INSTITUTO TECNOLGICO DE MORELIA DEPARTAMENTO DE INGENIERA BIOQUMICA MICROBIOLOGA AMBIENTAL

Examen unidad II Aislamiento de P. graminis.

VIRIDIANA MEDINA MIRAMAR RAUL VILLA ARVALO ERICK ORLANDO ZAVALA JOCELIN IRAIS ALVARADO PINTOR MICROBIOLOGA AMBIENTAL, 7 SEMESTRE PROFESOR: M. en C. YADIRA BELMONTE IZQUIERDO MORELIA, MICH. OCTUBRE, 2013

CLASIFICACIN TAXONMICA: Dominio Reino Phylum Clase Orden Familia Gnero Especie DESCRIPCIN: Karen Kaplan define la roya, o roya negra (Puccinia graminis) como un hongo que produce una enfermedad que afecta a diversos granos de cereal. Una epidemia de roya en el trigo causada por la raza Ug99 se encuentra actualmente en evolucin a travs de frica, Asia y ms recientemente el Medio Oriente y es motivo de gran preocupacin a causa del gran nmero de personas que dependen del trigo para su subsistencia. CARACTERSTICAS Y CICLO DE VIDA: Schumann y Leonard describen a Puccinia graminis como un parsito obligado, es decir, que se requiere que viva en otro organismo, que se benefician de ella, mientras que el organismo husped por lo general est estresado o en tiempo muerto. Tambin es heteroico, lo que significa que el hongo requiere que viva en dos especies lejanamente relacionadas a lo largo de su ciclo de vida. Estas dos especies alejadas que se derivan roya del trigo que requiere son: las plantas de trigo y el agracejo (grupo de arbustos de diversas especies que se caracterizan por tener espinas y alcanzar alturas de 1 hasta 3 metros). Su ciclo de vida se inicia por la introduccin de cualquiera de una aeciospora o un urediniosporas a una planta de trigo. Las esporas pueden provenir de una regin lejana llevada por el viento, de agracejo, el husped alternativo, o de la planta de trigo en s, si ya est infectado Eucariota Fungi Basidiomycota Pucciniomycotina Pucciniomycetes Pucciniaceae Puccinia Puccinia graminis sp (EPPO, 2012)

Infeccin sobre berberis. Germinacin de teliosporas y formacin de basidiosporas. Desarrollo de espermogonios con espermacios e hijas receptoras. Espermatizacin: fusin de espermacios con las hifas receptoras.

Ciclo de Puccinia graminis.

Desarrollo de telios y formacin de teliosporas. Infeccin sobre un cereal.

Desarrollo de ecios y formacin de eciosporas.

Germinacin de la eciospora y desarrollo de un micelio dicaritico. Germinacin de uredosporas Desarrollo de uredios y formacin de uredosporas.

Figura 1. Sntomas de la roya del tallo de trigo. JUSTIFICACIN El tallo roya del trigo es un problema muy grande que tenemos que encontrar una solucin para antes de que sea demasiado tarde, ya que si no encontramos una solucin para detener la expansin de Puccinia graminis, o al menos frenar su expansin, uno de los mayores productores de trigo ser destruido como lo menciona Singh. Tambin afirma que se ha estimado que alrededor del 85 % de la poblacin mundial requiere trigo como uno de su nica fuente de caloras, tambin se ha estimado 60 % dependen de l como su fuente de protena, con ese nmero cada vez mayor a 82 % si se tiene en cuenta la pases que utilizan trigo como fuente secundaria o terciaria de la protena

Muestreo. Para la toma de la muestra, se puede realizar de dos maneras: La primera, de acuerdo al lugar donde encontraramos esporas de nuestro hongo, consiste en situar alrededor del permetro de cultivo de gramneas (cereales: Trigo, avena, centenos, etc.) (CABI, 2011); situar el dispositivo que diseamos y construimos, y mediante el uso de un medio nutritivo general (y en base a las caractersticas morfolgicas coloniales y microscpicas de P. graminis, (colonias ovaladas de color rojizo-caf) (CIMMYT, 2005). Otra opcin es utilizar el un medio selectivo y diferencial (agar DIFCO) (Jin, Szabo, et al, 2008), dado el ciclo biolgico y los mtodos de estudio reportados se requiere antes de su aislamiento, que estas muestras proliferadas en agar sean cultivadas posteriormente en un tipo de gramnea para activar completamente las esporas y estudiarlas, estas tcnicas de muestreo del aire son aplicables dado que la fuerza de virulencia del hongo es el aire siendo capaz de recorrer distancias continentales. Un mtodo ms sencillo pero nicamente aplicable a zonas de cultivo ya infectadas es el aislar directamente de la planta infectada al hongo patgeno. (P. graminis.).

Planta infectada por P. graminis (izquierda), esporas de P. graminis (derecha).

Dispositivo muestreador de aire.

Procesamiento de la muestra. Una vez obtenida nuestra muestra se procede de acuerdo a su rango de crecimiento mnimo 4C y mximo de 29 C (DGSV CNRF, 2011). La muestra idealmente se puede conservar a 4C para conservarla y que su proliferacin sea lenta, cabe destacar que su periodo de latencia es de 7 a 9 das en los cuales se recomienda realizar anlisis. Despus de 20 das la cepa comienza a esporular y deja de ser apta para su estudio (Campos, Lopez, et al, 2009). Aislamiento Al tomar la muestra del dispositivo debe ser llevado al laboratorio para proceder con la incubacin o en caso de no poder hacer lo anterior se debe guardar a una temperatura de 4 C para limitar el crecimiento de otros organismos que pueden estar presentes adems de los hongos a incubar. La caja Petri que fue colocada en el dispositivo puede contener el medio Agar Sabouraud Glucosado (contienen pluripeptona y glucosa. El alto contenido de glucosa, la presencia de

cloranfenicol y pH cido, favorecen el crecimiento de hongos sobre bacterias); el cual puede mantner el crecimiento de los organismos a temperatura ambiente. Al llegar al laboratorio la caja petri donde se recolect la muestra puede llevarse a la incubadora a temperaturas de 15 a 28 C durante 4- 5 das o realizar lo siguiente: Transferir la muestra a una caja o cajas Petri con medio de cultivo PDA (Agar Dextrosa Papa), para impedir el crecimiento de bacterias contaminadoras puede ser acidificado con cido lctico al 25%, a razn de 2-5 gotas por cada caja petri segn sea el tamao de la caja y el volumen de medio de cultivo por caja (sin embargo hay que anotar que el cido lctico impide el crecimiento de muchas bacterias pero no de todas). Otra opcin es sembrarlos en placas de petri con medio PDA adicionado con 100 mg/L de cloranfenicol y 50 mg/L de ampicilina para inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes. Son incubadas en completa oscuridad a una temperatura de 30 C por 7 das. Tan pronto haya micelio suficientemente desarrollo, se procede a transferir parte de ste a una nueva caja de petri con PDA, para evitar la proliferacin de aquellos agentes contaminadores que hayan resistido la desinfeccin y que debido a su crecimiento ms rpido puedan impedir el desarrollo adecuado del hongo. Ya en la nueva caja de petri el hongo se somete una vez ms al proceso de incubacin hasta lograr la formacin o el desarrollo de las estructuras caractersticas. Para su identificacin se debe hacer una observacin macroscpica y microscpica Observacin Macroscpica: Esta observacin permite determinar las siguientes caractersticas: Aspecto de la colonia

Pigmentacin de la colonia. El aspecto y la pigmentacin de las colonias dependen mucho del contenido de nutrientes del medio de cultivo. Una vez caracterizados los hongos se realiza un repique el cual consiste en extraer del borde de la colonia un trozo de agar con micelio del hongo de inters para sembrarlo en nuevas placas con medio PDA pero sin sustancias bacteriostticas, e incubar las placas a 20 o 25C durante el tiempo que demore la formacin de las estructuras reproductivas necesarias para la identificacin del hongo. En funcin de los tipos de micelio desarrollados ser el nmero de repiques a realizar para llegar a obtener un cultivo puro.

REFERENCIAS:

Karen Kaplan A red alert for wheat July 22, 2009 BrandX/ LA Times EPPO, 2012. European and Mediterranean Plant Protection Organization. Puccinia graminis f. sp. Tritici (20 de diciembre de 2012). Singh, Ravi P., David P. Hodson, Julio Huerta-Espino, Yue Jin, Peter Njau, Ruth Wanyera, Sybil A. Herrera-Foessel, and Richard W. Ward. "Will stem rust destroy the world's wheat crop?." Advances in agronomy 98 (2008): 271-309. Pretorius, Z. A., R. P. Singh, W. W. Wagoire, and T. S. Payne. "Detection of virulence to wheat stem rust resistance gene Sr31 in Puccinia graminis. f. sp. tritici in Uganda." Plant Disease 84, no. 2 (2000): 203-203. CIMMYT. 2005. Sounding the Alarm on Global Stem Rust. An Assessment of UG99 in Kenya and Ethiopia and Potential for Impact in neighboring Regions and Beyond. Jin, Szabo, et al, 2008. Detection of Virulence to Resistance Gene Sr24 Within Race TTKS of Puccinia graminis f. sp. Tritici. Cereal Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, Winnipeg. CABI. 2011. Crop Protection Compendium. Data Sheet for: Puccinia graminis f.sp. tritici Global Module 7nd. Edition. CAB Internacional. UK. Direccin General de Sanidad Vegetal - Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (DGSV CNRF) 2011. Roya negra del tallo del trigo (Puccinia graminis Pers. f. sp. tritici Eriks & Henn). Ficha tcnica. SAGARPA-SENASICA. Mxico, D.F. Campos, Lopez, et al, 2009. Caracterizacin de aislamientos de Puccinia graminis f.sp. Tritici, agente causal de roya del tallo de trigo y su virulencia sobre cultivares de trigo pan. Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA). Argentina, Buenos Aires.