FAKULTET: PRIRODNO-MATEMATIKI FAKULTET KATEDRA: GENETIKA, BIOLOGIJA ELIJE I MIKROBIOLOGIJA PREDMET/KURS: BIOLOGIJA ELIJE Vjeba broj 1

Mikroskop i mikroskopiranje; Svjetlosni mikroskop; Tehnike mikroskopiranja

Biologija obuhvata irok spektar akademskih podruja koja se esto smatraju razliitim disciplinama. Ove discipline zajedno prouavaju ivot na razliitim nivoima. Molekularna biologija, biohemija i molekularna genetika su velikim dijelom preklapajude discipline koje prouavaju ivot na molekulskom i supramolekulskom nivou. ivot na nivou pojedinanih delija prouava delijska biologija. Citologija, delijska biologija je bioloka disciplina koja ima za cilj prouavanje delija. Ova prouavanja podrazumijevaju hemijske i fizike osobine delija, ivotni ciklus, delijsku diobu i smrt delije, fiziologiju i meusobnu komunikaciju delija, interakcije delija s okolinom, delijske organele. Zbog ivotnih procesa koji se odvijaju u na nivou delije, citologija danas zauzima centralno mjesto u biologiji. elija je osnovna strukturna i funkcionalna jedinica svih ivih bida. Ona predstavlja sloeni i otvoreni sistem organskih i neorganskih materija koje su u stalnoj dinamikoj ravnotei, a opstaje i odrava se sposobnodu samoregulacije. Svaka delija je izgraena od sistema membrana i ivog sadraja. elija se izuava u rasponu od jednodelijskih organizama (npr. bakterija), do specijaliziranih delija u viedelijskim organizmima (npr. ovjeku). Za postizanje to boljeg uspijeha u upoznavanju i izuavanju sastavnih dijelova delija, a naroito pojedinih organela i organizacije molekula u njima, neophodno je koristiti specijalne metode.

1. Mikroskopiranje
1.1. Mikroskop (gr. micron = malo, siduno; scopos = gledam) je instrument za posmatranje predmeta koji su previe mali da bi mogli da se vide golim okom. Istraivanje malih predmeta koristedi ovakve instrumente se naziva mikroskopija, a termin mikroskopski nosi znaenje "veoma mali", slabo vidljiv golim okom. Drugim rijeima, potreban je mikroskop kako bi bili vidljivi. Mikroskopi koje mi koristimo imaju istoriju dugu skoro 1200 godina, kada je Abbas ibn Firmas izumio optike lede (soiva). Prvi mikroskop je napravljen oko 1595. godine u Middleburgu, Holandija. Otkride mikroskopa se pripisuje trojici naunika: Hansu Lippersheyu, Hansu Janssenu i njegovom sinu Zachariasu Janssenu. Ime mikroskop je

dao Giovanni Faber 1625. godine Galilei-ovom sloenom mikroskopu, kojeg je Galileo zvao malo oko (occhiolino). Najjednostavniji tip mikroskopa, koji je ujedno i prvi izumljen, je optiki (svjetlosni) mikroskop. Ovo je optiki instrument koji sadri jednu ili vie leda koje proizvode uvedanu sliku objekta stavljenog na fokus leda. Vrlo je teko redi ko je izumio prvi mikroskop, no prvi zapisi o mikroskopu seu u 17. stoljede i veu se uz imena Robert Hooke-a i Antoni Van Leeuwenhoek-a. Levehook se koristio mikroskopm s jednom modnom konveksnom ledom i podesivim draem za objekt koji se posmatrao. S tim vrlo jednostavnim mikroskopom je mogao povedati objekte i do 500x. Takvim mikroskopom je posmatrao eritrocite, leukocite, spermatozoide, bakterije i dr. Daljnji razvoj mikroskopa iao je u smijeru dodavanja lede koja bi povedala prethodno uvedanje. Problem vedih i kvalitetnijih uvedanja uputio je na sistem soiva postavljenih u jednoj optikoj ravni. Ved samo dva odgovarajuda soiva, istina skromno i primitivno nagovjeatavaju ovaj princip kao rjeenje. Nastaje tzv. sloeni mikroskop. Izumiteljem prvog sloenog mikroskopa (s dvije lede) smatra se Robert Hooke. Pored tzv. obinog svjetlosnog mikroskopa (Slika 1) postoje i mikroskopi posebnih osobina i namjena (ultramikroskop, mikroskop s faznim kontrastom, polarizacijski, interferencijski, fluorescencijski, akustiki, konfokalni, elektronski) koji se koriste u istraivake svrhe ili za citoloke analize.

Slika 1. Optiki binokularni mikroskop

1.2. Osnovni dijelovi mikroskopa Mikroskop je graen od mehanikih i optikih dijelova (Slika 2). Mehaniki dijelovi mikroskopa su: postolje (stativ) donji dio mikroskopa koji nosi sve ostale dijelove; stalak nadovezuje se na postolje i on nosi u gornjem dijelu cijev (tubus) sa okularom i objektivom, u srednjem stolid, a sa donjim dijelom je vezan za postolje; cijev (tubus) je metalna cijev koji u svom donjem dijelu nosi objektiv, a u gornjem okular. On ima svoju fiziku i optiku duinu i one se razlikuju. Fizika iznosi oko 160

mm. Optika duina tubusa je razdaljina izmeu zadnje daljine objektiva i prednje ine daljine okulara; stolid platforma ispod objektiva na kojoj se nalazi preparat koji gledamo, istraujemo. U centru stolida postoji rupa kroz koju prolazi svjetlost prema preparatu. Stolid obino ima drae za koje privravamo staklo na kojem se nalazi prepar at (staklo je najede dimenzija 25mm sa 75mm); revolverska glava za koju se uvrduju objektivi; vijci (zavrtnji) kojima se regulie visina tubusa u odnosu na posmatrani predmet. Postoje dva zavrtnja. Veliki makrometarski (makro vijak) i mali mikrometarski (mikro vijak). Velikim se grubo postavlja tubus u blizinu samog predmeta, a onda se malim vijkom primie na potrebnu udaljenost od predmeta. Njima se vri pomijeranje tubusa ili stolida mikroskopa u cilju izotravanja slike.

U optike dijelove mikroskopa spadaju: okular cilindar koji u sebi ima dvije ili vie leda kako bi slika bila na fokusu. Okular se nalazi u gornjem dijelu mikroskopa, u samom tubusu. Okulari su zamjenjivi, te mnogi drugi okulari mogu biti ubaeni sa razliitim stepenom uvedanja. Tipini stepeni uvedanja okulara za svjetlosni mikroskop su 2x, 5x i 10x. U nekim mikroskopima jae performanse, optike konfiguracije objektiva i okulara se poklapaju sa najboljim mogudi optikim performansa uopde. Ovakvi mikroskopi najede imaju apohromatske lede; objektiv cilindar koji sadri jednu ili vie leda kako bi sakupio svjetlost sa preparata. Na donjoj strani tubusa nalazi se jedan ili vie objektiva spojenih u cirku larni dio koji se moe okretati da se izabere objektiv odgovarajudeg stepena uvedanja. Tipini stepeni uvedanja objektiva u svjetlosnom mikroskopu su 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 80x i 100x; izvor svjetlosti ispod stolida, nalazi se izvor svjetla, koja se dobija na razliite naine. Na najjednostavnijim svjetlosnim mikroskopima, svjetlo se dobija obinim ogledalom, koje reflektuje dnevnu svjetlost. Ogledalo je pokretno, s jedne strane ispupeno, a s druge udubljeno. Vedina mikroskopa ima svoj vlastiti izvor svjetlosti, koje se fokusira kroz optiki ureaj zvani kondenzator, sa filterima koji pomau pri dobijanju vede kvalitete i ravnomjernog intenziteta svjetla; kondenzor omogudava dovoljno jako i ravnomijerno osvijetljavanje predmeta. Graen je od sistema soiva i ima svoju inu daljinu. Vijcima se moe pomicati vertikalno po optikoj osi mikroskopa, sa kojom je kompatibilan, ime se vri njegovo fokusiranje. Za vedinu potreba u mikroskopiranju prednju iu kondenzora treba dovesti u ravan posmatranog predmeta; iris, zastor dijafragma, svojim promjenljivim otvorom propua odgovarajudu, maksimalnu koliinu svijetla odbijenog od mikroskopskog ogledala.

okular

veliki vijak tubus mali vijak revolverska glava objektiv stolid kondenzor stalak iris, zastor ogledalo postolje (stativ) zglob

Slika 2. Optiki (svjetlosni) mikroskop, mehaniki i optiki dijelovi mikroskopa

Za mikroskopiranje su takoer potrebni predmetno i pokrovno staklo. Na predmetno staklo se postavlja predmet koji se eli mikroskopirati. Predmet je uronjen u kap destilovane vode. Preko njih se postavlja pokrovno stakalce. Predmetno staklo je deblje, dok je pokrovno tanje i ima svoj indeks loma. Ono difrakcionom svijetlu iz posmatranog predmeta uvedava ugao pod kojim izlazi proputajudi ga u objektiv. Ono takoer utie na ukupno uvedanje mikroskopa. 1.3. U kakvom fizikom odnosu stoje okular i objektiv u tubusu? Iznad predmeta postavljen je objektiv. Predmet je postavljen uz samu ravninu prednje ie objektiva. Okular je udaljen od objektiva toliko da se slika predmeta, realna, obrnuta i uvedana objektivom, projektuje u prednju iu okulara. Okular, ovu realnu sliku predmeta, uvedanu objektivom, principom lupe, ponovo uvedava i konano virtuelno prikazuje. Budite svjesni toga da svjetlost prolazi kroz preparat, da tamo dolazi do meudjelovanja izmeu struktura u preparatu i svjetlosti, te da svjetlost koju lede mikroskopa usmjeravaju do vaeg oka, nosi informaciju koju mozak obrauje i interpretira.

1.4. Princip rada mikroskopa, stvaranje slike u mikroskopu Odbijenu svijetlost od posmatranog predmeta (objekta), odnosno minijaturnu sliku predmeta, soivo objektiva uvedava i razdvaja bliske take na njemu. Tako definisanu konanu sliku predmeta u objektivu, soivo okulara jo jedanput uvedava. Ovo je osnovni i uprodeni princip, a sve ostalo su samo sloene varijacije. Vrlo je znaajno kod mikroskopa razumjeti da nije uvedanje mikroskopa i dovoljno za dobijanje potrebne slike predmeta. Uvedanje je samo potrebno ali ne i dovoljan uslov za upotrebljivu sliku nastalu mikroskopom. Mnogo je vanija mod razdvajanja bliskih taaka promatranog objekta koju provodi objektiv. Sredna okolnost je da se povedanjem zakrivljenosti optikog sistema objektiva, odnosno uslonjavanjem njegovog sistema soiva, smanjuje ina daljina mikroskopa, pa tako jednim potezom povedavaju, i uvedanje, i mod razdvajanja objektiva. Upravo je kvaliteta objektiva presudna, jer ako u realnoj slici koju on daje, sitne pojedinosti nisu vidljive tj. razluene, okular de samo povedati sliku na kojoj se pojedinosti ne vide. To je prazno povedanje. Ukupno povedanje mikroskopa jednako je umnoku povedanja objektiva i okulara. Pu = Pok x Pob

Slika 3. Stvaranje slike u mikroskopu, pojednostavljen shematski crte

1.5. Kapacitet mikroskopa Kapacitet mikroskopa je to vedi koliko vie zadovoljava najmanje tri kriterijuma. Uvedanje mikroskopa pokazuje koliko je slika predmeta veda od predmeta koga mikroskopiramo. Na taj nain dobijamo vedu sliku posmatranog objekta.

Numerika apertura Mod razdvajanja objektiva je njegova sposobnost da daje slike dviju meusobno bliskih taaka razdvojene. to je veda apertura dobijamo jasniju i otriju sliku, tj. sliniju posmatranom objektu, odnosno vie detalja. Numerika apertura po Ernstu Abeu je proizvod indeksa loma pokrovnog stakalca i sinusa polovine ugla otvora objektiva (A = n x sin ). Greka soiva (kod optikih i mikroskopa koji sadre optike elemente) su: rasip bijele svijetlosti ili disperzija, hromatska aberacija, sferna aberacija i zakrivljenost ravnine slike. Otklanjaju se postavljanjem sistema komplementarnih soiva u objektivu i okularu. Sve ovo i jesu razlozi zato je mikroskop vrlo kompleksna sprava kod koga je jedino princip prost, a sve ostalo zahtjevno i vrlo visokog tehniko-tehnolokog nivoa. 2. Priprema i praktino mikroskopiranje Mikroskopiranje obuhvata nekoliko neizbjenih radnji. Uskladite visinu stolice prema svome tijelu, tako da bez naprezanja moete primaknuti oko okularu. Mikroskop neka bude tano ispred vas. Mikroskopirajte bez naoala, osim ako niste jako kratkovidni. U mikroskop gledajte lijevim okom a desno oko neka bude otvoreno i njime gledajte papir na kojem crtate! Priprema objekta, odnosno predmeta ili preparata za mikroskopiranje. To je sloena radnja i ovisi o vrsti preparta i namjeri posmatranja. Izuzetno se mora obratiti panja na istodu predmetnog i pokrovnog stakla, jer naroito kod vedih povedanja svaka neistoda de smetati slici posmatranog predmeta. Pripremeljen preparat izmeu stakla se postavlja na stoid i odozdo osvjetljava. Namjestite rasvjetu! 1. Primijenite najslabiji objektiv (povedanja 4x ili 10x). Okrenite objektiv prema stolidu mikroskopa uz pomod pokretnog nosaa objektiva (revolver). (uje se klik kad je objektiv u pravom poloaju.) 2. Velikim vijkom spustite tubus tako da objektiv bude udaljen priblino 1 cm od stolida mikroskopa tj. frontalne lede kondenzora. 3. Maknite predledu kondenzora. 4. Izvadite na trenutak okular i postavite ga okomito na stolid sa onom ledom na gore tj. onako kako ste ga izvadili. 5. Gledajte kroz otvor tubusa i pomiite ogledalo (njegovu ravnu stranu) dok slika sijalice ne padne u sredinu stranje lede objektiva (u sredinu vidnog polja). 6. Vratite okular u otvor tubusa (nemojte to zaboraviti, da praina ne pa da u tubus.) 7. Vidno polje mora biti jednoliko osvijetljeno!

Fokusiranje - traenje slike u mikroskopu Mikroskopiranje zaponite s najslabijim objektivom na sljededi nain:

1. Spustite paljivo tubus (velikim vijkom) tako da leda objektiva bude oko 0,5 cm udaljena od preparata. Provjerite je li rasvjeta dobro namjetena! 2. Gledajudi u okular podiite tubus (velikim vijkom) dok se u vidnom polju ne pojavi slika preparata. FOKUSIRAMO UVIJEK ODOZDO PREMA GORE! 3. Izotrite sliku predmeta, prema potrebi, malim vijkom. Pomiudi preparat odaberite mjesto koje elite mikroskopirati pomodu jaih objektiva. 4. Kad je slika fokusirana za slabiji objektiv, ona de biti u fokusu i za jae objektive. Okrenite revolver i namjestite jai objektiv (10x, 40x, ali ne najjai tj. imerzijski objektiv!), a zatim samo malim vijkom izotrite sliku. 2.1. uvanje mikroskopa Optiki, kao i mehaniki dijelovi mikroskopa su podloni vlazi, praini i ostalim neistodama. Postoje pravila po kojima se mikroskop uva i prenosi. Kd s n upotrebljava nalazi se pod zatitinim zvonom ili u specijalnoj kutiji. dino se smije podizati ako se uhvati za rukohvat predvien na njegovom stalku. Propisan je i nain odravanja istove optikih i drugih dijelova. Objektiv i okular se ne rastavljaju. Nikada se ni jedan dostupni dio soiva ne dodiruje rukom.