Prctica # 7 Protenas 1.- Objetivos Determinar las propiedades qumicas de las protenas.

Realizar las pruebas de identificacin de protenas Obtener el punto isocrtico de la casena.

2.- Resumen Se determinaron las caractersticas qumicas de algunas protenas de inters comercial como las que son la albmina, gelatina y casena, mediante pruebas de anlisis elemental que indicaron la presencia de carbono, hidrgeno, nitrgeno y azufre; al igual que pruebas de reactividad qumica que demostraron la presencia de anillos aromticos, enlace peptdico, triptfano y grupos funcionales. Se determin tambin el carcter anfotrico de las protenas y el punto isoelctrico de la casena. Se encontr que la casena fue la protena con mayor reactividad gracias a que es la ms completa y que el punto isocrtico de la misma se encuentra en 4,7 unidades de pH que comparado con el valor terico de 4,6 posee un error porcentual del 2,2 % 3.- Introduccin Las protenas son molculas formadas por cadenas lineales de aminocidos mediante enlaces peptdicos. Se clasifican en protenas simples, que por hidrlisis dan solo aminocidos o sus derivados; protenas conjugadas, que por hidrlisis dan aminocidos acompaados de sustancias diversas, y protenas derivadas, sustancias formadas por desnaturalizacin y desdoblamiento de las anteriores. Por otro lado cabe destacar la importancia de las protenas para la vida sobre todo porque constituyen el 80 % del protoplasma deshidratado de toda clula, as como tambin cumplen funciones biorreguladoras y de defensa. Desempean un papel importante en el crecimiento del organismo tanto estructural, inmunolgico as como enzimtico. Las protenas se sintetizan dependiendo de cmo se encuentren regulados los genes que las codifican. Por lo tanto, son susceptibles a seales o factores externos. Todas las protenas contienen en su estructura carbono, hidrgeno y nitrgeno. En general presentan un contenido de nitrgeno del 16%, es decir que por cada 6,25 gramos de protena existe un gramo de nitrgeno. Por lo tanto se utiliza el factor de 6,25 para estimar la cantidad de protena en una muestra a partir de la medicin de nitrgeno en la misma 4.- Parte Experimental Materiales y equipo:

Tubos de ensayo de 13 y 18 mm Pinza para tubo de ensayo Mechero Placa de toque

Vasos de precipitacin Reverbero Baln aforado de 25ml Papel filtro Papel tornasol

Reactivos: - Albmina - Gelatina - Casena - Agua - Sosa-cal - HCl 6N - Acetato de plomo 0,1M - NaOH 6 N - NaOH 10% - Carbonato de sodio 0,5% - HCl 0,2% - Reactivo de Milln 4.- Procedimiento ANLISIS ELEMENTAL

cido ntrico concentrado Reactivo de biuret Reactivo de hopkins-cole cido sulfrico concentrado Ninhidrina Cloruro mercrico 1% Nitrato de plata 1% cido tricloroactico cido pcrico Anaranjado de metilo cido actico 1N Acetato de sodio 0,1N

Presencia de carbono, hidrgeno y oxgeno - Colocar alrededor de 0.2 g. de albmina de huevo en polvo en un tubo de ensayo seco - Calentar gradualmente hasta carbonizar la muestra - Observar los cambios ocurridos, los mismos que indicarn la presencia de carbono, hidrgeno y oxgeno en forma de gotas de agua en la parte superior y fra del tubo. Presencia de azufre - Calentar alrededor de 0.2 g de albmina de huevo en polvo con 0.5 g de sosa-cal en un tubo de ensayo. - Calentar con cuidado lo suficiente hasta carbonizar la muestra. - Aadir al tubo fro 3mL de HCl 6N. - Colocar un papel filtro impregnado de solucin de acetato de plomo 0.1M en la boca del tubo.

Presencia de Nitrgeno - Colocar 0.2 g de albmina de huevo en polvo en un tubo de ensayo - Aadir 3mL de NaOH 6N y calentar cuidadosamente Solubilidad

Rotular 4 tubos de ensayo y colocar en ellos alrededor de 1 mL de solucin de albmina 1% Aadir en orden respectivo, 3 mL de: NaOH 10%, carbonato de sodio 0.5%, HCl 0.2% y agua destilada. Repetir el ensayo utilizando gelatina. Reportar los resultados: insoluble ( - ), + - (parcialmente soluble ) y + ( soluble )

REACCIONES QUMICAS Prueba de Milln - Marcar 4 hoyos en la placa de toque. - Colocar en cada hoyo respectivamente unas gotas de solucin al 1% de: albmina, gelatina, casena y agua que servir como blanco - Aadir a cada muestra 5 gotas de reactivo de Milln. - Mezclar. - Al formarse un precipitado blanco, llevar la placa a calentamiento a bao mara hasta la aparicin de un color rojo que se reportar como positiva para esta prueba Prueba Zantoproteica - Rotular 4 tubos de ensayo. - Colocar 1 mL de las muestras anteriores - Aadir 1 mL de cido ntrico. - Observar la formacin de un precipitado blanco - Calentar los tubos a bao mara. - Observar la presencia de coloracin amarilla - Enfriar los tubos en una corriente de agua fra. - Aadir a cada uno unas gotas de NaOH al 10%. Prueba de Biuret - Rotular 4 hoyos en la placa de toque. - Colocar en cada hoyo las muestras anteriores - Aadir 2 gotas de NaOH al 10% y una gota de Reactivo de Biuret - Mezclar Prueba de Hopkins-Cole - Rotular 4 tubos de ensayo. - Colocar respectivamente 1 mL de las muestra anteriores. - Aadir 1 mL del reactivo de Hopkins-Cole - Con cuidado y por las paredes del tubo aadir 1mL de cido sulfrico concentrado de modo que se formen dos capas en cuya interfase aparecer un anillo violeta. - Anotar los resultados Prueba de Ninhidrina - Rotular 4 tubos de ensayo. Colocar 1 mL de las muestras anteriores.

Ajustar el pH a 7 utilizando NaOH 1 N. Aadir 3 gotas de Ninhidrina. Llevar a bao mara por 10 minutos.

REACCIONES DE PRECIPITACIN Con cidos concentrados - Rotular 4 tubos de ensayo. Colocar 1 mL de las muestras anteriores. - Aadir unas gotas de cido ntrico concentrado. - Observar. Con sales de metales pesados - Rotulas 4 tubos de ensayo y aadir 1 mL de las muestras anteriores. - Aadir a cada tubo 1 mL de solucin de cloruro mercrico 1%. - Observar y repetir el ensayo utilizando nitrato de plata 1%. Con reactivo de alcaloides - Rotular 4 tubos de ensayo y aadir 1mL de las muestras. - Aadir a cada tubo unas gotas de cido tricloroactico. - Observar y repetir el ensayo utilizando una pizca de cido pcrico. Con Alcohol - Rotular 4 tubos de ensayo con las muestras y aadir 1 mL de alcohol, si es posible alcohol desnaturalizado. Observar Accin del calor - Colocar en un tubo de ensayo 1 mL de albmina al 1% - Llevar a ebullicin a bao mara. Observar y comparar con el original CARCTER ANFOTRICO DE LAS PROTENAS Como Bases - Diluir una gota de HCl 6N con 30 gotas de agua destilada - Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de agua destilada, una gota de la dilucin de HCl preparada y una gota de indicador anaranjado de metilo - La solucin tomar un color rojo a un pH alrededor de 3. Aadir a esta solucin 5 mL de solucin de albmina al 1%. Observar.

Como cidos - Diluir una gota de NaOH 6N con 30 gotas de agua destilada - Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de agua destilada, una gota de la dilucin de NaOH preparada y una gota de indicador anaranjado de metilo - La solucin tomar una coloracin rojo-prpura a un pH alrededor de 8. Aadir a esta solucin 5 mL de solucin de albmina al 1%. Observar

PUNTO ISOELCTRICO Punto isoelctrico de la casena - Pesar 0.25 g de casena. Transferir a un baln aforado de 25 mL - Aadir 10 mL de agua destilada y 2.5 mL de NaOH 1N. Mezclar - Aadir 2.5 mL de cido actico 1N, homogenizar - Aforar utilizando agua destilada. Rotular la solucin como casena en acetato de sodio 0.1N. Rotular 9 tubos de ensayo. - Aadir en cada tubo los reactivos cuya concentracin y volumen estn en la tabla. - Aadir a cada tubo 1 nL de la solucin de casena en acetato de sodio 0.1N preparada. - Observar la turbidez en las muestras despus de 10 y 30 respectivamente - Reportar los resultados: 0 = ausencia de turbidez, + = poco turbio, ++ = medianamente turbio, +++ = turbidez abundante. 5.- Resultados y discusin

PRUEBAS DE IDENTIFICACIN Anlisis Elemental La Tabla 1 contiene los resultados de las pruebas de anlisis ambiental donde (+) indica una prueba positiva y (-) prueba negativa
Prueba Caractersticas Tabla 1. Pruebas de anlisis elemental Presencia de C, H Presencia de S yO + + Presencia de N +

Como se puede observar en la tabla 1 se confirm la presencia de los 5 elementos: carbono, hidrgeno, azufre y nitrgeno ya que al realizar las pruebas se encontr un residuo oscuro correspondiente al carbn, emanacin de gases con olor a pelo quemado, caracterstico del nitrgeno en amoniaco y otro que condensaba que indicaba hidrgeno y oxgeno en forma de agua.

Solubilidad La Tabla 2 contiene los resultados de las pruebas de solubilidad donde (+) indica una prueba positiva y (-) prueba negativa
Muestra NaOH Tabla 2. Pruebas de solubilidad HCl Na2CO3 H2O

Albmina Gelatina

+ +

Los resultados de la Tabla 2 indican que las protenas albmina y gelatina indican que las protenas en general son solubles en todos los medios (neutro, bsico dbil, bsico fuerte y cido) aunque presentan una mejor solubilidad en un medio bsico fuerte como el que es la solucin de hidrxido de sodio REACCIONES QUMICAS Reacciones de Coloracin La Tabla 3 contiene los resultados de las pruebas de coloracin, (+) indica una prueba positiva y (-) prueba negativa
Muestra Albmina Gelatina Casena Agua Millon + Tabla 3. Pruebas de coloracin Pruebas Zantoproteica Biuret Hopkins-Cole + + + + + + + -

Ninhidrina + + + -

La prueba de Millon y la Zantoproteica al ser positivas para protenas con aminocidos con anillo aromtico indican que la casena es la nica de las muestras que posee fenilalanina, triptfano o tirosina. La prueba de de Biuret al ser una prueba positiva para enlaces peptdicos dio positivo para todas las muestras con la caracterstica coloracin rosada o violeta. Como se puede ver la prueba de Hopkins-Cole al ser positiva para la albmina y la casena comprueban una vez ms la presencia de un anillo aromtico en la composicin de la protena siendo esta vez especfica para el triptfano. Al igual que la prueba de Biuret la prueba de Ninhidrina dio positiva para todas las muestras, debido a que se trataban de protenas.

Reacciones de precipitacin La Tabla 4 contiene los resultados de las pruebas de precipitacin, (+) indica una prueba positiva y (-) prueba negativa.
Muestra Tabla 4. Pruebas de precipitacin Pruebas

Con cidos Albmina Gelatina Casena Agua + + -

Con sales de metales + + -

Con reactivo de alcaloides + + -

Con alcohol + + -

Con calor + -

Como se puede observar en la Tabla 4 solo la albmina y la casena dieron resultados positivos con las reacciones de precipitacin, dando como productos precipitados blancos, lo que da indicios de la calidad proteicas de las muestras, siendo mayor en las que dieron resultados positivos. Los precipitados observados corresponden a la formacin desales insolubles, en el caso de la reaccin con metales la sal corresponde a un anin formado por el aminocido y el catin del metal.

CARCTER ANFOTRICO DE LAS PROTENAS Como bases y cidos La tabla 5 contiene los resultados de la prueba de carcter anfotrico de las protenas
Muestra Albmina Tabla 5. Carcter anfotrico de las protenas Como base Como cido Coloracin anaranjada Coloracin rojiza

En solucin bsica la albmina torno de color ligeramente rojizo la solucin de NaOH indicando que actu como cido, mientras que en la solucin de HCl la volvi de color anaranjado indicando que actu como cido.

Punto isoelctrico La tabla 6 contiene los volmenes de reactivos con los que se prepararon las diferentes reacciones, al igual que el pH de las mismas y la turbidez que presentaron a 10 y 30 minutos.

Tabla 6. Determinacin del punto isoelctrico de la casena Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Agua destilada 8,38 7,75 8,75 8,5 8 7 5 c. Actico 0,01N 0,62 1,25 c. Actico 0,1N 0,25 0,5 1 2 4 pH resultante 5,9 5,6 5,3 5 4,7 4,1 4,4 10 0 0 + +++ +++ +++ ++ 30 0 0 + +++ +++ ++ ++

8 1 8 3,8 ++ ++

9 7,5 0 0

Como se puede observar en la Tabla 6 los pH a los cuales hubo mayor turbidez fueron 5; 4,7 y 4,1; valores con los que se trabajo para la determinacin del punto isoelctrico.
Tabla 7. Determinacin del punto isoelctrico de la casena Clculo del punto Punto isoelctrico Punto isoelctrico Error isoelctrico experimental experimental terico porcentual (5+4,7+4,1+5+4,7)/5=4,7 4,7 4,6 2,2 %

Como se observa en la tabla 7 el punto isoelctrico determinado fue de 4,7; valor correcto que concuerda con el terico de 4,6. 6. - Conclusiones Todas las protenas estn constituidas por carbono, hidrgeno, nitrgeno y algunas de azufre. Las pruebas de Biuret y ninhidrina permiten reconocer directamente protenas en una muestra. Con las pruebas de coloracin se pudo observar que la casena es una protena de mayor calidad debido a que posee una mayor diversidad de aminocidos. Las protenas tienen propiedad anftera por lo que pueden actuar como cidos o bses.

7. - Bibliografa Solomons, G. Qumica Orgnica, Editorial Limusa, Mxico, 1990. Pginas: 931938.