Diversidad bacteriana en Lquenes individuales La comunidad de organismos en cualquier hbitat est conformada por interacciones entre diversas influencias

en el tiempo. Influencias incluir las caractersticas del entorno abitico, las caractersticas de especies colonizadoras, y la trayectoria de sucesin de la comunidad s mismo, la comprensin de cmo influyen los diferentes procesos diversidad microbiana ser fundamental para traducir los principios ecolgicos a travs del rbol de la vida (13, 24). Ecologa Comunidad menudo define los hbitats de acuerdo a los parmetros del entorno fsico, por ejemplo, la temperatura o la topografa (8, 25). Sin embargo, la tarea de establecer los parmetros de un organismo ecolgico nichos de cambios cuando el hbitat es otro organismo vivo (10, 14) o mltiples especies que viven en simbiosis. Las bacterias son comnmente se encuentra dentro de simbiosis, por ejemplo, los corales (18), micorrizas (5), y lquenes (3, 7, 16). En estos ambientes, la dinmica cambiante de la propia simbiosis, como el crecimiento, de desarrollo, y las interacciones de simbiontes, pueden afectar a la comunidad encaje. Utilizamos lquenes como modelo para explorar la la diversidad de las comunidades de bacterias alojadas en toda la vida tejidos de una simbiosis.

Los lquenes son asociaciones estructuradas de un hongo y alga y proporcionar hbitats nicos para las bacterias (4). El entorno dentro del talo liquen incluye flujos continuos de nutrientes, seales qumicas, y metabolitos secundarios (11). Las comparaciones directas de la literatura emergente sobre las bacterias asociadas a liquen son difciles porque los experimentos utilizan un conjunto diverso de mtodos, pero la evidencia sugiere que las comunidades dentro de lquenes son distintas de las comunidades de sustratos adyacentes (4), y tanto la microscopa y la pirosecuenciacin sugieren que el liquen especies con diferentes morfologas casa distintivo bacteriana ensamblajes (3, 16). Comunidades de Cladonia arbuscula parecen estar dominados por Alphaproteobacteria (7), mientras que otros lquenes casa no fotosinttica cultivables de fijacin de nitrgeno Linajes Gammaproteobacteria (19) o no descrita anteriormente de Rhizobiales (17). Las actividades metablicas de las bacterias puede proporcionar un beneficio para el liquen (16), y, de hecho, la diversidad de los actinomicetos liquen ha atrado la atencin precisamente porque estas bacterias son una fuente potencial de novela pequea molculas (15) que pueden beneficiar a la investigacin farmacutica (9, 27). Hemos probado si las comunidades bacterianas tambin estn determinadas por los diferentes ambientes abiticos y biticos encuentran en todo el talo de los lquenes de las personas y si las comunidades bacterianas de estrechamente relacionados y lquenes morfolgicamente similares creciente en una sola superficie son distintas. Las especies objetivo en el gnero Xanthoparmelia; X. plittii y X. somloe nsis tiene diferente secundaria qumicas (X. plittii contiene cido stictic en su interiorcapa, mientras que X. somloe nsis contiene cido salazinic), pero comparten folioso muy similar (o, en forma de hoja plana) morfologas (6). En estos Xanthoparmelia lquenes, el centro del talo es la parte ms antigua del individuo (Fig. 1) y parece crecer como combinacin de tejidos y la regeneracin de originales; los bordes de los lquenes son el crecimiento reciente.

Mdulos Centro han estado expuestos a la temperatura ambiente, las bacterias colonizadoras para un perodo de tiempo tiempo que los mdulos de ltima generacin. Tambin puede haber qumica y diferencias fsicas entre los diferentes lugares, centros pueden ser ms propensas a fragmentarse, y los datos de, por ejemplo, Cetraria islandica sugieren que las concentraciones de nitrgeno son significativamente reducir en fragmentos mayores (21). En el lquenes Xanthoparmelia probamos, los centros ubicados nmeros densas de columnshaped estructuras reproductivas denominan isidia, mientras que los bordes carecido isidia y eran por lo tanto plana. En 2009, cortamos 43 fragmentos de transectos establecidos en nueve macrolquenes encontrar en una sola lpida en el Cementerio del Norte, Petersham, MA. Las muestras fueron caracterizadas como "centro", "intermedias o bordes." Hemos estado siguiendo el crecimiento de estas personas desde el ao 2006 y pueden documentar que los fragmentos ahora se considera "intermedio", fueron "borde", o an no haba crecido, en 2006 (Fig. 1). En contraste, los datos de tasa de crecimiento sugieren que los centros de los lquenes ms antiguas de nuestro estudio son al menos 10 aos de edad (A. Pringle, datos no publicados). Despus de la extraccin de ADN a partir de muestras sin lavar y amplificacin del gen del ARNr 16S bacteriano, restriccin terminales anlisis de polimorfismo de longitud de los fragmentos (RFLP-T) se utiliz para obtener perfiles de comunidades bacterianas en cada una de las muestras de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente (22), excepto 35 Ciclos de PCR se utilizaron para obtener suficiente producto para T RFLP anlisis . ( Dos borde , seis intermedio y dos muestras del centro no proporcionar suficientes datos para el anlisis , muy probablemente debido a inhibidores de la PCR del medio ambiente ; se descartaron estas muestras ) . A continuacin utiliza la secuencia 454 de los genes 16S en cuatro de los muestras ( dos muestras de centro y las muestras de borde correspondientes ) para corroborar las tendencias observadas diversidad taxonmica e identificar afiliaciones de bacterias ; bacteriana etiqueta codificada FLX Titanium - amplicn pirosecuenciacin ( bTEFAP ) se realiz por Investigacin y Laboratorios de Ensayo (RTL , Lubbock, TX ) de acuerdo a RTL protocolos descritos previamente ( 23 ) . Documento de datos disminuyendo la riqueza de especies de bacterias del centro a los bordes de un talo liquen ( fig. 2 ) . Se utiliz por primera vez el nmero de T -RFLP fragmentos como sustituto de la riqueza de especies ; niveles de fluorescencia totales no difiri significativamente entre los tres localidades (media total de los niveles de fluorescencia : muestras del centro , 176,627.9 ; muestras intermedias , 190,822.3 , muestras del borde, 235,716.6 ; pruebas t arrojaron valores de p de 0,15 para el borde aloja centro , 0,26 para el borde frente intermedia y 0,55 para el intermedio frente al centro). Muestras centros individuales son significativamente ms diverso que muestras borde individuales (valores medios : Centro , 31.9 , de nivel intermedio , 24,1 ; borde , 17,5 ; t21 ? 3,48 , P de dos colas ? 0.002 para las muestras de borde contra muestras del centro ) , una tendencia que corrobora por los datos 454 (Fig. 2 , vase ms adelante ) . Un anlisis de dos vas de varianza ( ANOVA ) (Stata versin 10 ; StataCorp LP , Colegio Station, TX ) de los datos de T-RFLP confirma ubicacin como una significativa predictor de la riqueza de especies de bacterias , an controlando

para especies de lquenes , la inversa no es verdad ( Tabla 1 ) . Las comunidades bacterianas de los centros de lquenes se agrupan , mientras que las muestras de los bordes son ms dispares ( fig. 3 ) . no mtricos la ordenacin de escalamiento multidimensional ( SNM) es una tcnica diseada para visualizar las diferencias en la composicin de la comunidad dentro de un espacio de dos dimensiones : pairwise distancias entre los perfiles de T-RFLP de las 33 muestras se calcularon como distancia matriz D con elementos de acuerdo con la ecuacin Dij? (1? QSij), donde QSij es la similitud cociente Srensen para las muestras ith y j-simo (26), y un multirrespuesta permutacin procedimiento (MRPP con el peso de cada grupo i igual a wi? NI /? Ni, donde ni es el nmero de muestras en el grupo i) era utilizado para evaluar el grado de agrupamiento (PC-Ord versin 5; MJM Software). Cuando las muestras se agruparon segn la ubicacin en la lquenes, el azarcorrigi intragrupal acuerdo (A) fue 0.039 (P? 0,008), donde los valores positivos de A indican ms agrupar por grupos de lo esperado por azar, hasta un mximo Un valor de 1 si todas las comunidades fueron idnticas dentro de cada grupo. Cuando las comunidades bacterianas fueron agrupados por lquenes especies, A fue 0,02 (P? 0,015). Los valores pequeos de A son comunes para los datos ecolgicos, y la interpretacin de estas estadsticas es sujeto a la permutacin de distribucin de A (20). MRPP mayo dar un valor bajo P incluso cuando la agrupacin se ha limitado ecolgica importancia, aunque esta tendencia se asocia ms comnmente con muestras de mayor tamao. En nuestros datos, la inspeccin visual de los los resultados NMS (Fig. 3) sugiere que intermedio y el centro muestras ocupan un espacio ecolgico diferente de puntos de borde sino que las diferencias entre las distribuciones de muestras de diferentes especies de lquenes pueden ser menos relevante ecolgicamente. La diversidad entre las muestras, tal como se mide por multivariante dispersiones ( 2 ) , fue significativamente mayor en el grupo de muestras de borde que dentro de los grupos de ya sea intermedio o muestras del centro . La diversidad beta fue descrito por una vez calcular D y a continuacin, siguiendo el mtodo descrito por Anderson ( 1 ) . Se asign a cada muestra un punto en una multidimensional Espacio euclidiano y realiz un solo sentido ANOVA de las distancias de cada punto a su centroide grupo. Las pruebas se llevaron a cabo en R (versin 2.12.0 , R Foundation Estadstica Informtica [ http://www.R-project.org/ ] ) utilizando vegan (modificado por nosotros desde la versin 1,17-4 [ http://CRAN.R project.org/package ? vegan ] ) . Distancias fueron significativamente diferentes en todos los tres grupos ( F2 , 30 8,29 , P 0.002 ? ? ) ; pairwise dos colas pruebas t confirman diferencias significativas entre dispersiones de borde y los grupos intermedios ( t24 ? 3,02 , P ? 0,006 ) y los grupos de borde y el centro ( t21 ? 3,67 , P ? 0,001 ) , pero no entre los grupos intermedio y central ( t15 ? 0,90 , P ? 0,38 ) . Comunidades en los bordes de liquen parece ser ms variable de los conjuntos ms uniformes del centro liquen . Las tendencias se analizan an ms el uso de la secuencia 454 de un solo centro y fragmentos de borde de cada una de dos X. plittii lquenes . Despus de desechar todas las secuencias se encuentran slo una vez dentro de la base de datos global, la eliminacin de las quimeras con ChimeraSlayer ( Amplio Institute, Cambridge , MA [ http://microbiomeutil.sourceforge.net / # A_CS ] ) , y la eliminacin de secuencias clasificadas como cloroplastos por el Ribosomal Database Project (RDP ) clasificador (Michigan Universidad del Estado de [ http://rdp.cme.msu.edu/ ] ) , la riqueza de taxa fue estimado mediante el clculo del ndice de cada uno de los cuatro Chao1

muestras en RDP . Cuando las unidades taxonmicas operacionales ( UTO ) se definieron en un 97 % de similitud ( aproximadamente equivalente a " especies ") , muestras centro aparecieron significativamente ms rico en especies que las muestras de borde (media Chao1 ndices : muestras del centro , 139.4 ; muestras de borde, 63,5 ; P ? 0,002 ) (Fig. 2 ) , lo que corrobora la TRFLP . La diferencia entre el borde y el centro muestras tambin fue significativa cuando Otus se definieron por cualquier nivel de similitud entre 85 y 100 % . El ndice de Shannon diversidad de especies mide la uniformidad , o la abundancia relativa, de las especies , as como la riqueza , y tambin se calcul en RDP ; la diferencia entre las medias de centro y el borde de muestras importancia acercado (media ndices de Shannon: a travs del centro muestras, 3.7, a travs de muestras de borde, 2,9, P? 0.076). Los patrones de abundancia bacteriana se analizaron mediante la clasificacin las secuencias con el PDR clasificador (fig. 4). Muchas secuencias permaneci sin identificar; cualquier secuencia no identific a la orden en el nivel de confianza del 60% se asign a la "inclasificable" categora. Todas las muestras fueron abrumadoramente dominados por Proteobacteria y Acidobacteria. El Acidobacteria eran miembros de Gp1 Acidobacteria y compuesto por una significativa mayor proporcin de centro frente borde comunidades . El Proteobacteria fueron dominados por Alphaproteobacteria . Casi todos los de las secuencias dentro de la Alphaproteobacteria pertenecan a las rdenes Sphingomonadales , Rhodospirillales y Rhizobiales . Aunque est claro que los diferentes grupos de bacterias no se distribuyen uniformemente a travs del centro y el borde de hbitats , la gran parte de las bacterias clasificadas impide definitiva conclusiones sobre las diferencias en los taxones proteobacterial dominante entre los centros y los bordes ( ver el material complementario para una tabla que muestra los resultados de BLASTN para inclasificable representante secuencias ). Ya sea que estas bacterias no clasificados representan nuevos linajes que queda por determinar. En conjunto , los datos sugieren que los centros de individuo lquenes casa tanto un mayor nmero de especies bacterianas y comunidades ms consistentes . En contraste, los bordes son especies pobres y las comunidades bacterianas de diferentes bordes son ms variable. Centros de Liquen han sido expuestos a dispersar las bacterias para perodos ms largos de tiempo , tal vez lo que permite una mayor subconjunto de colonizadores ambiente de establecer. Los patrones pueden tambin indicar algo as como una comunidad clmax se forma en el piezas centrales de talos individuales , mientras que los bordes casa morerandom ensambles . El mecanismo para este efecto no est claro ; Sin embargo , la similitud entre el centro y las muestras intermedias tanto en la riqueza y composicin de especies sugiere que la contraste fsico del centro de liquen isidiate , en comparacin con la bordes planos , tambin pueden ser importantes en la determinacin bacteriana composicin de la comunidad . El centro de la ms gruesa de un liquen tiene ms biomasa por unidad de rea y por lo tanto ms hbitat disponible; el isidia verticales tambin puede darse el lujo ms nichos ecolgicos por creando gradientes de luz y humedad disponible . Diferencias en la qumica secundaria de mdulos de centro y borde Tambin puede afectar a las comunidades bacterianas , aunque no est claro si las bacterias entran en contacto directo con el secundario metabolitos . Las diferencias precisas en parmetros abiticos y biticos a travs de un liquen y la influencia relativa de estos parmetros , limitacin de la dispersin , y la sucesin de la comunidad deben ser

aclararn con la investigacin adicional tanto en el liquen fisiologa y funciones bacterianas y adaptaciones . Sin embargo, como los datos hacen que las comunidades bacterianas claras, dentro de un liquen no son estticos y en su lugar estn sujetos a los efectos de los procesos ecolgicos operar en escalas pequeas . Los lquenes se han conceptualizado como ecosistemas autnomos ( 12 ) . Los organismos que crece dentro de estos hbitats forman comunidades que , como las plantas sometidas a sucesin en las dunas de arena del lago Michigan ( 8 ) , parece montar predecible en respuesta a una confluencia de variables , incluyendo caractersticas de las simbiosis en la que estn alojados .