PREPARATE ENZIMATICE UTILIZATE N INDUSTRIA BERII

n industria berii intervin dou tehnologii distincte i anume tehnologia malului i tehnologia berii.

4.1. TEHNOLOGIA MALULUI

Tehnologia malului implic urmtoarele operaii (fig. 1) din care, din punct de vedere biotehnologic, intereseaz operaia de germinare a orzului, respectiv orzoaicei, materii prime de start. Germinarea orzului/orzoaicei are drept scop urmtoarele: sinteza de enzime n cantitate mai mare; micorarea complexitii substanelor de rezerv i a celor ce intr n structura bobului de La germinarea orzului/orzoaicei au loc urmtoarele procese: creterea esutului embrionar cu dezvoltarea plumulei i a radicelelor; activarea enzimelor preexistente n orz i sintetizarea de novo a enzimelor, n principal a

orz/orzoaic, proces denumit i solubilizarea orzului.

hidrolazelor, orzul/orzoaica matur() coninnd n cantiti mici toate enzimele hidrolitice cu excepia -amilazei. La germinare se formeaz deci amilaz i cantiti noi din celelalte hidrolaze n urmtoarea succesiune: -glucanaze, -amilaz, enzime proteolitice (peptidaze i proteinaze), fosfataze, -amilaz; respiraia, care va fi dependent de aerarea orzului n procesul de germinare. La germinare sunt degradate principalele substane din orz i anume: Degradarea amidonului. Coninutul de amidon scade de la ~ 63% la ~ 58% prin formare de zaharuri simple sub aciunea amilazelor. Din zaharurile simple formate ~ 50% sunt consumate prin respiraie. Activitatea amilazic a malului finit se msoar prin puterea diastazic.

Orz brut Condiionare Precuraire Curire Sortare pe calitate Depozitare pentru postmaturare i nvingerea repausului germinativ Ap nmuierea orzului la 1520C/36-48 ore, splare i dezinfectare Germinare 17-25C/4-6 zile Aer cald Orz germinat (mal verde) Uscare la 50-60C la 60-80C Rcire i degerminare Mal finit Depozitare pentru maturare

Aer

Aer

Fig. 1. Schema de operaii unitare a procesului de fabricare a malului Degradarea hemicelulozelor Pereii celulari ai bobului de orz sunt formai din

hemiceluloze, respectiv din -glucani (80-90%) i pentozani (20%). -Glucanii sunt polimeri liniari cu mas molecular mare (conin ~ 200000 resturi de D-glucopiranoz) formai din D-glucoz legate ntre ele -1,4 (70%) i 1,3 (30%). La nivelul pereilor celulari -glucanii sunt legai de proteine prin legturi covalente, formnd complexe care realizeaz o matrice relativ rigid. Pentozanii sunt polimeri ramificai cu mas molecular mare formai din molecule de D-xiloz legate -1,4. Lanurile laterale sunt formate din arabinoz. Prima enzim implicat n degradarea -glucanilor este -glucan solubilaza care realizeaz scindarea -glucanului de protein (enzima joac rolul unei carboxipeptidaze), glucanii eliberai din complex devenind solubili. -Glucan solubilaza este prezent n orz dar este i sintetizat n cursul germinrii. Enzima este termostabil, fiind stabil la brasaj, timp de o or i la 65C. -Glucanii sunt degradai n continuare de -glucanaze diferite. Dou endo--

glucanaze i anume -1,3 glucanaza i 1,3-1,4 glucanaza sunt n principal sintetizate la germinare i vor interveni n degradarea pereilor celulari ai orzului. Aceste -glucanaze fragmenteaz lanul -glucanic conducnd la -oligozaharide. Exo -glucanazele desprind o molecul de celobioz de la captul nereductor al lanului -glucanic iar celobioza la rndul ei este transformat n dou molecule de glucoz de ctre celobiaz (-glucozidaz). Circa 50-90% din activitatea -glucanazelor este pierdut la uscarea malului, iar la brasaj hidroliza -glucanilor are loc la 45-55C deoarece la temperaturi ceva mai ridicate aceste -glucanaze sunt inactivate rmnnd doar -glucan solubilaza care va elibera glucani din complexul cu proteinele, ceea ce va conduce la creterea vscozitii mustului i deci mrirea timpului de filtrare a plmezii. Un exces de -glucani n bere poate cauza dificulti de filtrare sau tulburri n produsul finit. Enzimele care degradeaz pentozanii sunt: endoxilanaza (hidrolizeaz legturile - 1,4 din interiorul lanului pentozanic); exoxilanaza (hidrolizeaz legturile -1,4 de la captul lanului pentozanic); arabinoxilanaza care acioneaz asupra lanurilor laterale de pentozani formate din arabinoz cu eliberare de arabinoz; xilobiaza care degradeaz xilobioza la dou molecule de xiloz. n prima etap de degradare a -glucanilor i a pentozanilor se formeaz dextrine liniare -glucanice i respectiv dextrine ramificate -pentozanice. n etapa a doua dextrinele menionate sunt degradate la celobioz i respectiv xilobioz (dizaharide) i glucoz, respectiv arabinoza, xiloz (monozaharide). Hidroliza hemicelulozelor (-glucani) i pentozani are loc n proporie de 70% n timpul malificrii orzului (fig. 2). Gradul de degradare a hemicelulozelor se apreciaz prin diferena de randament ntre mciniul fin i mciniul grosier (dur) care trebuie s fie maximum 2,2% i prin msurarea vscozitii mustului de laborator (maximum 1,85 mPas) respectiv a coninutului de -glucani (~ 200 mg/l). Degradarea proteinelor. Sub influena peptid hidrolazelor (endo- i exopeptidaze i proteinaze) are loc o hidroliz a substanelor cu azot fapt ce este apreciat prin gradul de solubilizare proteic (cifra Kolbach) i coninutul malului n azot aminoacidic. Nivelul de solubilizare este n funcie de tipul de bere ce se produce din malul respectiv: malul tip Pils va conine ~ 600 mg/100 g s.u. azot solubil total i 126 mg/100 g s.u. azot -aminic; malul pentru berea blond va conine 700 mg/100 g s.u. azot solubil total i 147 mg/100 g s.u. azot -aminic;

malul pentru berea brun va conine 900 mg/100 g s.u. azot solubil total i 190 g/100 g s.u. azot -aminic.

Fig. 2. Hidroliza pentozanilor i -glucanilor Din diferite cauze, malul finit poate prezenta urmtoarele deficiene: coninut ridicat de boabe negerminate, care se constat prin msurarea plumulei 2/3 pn la 3/4 din lungimea bobului la malul blond; 3/4 pn la 1/1 din lungimea bobului la malul brun. (acrospirei) care, n mod normal, la orzul bine germinat este:

Dac plumula este zero, orzul se consider negerminat i atunci se determin procentul de boabe negerminate. Un mal cu 8% boabe negerminate este de fapt un amestec de mal i orz i ca atare la plmdire se intervine cu enzime din afar pentru a suplimenta nivelul de enzime al boabelor negerminate la nivelul celor germinate. n acest scop se recomand s se foloseasc Cereflo 200 L (endo--glucanaz dar care are i activitate nestandardizat de -

amilaz) + Cereflo 2XL (conine -amilaz, -glucanaz i proteaz), Ceremix 2XL + Ultraflo L (conine -glucanaza) sau Ceremix 6XMG (conine proteaza neutr, -amilaz, -glucanaz, pentozanaz i celulaz). Se poate folosi i Alphalase AP-3 care conine -amilaz, proteaz i glucanaz. Mal deficitar n -amilaz, deficien care se poate constata analitic prin una din determinarea duratei de zaharificare (normal 15 min); determinarea filtrabilitii palierului 80C de la brasaj (analiza Hartong-Piratski); determinarea gradului de fermentare a mustului de laborator (minimum 80%); determinarea coninutului de -amilaz dup metoda EBC. urmtoarele metode:

Prelucrarea malului cu deficien n -amilaz va avea urmtoarele consecine: obinerea de plmezi nezaharificate; filtrabilitate redus a mustului i berii; flocularea prematur a drojdiei la fermentare; obinerea de bere cu grad de fermentare redus; apariia de urme de nezaharificate n must i bere. Deficienele menionate se pot corecta folosind enzime exogene n diferite etape tehnologice: plmdire, n mustul cu hamei nainte de fierbere; n linul de fermentare. Deficitul de -amilaz n mal poate fi corectat dup cum urmeaz: adaos de Fungamyl 800L n proporie de 1-2kg/t mcini la plmdire; adaos de Termamyl 120 L n proporie de 2g/hl must; adaos de Fungamyl 800 L n proporie de 0,5-3 g/hl must n linul de fermentare (doza

de 0,5 g/hl se utilizeaz atunci cnd temperatura de fermentare este de 4-7C, doza de 3g/hl se folosete cnd se dorete un grad de fermentare mai ridicat); adaos de Nervanase BT-2 n proporie de 1,5l/ton mal pentru Nervanase BT-2 (180) Mal incomplet citolizat. Aceast deficien a malului se poate constata prin urmtoarele

determinri: diferena ntre mciniul fin i grosier (dur), care n mod normal trebuie s fie 1,8%; vscozitatea mustului de laborator care n mod normal trebuie s fie 1,5-1,65 mPasec. Folosirea malului incomplet citolizat ar conduce la randament n extract mai sczut, o filtrabilitate mai sczut a mustului i berii. Se recomand n acest caz folosirea urmtoarelor preparate enzimatice exogene: Cereflo 200L n proporie de 0,5-1 kg/ton mal sau Ultraflo L n proporie de 0,2 kg/ton mal. Deoarece Ultraflo L are numai activitate -glucanazic, n principal, i celulazic, pentozanazic, arabinazic, n secundar, i nu are activitate -amilazic, cele dou enzime se utilizeaz mpreun la plmdire, n urmtoarele proporii: Cereflo 200L 0,4-0,8 kg/ton mal iar Ultraflo L 0,1-0,2 kg/ton mal.

Se mai recomand i adaosul de Fynizym n proporie de 1g/hl must; la fermentarea primar se pot folosi i combinaiile Ceremix 2XL+Cereflo 200 L; Ceremix 2XL + Ultraflo L sau Ceremix 6XMG, al crui dozaj se face n funcie de diferena ntre randamentul n mcini fin i grosier (dur) aa cum se arat n tabelul 1. Tabelul 1. Corelaia dintre diferena de mcini n % i adaosul de Ceremix 6XMG Diferena de randament de mcini % Ceremix 6XMG g/ton mal 3,0 50 3,5 100 4,0 150 4,5 200 5,0 250

Se poate utiliza i -Glucanase 200 L n proporie de 250-500 ml/ton mal. Mal insuficient solubilizat proteolitic. n general un mal bine solubilizat este azot solubil total pentru o bere blond 550-750 mg/100 g s.u.; azot aminic liber, minimum 150 mg/100 g s.u. Determinrile se fac pe mustul de laborator. Dac valorile menionate nu sunt realizate, malul este insuficient solubilizat i va avea urmtoarele consecine: ncetinirea procesului de fermentaie i respectiv oprirea procesului de fermentare la diferite grade de fermentare (aceste deficiene sunt datorate n principal coninutului mai sczut de aminoacizi liberi). La un coninut de aminoacizi liberi prea mare (mal suprasolubilizat) se va influena negativ culoarea mustului la fierbere i implicit a berii i de asemenea se vor nruti proprietile senzoriale i stabilitatea berii (coloidal i biologic). Pentru a remedia aceast deficien a malului (de slab solubilizare) se recomand folosirea la brasaj a preparatului Neutraz 0,5L n proporie de 0,3-0,7 kg/ton mal. Se mai poate folosi Proteinase 200 L n proporie de 0,25 kg/ton mal. caracterizat prin urmtoarele:

4.2. TEHNOLOGIA BERII

Tehnologia berii implic operaiile menionate n figura 3, din care, din punct de vedere biotehnologic, intereseaz operaiile de brasaj (plmdire i zaharificare), fermentaie /primar i secundar) i maturizare a berii.

Mal Pretratare mal Curire Desprfuire Mcinare Brasaj

(Plmdire i zaharificare) 4070C 100 150 min

Cereale nemalificate

Pstrare cereale Curire Desprfuire

Pregtire termic a nemalificatelor (cazan de plmdire) 50100 C 40-60 min Borhot

Filtrare plmad zaharificat

Hamei

Must Fierbere must cu hamei Separarea trubului la cald Trub la cald Rcire n schimbtor cu plci de la 95C la 8C Limpezire la rece Trub la rece

CO2

Fermentare 10-20C 0-15 zile Tanc de maturare la 0C/7-21 zile Filtrare bere Pasteurizare n tunel sau Flash 64-70C/40/0,5 min

Inoculator drojdie

Drojdie

Tragere bere la sticle, butoaie, cutii

Fig. 3. Schema tehnologic de obinere a berii

Plmdirea i zaharificarea plmezii (brasaj) este operaia care se execut n scopul obinerii mustului. Substanele care trec din mal n must formeaz extractul mustului, extract ce este format prin solubilizarea substanelor solubile preexistente n mal, respectiv cele care devin solubile n operaia de brasaj sub influena enzimelor din mal i a celor adugate. Principalele enzime care acioneaz la brasaj i sunt proprii plmezii sunt artate n tabelul 2. Tabelul.2. Principalele enzime de plmad i caracteristicile lor
Enzima pH optim Temperatura optim Temperatura de inactivare, C 80 Legtura hidrolizat Produse de hidroliz

Enzime care hidrolizeaz amidonul

-amilaza 5,6-5,8 70-75 -1,4 din orice loc n dextrine liniare din interiorul amilozei i amiloz amilopectinei. dextrine ramificate Aciunea se oprete la din amilopectin 2-3 resturi glucoz maltoz (puin) i naintea legturii -1,4 glucoza din amiloz i amilopectin -1,4 de la captul dextrine nereductor al catenei ramificate att la amiloz ct i la maltoz amilopectin. Aciunea se oprete la 2-3 resturi glucoz n faa legturii -1,6 Dextrine liniare cu mas 1,6 molecular mic din cele ramificate cu mas molecular mai mic (5-8 resturi de glucoz) Maltoza 2 Glucoz Zaharoza Glucoza+fructoza Legturi peptidice din interiorul polimerului proteic Legturi peptidice din interiorul polimerului proteic Legturi peptidice de la captul Cterminal Dipeptide Legturi 1,4 Peptide scurte

-amilaz

5,4-5,6

60-65

70

Dextrinaza limit (pulullanaza)

5,1

55-60

65

Maltaza Invertaza Endopeptid hidrolaze (proteinaze) Carboxi peptidaze Amino peptidaze Dipeptidaza Endo 1,4 glucanaza Endo -1,3 glucanaze -Glucan solubilaza

6,0 5,5 3,9 i 5,5 5,2-5,6

35-40 50 45-50

40 55 7

Enzime care hidrolizeaz substanele cu azot

50

70

Peptide scurte

7,0-7,2

40-45

55

Aminoacizi

8,8 4,5-4,8 4,6 i 5,5 6,6-7,0

40-45 40-45 60 63

55

Aminoacizi

Glucanaze
55 70 73 -glucani cu mas molecular mic Legturi 1,3 -Glucani cu mas molecular mic Legtura dintre - -Glucani + protein glucan i proteine

Enzima

pH optim 5,0 5,0 4,6-4,7

Temperatura optim 42 45 40-50

Temperatura de inactivare, C

Legtura hidrolizat

Produse de hidroliz

Endoxilanaze Exoxilanaze Arabino xilanaza Fosfataze Peroxidaze Lipaze

60

Xilandextrine Xiloza Arabinoza

Alte enzime
5,0 50-53 50-65 50 60 70-75 65 Fosfai organici Oxidarea polifenolilor Lipide Acid fosforic Polifenolioxidai Acizi grai + glicerin

Substraturile atacate n timpul brasajului sunt substanele cu azot, hemicelulozele, compuii cu fosfor, polifenolii, lipidele i amidonul. Degradarea substanelor cu azot Substanele cu azot din orz sunt solubilizate n proporie de ~ 70% la malificare de ctre peptid hidrolazele existente n orz i cele sintetizate la malificare. n malul uscat vor rmne active n principal proteinazele (endopeptid hidrolazele) i carboxipeptidaza. n timpul malificrii se vor forma din proteinele insolubile de depozit, proteine solubile, peptide i aminoacizi. La brasaj vor exista n plmad proteine insolubile, globuline i albumine solubi le, peptide i aminoacizi. Primul palier de temperatur la brasaj este cel denumit proteolitic i este cuprins ntre 40 i 50C iar durata variaz ntre 15 i 60 minute. n timpul acestui palier se vor hidroliza n continuare proteinele cu formare de peptide i aminoacizi. Sub aciunea enzimelor proteolitice menionate n tabelul 6,2, aciunea acestor enzime fiind dependent de temperatur, pH i durat. La temperaturi de 40-45C se formeaz produi cu mas molecular mai mare (acioneaz mai bine endoproteinazele i carboxipeptidazele). Dac pauza de proteoliz la 4550C este mai mare se micoreaz cantitatea de substane cu mas molecular mai mare i deci se va influena negativ capacitatea de spumare a berii i stabilitatea spumei acesteia. Produii rezultai n urma activitii endo- i exopeptid hidrolazelor sunt urmtorii: Compui macromoleculari cu masa molecular 60000 care constituie azotul coagulabil i care reprezint ~ 20% din substanele cu azot ale mustului nefiert. Aceti compui sunt coagulabili la plmdire i mai ales la fierberea mustului. Sunt precursori activi de trub din bere; Compui cu mas molecular medie (10000-60000) care reprezint ~ 20% din substanele Compui cu mas molecular mic, reprezentnd ~ 60% din substanele cu azot din must, cu azot din must. Au aciune favorabil n formarea spumei berii, fiind relativ termostabili; din care circa 22% sunt -aminoacizi liberi, surs de azot pentru drojdii. Coninutul n -aminoacizi din must trebuie s fie 200 mg N/l pentru a se asigura multiplicarea drojdiei i o arom corect a berii.

Controlul degradrii substanelor cu azot la brasaj se face prin determinarea azotului solubil, azotului coagulabil, azotului -aminic. Un indice important este cifra intensitii plmdirii dup Kolbach cu valori ntre 80-120 (normal 105) care se calculeaz cu relaia: Grad de solubilizare n primul must Intensitatea plmdirii = _________________________________100 Grad de solubilizare n mustul congres fiert Substanele cu azot formate la brasaj i care ajung n must sunt implicate n: nutriia drojdiei pentru fermentare deci i formarea unor substane de arom; nsuirile senzoriale ale berii finite (plintate i rotunjire, gust, culoare); capacitatea de spumare a berii i nsuirile spumei (densitate, persisten, volum); formarea trubului n berea finit, deci stabilitatea coloidal a berii. Degradarea hemicelulozelor n timpul palierului de proteoliz are loc i o degradare a

-glucanilor din pereii celulari ai endospermului sub influena -1,3-1,4 glucanazei i endo 1,4 glucanazei care acioneaz bine la 40-45C i sunt inactivate la 55-60C. La temperaturi mai mari se elibereaz -glucani din complexele cu proteinele sub influena -glucan-solubilazei i respectiv este eficient endo 1,3- glucanaza care acioneaz bine la 60-62C. Rezult c n must pot exista -oligozaharide, glucoza, arabinoza, xiloz, precum i -glucani i pentozani n msura n care acetia nu au fost solubilizai. Rezult cu nivelul de -glucani i -xilani din must va fi cu att mai mare cu ct malul iniial a fost mai slab solubilizat. Pe de alt parte nivelul substanelor menionate n must va fi mai mare dac nu se respect la brasaj parametrii optimi de aciune ai -glucanazelor i xilanazelor. Degradarea compuilor cu fosfor Degradarea fosfailor are loc sub influena fosfatazelor din mal care hidrolizeaz compuii cu fosfor organici elibernd acid fosforic. Acidul fosforic eliberat reacioneaz cu srurile din ap i formeaz n plmad i must sisteme tampon. Are loc i o scdere a pH-ului plmezii. Condiiile optime pentru fosfataze sunt: temperatura 50-53C (sunt inactivate la temperaturi mai mari de 60C i pH = 5). Temperatura de plmdire de 5862C restrnge activitatea fosfatazelor. Degradarea compuilor cu fosfor este influenat de gradul de solubilizare a malului, de activitatea fosfatazic a malului i condiiile de brasaj. Degradarea polifenolilor Polifenolii reprezint 0,3-0,4% din substana uscat a orzului, fiind localizai n coaj i strat aleuronic (mai puin) precum i n endosperm. La brasaj, polifenolii care trec n plmad i respectiv n must vor forma cu proteinele compleci insolubili (mai ales la fierberea mustului cu hamei), ceea ce va face ca berea finit s fie mai stabil coloidal. n prezena aerului ns, polifenolii pot fi oxidai enzimatic la brasaj, cu formare de

compui incolori care apoi se vor polimeriza n compui colorai. Brasajul, la temperaturi mai mici (~ 50C) i cu pauze mari va conduce la o cantitate mai mare de polifenoli n must, iar un brasaj la temperatur mai mare i durata mai mic va conduce la un must cu un coninut mai redus de polifenoli. La plmdire este necesar s se ia urmtoarele msuri: s se evite contactul cu aerul pentru a nu se ajunge la formarea de substane colorante; s se corecteze pH-ul (pH-ul deplasat spre acid conduce la micorarea oxidrii s se inactiveze enzimele care catalizeaz oxidarea enzimatic a polifenolilor prin adaos Degradarea lipidelor Degradarea lipidelor aduse de mal (trigliceride mono- i

polifenolilor); de formaldehid (250 mg/kg mal folosit la plmdire). digliceride, fosfatide) are loc i la brasaj, sub influena lipazelor din mal, care au temperatur optim la 35-40C i sunt inactivate la 65C/30 min. La plmdire la 62-64C n must se gsete o cantitate mai mic de lipide dect la plmdire la 68C. La fierberea mustului i la rcirea acestuia, odat cu trubul format se elimin o parte din lipidele mustului. Cu ct n must se gsete o cantitate mai mare de lipide nehidrolizate cu att se influeneaz mai mult negativ gustul berii i nsuirile de spumare ale berii. Degradarea amidonului Degradarea amidonului decurge n trei faze: absorbia apei i umflarea granulei; gelatinizarea amidonului; degradarea enzimatic a componentelor granulei de amidon (lichefiere i zaharificare). n prima faz granula de amidon absoarbe apa i i mrete volumul, cu att mai mult cu ct temperatura apei de plmdire este mai mare (volumul maxim se obine la 50C). n faza a doua granula de amidon se fisureaz iar cnd granula ajunge la temperatura de gelatinizare, se distruge i amidonul se transform ntr-o soluie vscoas, care la rcire se gelific. Soluia vscoas de amidon este format din molecule de amilopectin dispersate n faza continu format din amiloz. Temperatura de gelificare a amidonului este n funcie de proveniena acestuia (tabelul 3).

Tabelul 3. Temperatura de gelatinizare a amidonului din diferite surse Sursa de amidon Cartofi Gru Porumb Orz(mal) Orez Temperatura de gelatinizare, C 55-60 62-74 70 60 68-78

n faza a treia sub aciunea enzimelor sintetizate n principal la malificare au loc dou procese i anume: lichefierea amidonului, care se manifest prin micorarea vscozitii amidonului zaharificarea, care const n scindarea legturilor -1,4 din amiloz i amilopectin de gelatinizat sub aciunea dextrinizant a -amilazei (optim la 70C); ctre -amilaza cu formare de dextrine liniare i ramificate i cu mas molecular mai mic, precum i cantiti mici de maltoz i glucoz; concomitent acioneaz i -amilaza (optim 63C) cu formare de amilopectin. (Att aciunea -amilazei ct i a -amilazei asupra amilopectinei se oprete la 2-3 resturi de glucoz n faa legturilor -1,6 din amilopectin. Dextrinaza limit (optim 55-60C) are o aciune slab deoarece este inactivat la temperaturi sczute (65C). n fig. 4. se arat schema de degradare a amidonului la brasaj. Pentru a obine musturi cu fermentescibilitate mai mare (coninut mai mare de lactoz) se fac pauze mai mari la temperatura de 62-63C, adic la temperatura optim de aciune a amilazei i se corecteaz pH-ul plmezii la 5,4-5,6. Dac se fac pauze mari la 72-75C, adic la temperatura optim de aciune a fermentescibilitate mai redus. Aciunea de zaharificare a enzimelor din plmad va putea fi deci influenat prin temperatur, durat, pH, concentraia plmezii. O zaharificare bun a amidonului trebuie s conduc la musturi cu grad final aparent de fermentaie de cel puin 80% (must numai din mal). -amilazelor, musturile sunt mai bogate n dextrine, deci au

Figura 4 Schema de degradare a amidonului la malificare i brasaj

2.1. Preparate enzimatice exogene utilizate la fermentarea primar

Preparatele enzimatice folosite la fermentaia primar se utilizeaz pentru unul din urmtoarele scopuri: hidroliza urmelor de amidon din must; creterea gradului de fermentare; mbuntirea filtrabilitii berii. n primul caz, se tie c mustul diluat, rezultat din amestecarea primului must cu apele de splare a borhotului (denumit i mustul de cazan plin) se fierbe mpreun cu hameiul, dup care se separ trubul la cald, se rcete pn la temperatura de nsmnare i se limpezete la rece. Acest must mai poate conine urme de amidon nehidrolizat (valori de iod mai mari de 0,2 determinate fotometric dup metoda EBC), care ar afecta stabillitatea coloidal i microbiologic a berii finite. Pentru a nltura acest inconvenient se recomand un adaos de Fungamyl 800 L, n proporie de 0,3-0,5 ml/hl must, n linul de fermentare, preparat enzimatic care este o -amilaz fungic ce hidrolizeaz legturile 1,4 din amiloz i amilopectin. Prin adaos de Fungamyl 800 L, crete i gradul de fermentare cu 2.5%. n cel de-al doilea caz, pentru creterea gradului de fermentare, este necesar s se modifice spectrul n hidrai de carbon al mustului, ceea ce se poate realiza prin urmtoarele metode: modificarea diagramei de brasaj, prin mrirea pauzei la 63C, pentru creterea cantitii de zaharuri fermentescibile; adaos de extract de mal cu putere diastazic ridicat n timpul fermentaiei, ns exist pericolul infectrii mustului iniial; prin utilizarea unor preparate enzimatice pentru zaharificare, fie la brasaj, fie la fermentare. Ca preparate enzimatice se pot folosi: Fungamyl 800L n proporie de 0,3-1 ml/hl must pentru un grad de fermentare de 80-85%; Fungamyl 800 L n proporie de 1-5 ml/hl must pentru un grad de fermentare de 85-90%. Preparatul enzimatic se adaug n linul de fermentare. AMG-300 L (amiloglucozidaza), n proporie de 5 ml/hl must, n care caz se obine un grad de fermentare foarte mare ( 100%), berile respective avnd un coninut redus de hidrai de carbon. Explicaia faptului c prin folosirea AMG se obine un grad de fermentare aa de mare, const n aceea c AMG scindeaz att legturile -1,4 ct i pe cele -1,6 glucozidice de la captul nereductor al substratului care poate fi amidonul, dextrinele sau oligozaharidele din must, cu eliberare de glucoz.

Promozym 200L, n proporie de 32 ml/hl must pentru a obine un grad de fermentare de

pn la 90%, enzima producnd deramificarea dextrinelor i amilopectinei, prin scindarea legturilor -1,6. Ambazyme 200 L (amiloglucozidaza), care se folosete n proporie de 3-9 g/hl must; Amylozyme 200 L, care se folosete n proporie de 1-2 g/hl must. Preparatele ezimatice utilizate, dup ce au acionat, trebuie s fie inactivate, ceea ce impune pasteurizarea berii finite. Acest lucru se impune cu att mai mult cu ct att AMG ct i Fungamyl au i o activitate proteolitic nestandardizat care ar putea conduce la deprecierea berii. Pentru inactivarea enzimelor respective trebuie realizate urmtoarele valori de pasteurizare: AMG 1200 UP (echivalent a 5 min. de nclzire la 76C); Promozym 80 UP; Fungamyl 10UP (echivalent a 60 min. la 60C). n general, preparatele enzimatice amilolitice de origine fungic sunt caracterizate prin temperaturi de inactivare mai sczute dect cele de origine bacterian i de aceea sunt preferate sub aspectul inactivrii lor ntr-un regim blnd de pasteurizare a berii. Avnd n vedere totui rezistena termic destul de ridicat a AMG i n mare msur i a Promozym-ului, se recomand ca aceste enzime s fie folosite la plmdire i mai puin la fermentarea primar. n cazul n care berea nu se pasteurizeaz este necesar ca i Fungamyl -ul s fie utilizat tot la plmdire. n cel de-al treilea caz, pentru mbuntirea filtrabilitii berii se utilizeaz Finizym 200 L n proporie de 0,4 ml/hl bere. Se mai poate mri filtrabilitatea mustului i respectiv a berii prin folosire la plmdire a urmtoarelor preparate enzimatice: Cereflo 200L; Ultraflo L; Viscozym 120L. De asemenea se recomand folosirea preparatului enzimatic -Glucanase 200L n proporie de 250-500 ml/ton mal (cnd se utilizeaz mal + orez). Preparatul poate fi adugat i la fermentarea primar/secundar n proporie de 0,5-1 ml/ton must sau bere.

2.2. Preparate enzimatice exogene utilizate la fermentarea secundar i

maturarea berii
Berea de fermentaie primar este o bere din care s-a recuperat biomasa de drojdie (2-2,5 l crem de drojdie/hl must nsmnat) i care conine 0,4-0,5 kg CO2/hl dizolvat. Aceast bere este trecut la fermentaia secundar i maturare unde vine cu 1,2-1,4% extract fermentescibil din care 80% maltoz i 20% maltotrioz. La fermentaia secundar au loc urmtoarele procese: se continu fermentarea zaharurilor pn la atingerea gradului de fermentare a berii de vnzare;

saturarea berii cu CO2; limpezirea natural a berii (formarea trubului la rece). La maturarea berii au loc urmtoarele procese: depunerea drojdiilor rmase dup ndeprtarea biomasei i a precipitatelor din bere; antrenarea unor compui volatili cu CO2 care se degaj; sinteza unor noi cantiti de produi secundari de fermentaie (crete cu 20% cantitatea de transformarea unor compui cu prag de sensibilitate mai ridicat (diacetil, aldehide), berea Consecina maturrii berii l reprezint nnobilarea gustului i aromei berii. La fermentaia secundar i maturarea berii trebuie s avem n vedere urmtoarele

alcooli superiori i cu 30-200% cea de esteri); considerndu-se matur cnd coninutul de diacetil scade sub 0,1 mg/l.

aspecte: ndeprtarea componentelor care ar produce n berea finit trubul coloidal (amidon, ndeprtarea sau mpiedicarea formrii produilor secundari cu prag de sensibilitate ridicat ndeprtarea oxigenului. Pentru ndeprtarea amidonului nehidrolizat i a dextrinelor i -glucanilor se utilizeaz, n ordine, urmtoarele enzime: Fungamyl 800L, care se dozeaz n berea cu temperatura de 4C, n proporie de 1ml/hl Fungamyl 800 L, care se dozeaz n berea cu temperatura de 4C, n proporie de 3 ml/hl, Fungamyl-ul se adaug atunci cnd n berea rezultat de la fermentaia primar au rmas urme de amidon i cnd concentraia de CO2 din bere , nainte de filtrare, este prea mic. Enzima este introdus ntr-un tanc gol peste care se transvazeaz berea cu deficienele menionate. Finizym 200 L care se adaug n proporie de 1ml/hl bere, n condiiile n care berea nu s-a limpezit bine ca o consecina a unui coninut mare de -glucani. Enzima se introduce ntr-un tanc gol peste care se transvazeaz berea cu deficiene. La folosirea Finizym-ului n scopul mbuntirii filtrabilitii berii timpul de maturare se prelungete cu 2-5 zile. Amylozyme 200 L n proporie de 0,1-0,5 g/hl bere. ndeprtarea proteinelor Pentru ndeprtarea substanelor proteice, pe plan mondial sau utilizat urmtoarele enzime: pentru un timp de acionare de 5 zile; pentru un timp de aciune de 3 zile. dextrine, -glucani, proteine, polifenoli); (dicetone vicinale cum ar fi diacetilul i acetoina); -

Papaina care se adaug n tancul de fermentare secundar, n timpul maturrii berii, cnd

pH-ul este mic i deci exist condiii de activare a enzimei de ctre substanele reductoare din bere. Papaina se poate doza n bere i dup o prefiltrare prealabil a berii, n filt re cu Kieselgur, n acest fel crescnd eficiena papainei. Cnd se utilizeaz sub form de preparat purificat papaina se poate doza, n berea filtrat, nainte de mbuteliere. n afara aciunii hidrolizante, papaina are i capacitatea de a precipita protei nele din bere ncrcate negativ, deoarece papaina are sarcin electric negativ. Prin adaos de papain n berea tnr (bere dup fermentaia primar) se formeaz trub, din aceast cauz adaosul de papain trebuie fcut cu 10-14 zile nainte de flitrare, n caz contrar trubul se formeaz n berea finit. Doza de preparat comercial utilizat variaz ntre 2-10 g/hl bere. n timpul pregtirii soluiei de papain trebuie evitat contactul cu aerul sau n apa de solubilizare trebuie s se adauge 0,1% metabisulfit. n acest fel se evit inactivarea papainei. Firma Enzymes et Derivates recomand folosirea preparatului Papain Chilko P n proporia menionat n fia tehnic. Preparatele enzimatice de origine microbian sunt reprezentate de endopeptid hidrolaze din fungi i bacterii care trebuie s hidrolizeze numai compuii macromoleculari din bere ce sunt precursorii trubului coloidal. Nu trebuie s fie afectai compuii cu azot responsabili de o bun spumare a berii, pentru plintatea i catifelarea gustului ei. ndeprtarea compuilor fenolici pentru ndeprtarea compuilor fenolici s-au propus urmtoarele procedee: oxidarea lor cu o polifenoloxidaz n cursul brasajului, oxidare care antreneaz polimerizarea i deci precipitarea lor, precipitatele fiind ndeprtate la filtrarea plmezii. Acest procedeu nu este nc practicat industrial; prin utilizarea PVPP care este un procedeu fiabil, dar costisitor. ndeprtarea polifenolilor, ndeprtarea oxigenului Oxigenul dizolvat n bere poate modifica caracteristicile senzoriale ale acesteia prin reacii de oxidare. n berea nepasteurizat, oxigenul favorizeaz dezvoltarea bacteriilor aerobe, inclusiv a drojdiilor care n-au fost eliminate n totalitate, i deci favorizeaz apariia trubului biologic. Pentru ndeprtarea oxigenului se utilizeaz preparatul enzimatic glucozoxidaz - catalaz care acioneaz dup urmtorul mecanism: glucozoxidaza elimin oxigenul pe care l consum pentru oxidarea glucozei pe care o transform n acid gluconic; catalaza transform apa oxigenat generat n cursul aciunii glucozoxidazei n ap i oxigen. Preparatele enzimatice de glucozoxidaz-catalaz extrase din Asp. niger i P. notatum au pH optim la 4,8 i 6,0 la 20C. Avnd n vedere c eliminarea oxigenului este posibil att timp ct exist glucoza n bere este necesar ca preparatul de glucozoxidaz s conin i urme de carbohidraze care s care sunt antioxidani, poate avea un efect negativ asupra stabilitii senzoriale a berii.

regenereze glucoza din carbohidraii existeni n bere sau s se adauge glucoza la nivel de 0,1g/l bere. Berea tratat cu glucozoxidaz-catalaz capt un gust uor de oxidat, datorit faptului c enzima catalaza nu poate transforma H2O2 n prezena alcoolului i n acest caz acioneaz ca o peroxidaz care oxideaz compui din bere. Acest inconvenient poate fi surclasat prin folosirea superoxiddismutazei care reacioneaz cu ionii superoxidici i deci conduce la ameliorarea proprietilor senzoriale ale berii. Firma Enzymes et Derivates recomand utilizarea preparatului enzimatic Glucox RF (conine glucozoxidaz + catalaz) n proporie de 0,4-1,5 g/hl bere. Accelerarea maturizrii berii Reducerea diacetilului i acetoinei este etapa limitant a maturrii berii, defectele de gust datorit diacetilului i acetoinei fiind o problem major a berarilor. Diacetilul i acetoina confer berii un gust de unt inacceptabil pentru consumatori. Pragul de percepie pentru diacetil este de 0,02-0,08 mg/l n funcie de bere i sensibilitatea consumatorului. Concentraia de diacetil n bere la sfritul maturrii trebuie s fie 0,1 mg/l, la concentraii superioare exist riscul ca berea s prezinte un gust de unt. Precursorul diacetilului este -acetolactatul produs de drojdie n timpul fermentaiei. -Acetolactatul eliberat n must este transformat neenzimatic n diacetil. Aceast reacie chimic este etapa limitant i este accelerat la temperaturi mai ridicate. n final, diacetilul este asimilat de drojdie i redus enzimatic n acetoin care are un prag de percepie la 50 mg/l. Cantitatea de diacetil format va depinde de compoziia mustului, starea fiziologic a drojdiei i procedeul de fermentaie. Pentru reducerea rapid a diacetilului n cursul maturrii berii s-au propus urmtoarele procedee: maturarea la cald a berii (14-16C/2-3 zile), n care caz -acetolactatul este transformat n diacetil, care, la rndul su este redus de drojdii n acetoin. Datorit temperaturii ridicate se favorizeaz autoliza drojdiei i deci apariia gustului de drojdie, de autoliz la bere. n plus, din drojdia autolizat se elibereaz enzime proteolitice care afecteaz spumarea berii prin degradarea proteinelor cu capacitate de spumare. folosirea de -acetolactat decarboxilaz sub denumirea de Maturex L care se adaug n mustul de bere rcit, n linul de angajare n proporie de 1 -2 ml/hl must. Prin folosirea Maturexului concentraia de diacetil se menine la nivele sczute i timpul de fabricare al berii se scurteaz cu 5-6 zile. Firma recomand ca Maturex-ul s se utilizeze concomitent cu Finizym-ul i Fungamylul, pentru a realiza i o mai bun saturare cu CO2 a berii i pentru o mai bun limpezire.

Proporiile din fiecare enzim sunt urmtoarele: Maturex L 0,25 ml/hl; Finizym 200 L 0,25 ml/hl; Fungamyl 800 L 0,25 ml/hl; Degradarea dicetonelor vicinale (diacetil i acetoin) cu ajutorul unui preparat enzimatic de diacetilreductaz elaborat de Acetobacter aerogenes sau obinut dintr-un extract de drojdie. Activitatea diacetilreductazei este inhibat de alcool, la o concentraie de 3,3% alcool, enzima fiind inactivat n proporie de 42%. Aceast aciune inhibitoare a alcoolului limiteaz utilizarea enzimei sub aspect economic.

3. FOLOSIREA NEMALIFICATELOR LA FABRICAREA BERII

Ca cereale nemalificate pot fi utilizate porumbul, orezul, orzul. La folosirea porumbului i orezului la fabricarea berii se obin urmtoarele avantaje: costurile de fabricaie sunt mai mici; berea finit are o culoare mai deschis; berea finit are o stabilitate mai mare; proprietile de spumare ale berii sunt mai bune. Deoarece temperaturile de gelatinizare a amidonului de porumb i orez sunt mai mari dect a amidonului din mal, plmdirea acestor materii prime se face ntr-un cazan separat pentru nemalificate, deci se impune o faz tehnologic separat. Pot fi utilizate dou variante tehnologice n cazul utilizrii acestor dou nemalificate i anume: utilizarea de mal, care aduce att -amilaz ct i -amilaz; utilizarea unor enzime exogene de lichefiere i anume o -amilaz industrial. n primul rnd se utilizeaz 10% mal fa de cantitatea de porumb sau orez folosit ca nemalificate, concentraia plmezii de porumb sau orez trebuind s fie 20% (raport ap/cereale = 5:1). Diagrama de plmdire cu porumb ar fi urmtoarea: [ 45C(20), 75C(30), 100 C(30)] 45C (20), 53C (20), 63C (90), 72C (zah), 76C (10). Diagrama de plmdire cu orez ar fi urmtoarea: [ 45C (20), 85C (30), 100C (30)] 45C (20), 53C (20), 63C (90), 72C (zah), 76C (10). n cel de-al doilea caz se utilizeaz un preparat enzimatic pentru lichefiere. Firma Novo recomand preparatul enzimatic Termamyl 60 L sau 20 L n proporrie de 0,5 kg/ton nemalificate (porumb sau orez) precum i folosirea a 50-70 ppm Ca2+ prin adaos de Ca (OH)2 n

apa de plmdire , deoarece ionii de Ca2+ au efect de stabilizare termic a Termamyl-ului. Prin folosirea Termamyl-ului este posibil s se ridice concentraia plmezii pn la 30% (raport ap/nemalificate = 3,3:1). La folosirea orzului ca cereal nemalificat, malul poate fi nlocuit n proporie de 50% cu orz, cu condiia folosirii unor preparate enzimatice adecvate. Folosirea orzului ca cereal nemalificat prezint urmtoarele avantaje: amidonul din orz i mal au aceeai temperatur de gelatinizare i deci nu este nevoie de orzul conine i -amilaz ca i malul i deci poate fi ridicat procentul de nemalificat degradarea proteinelor dun orz conduce la obinerea de aminoacizi la fel ca i din mal. Avnd n vedere c prin fermentarea mustului se obine un grad de fermentare mai sczut dect atunci cnd la brasaj s-a folosit numai mal, se utilizeaz la plmdire urmtoarele combinaii de enzime: - Cereflo 200 L - Neutraza 0,5 - Ceremix 2XL 1 kg/t orz; 0,5 kg/t orz sau 2 kg/t orz sau un cazan pentru nemalificate; -

peste 50%; -

- Ceremix 6XMG 1 kg/t orz. Dac procentul de orz depete 40% este bine s se foloseasc i Fungamyl 800 L n proporie de 0,3-0,5 g/h care se adaug n linul de fermentare n vederea creterii gradului de fermentare. Diagrama de plmdire la prelucrarea plmezii din mcintura de mal i orz este urmtoarea: 45C (20), 52C (30), 63C (90), 72C (zah), 76C( 10). Se mai pot folosi i urmtoarele preparate enzimatice: Nervanase BT-2 (vezi fia produsului) mpreun cu -Glucanase (vezi fia produsului) i Proteinase 200 L (vezi fia produsului). Alphalase AP-3 se poate folosi i singur (vezi fia produsului http://www.epages.dk/epub/37/altpdf/epub_37.pdf, guide/alphalase_ap3.pdf). http://mags.datagraf.dk/epub/files/brewing%20e-