencia se traduce en alteraciones del sistema nervios, piel y digestivo. Fuentes: Carne, leche, pescado, huevo, cereales, arroz, trigo

METODOS ANLITICOS: 1. Mtodo Microbiolgico (ms utilizado en alimentos) Se utiliza Lactobacillus Plantarum. Necesita extraccin con hidrlisis cida a altas temperaturas y luego extraccin con solventes (bsicos) se mide turbidez 2. Mtodo por HPLC; en fase reverso con detector UV o de fluorescencia (desviacin) tambin necesita extraccin

ACIDO PANTOTENICO o Vitamina B5

Funciones : Parte de la co-enzima a que participa en el metabolizacin de Hidrato de Carbono y lpidos. Fuentes: Vitamina ampliamente difundida en todos los alimentos; carnes, vegetales, leche huevo.

METODOS ANLITICOS: 1. Mtodo Microbiolgico Se utiliza Lactobacillus Plantarum o a veces Ovarun, Necesita tratamiento enzimtico para extraccin

Sacharomyces

VITAMINA C

cido ascrbico o cido dehidroascorbico(80% actividad Vitamina C). Funciones : Su actividad se relaciona con la sntesis de muchos tejidos del organismo: ayuda a la absorcin de hierro. Interviene en reacciones metablicas Deficiencia: enfermedad escorbuto Necesidad: 50 80 mg/da Fuentes: Principalmente frutas citricas( limones, naranjas, kivis, etc) (varan mucho en contenido)

METODOS ANLITICOS: 1. Mtodos qumicos: Mtodos de oxido reduccin titulacin ) Mtodo de Tillmans Titulacin con 2,6 diclorofenolindofenol (DCFI Este reactivo (DCFI) es de color azul intenso y es reducido por el cido ascrbico a un compuesto incoloro; cuando existe exceso de DCFI la solucin se torna rosada (punto final de la titulacin) Solo determina cido ascrbico, aplicable a frutas y verduras frescas. Requiere de extraccin con cido metafosforico.

2. Metodo fluorimtrico Se derivatiza el cido dehidroascorbico (cido ascorbico se oxida a cido Dehidroascorbico) con fenildiamina (ODP) y formar un derivado que posee fluorescencia, que se mide un fluorometro.

3. Metodo espectrofotometrico Se hace reaccionar al cido dehidroascorbico ( cido absorvico u oxidado) con 2,4 dinitrofenilhidracina por dar un compuesto que absorve a 520 mm.

4. Mtodo por HPLC: En fase reversa, con detector fluorimetrico previa derivatizacin de la muestra con ODP. Ventaja: Se puede determinar por separado cido ascrbico por cido dehidro ascorbico