Biorreactores: una perspectiva de la ingeniera qumica

Tecnologa de DuPont Engineering, Wilmington, DE 19898, EE.UU. Departamento de Biotecnologa de la Universidad Tcnica de Dinamarca, 2800 Lyngby, Dinamarca

una

Abstracto A pesar de los avances en biologa molecular que han abierto nuevas vas de sntesis para productos farmacuticos y productos qumicos finos, la biotecnologa no ha sido ampliamente desplegado para la produccin de alto volumen, los productos qumicos de bajo coste. Se argumenta que el ritmo de desarrollo de bioprocesos a gran escala puede acelerarse mediante la aplicacin cada vez ms los principios bsicos de la ingeniera qumica, junto con los conceptos de primera lnea de la biologa molecular. Una comprensin fundamental del acoplamiento entre cintica, hidrodinmica, y los procesos de transporte en un biorreactor tambin puede afectar favorablemente la economa del proceso. Se discuten las oportunidades de estado y el futuro en reas como la cintica de biorreaccin, seleccin de reactor, el diseo, la escala y de control.Varios ejemplos de cmo los principios de la ingeniera de reaccin pueden provocar el xito del diseo y la escala y evitar los errores comunes se ilustran. Por ltimo, la necesidad de optimizar el proceso integrado, en lugar de slo el biorreactor, se indica.

1. Introduccin Los descubrimientos relacionados con el genoma de los muchos microorganismos recin secuenciado y las vas de informacin entre el genoma, las protenas expresadas y los metabolitos producidos por las protenas han causado un considerable entusiasmo en relacin con el potencial a corto plazo para "biologa".Nuevos medicamentos ms potentes o ms seguros, o nuevos conceptos de tratamiento, como la terapia gnica, se estn desarrollando activamente. Tambin existe la posibilidad de fabricacin de productos qumicos utilizando bioprocesos que son ms respetuoso del medio ambiente y utilizar los recursos renovables. En la frontera intelectual de "biologa", la biologa molecular es la fuerza innovadora. Las nuevas tcnicas para el estudio de la masa y el flujo de la seal en las vas metablicas complejas con cascadas de protenas (que regulan el espectro de metabolito y donde los

metabolitos a su vez regulan la actividad de la protena tanto en la transcripcin y en el nivel de la traduccin) se han desarrollado. Organismos ahora se pueden modificar usando metodologas de ingeniera gentica para producir productos deseables en la mejora de la selectividad. Como era el caso en la aplicacin de la qumica, una comprensin fundamental del acoplamiento entre los procesos cinticos y de transporte asociados con la bio-conversin de los reactivos a los productos es importante en el desarrollo y el despliegue de los procesos econmicos. Este acoplamiento puede ser importante en diferentes escalas, desde micro (molecular) para meso (turbulento remolino) a macro escala (reactor). Ingenieros reaccin qumica juegan un papel complementario a los bilogos en el desarrollo de esta comprensin. Contribuciones a la interfaz de la biologa y la ingeniera se han realizado principalmente por los investigadores con formacin en ingeniera qumica tradicional que combina los detalles ms finos de la biologa con la investigacin en ingeniera y el anlisis necesario para desarrollar un bajo costo bioprocesos integrados. Bailey y Stephanopoulos fueron los primeros en aplicar conceptos de ingeniera qumica en el campo de la Ingeniera Metablica ( Bailey, 1991 ; Stephanopoulos y Vallino, 1991 ; Stephanopoulos, 1999 ).Liao y Lightfoot (1988) aplicaron el concepto de ingeniera qumica clsica de caminos de reaccin caractersticos ( Wei y Prater, 1962 , Cap. 5) para determinar la sensibilidad del flujo a travs de las vas metablicas a los cambios en las actividades enzimticas individuales (los llamados "coeficientes de control de flujo"). Este enfoque se aplic a la determinacin experimental de los coeficientes de control de flujo ( Delgado y Liao 1992a , 1992b Delgado y Liao y Delgado y Liao 1997 ) y se extendi a las perturbaciones ms grandes en las vas estrictamente no lineales ( Hatzimanikatis, 1999 ). La necesidad de desarrollar metodologas para el anlisis de redes metablicas experimental y el uso de diferentes tcnicas matemticas ha revitalizado las grandes reas de la ingeniera qumica tradicional.Cuando se analizan las redes metablicas grandes con ramas convergentes y reacciones reversibles uno debe incluir necesariamente mediciones con sustratos marcados. Por ejemplo, la medicin de 13 C enriquecimiento de metabolitos (especialmente RMN o MS-GS medicin de la posicin de la etiqueta en los llamados isotopomers) crea un problema formidable computacional cuando los flujos de va han de calcularse por la solucin de grandes conjuntos de ecuaciones no lineales ( Christensen y Nielsen, 2000) .Mtodos de lgebra Nueva lineales (o cuasi-lineal) Recientemente se han desarrollado para resolver para los flujos y su sensibilidad a los errores de medicin como se describe en un conjunto de documentos seminal (Wiechert, Mllney, Isermann, Wurzel, y de Graaf, 1999 ). Por ltimo, con el fin de descubrir la capacidad metablica total de microorganismos, Palsson y colaboradores han desarrollado una descripcin sistmica rigurosa de las vas metablicas primero para E. coli ( Varma, Boesch, y Palsson, 1993 ; Varma y Palsson 1993 y Varma y Palsson 1994 ) y ms tarde en trminos ms generales ( Schilling, Schuster, Palsson, y Heinrich, 1999 ). La importancia de las consideraciones de ingeniera qumica en el desarrollo de bioprocesos se pone de relieve por la aparicin de varios libros de texto y revisiones

(entre otras cosas Sahm y Wandrey, 1996 ;Stephanopoulos, Aristidou, y Nielsen, 1998 ; Lee & Papoutsakis, 1999 ; Schgerl y Bellgardt, 2000 ) en los ltimos 5 aos. Esto es anlogo a la aparicin de libros sobre diseo de reactores qumicos y anlisis a finales de 1970. Para los productos de alto valor, de bajo volumen, las consideraciones de los procesos de ingeniera desempean un papel menor en la viabilidad econmica. En un caso en el que una protena teraputica particular, se expresa y se secreta a partir del organismo husped, una produccin ms alta se puede lograr sin consecuencias econmicas adversas de multiplicar el nmero de botellas de agitacin utilizadas.Incluso en este caso los problemas de selectividad son importantes, aumento de la selectividad de ayudar en la reduccin de generacin de flujos de residuos perjudiciales del medio ambiente. Esta situacin es anloga a la fabricacin de productos qumicos finos en la industria farmacutica. Por el contrario, para los productos de menor valor de alto volumen, tales como productos qumicos de los productos bsicos, adems de los avances en la biologa molecular, la viabilidad comercial y una ventaja competitiva puede depender de la capacidad de "ingeniero" un proceso de bajo costo. Esto se puede lograr por una comprensin del acoplamiento entre cintica, hidrodinmica, y los procesos de transporte que determina la estabilidad de la conversin, selectividad, productividad y microorganismo. Por ejemplo, una enzima detergente tpico de bajo coste es producido por el organismo husped (una ingeniera Aspergilluscepa) slo cuando el nivel de sustrato (glucosa) est por debajo . Por lo tanto, para lograr una alta selectividad y rendimiento del producto, la cintica de la utilizacin de sustratos en diferente (pero baja) los niveles deben ser determinados con precisin. Reactor de uniformidad tambin es importante. La capacidad de mezclar ntimamente un alimento de alta concentracin ( glucosa) en un reactor (con un nivel de substrato en masa de slo glucosa) determina si se est produciendo enzima valiosa en lugar de residuos de biomasa. Biomasa adhesin a las paredes del reactor y la eliminacin de calor (generado mediante la mezcla de los medios viscosos y debido a la reaccin exotrmica) en un reactor de enzima detergente aerbico presentan problemas graves y algunas veces infranqueable en escala (De decir laboratorio para escala de produccin). Limitaciones de transferencia de masa gas-lquido tambin puede dominar la escala hacia arriba. El uso de aire enriquecido (o S incluso pura 2 ) aumenta la tasa de transferencia de oxgeno, lo que aumenta la tasa volumtrica de la reaccin, sin embargo, la generacin de calor tambin aumenta y esto puede conducir a limitaciones de transferencia de calor. La calidad del producto y el rendimiento (y, a veces incluso la estabilidad del proceso) dependen crticamente de la capacidad de supervisar y controlar las condiciones de reaccin dentro de lmites estrechos. Si bien los avances en la ltima dcada ha sido nada menos que espectacular, hay una serie de reas en la bioingeniera con potencial de mejorar nuestra comprensin de la biologa y la interfaz entre la biologa y la ingeniera. Investigacin en Ingeniera dirigido a estos temas puede tener un impacto significativo en el desarrollo de bioprocesos a gran

escala para la produccin de alto volumen, los productos qumicos de menor valor. En el presente documento se examinarn el estado y la direccin de las fronteras de la investigacin desde la perspectiva de los autores. 2. Cintica El reto en la investigacin en ingeniera bio-reaccin es para explotar el potencial del organismo para convertir diferentes sustratos a una gama de productos metablicos, incluyendo las protenas heterlogas deseadas. Si bien la conversin de una materia prima de hidrocarburo complejo puede as dar lugar a diferentes distribuciones de productos en diferentes condiciones de reaccin, la riqueza de la respuesta de la clula a los cambios ambientales no tiene contrapartida en sistemas que implican slo productos qumicos y un catalizador. Estequiometra de la reaccin se puede cambiar con el nivel de sustrato, pH, temperatura, y concentracin de biomasa. Esto, en nuestra opinin, es una diferencia importante entre bioreactions y reacciones qumicas convencionales. Experimentos de estado estacionario en un reactor de tanque agitado, tambin llamado un quimiostato, y experimentos transitorios en un fermentador por lotes a menudo se llevan a cabo para estudiar el efecto de las condiciones de funcionamiento en la selectividad y el rendimiento de un metabolito dado. Cada experimento proporciona un conjunto de tasas medidas que se pueden utilizar para calcular los flujos en una red metablica postulado. En tal anlisis, se supone que un conjunto de las reacciones enzimticas tericamente posibles para estar activo, mientras que otras reacciones posibles se supone que son inactivas (es decir, las enzimas no se expresan). El anlisis, que se basa en la medicin de las tasas de produccin extracelulares de sustratos y metabolitos excretados (a veces complementados por los experimentos de trazadores), se conoce como anlisis de flujo metablico ( Nielsen y Villadsen, 1994 ). Las tasas de produccin medidos tambin pueden ser insertados en un solo estequiomtrica o "cuadro negro" modelo para proporcionar coeficientes de rendimiento para cada producto en el sustrato consumido.El cambio coeficientes de rendimiento, a veces muy bruscamente con el medio ambiente, lo que refleja el cambio de distribucin de flujo en la red metablica subyacente. Si se utiliza un modelo de red metablica o un modelo de caja negro, se necesita gran cuidado para asegurar que todos los metabolitos se identifican en los experimentos y que las tasas de produccin se miden con precisin. Una gama completa de hasta a la fecha, en lnea o en la lnea de los dispositivos de medicin estn disponibles para las especies de reaccin biomasa, lquido o en fase gaseosa (ver Sonnleitner, 2000 para una revisin reciente). No se deben escatimar esfuerzos para obtener unos datos fiables. Idealmente, los balances de carbono y nitrgeno deben cerrar con una precisin de 98%. Esto es ciertamente posible si se usa un medio definido con concentraciones conocidas de aminocidos, pero menos fcilmente lograrse si se utilizan medios industriales (por ejemplo, licor de maz fermentado). Un fallo para cerrar el balance de masa dar lugar a inexactitudes graves en el clculo de la distribucin de flujo y, en general, hacer imposible el desarrollo de la cintica significativas. Desafortunadamente, una gran parte de los datos experimentales

publicados sufren de inconsistencias en este respecto, tpicamente porque los controladores de flujo de masa inadecuadas invalidan el clculo de las tasas de produccin de componentes de la fase de gas o porque algunos metabolitos de fase lquida no se detect. Una expresin fiable velocidad cintica es especialmente importante en el caso de los productos de menor valor de mayor volumen, en los que el valor del producto es slo ligeramente mayor que el costo sustrato. En un caso, la tasa de produccin volumtrica no ptimo o subproductos tales prdidas pueden conducir a la economa desfavorables. Adems de los problemas de selectividad de conversin tradicionales y el reciclaje o la disposicin de las aguas residuales y la biomasa son cuestiones importantes. 3. Experimentos en estado estacionario Las tasas medidas en estado estacionario, en principio, pueden ser usados para calcular una expresin de la velocidad de reaccin para la conversin global de sustratos a productos. Esto, sin embargo, llegar a ser difcil para al menos dos razones: (1) el gran nmero de sustratos y productos hace que sea prcticamente imposible para incluir todas las entradas en la expresin de la velocidad; (2) la estequiometra de la reaccin en un solo postulado se la mayora de los casos cambian con el entorno de la reaccin. Por lo tanto, simples expresiones de velocidad de reaccin deben volver a valer, si se utilizan fuera del estrecho rango de concentraciones de sustrato o el producto para el que fueron desarrolladas. El enfoque ms prometedor cintica se basa en el concepto de un "sustrato limitante" con la concentracin de s 1 en el reactor. Si cualquier otro sustrato s j es en exceso, la tasa volumtrica de la produccin de biomasa q x partir de una alimentacin estril, y el consumo de otros sustratos y la produccin de metabolitos ( q p i ) se puede encontrar desde Ecuacin (1)

Aqu x es la concentracin de biomasa, y el rendimiento coeficientes Y ij se define como la masa de jproducida (o consumida) por masa de i , y f ( s 1 ) es la expresin de la velocidad de crecimiento de la biomasa. Los coeficientes de rendimiento son todas positivas, mientras que las tasas de q i es positiva sii se produce, y negativo si i se consume. Para obtener un rendimiento constante coeficientes Y ij :

ecuacin( 2 )

Ecuacin. (2) indica una simple proporcionalidad entre las tasas expresadas en la ecuacin. (1) u obtenidos de balances de masa total, en funcin de las concentraciones de alimentacin, s 1 f , y las concentraciones de salida medidos, s j , y es vlido slo

si Y ij son constantes. Como se discuti anteriormente, esto es raramente el caso, excepto en una estrecha gama de condiciones de funcionamiento. La inclusin de un trmino de consumo de sustrato no relacionada con el crecimiento no resuelve el problema fundamental de los coeficientes de rendimiento que cambian con las condiciones de crecimiento. ecuacin( 3 )

Ecuacin. (3) , la llamada Luedeking-Piret cintica, incluye un trmino de mantenimiento m s 1 para el consumo de sustrato no relacionado con el crecimiento y un trmino correspondiente para la formacin de producto m p i . Los coeficientes de rendimiento ( Y xs 1 y Y xp i , respectivamente) todava pueden variar con el medio ambiente, como se ha demostrado para la fermentacin de cido lctico ( Benthin, Schulze, Nielsen, y Villadsen, 1994 ). Con esta incertidumbre de la estructura, hay poco valor el aumento de la complejidad del trmino tasa de f ( s 1 ) ms all de un mnimo necesario. Al igual que con la cintica qumica tradicionales, se han reportado expresiones de velocidad que tratan de imitar expresiones derivadas mecnicamente para la cintica de enzimas individuales. Por ejemplo, la expresin de la velocidad se puede expresar como el producto de varios factores, uno para cada uno de los sustratos (y quizs productos). Esta expresin de la velocidad con muchos parmetros determinados mal es complicado de usar, y puede tener nada que ver con los "verdaderos" cintica de la clula. Es arriesgado utilizar este tipo de expresiones para fines de diseo fuera del rango de los datos experimentales subyacentes. Otras expresiones empricas como "la expresin logstica tasa" o la expresin Contois ( (4a) y (4b) ) son igualmente pobres, ya que no pueden representar cualitativamente el comportamiento celular.

Ecuacin (4a)

Ecuacin (4b)

En la ecuacin. (4a) , el lmite superior ( x = k ) de la concentracin de biomasa representa la falta de un sustrato limitante (que no se incluye en la expresin). En la ecuacin. (4b) , la influencia negativa de x es debido a la inhibicin del producto. El valor de K s puede cambiar con la concentracin del producto inicial en un reactor discontinuo, o con la concentracin del producto en la alimentacin a un reactor continuo. La forma ms segura de la construccin de la expresin cintica es encontrar para cada s j el lmite inferior por encima del cual la adicin del sustrato no cambia la tasa apreciablemente. Una vez que las concentraciones de sustrato s j debajo de la cual

sustrato j se ha encontrado es limitante, uno tiene que evaluar el efecto de s j y de cada uno de los productos en la expresin de la velocidad. Expresiones de velocidad que tienen la forma funcional correcta para describir la cintica incluyen ecuacin( 5a )

ecuacin( 5b )

ecuacin( 5c )

donde s 1 es el sustrato limitante y = f ( s 1 ) es la tasa de crecimiento especfico. ecuacin. (5a) , conocido como la cintica de Monod, incluye caractersticas fundamentales que uno puede concluir con seguridad debe encontrarse en todas las fermentaciones. Cuando la concentracin del sustrato limitante es lo suficientemente baja la velocidad de reaccin global es proporcional a s 1 . Como s 1 aumenta, la capacidad de la maquinaria de la clula para convertir el sustrato se acerca a un lmite superior. Una debilidad de esta expresin es que el sustrato limitante es rara vez va a ser la misma para todos los valores de s 1 . A valores altos de s 1 , es muy posible que otro sustrato, o tal vez una concentracin de metales traza, limita la velocidad de reaccin. Eq. (5b) incluye un trmino inhibicin de sustrato que domina ms all de una cierta concentracin de sustrato (f(s1) disminuye con s 1 para , Mientras que la ecuacin. (5c) incluye un efecto negativo del producto metablico p i .Para p i > p i max la tasa de crecimiento especfica f ( s 1 ) = es cero. Tal es el caso de la fermentacin del etanol utilizando Saccharomyces cerevisiae . Para muchos organismos y para un gran nmero de sustratos (tales como azcares, amoniaco, O 2 y otros sustratos gaseosos) el valor de K s en la ecuacin. (5a) es ms pequeo que . La levadura tiene un relativamente alto K s valor a la glucosa, sobre . En una investigacin experimental en el que se miden todas las concentraciones de sustrato en el reactor esta informacin puede ser til para decidir cundo es necesario un cambio de la concentracin de la alimentacin de entrada de algn otro sustrato a cambiar a un nuevo sustrato limitante. Se han hecho muchos intentos para construir alguna informacin relativa a la metabolismo del microorganismo estudiado en el modelo cintico, por lo menos en un nivel descriptivo cualitativo. El (1986) Sonnleitner y Kppeli modelo para la fermentacin de levadura aerbica es un intento simple y eficaz para incorporar en una expresin cintica del crecimiento respiratoria de la glucosa en la baja tasa de dilucin D(por ejemplo, alto tiempo de residencia ), el crecimiento en parte fermentativa de la glucosa en alto D , y un crecimiento potencial en etanol si es lo suficientemente O 2 est presente. El concepto de un "activo" y un compartimento celular "pasiva" ( Nielsen y

Villadsen, 1994 , Cap. 4) se basa en la hiptesis de un "activo" de clulas compartimentos X A que pueden incluir enzimas clave, presumiblemente en las vas catablicas o XA puede ser interpretado como el contenido total de ARN de la clula. El X Un compartimento se forma a partir del sustrato mientras que el resto de la clula, el compartimiento de "pasiva" X T est formado a expensas de X Una . Ambas reacciones son de primer orden en X A , una imagen intuitivamente razonable de la biologa de las clulas, ya que las tasas de reaccin celulares deben aumentar con X A esto es consistente con la interpretacin de X A medida que la concentracin de ARN total, se sabe que aumenta con el crecimiento especfica tasa. Estos modelos "estructurados" y los modelos cibernticos bsicamente equivalentes de Ramakrishna, Kompaa y compaeros de trabajo (vase Kompaa, Ramakrishna, Jansen, y Tsao, 1986 ), han tenido bastante xito en modelar el crecimiento y la captacin de sustrato de un feed de azcares mezclados en un grande D -intervalo. El lmite de la utilidad de los modelos "estructurados", sin embargo, que pronto ser alcanzado como lo demuestran los muchos parmetros, que se producen en las ltimas versiones de estos modelos de tipos sigue siendo muy empricos. Sin embargo, algunas caractersticas de las fermentaciones no en estado estable, como el retraso de la fase inicial en un reactor discontinuo y la fase de latencia entre la captacin de dos sustratos (por ejemplo, glucosa y etanol) en fermentaciones de lotes, se pueden predecir con bastante exactitud. Un modelo de cintica en estado estacionario fundamental contendra informacin sobre la dimensin caracterstica de la clula e incluyen el transporte del sustrato limitante travs de la membrana celular.Despus de la activacin, por ejemplo, despus de una fosforilacin del sustrato limitante participara en la primera reaccin de la va. El producto de esta reaccin sera entregar reactivo a la siguiente va de reaccin, y as sucesivamente. Al igual que con los modelos de micro-cinticos en catlisis heterognea, el modelo contendra cada paso elemental en la red metablica. A pesar de que hay pocas mediciones precisas de las concentraciones de metabolitos piscina como funciones de la concentracin de sustrato limitante, y an menos informacin sobre el efecto en la tasa y la distribucin del producto, tal conocimiento fundamental puede ser muy til para explicar el comportamiento observado y el rector de la mejor opcin de modificaciones genticas. Jensen, Jokumsen y Villadsen (1999)midieron las concentraciones en estado estacionario de los metabolitos de la va EMP convertir la glucosa en piruvato en Lactococcus lactis . A alta concentracin de glucosa, el nivel de la dihidroxiacetona metabolitos (DHAP) y glyceraldehydephosphate (GAP) era alta, y as fue la tasa de produccin del nico producto metablico, el cido lctico (ver la fig. 1 ). A menor concentracin de glucosa en la DHAP y los niveles de BPA eran ms bajos, que no slo tuvo una influencia directa sobre la tasa de produccin de cido lctico, sino que tambin alivia la represin de las enzimas aguas abajo de piruvato, lo que precipit un cambio completo en la distribucin del producto. La produccin total de cido fue menor, y la mayora de los productos metablicos son formiato, acetato y etanol.

. Figura 1. metabolismo fermentativo de Lactococcus lactis y su regulacin alostrica por fosfatos de azcar. () Activacin de la lactato deshidrogenasa (LDH). ( ) La inhibicin de la piruvato formato liasa (PFL). En la concentracin de cido lctico alto nivel de azcar es el nico producto. A bajas concentraciones de azcar en una mezcla de varios cidos y los resultados de operacin de etanol (heterofermentativo). Opciones Figura 4. Experimentos transitorios rpidos Medidas transitorias obtenidas de lotes o semi-batch reactores no son adecuadas para la determinacin de las expresiones en estado estacionario de velocidad cintica. El valor del parmetro max en la ecuacin. (5) se puede determinar con gran precisin por experimentos llevados a cabo por lotes correctamente. Sin embargo, como se discuti anteriormente, las constantes de saturacin son tpicamente rdenes de magnitud ms pequeo que s 1 f y hay mediciones son propensos a estar presente en el rango de sustrato donde una influencia de K s podra ser visto. Expresiones de velocidad obtenidos por las tasas ajustadas a la derivada de los datos en funcin del tiempo, o por formas integradas de ajuste de las ecuaciones del reactor (con expresiones de velocidad asumidos) a los datos en funcin del tiempo a menudo puede ser engaosa. La fase de latencia inicial de la fermentacin por lotes puede extenderse desde unos pocos minutos y hasta muchas horas, dependiendo del estado del inculo y la composicin del medio. En lo sucesivo, un reactor discontinuo es, en principio, no es diferente de un quimiostato operado en el estado estacionario. Si todos los sustratos estn presentes en grandes cantidades se tardar mucho tiempo antes de que uno se convierte en sustrato limitante. En tanto el quimiostato estado estacionario y en el reactor por lotes el crecimiento es "equilibrada", es decir, reacciones catablicas se producen exactamente a la tasa, que corresponde a la tasa de las reacciones anablicas, la entrega

de energa (ATP) y precursores de biomasa a tasas constantes para ser utilizado en las reacciones de biosntesis. La tasa de las reacciones catablicas se determina por el requisito de D = = la tasa especfica de las reacciones anablicas para quimiostatos estado estacionario y por = max para el reactor por lotes. Puesto que la constante de saturacin ( K s en la ecuacin (5).) para el sustrato clave, por lo general un azcar, es muy pequea en comparacin con la concentracin de azcar inicial en el lote, la forma ideal de la curva de crecimiento por lotes es la de una fase de demora , seguido por una lnea recta, , Seguido por un cambio abrupto de q x = 0 cuando se utiliza el sustrato hacia arriba. Si el perfil de tiempo de poco a poco se inclina lejos de la lnea recta que puede ser debido a la inhibicin del producto ( Eq. (5c) ). Esto puede ser investigada mediante la repeticin de la fermentacin por lotes, con una concentracin inicial del producto p > 0 en el medio. En la mayora de los casos la lenta disminucin de hacia cero es, sin embargo, debido a una composicin incorrecta del medio donde algn otro sustrato, por ejemplo, un aminocido no esencial, se suministra inicialmente en una concentracin demasiado pequeo. A una cierta concentracin de biomasa del aminocido se agota, y el organismo tiene que sintetizar este precursor de biomasa a expensas de ATP, lo que resulta en una disminucin gradual . Una interpretacin errnea de los datos experimentales sera en ambos casos, dar lugar a que un valor demasiado alto gran parte de K s se determina. Las verdaderas dinmicas de bioreactions nunca se revelan en las fermentaciones de lotes, que como se discuti anteriormente operar en una especie de estado pseudoestacionario debido a la "condicin de crecimiento equilibrado" con los niveles de enzimas constantes y una red de sealizacin sin cambios durante la mayor parte del lote. Es slo cuando el cultivo est expuesto a cambios bruscos del medio ambiente, que se observan las complejas y altamente no lineal dinmica de la cultura. Por ejemplo, esto puede ser obtenido en un experimento de pulso donde la glucosa se aade a un estado estacionario quimiostato que opera a una concentracin de glucosa de , O cuando se cambia la tasa de dilucin en un paso de, por ejemplo 0,05 / h a una tasa de dilucin mucho ms alto de, por ejemplo 0,25 / h. La cintica de estado estable discutidos anteriormente no se pueden utilizar para describir los transitorios que resultan de los cambios bruscos en el medio ambiente. Por ejemplo, si la ecuacin. (5a) se insert en un balance de masas transitoria para un quimiostato que se somete a un cambio de paso de tasa de dilucin deD 0 a un valor mucho ms alto D en el tiempo = 0:

ecuacin( 6 )

a continuacin, la longitud del transitorio se subestimada por al menos un orden de magnitud. A primera vista, se parece casi natural para el ingeniero reaccin qumica que una expresin de la velocidad, que fue derivada a un gran costo a partir de experimentos

en estado estacionario es intil para la interpretacin de los transitorios. En la catlisis heterognea uno est acostumbrado a una respuesta casi instantnea de la velocidad de reaccin cuando se cambia la concentracin de reactivo. La superficie cataltica establece un plazo mximo de unos segundos, una nueva actividad que correspondan al entorno modificado. La dinmica de cambio de la actividad cataltica pasa desapercibido en experimentos, que no se dirigen especficamente hacia los estudios de superficies catalticas. En principio, la situacin no es diferente para las reacciones celulares. La maquinaria celular reacciona de una manera mucho ms compleja y ampliamente con diferentes constantes de tiempo, la mayor de las cuales puede ser de varias horas. Slo en los ltimos aos las consecuencias de la lenta respuesta de los microorganismos a un entorno que cambia rpidamente estn empezando a ser entendido y aplicado en los estudios de la fisiologa celular.Ahora es posible disear un sistema de control de proceso para biorreactores que no se produce fuera de la pista por el-retrasos desde hace mucho tiempo en la respuesta de la cultura (en lugar incluso a fluctuaciones rpidas en, por ejemplo, el pH del medio). El primer intento de correlacionar los resultados de las mediciones de transitorios muy precisas de sustratos, productos metablicos y la concentracin de ARN (como un representante de la actividad de las clulas) por un modelo cualitativo era probablemente la de Benthin, Nielsen, y Villadsen (1992) y Benthin, y col . (1994) . Una tcnica de medicin mucho ms avanzado que permiti transitorios con constantes de tiempo de menos de que se sigui fue desarrollado por Reuss y compaeros de trabajo ( Theobald, Mailinger, Baltes, Rizzi, y Reuss, 1997 ). Ellos fueron capaces de seguir tambin metabolitos intracelulares (en la va EMP) y el modelo de la mayora de las respuestas de una manera cualitativamente satisfactoria.Mejoras posteriores ( Mauch, Vaseghi, y Reuss, 2000 , Cap. 14) permiten la tcnica a ser aplicada en el rango de milisegundos. Para ilustrar el poder de experimentos transitorios en la elucidacin de la regulacin metablica se dar un ejemplo sencillo ( Melchiorsen, 2000 ; Melchiorsen, Jensen, Christensen, Jokumsen, y Villadsen, 2001 ).figura. 1 muestra la va de EMP de Lactococcus lactis y el punto de ramificacin en piruvato a partir de la cual el cido lctico o el "cidos mixtos" se pueden formar. figura. 2a muestra el resultado de un experimento quimiostato anaerbico donde se cambia la tasa de dilucin de D = 0,10 / h a 0,50 / h en t = 0.Antes de que el cambio de la fermentacin era principalmente heterofermentantes con concentraciones de formiato, acetato y lactato igual a 77, 38 y , Respectivamente. Se necesita una relacin entre formiato y acetato de 2 para satisfacer el equilibrio redox. Tan pronto como D se incrementa, la produccin de acetato y formiato paradas. Estrechamente los puntos experimentales siguen la curva de lavado c / c 0 = exp (-0,5 t ) La produccin de lactato aumenta inmediatamente peso seco) en comparacin con peso seco en el primer estado de equilibrio D = 0,1 / h. Los resultados demuestran una regulacin de la enzima lactatodeshidrogenasa (LDH) en el nivel de protena: Tan pronto como D se cambia la concentracin de azcar y por lo tanto el nivel de la fructosa 1,6 bifosfato (FDP)

aumenta y LDH est listo para funcionar. La enzima ha sido tanto constitutivamente sintetizado a un nivel suficientemente alto como durante el largo perodo en el que la concentracin de azcar es bajo y su funcin fue parcialmente inhibida. Del mismo modo la enzima piruvato-formiato liasa (PFL), clave para las vas de cidos mixtos, es fuertemente inhibida por la glucosa a nivel de protenas (inhibicin metabolito): tan pronto como la concentracin de azcar aumenta pierde su actividad. Un anlisis ms detallado (no mostrado aqu) revela que PFL tambin es hacia abajo-regulada durante el transitorio: slo aproximadamente 1/3 de la concentracin de protena inicial (y completamente inactivo) est presente al final del transitorio.

. Figura 2. (a) Respuesta de un cultivo continuo de Lactococcus lactis cuando la tasa de dilucin es cambiado paso de 0,10 a . () glucosa, () biomasa de peso celular seco (DW), (+) lactato, () formiato, () acetato de etilo, () etanol. (B) Respuesta de la cultura cuando se paso la tasa de dilucin pas de 0,49 a . Smbolos como en (a). Opciones Figura Los resultados de un experimento de desplazamiento hacia abajo ( D 0,49 a 0,095 / h, ver fig. 2b ) se modela mediante un modelo de dos piezas simples ( Melchiorsen et al., 2001 ). Cuando la concentracin de glucosa se ha reducido por debajo de aproximadamente donde PFL no se inhibe, hay un salto en la actividad PFL desde casi cero a peso en seco), o 30% de la actividad de estado estacionario a D = 0.095 / h. Se concluye que la protena est disponible en una cierta concentracin a pesar de que es completamente inactivo hasta que el nivel de azcar es

bajo. El resto de la actividad que debe alcanzarse en la tasa de estado estacionario bajo dilucin se resintetizado con una constante de tiempo . Todos los perfiles de metabolitos, el perfil de la glucosa y el perfil de la biomasa se reproducen fielmente en este modelo simple con un primer tiempo de la orden constante y el salto inicial de la actividad PFL como los nicos parmetros. Se obtuvieron resultados similares para la fermentacin de la levadura porDuboc, von Stockar, y Villadsen (1998) en una investigacin que cubra condiciones anaerbicas y aerbicas y una alimentacin que consiste en glucosa, etanol o acetato. Se desprende de estas diferentes investigaciones que los microorganismos que crecen en un ambiente donde parte de la red de reacciones catablicas viables se apaga debido a la inhibicin metabolito y regulacin a la baja, con una capacidad para convertir las actividades enzimticas va catablica que quedan dentro y regeneran lentamente la baja enzimas cuando el ambiente se cambia favorablemente regulado. Las enzimas en las vas anablicas no tienen esta capacidad oculta. Por lo tanto, en un experimento de cambio ascendente, la biomasa se regenerar su actividad de manera exponencial, a partir de la capacidad de sntesis que corresponde al lento crecimiento antes de que el cambio en D . Desde un punto de vista estratgico, esto es una poltica de la sana primera prioridad del organismo cuando se encuentra en un medio ambiente mejor es activar las vas catablicas que proporcionan ATP para impulsar las reacciones anablicas. Los ejemplos anteriores de hecho muestran que los transitorios se pueden modelar, pero hasta que se sabe mucho ms acerca de la red de regulacin de los microorganismos en general, el xito de los modelos debe contar con una base de caso por caso. Uno debe tener un conocimiento considerable en el metabolismo del microorganismo investigado, y slo una parte de la dinmica de la red debe ser modelado por el experimento transitorio menos que la velocidad de adquisicin de datos se incrementa considerablemente (por ejemplo,Mauch et al., 2000 ). Otra complicacin surge cuando la modelizacin del comportamiento, incluso a largo plazo de una clula. La clula puede adaptarse al entorno. Cuando las clulas se hacen crecer a una tasa de dilucin de cerca al lavado que poco a poco se adaptan a estas condiciones de crecimiento, aumentando su max por los cambios genticos sutiles. Del mismo modo un lapso imprevisto en el control del nivel de glucosa puede inducir una reaccin hambre que conduce a la prdida de plsmidos, por ejemplo, para la produccin de antibiticos. Puede rpidamente detectar el error de control, pero una vez que comenz la respuesta gentica es irreversible. Se necesita una comprensin de este comportamiento para extender el tiempo til de la productividad del organismo. 5. Opciones Reactor Las variables importantes que determinan la conversin de sustrato y la relacin entre el producto deseado a la biomasa incluyen entre otros los piensos y la concentracin de nutrientes, pH, temperatura, presin, concentracin de biomasa (discutido anteriormente), y la distribucin del tamao del organismo. Reactor de diseo y la escala de hasta

consideraciones son impulsadas por la necesidad de proporcionar las condiciones ptimas organismo para producir el producto deseado de manera uniforme en el reactor. Se prefiere un quimiostato laboratorio o reactor de tanque agitado para el desarrollo de las expresiones cinticas de velocidad, debido a la uniformidad de las concentraciones y la temperatura en el volumen del reactor, y debido al transporte eficiente del gas a la fase lquida. El tanque agitado mecnicamente tambin se utiliza en el funcionamiento a mayor escala, y junto con el semi-lotes (fed-batch) del reactor tiene la ventaja de operar a un bajo nivel de sustrato, que normalmente es necesaria para la expresin de las protenas deseadas. Reactores gas-agitados tales como columna de burbujas y reactores de transporte areo se prefieren a menudo debido a un diseo simple y la falta de partes mviles, y se utilizan cuando la transferencia de masa gas / lquido no es limitante, o cuando los requisitos de energa para los reactores agitados mecnicamente son excesivas debido a el gran tamao del reactor requerido. En casos especiales, si ensuciamiento y la cada de presin se pueden controlar, el organismo puede ser inmovilizado o crecido en un relleno estructurado o monolito. Tales reactores se utilizan principalmente para la bio-tratamiento de gas residual y lquido en la industria del medio ambiente. Con la creciente comprensin de la fisiologa celular que puede llegar a ser posible proponer configuraciones de reactor y modos de operacin, que son ptimas para una biorreaccin dado. Por ejemplo se podra usar la respuesta al estrs de un organismo, que se induce cuando el organismo se ve obligado a desplazarse entre dos estados estables. Bien puede ser posible aumentar la productividad de un producto deseado, si la tasa de dilucin se realiza un ciclo entre un valor bajo y un valor ms alto ( Benthin et al., 1994 ). 6. Cuestiones de escala-up Numerosos problemas asociados con el diseo y la escala de biorreactores se han discutido en la literatura.Adems, hay cuentas publicados de la industria de los desastres cerca resultantes de escala de los procesos que se han "investigado a fondo en el laboratorio". Biorreactores tpicamente operan bien en una estrecha ventana de la temperatura, disuelto O 2 , pH y concentracin de la biomasa. Tpica escala-hasta problemas resultado de una inadecuada transferencia de masa interfase o eliminacin de calor del reactor, y de temperatura no uniforme y perfiles de concentracin en el reactor. La mezcla de alimentacin de alta concentracin de sustrato y un comportamiento inesperado de la biomasa (es decir, la floculacin, la formacin de espuma o crecimiento en la pared del reactor por encima del lquido debido a las salpicaduras) son otros problemas tpicos. Reactor modelos que tienen en cuenta la hidrodinmica, la interfase y la cintica de transporte son esenciales para evaluar el efecto de la concentracin y la temperatura no uniformidades en el rendimiento y la estabilidad de los microorganismos. Modelos de dinmica de fluidos computacional (CFD) se pueden utilizar para establecer la hidrodinmica, y los resultados se pueden incorporar en los modelos simplificados de

zona. Este tipo de anlisis permite captar la esencia de los patrones de flujo y su efecto en las distintas bioreactions, y establecer el grado de concentracin y los gradientes de temperatura. La distribucin del tiempo de residencia de los microorganismos en diferentes zonas en el reactor combinado con experimentos de laboratorio que simulan las condiciones en las diferentes zonas, se puede utilizar para establecer gradientes crticos que conducen a la muerte de microorganismos, mutaciones o cambios en la estructura de rendimiento. Por ejemplo, la red de zonas de modelo de Vlaev et al. (2000) con cientos de zonas se ha utilizado para simular un mecnicamente agitado fermentador a escala piloto. Los resultados indican que significativas O 2 y gradientes de nutrientes estn presentes incluso en este relativamente pequeo reactor. Gupta, Al-Dahhan, Dudukovic, y Toseland (2000) desarroll un lquido / modelo de zona de circulacin de gas para describir la hidrodinmica en un reactor de columna de burbujas, que tiene un nmero de zonas para cada fase. Este modelo ha sido validado con xito con una mezcla de metanol Sntesis de los datos de rastreo de la planta piloto sin requerir ningn parmetro ajustable. Los problemas y el enfoque de arriba deben ser considerados en las fases de diseo y de la ampliacin y el ingeniero qumico debe ser el experto. En lugar de que el tratamiento de este tema de manera exhaustiva, ofrecemos algunos ejemplos de problemas de escala hasta de nuestra propia experiencia. 7. La transferencia de calor Protenas unicelulares (SCP) se produce a partir del metano del gas natural mediante un proceso aerbico usando Methylococcus capsulatus . CH 4 se utiliza para producir de la biomasa, lo que conduce a la siguiente estequiometra de los reactivos principales: ecuacin( 7 )

El calor de reaccin es CH 4 que corresponde a protena producida de acuerdo con la ecuacin. (7) . Un biorreactor convencional del tipo de tanque agitado es un recipiente cilndrico con una altura igual a 3 veces el dimetro. El rea de transferencia de calor se compone de tubos verticales con un rea activa total prxima a la de la vertical de carcasa de cilindro. Para un motor de temperatura de 30 C y un coeficiente de transferencia de calor de se puede calcular la mxima productividad volumtrica en el reactor como ( q x ) mx = 0,60 V -1 / 3 , donde V es en m 3 y ( q x ) mximo en kg / m 3 / h. Con una densidad celular de ,

ecuacin( 8 )

Mientras que la tasa de dilucin en el reactor continuo de laboratorio est cerca de mx = 0,35 / h del organismo y por lo tanto muy satisfactorio, la productividad del reactor industrial es desastrosamente bajo. El diseo del reactor elegido por Norferm A / S (una filial de Statoil), que opera una planta de protena en Noruega est lejos de la de la biorreactor convencional. El metano puro y O 2 se inyectan en un tubo largo de ms de 100 m en la que el medio de fermentacin (300 ) Circula. A intervalos regulares, una parte del lquido se retira y se enfra por agua de mar en intercambiadores de calor externos.El reactor tubular que da una alta utilizacin de los gases, mientras que la concentracin de biomasa es constante alrededor del bucle (tiempo de residencia de lquido es de varias horas). 8. La adhesin celular y el crecimiento sobre superficies slidas En un quimiostato de estado estacionario que funciona a la tasa de dilucin D , la biomasa crece con una tasa especfica = q x / x = D si el cultivo se suspende. Lavado de la biomasa se produce cuando D se elige ms alta que la tasa mxima de crecimiento especfico max (vase la ecuacin. (5) para s f K s ), ya que la produccin de biomasa se hace menor que la velocidad de eliminacin de la biomasa en el efluente. En algunos casos, especialmente para las fermentaciones de hongos filamentosos-parte de la cultura crece en la superficie interna del reactor. Deje que la concentracin de biomasa suspendida ser y de adherirse biomasa (Conversin de una unidad 2 ms natural de g / m de superficie interior). Tanto la biomasa suspendida y adherirse crecer con el coeficiente de rendimiento misma Y sx en el sustrato y en la misma tasa de crecimiento especfico . Los dos tipos de biomasa se intercambian por cintica de primer orden. As, los siguientes balances de masa se cumplen: ecuacin( 9 )

donde 0 < k 2 < k 1 .

Para esta situacin D no es igual a en el estado estacionario, pero ecuacin( 10 )

Consideremos un caso en el que , Todo en unidades de (1 / h). Para el lavado del cultivo suspendido se produce para D = 5/12/h = 0,42 / h, mientras que lavado de la cultura actual est en D = 2,84 0,42 = 1,19 / h.

El espesor de una biopelcula que cubre la pared interna de un reactor es muy pequea, incluso cuando una parte sustancial de las adhiere biomasa. En el ejemplo anterior, con , Y sx = 0,5 y D = 0,2 / h, se puede calcular fcilmente un espesor de biopelcula en un reactor. Apenas ser detectado Esta pelcula, pero la cintica observada es bastante diferente de los verdaderos cintica con una cola larga que se extiende a D = 1,19 / h antes de que ocurra un lavado-sobreestimacin de max por un factor de 2,84. Al ampliarse hasta un reactor de la relacin entre la superficie interna del reactor y el volumen del reactor se hace despreciablemente pequea en comparacin con la de la reactor. Por lo tanto el crecimiento de la pared no tiene un efecto apreciable, pero si no se considera en la etapa de laboratorio que se traducir en un diseo bajo del fermentador por un factor mayor que 2,3 para cualquier valor de D elegido entre 0 y 0,42 / h. Los resultados de este estudio fueron en esencia derivada mediante el examen de los datos de laboratorio para un proceso de hidrlisis de una emulsin de aceite de linaza en un medio acuoso en cido oleico mediante un organismo con ms de expresado nivel de lipasa. Una cola larga no caracterstica de las x vs Ddatos llev a la sospecha de la adhesin celular, que luego fue confirmado. El aceite forma una capa delgada sobre la pared del reactor, y las clulas se adhieren a esta capa. 9. Mezcla El llamado reactor discontinuo alimentado se utiliza comnmente en la produccin a gran escala de muchos productos bioqumicos: antibiticos, enzimas detergentes y levadura de panadera. El proceso se inicia como un proceso por lotes para producir una cantidad suficiente de biomasa activa a partir de la fuente de carbono (por lo general un azcar). Cuando la concentracin de azcar inicialmente alta ( s 0 ) se reduce a un nivel bajo predeterminado, una corriente de alimentacin de los nutrientes con la concentracin de azcar ( s f ) se aade a una velocidad que mantiene la concentracin de azcar en el reactor a s . Operacin en constante s (es decir, constante ) contina durante muchas horas con un aumento exponencial v f -el perfil de alimentacin que se pueden mostrar para dar constantes -hasta que se alcanza un volumen mximo del reactor y el producto se cosecha. Naturalmente, es de inters para mantener s f tan alto como sea posible para evitar alcanzar el volumen mximo reactor hasta que una gran cantidad de producto (biomasa o producto excretado) se ha acumulado.La misma consideracin es vlida para un reactor de tanque agitado continuo: para obtener una alta concentracin de producto en el efluente a una tasa de dilucin dada la concentracin de la alimentacin de sustrato debe ser alta. Por consiguiente, el diseo de un biorreactor debe considerar que la concentracin de la alimentacin de nutrientes (o de la alimentacin de lcali para mantener constante el pH) es mucho mayor que la concentracin en el reactor. Tpicamente, la concentracin de azcar es 100 en la alimentacin, mientras que la concentracin de azcar en

el reactor debe mantenerse por debajo para evitar la formacin de subproductos no deseados. La mezcla de solucin de azcar en un medio con 10.000 veces la concentracin de azcar ms bajos y evitar el contacto de las clulas con las bolsas de solucin con ms del 50 azcar es en s mismo un problema tcnico formidable. A esto se suma la falta de fluidez y el comportamiento no newtoniano del medio, por ejemplo en la produccin de antibiticos utilizando hongos filamentosos. No es de extraar que la escala de mezclar sustrato ha causado muchas decepciones en bioprocesamiento de productos qumicos a granel. Hay numerosas patentes que describen la construccin ptima de los puertos de alimentacin y de agitadores mecnicos. Tambin hay muchos estudios acadmicos de la mezcla en biorreactores, ambos estudios experimentales y tericos basados en papeles ms o menos compartimentos realistas en el reactor, y, recientemente, tambin utilizando CFD, pero todava slo con los medios de comunicacin-como el agua. Como la produccin de levadura de panadero es un volumen alto, bajo proceso de valor agregado, este tema se ha prestado mucha atencin. En la fermentacin de levadura aerbica, si en algunas regiones del reactor de la tensin de oxgeno es demasiado baja o la concentracin de azcar es superior a aproximadamente se forma el etanol subproducto no deseado. Larsson et al. (1996) informan de los resultados de un gran proyecto europeo destinado a analizar el efecto sobre el escalado de la mezcla inadecuada. Reuss, Schmalzriedt y Jenne (2000) revisin de la aplicacin de CFD en el modelado de biorreactores de tanque agitado. Amanullah, McFarlane, Emery y Nienow (2001) han ideado una tcnica analtica para estudiar los gradientes de pH a veces graves, que resultan cuando se utiliza para controlar el pH a 6,8 por ejemplo, en un gran biorreactor. Vamos a ilustrar la gravedad de los problemas de mezcla con un ejemplo de -amilasa de produccin por hongos filamentosos, Agger (1999) y Agger, Spohr, y Nielsen (2001) . figura. 3 combina los resultados de muchas fermentaciones, todos ellos llevados a cabo a una tasa de crecimiento especfico de = 0.075 / h.Fue de inters para trabajar con una concentracin tan alta biomasa (peso seco, DW) como sea posible, ya que la tasa de produccin volumtrica de la enzima debera ser, idealmente, proporcional a x . Las altas concentraciones de biomasa en fijos se obtienen mediante el aumento de la concentracin de glucosa en la alimentacin. Por desgracia, la productividad de la amilasa especfica de las clulas disminuye casi inversamente con la concentracin de biomasa para un medio en el que x > 4 , Y el aumento de la productividad volumtrica es casi cero. La actividad especfica se normaliza a 100% en medio, y la disminucin de la actividad especfica por debajo medio puede ser causada por la inexactitud experimental (es difcil obtener una muestra lo suficientemente grande). Agger (1999) utilizado diferentes velocidades de agitacin y se purg con N 2 / S 2 mezclas con diferentes O 2 concentraciones. El presente se asegur de que la actividad especfica de la disminucin no se debe a la limitacin de oxgeno.

. Figura 3. Tasa especfica de -amilasa en la produccin de un quimiostato y en un cultivo discontinuo alimentado deAspergillus oryzae . La tasa de produccin especfica arbitraria se ha establecido en 100% a una concentracin cerca de la biomasa medio. Todas las fermentaciones se han llevado a cabo a una tasa de crecimiento especfica y la diferente x -valores se obtienen mediante el uso de alimentacin con diferentes concentraciones de glucosa. El almidn es hidrolizado extracelularmente a la glucosa. Con el alto nmero de copias, Aspergillus cepa de tipo salvaje utilizado en el estudio de la expresin de -amilasa es reprimida por la glucosa para las concentraciones de glucosa mayor que . Si una instantnea de la mezcla de piensos para el medio se lleva a cabo la concentracin de glucosa en el quimiostato o reactor de alimentacin discontinua sera muy por debajo y la productividad especfica se mantendra constante para cualquier valor de x . El problema de la mezcla es de una gran complejidad. Poco a poco, por macro y micromezcla la alimentacin se muele hasta la concentracin de glucosa predominante de unos pocos mg / l en el reactor.La alimentacin, y sobre todo el medio de fermentacin es muy viscosa y las hifas del hongo en suspensin vagan entre las regiones de baja concentracin y muy alto nivel de azcar. Es muy probable que el tiempo medio de las clulas estn expuestas a la concentracin de glucosa por encima es ms largo que el tiempo que se necesita para reprimir la expresin de la enzima, incluso si el tiempo de residencia en el fermentador es . Sera una propuesta de investigacin maravilloso para disear una investigacin experimental de la mezcla patrn y para simular el problema de la mezcla / difusin / reaccin con el estado de la tcnica de software CFD y un modelo con los supuestos realistas adecuados. Si bien este problema de ingeniera espera a una solucin, Agger (1999) ha resuelto el problema de la produccin prctica mediante la interrupcin de la creA gen, que es responsable de la glucosa en la represin de la expresin de -amilasa. Con la cepa genticamente modificada de la productividad especfica se mantuvo constante hasta al menos biomasa / medio kg. Este resultado pone de manifiesto que una visin de las

tcnicas de biologa molecular ser siempre indispensable en relacin con la ingeniera de bioprocesos biorreaccin si se van a utilizar en las producciones rentables. 10. Diseo, operacin y optimizacin de bioprocesos integrados El biorreactor es slo uno, aunque sea pieza clave del equipo en un diagrama de flujo del proceso industrial.Su funcionamiento adecuada es esencial para el resultado de todo el proceso, pero a veces el coste de separacin corriente abajo y fases de purificacin constituyen la mayor parte de los costes de inversin y de produccin. Esto es particularmente cierto para la produccin de protenas teraputicas que estn presentes en pequeas cantidades en el medio de fermentacin y que tienen que ser capturados en el medio en pocos pasos y eficiente para evitar una prdida inaceptable de rendimiento de producto. En la actualidad, se estn desarrollando una serie de mtodos muy especficos "de pesca", que son capaces de recoger la protena del medio gastado y enviar la protena directamente a etapas de purificacin y pulido para operaciones a gran escala. Cama Ampliado de adsorcin y separacin magntica con receptores especficos para la protena en las partculas finas son algunos de los mtodos que se estn ampliando actualmente a partir de laboratorio a la escala de produccin con capacidad de varios m 3 / h. Debemos, sin embargo, hablar de las consideraciones de diseo y procesos unitarios, sobre todo aguas abajo del reactor, pero a veces tambin aguas arriba, que son de particular inters para la produccin de productos bioqumicos de bajo valor. El cido lctico es un producto qumico de bajo precio que se produce por fermentacin usando glucosa (a partir de la industria del almidn) en algunos lugares y lactosa de permeato de suero, en otros entornos. El volumen actual de produccin mundial es de aproximadamente , Sin embargo, un aumento de la produccin de cerca de est prevista por una empresa conjunta entre Cargill y Dow, sobre todo para la fabricacin de polmeros a base de lactato. Es evidente que una produccin de estas cuestiones se destacan escala relacionados con la estabilidad del proceso, control de calidad de los productos, la minimizacin de los costos de inversin y de la produccin (especialmente la energa). Adems de optar por fermentaciones continuas como la nica alternativa viable para este gran volumen de proceso de valor de productos consideraciones serias bajas se debe dar a los procesos posteriores. Una cepa debe ser elegido lo que minimiza la formacin de subproductos ( . Fig. 1 ) y que convierte completamente el azcar, desde la aparicin de acetato de azcar o corriente abajo del reactor dar lugar a una grave prdida de la calidad del producto. Hay muchas maneras diferentes de cido lctico se recuperan de un medio que consiste en sales minerales y unos cido lctico: la precipitacin de lactato, electrodilisis y quizs extraccin lquido-lquido. Cada mtodo debe ser evaluada sobre la base de coste de los productos qumicos utilizados en el proceso de purificacin, el requisito de energa,

eliminacin de residuos, y de la seguridad del proceso de golf (procesos de membrana pueden ser plagados por la corrosin de las membranas). Como ejemplo de las consideraciones de diseo para el proceso de cido lctico discutiremos la ventaja potencial de recirculacin de clulas. figura. 4 muestra un tpico configurar con un ultrafiltro, que entrega libre de clulas permeado v 2 y un retenido, el cual es enviado de vuelta al reactor. Una corriente de purga se puede tomar directamente desde el fermentador como se muestra en la figura o desde el lado de presin del filtro.

. Figura 4. Esquema de un biorreactor de tanque agitado continuo (quimiostato) con recirculacin celular. El ultrafiltro no es permeable a las clulas. Las concentraciones de azcar ( s s f ), cido lctico ( p ) y la biomasa ( x ) en el reactor de volumen V se indican en la figura. La tasa de dilucin es D = v / V = ( v 1 + v 2 ) / V . Definir el factor de separacin S = v 2 /v y la concentracin de clulas en el retenido como x R (> x ). Un balance de masa para el sistema (Nordkvist, 2000 ) da la siguiente: ecuacin( 11 )

P = productividad de cido lctico = SDP SD ( p ( S = 0)). Ecuacin. (11) se cumple para cualquier cintica que depende nicamente de las concentraciones de sustrato y producto, tambin si el mantenimiento, la ecuacin. (3) se incluye. Si el sangrado es considerado como residuo la productividad en un volumen de reactor dado aumenta proporcional a S (1 - S ) -1 ya que la demanda de que casi no hay azcar est presente en el efluente asegura que p = p ( S = 0) para una fermentacin con cido lctico como el nico producto. Los estudios experimentales ( Brgardts, Krischke, Trsch, y Brunner, 1998 ) muestran que se logran estos objetivos de produccin: el uso de permeado de suero con lactosa / l suministra con una fuente de protena que obtienen y . En = 0,18 / h sin lactosa se

encuentra en el efluente y con S = 0,9 una tasa de dilucin de aproximadamente 1,5 / h todava asegura 100% de conversin del azcar. Hay un precio para el aumento de la productividad por un factor S (1 - S ) -1 . Supongamos que de se trata en un reactor de volumen y v 1 es , Y el rea de filtro es requerido y con S = 0,9. v 2 es . Un filtro diseado de forma conservadora soporta un flujo . Para mantener el flujo el flujo filtro, lo que dara un flujo de la . Para una cada de presin de 4 bar entrada de energa es

volumtrico en el filtro podra ser, por ejemplo recirculacin de asumido sobre el filtro de

para una bomba con 65% de eficiencia. Teniendo en cuenta estos nmeros (que son ciertamente no optimizado con respecto al diseo del filtro) es posible concluir si el ahorro en volumen de reactor son mayores que el costo de la energa y la diferencia entre la inversin en una unidad de UF y un filtro de tambor convencional. Considerando que la instalacin de una unidad de la recirculacin de clulas para reducir el volumen del reactor puede quizs aparecer como una complicacin innecesaria cuando se ve desde el punto de vista del diseo del proceso integrado, que puede ofrecer otros beneficios. Villadsen (1999) investig el diseo de un proceso biotecnolgico para la degradacin de un recalcitrantes, impureza aguas residuales txicas (un organofosforado). Un determinado organismo puede utilizar el compuesto como sustrato, pero slo en concentraciones bajas. A concentraciones ms altas, el crecimiento se ve gravemente inhibida sustrato, y est bien representada por la ecuacin. (5b) . Con la inhibicin de sustrato pronunciada de es obvio que un quimiostato es el modo correcto de funcionamiento. Para dar un estado de equilibrio asintticamente estable se debe trabajar en una concentracin de sustrato inferior , El valor de s en el mximo de , pero a una tasa de dilucin no mucho menor que el mximo 0.036 / h de (s). La recirculacin es ventajoso por dos razones: En primer lugar una capacidad de estado estacionario aceptable del reactor se puede obtener a pesar de la baja tasa de crecimiento mximo de 0.036 / h. No se esperan problemas con el bombeo de lquidos de alta densidad celular ya que la concentracin de la alimentacin del contaminante es muy baja ). Ms significativamente se muestra que la estabilidad del estado de equilibrio se mejora significativamente por la recirculacin. Sin recirculacin de una fluctuacin del 1% en s f alrededor dar lugar al lavado de la cultura a causa de la rama larga, inestable del de a . Incluso un modesto recirculacin permite una operacin estable y ms de 95% de degradacin del contaminante, incluso cuando s f flucta alrededor de 25% . 11. Observaciones finales En un momento de forma exhaustiva, hemos tratado de sealar algunos problemas insuficientemente tratados en ingeniera biorreaccin. El diseo y la interpretacin de los datos de laboratorio para la cintica de fermentacin se han abordado. La combinacin de

la cintica, la hidrodinmica y los fenmenos de transporte que ofrecen la escala adecuada de biorreactores de laboratorio a escala industrial se examin a continuacin. Por ltimo, y slo brevemente, se consideraron la seleccin del reactor y la integracin del biorreactor en todo el diseo del proceso. El aumento de la presin de la comunidad industrial ayudar a identificar los problemas ms dignos, acelerar nuestra comprensin del diseo del proceso y las cuestiones de escala, y apoyar la educacin de los biotecnlogos con una slida formacin en la biologa molecular y la ingeniera qumica.