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1136-4815/06/48-52 ALIMENTACION, NUTRICION Y SALUD Copyright 2006 INSTITUTO DANONE

ALIM. NUTRI. SALUD Vol. 13, N. 2, pp. 48-52, 2006

Probiticos: aspectos microbiolgicos y tecnolgicos

D. Ramn Vidal
DEPARTAMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA Y SALUD PBLICA, CIENCIA DE LOS ALIMENTOS, TOXICOLOGA Y MEDICINA LEGAL. FACULTAD DE FARMACIA. UNIVERSITAT DE VALENCIA BURJASSOT, VALENCIA. DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGA. INSTITUTO DE AGROQUMICA Y TECNOLOGA DE ALIMENTO-CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTFICAS. DEPARTAMENTO DE I+D, BIPOLIS S.L. VALENCIA

RESUMEN

ABSTRACT

urante los ltimos aos las ventas de probiticos han aumentado notoriamente en muchos pases. Su produccin industrial exige la bsqueda del microorganismo y su validacin cientfica, la optimizacin de su produccin industrial, la formulacin del alimento adicionado del probitico y su validacin clnica. El futuro de la investigacin con probiticos vendr marcado por el empleo de las nuevas tecnologas micas. Palabras clave: Probitico. Validacin. Produccin.

uring the last few years, sales of probiotics have been increased in many countries. The industrial production of these microorganisms includes the search for the probiotic and its scientific validation, the optimization of its industrial production, the formulation of the probiotic food or beverage and finally its clinical validation. Future trends in probiotic research will be based on the use of the new omic technologies. Key words: Probiotic. Validation. Production.

QU ES UN PROBITICO? Durante siglos las bacterias cido lcticas se han usado empricamente como forma de preservar y mejorar la calidad de los alimentos fermentados. Desde hace unos pocos aos se acumulan muchas evidencias cientficas que indican que el consumo sistemtico de algunas de ellas afecta a la composicin de la microflora del tracto gastrointestinal del individuo que las ingiere. Como consecuencia se produce un efecto beneficioso en su salud. Durante ms tiempo del deseable muchas de estas afirmaciones se basaban en evidencias in vitro o estudios preclnicos con animales de experimentacin, pero en los ltimos aos se han acumulado evidencias cientficas en experimentacin clnica con voluntarios humanos (Tabla I) que nos permiten afirmar que algunas de estas bacterias tienen un efecto positivo sobre algunas patologas clnicas en humanos (1). En
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muchos pases desarrollados se ha disparado el consumo de alimentos adicionados con estos microorganismos como una forma de prevenir la aparicin de determinadas enfermedades o mejorar el estado general de salud del consumidor. A este tipo de microorganismos los denominamos probiticos. Existen muchas definiciones de probitico. En general, considerando lo propuesto en su da por ILSI, FAO y OMS podemos entender por probitico un suplemento alimentario compuesto por microorganismos viables que tienen una influencia beneficiosa sobre la salud del consumidor. En esta definicin se hace preciso considerar que dicha influencia es especfica de cepa, debe producirse con la ingesta en cantidad usual del alimento y debe ser demostrada por medio de una experimentacin cientfica rigurosa. Aunque atenindose a este concepto de probitico hay muchos microorganismos que pueden serlo, los que se comercializan son fundamentalmente bacterias cido lcticas (Tabla II). De hecho, casi todos

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Vol. 13, N. 2, 2006 TABLA I

PROBITICOS: ASPECTOS MICROBIOLGICOS Y TECNOLGICOS

ALGUNAS PATOLOGAS EN LAS QUE SE DISPONE DE ALGN ENSAYO CLNICO CON PROBITICOS CON EFECTO POSITIVO

Patologa Colitis ulcerosa Dermatitis atpica Diarrea asociada a Clostridium difficile Diarrea asociada al consumo de antibiticos Diarrea infantil Diarrea de los viajeros Enfermedad de Crohn Pouchitis Sndrome de colon irritable Vaginitis
Confeccionada con los datos descritos en 1.

TABLA II ALGUNOS MICROORGANISMOS IDENTIFICADOS COMO PROBITICOS

Grupo microbiano Bifidobacterias

Especie Bifidobacterium adolescentis Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bifidobacterium bifidum Bifidobacterium brevis Bifidobacterium infantis Bifidobacterium longum Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Lactobacillus acidophilus Lactobacillus amylovorus Lactobacillus casei Lactobacillus crispatus Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Lactobacillus fermentum Lactobacillus gallinarum Lactobacillus gasseri Lactobacillus helveticus Lactobacillus johnsonii Lactobacillus paracasei Lactobacillus plantarum Lactobacillus reuteri Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus salivarius Lactococcus lactis subsp. lactis Saccharomyces boulardii

los probiticos comerciales estn compuestos por clulas viables de bacterias cido lcticas pertenecientes a los gneros Bifidobacterium y Lactobacillus. Las bacterias utilizadas con mayor frecuencia como probiticos son distintas cepas de las especies Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus johnsonii y Lactobacillus rhamnosus. Aunque existe mucha confusin sobre la taxonoma de algunas de estas cepas, como sucede en otros procesos industriales, dicha confusin obedece en ms ocasiones a intereses comerciales que a cuestiones cientficas. Hay muchos productos alimentarios que contienen probiticos y estn autorizados para la comercializacin. Para tener una idea del potencial de mercado de estos productos, baste recordar que en el ao 1998 se manejaban datos de ventas elevados en Alemania (60 millones de dlares), Holanda (30 millones de dlares), Francia (28 millones de dlares), Espaa (24 millones de dlares) y Reino Unido (14 millones de dlares) y que slo en el ltimo de estos pases, en el ao 2002 esta cifra haba aumentado hasta 676 millones de dlares (2,3). En alimentacin convencional los derivados lcteos como el yogur, el queso, los helados o la mantequilla son el vehculo ms utilizado para comercializar probiticos aunque existen otros como las leches de soja, mayonesa, zumos e incluso carnes, cacahuetes o sopas. Aun as se hace necesario recordar que buena parte de la produccin mundial de probiticos se vende en forma de suplementos nutricionales, particularmente en Estados Unidos.

Enterococos Lactobacilos

CMO PRODUCIR UN ALIMENTO CON UN PROBITICO? Aunque a todos nos parece familiar el consumo de este tipo de productos, con frecuencia desconocemos todos los pasos de investigacin y desarrollo que hay que llevar a cabo para poder formular el alimento adicionado del probitico. Estos pasos incluyen la bsqueda del microorganismo y su validacin cientfica, la optimizacin de su produccin industrial, la formulacin del alimento adicionado del probitico y su validacin clnica. Dado el elevado coste de los ensayos clnicos en humanos, ninguna empresa del sector asume este tipo de investigacin hasta estar seguros de ser capaces de disponer de un microorganismo que tenga unas determinadas propiedades funcionales in vitro se pueda producir de forma estable y sea viable en la matriz alimentaria a la que se va a aadir. En cuanto a la bsqueda del probitico, se recomienda partir de muestras biolgicas humanas (fundamentalmente heces) provenientes de individuos sa49

Lactococos Levaduras

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nos. Se suelen seguir estrategias de enriquecimiento haciendo cultivos en medios a pH cido adicionados de sales biliares. De esta forma se seleccionan cepas que posteriormente sean capaces de resistir las condiciones extremas del tracto digestivo y puedan por lo tanto ejercer una accin positiva sobre la salud del consumidor. Las cepas seleccionadas se someten a una caracterizacin taxonmica exhaustiva, combinando propiedades fenotpicas con caractersticas genticas. Es importante definir una huella gentica de la cepa que permita posteriormente identificarla a objeto de proteccin jurdica. Adems se evala la resistencia al pH cido y a las sales biliares y tambin se estudia su capacidad de adherencia a mucus intestinal, se analiza su perfil de resistencia a antibiticos y la posible produccin de determinados metabolitos indeseados. A todo ello se suman estudios bioqumicos y fisiolgicos in vitro e in vivo con animales de experimentacin que permitan definir las bases moleculares de la actuacin del probitico en la patologa o funcin fisiolgica objeto de estudio. Este hecho es uno de los requisitos de la nueva reglamentacin sobre alegaciones funcionales. Optimizar la produccin industrial de un probitico no es tarea fcil. Cada cepa tiene un comportamiento diferencial, lo que obliga a definir los parmetros de crecimiento (medio de cultivo, temperatura, agitacin, oxigenacin, fase de crecimiento) y conservacin (fase de cultivo para la recogida, tipo de secado, crioprotector, temperatura de almacenamiento) para cada nuevo probitico. A pesar de su precio, se suelen utilizar medios complejos como los denominados BFM, MRS o TPY (4). En el caso de las bifidobacterias y Lb. acidophilus, dada su baja actividad proteoltica se suelen aadir al medio aminocidos, extracto de levadura o hidrolizados de casena (5,6). Se optimiza el inculo inicial, la temperatura y, si se trabaja en feed-batch, el rgimen de alimentacin del nutriente limitante. Suele ser crtica la aireacin y en consecuencia el potencial redox, por lo que se suele crecer el microorganismo en un ambiente anaerobio. En ocasiones es adecuado aadir algunos compuestos con actividad antioxidante como el cido ascrbico o la L-cistena (7,8). En cualquier caso, esta fase de produccin del probitico debe ir ligada a la siguiente que se refiere a su conservacin. En este sentido, la liofilizacin suele ser el mtodo ms conveniente. Para optimizar esta fase se analiza la fase de cultivo en la que recoger la biomasa (fase logartmica versus fase estacionaria), se ensayan diferentes crioprotectores y su efecto sobre la viabilidad del microorganismo, la textura del probitico desecado y su influencia organolptica en el alimento final. Con todo ello se estudian distintas temperaturas de almacenamiento y se define la vida til del probitico como ingrediente alimentario en las condiciones subptimas de almacenamiento. Finalmente hay que escoger la matriz alimentaria a la que aadir el probitico. Una vez seleccionada hay
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que asegurar la dispersin homognea del mismo en el seno del alimento. Este trabajo es ms sencillo al trabajar con bebidas que con alimentos slidos donde se hace necesario afinar las operaciones unitarias de mezcla. Sin duda, en esta fase lo ms importante es definir la concentracin del probitico en el alimento o bebida final. Dicha concentracin debe ser un compromiso entre la dosis efectiva diaria de probitico y la ingesta usual diaria del alimento. A ttulo orientativo, la Federacin Internacional de Lechera o la Asociacin Japonesa para los Derivados Lcteos recomiendan 107 ufc/ml en matrices lquidas. En el caso de alimentos slidos los expertos sugieren cifras en torno a las 109 ufc/g. El problema es que las distintas matrices alimentarias pueden afectar diferencialmente a la viabilidad de un mismo probitico. Para conocer este efecto se analiza la supervivencia del probitico almacenando el alimento en las condiciones de venta. En estos trabajos hay que considerar entre otros la influencia del pH, el oxgeno o el tipo de envase. Se han descrito casos de grandes prdidas de viabilidad (menos de 103 ufc/ml o 106 ufc/g en el alimento final) que invalidaran el efecto funcional (9). Es un problema especialmente grave en el caso de alimentos con larga vida til (papillas infantiles) y tambin con determinados probiticos (bifidobacterias). Una de las formas de evitarlo es acudir a la microencapsulacin del probitico. En este sentido se ha descrito la microencapsulacin en lpidos como una estrategia de mejora de la vida til tras tratamientos trmicos y tambin el empleo de gelatina, gomas vegetales o geles de alginato como materiales de encapsulacin que podran incluso proteger al probitico de las condiciones extremas de acidez del tracto digestivo tras la ingesta (10,11).

LTIMOS PASOS: EVALUACIN CLNICA Y REQUISITOS LEGALES

Como antes se indic, el nuevo reglamento europeo sobre alegaciones funcionales exigir conocer las bases moleculares de la alegacin funcional asociada al probitico, pero tambin obligar a demostrar su efecto en al menos dos ensayos clnicos en hospitales diferentes. Para llevar a cabo este tipo de experimentacin clnica se recomienda seguir las directrices del grupo de expertos FAO/OMS que en el ao 2001 se reunieron en la ciudad argentina de Crdoba (12). En esencia, estas recomendaciones sugieren una dinmica de evaluacin comparable a la que se lleva a cabo con frmacos aunque con una exigencia menor. Es importante destacar que las evaluaciones clnicas siempre se deben llevar a cabo con el alimento final adicionado con el probitico y no con el probitico aislado. Como en el caso de las evaluaciones de frmacos se habla de distintas fases.

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La llamada fase I, o fase de evaluacin de la seguridad, implica un trabajo previo de determinacin del perfil de resistencia a antibiticos del probitico, la ausencia de produccin de compuestos indeseados y, a ser posible, su estatus GRAS. Si el desarrollo del producto se ha llevado a cabo de forma racional, buena parte de este trabajo ya habr sido abordado durante la seleccin del probitico (vide supra). La fase II, o fase de evaluacin de la eficacia, conlleva los ensayos en voluntarios humanos informados. Deben ser ensayos al azar a doble ciego y con un control de placebo. Como antes indicamos, se recomienda llevar a cabo al menos dos ensayos en centros clnicos independientes. La fase III o fase de evaluacin de la efectividad es opcional. Consiste en comparar la efectividad del probitico con la ejercida por un producto comparable (otro probitico previamente comercializado o un frmaco). En la medida de lo posible conviene llevar a cabo estas evaluaciones en poblaciones sanas. Como antes se indic, el coste de este tipo de evaluaciones implica que las empresas del sector no abordan su ejecucin hasta tener una completa seguridad de la validez tecnolgica del probitico. Superadas todas estas evaluaciones se llega a la comercializacin del alimento adicionado con el probitico. En la actualidad en la Unin Europea (UE) se comercializan muchos productos con probiticos. Con ms frecuencia de la deseada en su publicidad existe un marketing demasiado agresivo y se hace uso de alegaciones funcionales que no se corresponden con la experimentacin preclnica y clnica abordada para esa cepa concreta. En la UE no existe una definicin legal ni una legislacin sobre probiticos pero existe una serie de legislaciones horizontales que las empresas productoras deben tomar en consideracin (13). La primera de ellas es el reglamento de nuevos alimentos. El listado de categoras de nuevos alimentos incluidos en esta reglamentacin incluye un apartado para ingredientes alimentarios que sean o consistan en microorganismos. Una interpretacin razonada de este requisito implicara reconocer como nuevo alimento cualquier nuevo probitico. Sin embargo, a pesar de haberse presentado desde el ao 1997 un total de 53 aplicaciones de nuevo alimento, ninguna ha hecho referencia a un nuevo probitico. La segunda es la regulacin sobre produccin orgnica que limita el empleo del trmino bio o eco para los productos de la agricultura ecolgica. La falta de base cientfica para tal decisin slo puede ser explicada por los intereses econmicos y las presiones polticas que la promovieron. Lo bien cierto es que un producto que contenga un probitico no podr usar esta terminologa a menos que se haya elaborado siguiendo las directrices de la agricultura ecolgica. El resto de normativas horizontales que afectarn a la comercializacin de probiticos en la UE an no estn en vigor. Son el anteriormente mencionado reglamento sobre alegaciones funcionales y la propuesta de la Comisin para la regulacin del yogur y los productos similares al yogur. Sin duda, su aprobacin marcar pautas de comercializa-

cin y etiquetado de los alimentos con probiticos, sobre todo el primero de ellos que pretende que: a) la evaluacin cientfica sea el nico motor del desarrollo de alimentos funcionales; b) las alegaciones funcionales se basen en pruebas fundadas, objetivas y apropiadas; c) las pruebas se sustenten en exigencias cientficas en vigor; y d) las alegaciones sean verdaderas y no induzcan al error al consumidor.

EL FUTURO El futuro de la investigacin en probiticos vendr de la mano de las nuevas tecnologas micas. Debemos incrementar nuestro conocimiento sobre la ecologa microbiana del tracto gastrointestinal para, de esa forma, desarrollar probiticos ms eficaces. En este sentido es interesante destacar el comienzo de algunos proyectos de metagenmica de bacterias de la cavidad bucal y el tracto gastrointestinal (14). A ello habr que sumar los estudios de secuenciacin de genomas de probiticos. En la fecha de redaccin de este artculo hay secuencia pblica del genoma de tres cepas probiticas (B. longum NCC2705, Lb. johnsonii NCC533 y Lb. plantarum WCFS1) aunque existen proyectos en marcha de otras muchas ms (15). La informacin que de ellas obtengamos, unida a estudios de transcriptmica y protemica, ser la base de los probiticos de la prxima dcada. Llegados a este punto conviene recordar que ya se han desarrollado los primeros probiticos transgnicos. Se han diseado cepas transgnicas de Lactococcus lactis que expresan el gen de la subunidad B de la toxina tetnica (16) o genes de interleuquinas (17) y tambin cepas transgnicas de Lactobacillus que producen antgenos capsulares de rotavirus (18). La poca receptividad de los consumidores europeos a este tipo de productos dificulta su desarrollo aunque nadie duda de su valor en algunos pases en vas de desarrollo. Desde la UE, con la barriga llena, es fcil decir no a estos desarrollos que solventan problemas sanitarios que no afectan a nuestra sociedad. La pregunta clave es: aceptara un consumidor europeo un probitico transgnico eficaz contra la enfermedad celiaca? Quizs en este caso la respuesta fuera otra. Lo que es probable es que ese desarrollo marcara un antes y un despus de la investigacin con probiticos

CORRESPONDENCIA: Daniel Ramn Vidal Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pblica, Ciencia de los Alimentos, Toxicologa y Medicina Legal Facultad de Farmacia Universitat de Valencia Avda. Vicent Andrs Estells, s/n 46100 Burjassot, Valencia e-mail: daniel.ramon@uv.es

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