1

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK BERAS KETAN HITAM

(Oryza sativa Linn. var glutinosa) DENGAN METODE DPPH
(2,2-Difenil-1-Pikril Hidrazil)
AMIRA LESTARI
Fakultas Farmasi, Universitas Hasanuddin, Makassar-Indonesia 90245

ABSTRAK
Beras ketan hitam (Oryza sativa Linn. var glutinosa) merupakan
salah satu varietas beras yang mengandung pigmen antosianin yang
memiliki aktivitas antioksidan dan dapat menghambat radikal bebas.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dari beras
ketan hitam. Dilakukan uji aktivitas antioksidan metode penangkapan
radikal bebas DPPH (2,2 difenil 1 pikrilhidrazil). Hasil penelitian
menunjukkan bahwa ekstrak beras hitam ketan memiliki antioksidan
dengan IC
50
ekstrak metanol, ekstrak etanol dan ekstrak aseton adalah
47,15 g/ml, 23,32 g/ml dan 14,49 g/ml. Jenis ekstrak tersebut secara
signifikan mempengaruhi aktivitas antioksidan (p <0,01).
ABSTRACT
The black glutinous rice (Oryza sativa Linn. var glutinosa) was one
of the rice varieties that contained anthocyanin pigment that had
antioxidant activity and it was able to inhibit the free radical. This study
aimed to determine the antioxidant activity of the black glutinous rice.
Antioxidant activity tested by the method of DPPH (2,2 diphenyl 1
pikrilhidrazil) free radical scavenging. The result of research showed that
black glutinous rice extracts have antioxidant with IC
50
value of methanol
extract, ethanol extract and acetone extract were 47,15 g/ml, 23,32 g/ml
and 14,49 g/ml. The kind of extract significantly influence these
antioxidant activity (p<0,01).
BAB I
PENDAHULUAN
Beras merupakan bahan pangan pokok bagi sebagian besar
penduduk Indonesia. Permintaan akan beras terus meningkat seiring
dengan pertambahan jumlah penduduk. Beras tidak hanya merupakan
sumber energi dan protein, tetapi juga sumber vitamin dan mineral yang
bermanfaat bagi kesehatan. Salah satu jenis beras yang banyak
dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia adalah beras ketan. Beras ketan
adalah jenis bahan pangan yang seluruh bagian butirnya mengapur atau
kelam, tetapi kekerasan butirnya sama dengan beras bukan ketan (1).
Ketan hitam diketahui memiliki pigmen yang bernama antosianin.
Antosianin adalah senyawa fenolik yang masuk kelompok flavonoid dan
2

berfungsi sebagai antioksidan, berperan penting, baik bagi tanaman itu
sendiri maupun bagi kesehatan manusia. Peran antioksidan bagi
kesehatan manusia adalah untuk mencegah penyakit hati (hepatitis),
kanker usus, stroke, diabetes, sangat esensial bagi fungsi otak dan
mengurangi pengaruh penuaan otak. Antosianin dari beras ketan hitam
dapat diekstraksi dengan pelarut organik, seperti etanol, metanol dan
aseton (2, 3, 4).
Antioksidan adalah zat yang dapat menangkal atau mencegah
reaksi oksidasi dari radikal bebas. Reaksi oksidasi dapat menghasilkan
radikal bebas dan memicu reaksi berantai, menyebabkan kerusakan sel
dalam tubuh. Radikal bebas sangat berbahaya karena dapat merusak
jaringan tubuh yang dapat menyebabkan penyakit degenerative (5).
Radikal bebas merupakan atom, molekul ataupun senyawa yang
sangat tidak stabil, karena struktur atom dan molekulnya yang tidak
berpasangan, sehingga radikal bebas sangat reaktif. Radikal bebas harus
berpasangan dengan molekul, atom, atau bahkan elektron untuk
membentuk senyawa yang stabil, dengan cara mengambil atom hidrogen
dari molekul lain, berikatan dengan molekul lain, atau berinteraksi dengan
radikal bebas lainnya. Radikal dapat terbentuk secara endogen dan
eksogen. Radikal endogen terbentuk dalam tubuh melalui proses
metabolism normal di dalam tubuh. Sementara radikal eksogen berasal
dari bahan pencemar yang masuk ke dalam tubuh melalui pernafasan,
pencernaan, dan penyerapan kulit (6, 7).
Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan
menggunakan beberapa metode, salah satunya adalah metode DPPH
(2,2-difenil-1-pikril hidrazil). Metode ini digunakan sebab hasilnya terbukti
akurat, reliabel dan praktis dalam mendeteksi antiradikal. Selain itu,
sederhana, cepat dan memerlukan sedikit sampel (8).
Berdasarkan uraian diatas, maka akan dilakukan penelitian yang
bertujuan mengetahui adanya aktivitas antioksidan dari ekstrak metanol,
etanol dan aseton beras ketan hitam (Oryza sativa Linn. var glutinosa)
dengan metode DPPH (2,2-difenil-1-pikril hidrazil).
BAB II
PELAKSANAAN PENELITIAN
III.1 Penyiapan Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah botol coklat, Elisa reader
(Biotec), kertas saring whatman no.1, labu Erlenmeyer (Pyrex), labu
tentukur, mikropipet (Socorex), mikrowell plate, multichannel mikropipet,
neraca analitik (Sartorius), oven, pH meter (Buchi), pipet volume,
seperangkat alat rotavapor (Buchii), seperangkat alat pompa vakum
(Buchii), Spektrofotometer UV-Vis (Agilent) dan vial.
Bahan yang digunakan adalah air suling, beras ketan hitam (Oryza
sativa Linn. var glutinosa), difenil pikril hidrazil (DPPH) (Sigma Aldrick),
HCl Pekat (36%), KCl, Na-Asetat (CH
3
COONa), pelarut etanol tekhnis,
3

pelarut aseton tekhnis, pelarut metanol tekhnis, metanol absolute tekhnis,
silika gel RP-18 (E.Merck) dan vitamin C (E.Merck).
III.2 Metode Kerja
III.2.1 Pengambilan Sampel Penelitian
Sampel beras ketan hitam (BKH) diperoleh di pasar Daya,
Makassar. Sampel dikeringkan dalam oven simplisia suhu 40C lalu
diserbukkan dengan menggunakan blender sebelum diekstraksi.
III.2.2 Ekstraksi Sampel
Sampel diekstraksi dengan cara maserasi dengan
memenggunakan 3 macam larutan penyari, yaitu :
BKH (A) : 25 gram beras ketan hitam yang diekstraksi menggunakan 50
ml larutan HCl 0,01% dalam metanol.
BKH (B) : 25 gram beras ketan hitam yang diekstraksi menggunakan 50
ml larutan HCl 0,01% dalam etanol.
BKH (C) : 25 gram beras ketan hitam yang diekstraksi menggunakan 50
ml larutan penyari yang terdiri dari aseton 70% yang dibuat
dalam HCl 0,01%.
Maserasi dilakukan selama 1 hari dengan dilakukan pengadukan
sesekali. Ekstrak yang diperoleh kemudian disaring dengan menggunakan
kertas whatman no.1 dengan bantuan pompa vakum. Selanjutnya
dilakukan remaserasi sebanyak 4-5 kali hingga diperoleh hasil ekstraksi
yang agak jernih. Ekstrak yang diperoleh kemudian dikumpulkan dan
dipekatkan menggunakan rotavapor suhu 50C untuk mengu apkan
pelarut. Ekstrak yang diperoleh dimasukkan didalam lemari pendingin.
III.2.3 Pengukuran dan Perhitungan Kadar Antosianin Total dengan
Metode pH Differensial (9)
III.2.3.1 Pembuatan Larutan Dapar pH 1,0 dan pH 4,5
Larutan dapar pH 1,0 dibuat dengan menggunakan KCl sebanyak
1,86 g dicampur dengan air suling dan diatur pH-nya hingga mencapai 1
dengan menggunakan HCl pekat. Selanjutnya larutan dipindahkan ke
dalam labu ukur 1 L dan dicukupkan volumenya hingga 1 L dengan
menggunakan air suling.
Larutan dapar pH 4,5 dibuat dengan menggunakan CH
3
COONa.3H
2
O
sebanyak 54,43 g dicampur dengan 960 ml air suling. Kemudian diukur
pH-nya dan diatur dengan penambahan HCl pekat hingga diperoleh
larutan dengan pH 4,5. Selanjutnya larutan dipindahkan ke dalam labu
ukur 1 L dan dicukupkan volumenya dengan air suling hingga 1 L.

III.2.3.2 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum dan Faktor
Pengenceran
Sampel dilarutkan dalam dapar KCl pH 1 kemudian diukur pada
spektrofotometer untuk menentukan panjang gelombang maksimum dari
sampel. Faktor pengenceran ditentukan dengan cara melarutkan sampel
dalam dapar KCl pH 1 hingga diperoleh absorbansi kurang dari 1,2. Faktor
4

pengenceran yang diperoleh adalah 0,1 ml ekstrak antosianin dilarutkan
hingga 5 ml. Jadi Faktor pengenceran = 50
III.2.3.3Perhitungan Kadar Antosianin
1. Dua larutan sampel disiapkan, pada sampel yang pertama digunakan
dapar KCl pH 1 dan untuk sampel kedua digunakan dapar Na-Asetat
dengan pH 4,5. Masing-masing sampel dilarutkan dalam larutan dapar
berdasarkan FP (faktor pengenceran) yang sudah ditentukan
sebelumnya. Dibuat 3 replikasi untuk masing-masing sampel
2. Sampel yang dilarutkan menggunakan dapar pH 1 dibiarkan selama 15
menit sebelum diukur, sedangkan sampel yang dilarutkan dengan
dapar pH 4,5 di ukur setelah dibiarkan bercampur selama 5 menit.
3. Absorbansi dari setiap larutan pada panjang gelombang 509 dan 700
nm diukur dengan dapar pH 1 dan pH 4,5 sebagai blankonya
4. Absorbansi dari sampel yang telah dilarutkan (A) ditentukan dengan
rumus :
A = [(A
509
A
700
)
pH 1
(A
509
A
700
)
pH 4,5
]
5. Kandungan antosianin pada sampel dihitung dengan rumus :
Total antosianin (%b/b) =
A x Mw x P x v x 100%
s x L x wt

Keterangan :
= Absorptivitas molar Sianidin-3-glukosida = 26900 L(mol.cm)
L = Lebar kuvet = 1 cm
MW = Bobot molekul Sianidin-3-glukosida = 449,2 g/mol
DF = Volume akhir atau volume ekstrak pigmen (L)
Wt = Bobot awal bahan (g)
III.2.4 Uji Kualitatif Aktivitas Antioksidan
Analisis dilakukan secara kromatografi lapis tipis autografi terhadap
ekstrak metanol, etanol dan aseton dari sampel yang dilarutkan dalam
metanol, ditotolkan pada lempeng KLT silika gel RP-18 dan dikeringkan.
Fase gerak KLT untuk ekstrak adalah metanol dengan air (80:20).
Selanjutnya dilakukan pengembangan dalam bejana kromatografi dan
noda yang terbentuk diperiksa di bawah lampu UV pada panjang
gelombang 366 nm dan 254 nm. Noda-noda yang memiliki daya
antioksidan terlihat dari pemudaran warna pereaksi semprot DPPH.
III.2.5 Uji Kuantitatif Aktivitas Antioksidan
III.2.5.1 Pembuatan Larutan Sampel
Ekstrak BKH (A), (B) dan (C) ditimbang sebanyak 1 mg, kemudian
dilarutkan dengan metanol absolut dan dicukupkan volumeya hingga 10
ml, sehingga diperoleh larutan stok 100 g/ml. Kemudian masing-masing
ekstrak dibuat pengenceran dengan konsentrasi yang berbeda-beda.
III.2.5.2 Pembuatan Larutan DPPH 240 M
DPPH ditimbang sebanyak 0,94 mg. kemudian dilarutkan dalam
metanol absolute hingga volume 10 ml.
5

III.2.5.3 Pengujian Aktivitas Antioksidan Sampel
Ekstrak BKH (A), (B) dan (C) masing-masing dipipet sebanyak 20,
40, 60, 80 dan 100 l kedalam mikroplate, lalu masing-masing
ditambahkan 75 l DPPH 240 M dengan menggunakan multichannel
mikropipet dan volume campuran dicukupkan sehingga 200l dengan
pelarut metanol, sehingga didapatkan seri konsentrasi 10, 20, 30, 40 dan
50 g/ml. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37C s elama 30 menit,
kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum
(515 nm) dengan menggunakan Elisa Reader, sebagai blanko larutan
DPPH 240 M dipipet sebanyak 75 l kemudian ditambahkan 125 l
metanol absolute. Untuk pembanding digunakan vitamin C dengan
konsentrasi 2,5; 5; 7,5; 10 dan 12,5 bpj. Aktivitas antioksidan dari masing-
masing sampel dinyatakan dengan persen inhibisi, yang dihitung dengan
rumus sebagai berikut :
% inhibisi =
seiapan blanko seiapan sampel
seiapan blanko
x 1%
Persen inhibisi yang dihasilkan oleh masing-masing ekstrak
beras ketan hitam uji, kemudian ditabulasi dan dihitung nilai IC
50
nya
dengan analisis probit dari data log konsentrasi dengan probit persentasi
pengikat radikal bebas.
II.2.6 Analisis Statistik
Analisis data statistik menggunakan SPSS 16.0 for windows
dengan metode oneway Anova yang dilanjutkan dengan analisis lanjutan
uji Duncan untuk mengetahui pengaruh jenis ekstrak terhadap aktivitas
antioksidan ekstrak beras ketan hitam. Analisis korelasi antara kadar
antosianin total dengan nilai IC
50
dianalisis dengan metode korelasi
Pearson. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS
16.0 for windows.
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
III.1 Hasil Penelitian
III.1.1Hasil Perhitungan Rendamen
Tabel 1. Hasil Perhitungan Rendamen Ekstrak BKH
No Jenis Ekstrak Hasil Ekstraksi (g) rendamen (%b/b)*
1 metanol-Asam 22.8758 2.29
2 Alkohol-asam 22.5389 2.25
3 Aseton-asam 26.9059 2.69
*rata-rata dari 3 replikasi



6

III.1.2 Hasil Perhitungan Kandungan Total Antosianin
Table 2. Hasil Perhitungan Kadar Antosianin Total Ekstrak BKH
No Jenis Ekstrak
Kadar Antosianin
(%b/b)*
1 Metanol 0,166
2 Etanol 0,126
3 Aseton 0,076
*rata-rata dari 3 replikasi
III.1.3 Profil KLT




















Gambar 1. Kromatogram Lapis Tipis Ekstrak Beras Ketan Hitam dan antosianin murni

Keterangan :
M = Ekstrak Metanol
E = Ekstrak Etanol
A = Ekstrak Aseton
Fase diam : Silika gel RP-18
Fase gerak : Metanol-Air (80:20)
A,E = Profil KLT pada sinar tampak
B,F = Visualisasi dengan UV 254
C,G = Visualisasi dengan UV 366
D = Visualisasi dengan larutan DPPH 0,4Mm



A B C D
M E A
E An
M E A M E A
M E A
E An
E An
E F G
7

III.1.4 Hasil Perhitungan Aktivitas Antioksidan
Tabel 3. Hasil pengujian aktivitas antioksidan Beras Ketan Hitam
Sampel Nilai IC
50
(g/ml)*
BKH A
47,15 1,26537
BKH B
23,32 1,26537
BKH C
14,49 0,29141
Vitamin C
7,11 0,20075
*rata-rata dari 5 replikasi
III.2 Pembahasan
Beras ketan hitam merupakan salah satu varietas beras berpigmen
yang telah lama dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia sebagai bahan
makanan. Beras ketan hitam mengandung pigmen antosianin yang
tergolong senyawa fenolik kelompok flavanoid. Antosianin memiliki
aktivitas antioksidan dan dapat menghambat radikal bebas (2,3).
Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi senyawa
antosianin dalam sampel. Metode ini digunakan karena senyawa
antosianin tidak stabil dengan pemanasan. Pelarut yang digunakan adalah
metanol, etanol dan aseton yang diasamkan dengan penambahan 0,01%
HCl. Menurut literatur, antosianin dapat diekstraksi menggunakan tiga
pelarut yaitu metanol, etanol, dan aseton yang diberi asam klorida dalam
jumlah kecil karena antosianin bersifat stabil dalam suasana asam (10).
Cairan ekstrak yang telah dimaserasi dipekatkan dengan rotavapor
dengan suhu 50C hingga sampel mengental, kemudian diu apkan.
Setelah proses ekstraksi, diperoleh rendamen ekstrak metanol sebanyak
2,29%b/b, ekstrak etanol sebanyak 2,25%b/b dan ekstrak aseton
sebanyak 2,69%b/b.
Ekstrak yang diperoleh diduga mengandung antosianin. Dimana hal
ini dapat dilihat berdasarkan warna tiap ekstrak yaitu berwarna merah
tua-ungu. Menurut pustaka, antosianin merupakan suatu zat warna atau
pigmen pada tanaman seperti buah, umbi dan biji-bijian yang memberi
warna merah, biru dan ungu (11). Selain itu, berdasarkan pengukuran
panjang gelombangnya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis,
ekstrak antosianin beras ketan hitam memiliki panjang gelombang
maksimum 509nm. Hal ini sesuai dengan pustaka yang menyatakan
panjang gelombang antosianin berada pada rentang 500-535nm (10).
Dilihat dari profil KLT ekstrak etanol BKH dibandingkan dengan
antosianin murni menggunakan lempeng silika RP-18 dan fase gerak
metanol-air (80:20), noda ekstrak BKH memiliki Rf yang sama dengan
antosianin murni yaitu 0,85. Hal ini berarti ekstrak BKH yang diperoleh
mengandung antosianin.
8

Pengukuran kadar antosianin total dilakukan dengan metode pH
Differensial yaitu metode yang digunakan untuk mengukur antosianin
berdasarkan perbedaan pH 1,0 dan pH 4,5. Penetapan konsentrasi
antosianin dengan metode ini dikarenakan pada pH 1,0 antosianain
membentuk senyawa oxonium (kation flavilium) yang berwarna dan pada
pH 4,5 berbentuk karbinol/hemiketal tidak berwarna. Kondisi inilah yang
akan dijadikan acuan untuk menentukan absorbansi dengan
menggunakan spektrofotometer Uv-Vis dari masing-masing ekstrak yang
dihasilkan. Perubahan warna pada antosianin dalam tingkatan pH tertentu
disebabkan sifat antosianin yang memiliki tingkat kestabilan yang berbeda
(12). Dari hasil penetapan senyawa antosianin dengan metode pH
differensial, maka diperoleh kadar antosianin ekstrak metanol sebesar
0,166%b/b, ekstrak etanol sebesar 0,126%b/b dan ekstrak aseton
0,076%b/b.
Masing-masing ekstrak dari tiap sampel kemudian di uji kualitatif
menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT), dengan fase diam
silika gel RP-18 dan fase gerak yang digunakan adalah campuran
metanol:air (80:20). Profil KLT menunjukkan 1 noda pada sinar tampak
dengan nilai Rf ekstrak metanol, etanol dan aseton sama yaitu 0,87. Noda
yang terbentuk kemudian diperiksa dibawah lampu UV pada panjang
gelombang 366 nm dan 254 nm. Identifikasi noda pada UV 254 nm
berdasarkan adsorbsi oleh noda yang mengandung gugus kromofor
terhadap sinar UV 254 nm sehingga noda tampak gelap pada lempeng
KLT dibawah sinar UV 254 nm, sedangkan pada UV 366 nm noda yang
tampak akan berwarna terang dengan latar yang gelap.
Identifikasi KLT juga dilakukan dengan menggunakan DPPH untuk
mengetahui apakah noda yang dimiliki oleh ekstrak tersebut dapat
mengikat radikal bebas DPPH. Selain noda dengan Rf-0,87, pada ekstrak
aseton juga terdapat 2 noda setelah disemprot DPPH dengan Rf=0,93.
Uji aktivitas antioksidan dilakukan menggunakan metode DPPH
(2,2-Difenil-1-Pikrilhidrazil). Metode DPPH ini dipilih karena pengerjaannya
cepat, sederhana, dan praktis untuk mengetahui kapasitas antioksidan
(13). Radikal DPPH merupakan senyawa organik berwarna ungu yang
mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada
max
515
nm. Setelah bereaksi dengan senyawa antioksidan, DPPH tersebut akan
tereduksi dan warnanya akan memudar (penurunan intensitas warna).
Perubahan tersebut dapat diukur dengan Mikroplate Reader. Penurunan
intensitas warna yang terjadi disebabkan oleh berkurangnya ikatan
rangkap terkonjugasi pada DPPH karena terjadi penangkapan satu
elektron oleh zat antioksidan, menyebabkan tidak adanya kesempatan
elektron tersebut untuk beresonansi. Sebagai akibatnya, penambahan
senyawa antioksidan akan menurunkan konsentrasi DPPH dan akan
menyebabkan penurunan absorbansinya, sehingga akan diperoleh suatu
kurva yang menurun. Parameter yang digunakan untuk
menginterpretasikan hasil dari metode DPPH adalah nilai EC
50
(Efficient
Concentration) atau sering juga disebut nilai IC
50
(Inhibitory Concentration)

9

yang didefinisikan sebagai konsentrasi dari substansi yang dapat
meredam 50% aktivitas DPPH. Parameter IC
50
menunjukkan bahwa
semakin tinggi aktivitas antioksidan, maka semakin rendah nilai IC
50
(14)
.
Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan yang sangat kuat apabila
nilai IC
50
kurang dari 50 g/ml, kuat apabila nilai IC
50
50-100 g/ml, sedang
apabila nilai IC
50
100-150 g/ml, dan lemah bila nilai IC
50
antara 150-200
g/ml (13).
Berdasarkan hasil pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak
metanol, etanol dan aseton berturut-turut adalah 47,15 g/ml; 23,32 g/ml
dan 14,49 g/ml. Aktivitas antioksidan yang paling tertinggi terdapat pada
ekstrak aseton yaitu 14,49 g/ml. Sedangkan aktivitas antioksidan yang
paling lemah terdapat pada ekstrak metanol yaitu 47,39 g/ml. Angka ini
menunjukkan bahwa ekstrak aseton memiliki aktivitas antioksidan yang
lebih besar dari pada ekstrak metanol dan ekstrak etanol pada konsentrasi
yang sama.

Gambar 8. IC
50
penangkalan radikal bebas DPPH
Selanjutnya dari aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
dianalisis secara statistik dengan menggunakan analisis ragam (ANOVA)
dan dilanjutkan dengan uji lanjutan Duncan. Hasil pengolahan statistik
data hasil pengukuran aktivitas antioksidan dengan metode DPPH.
Data hasil pengolahan analisis ragam menunjukkan bahwa nilai
signifikan sampel adalah 0,000<0,05. Nilai signifikansi tersebut
menunjukkan bahwa pada selang kepercayaan 95%, sampel ekstrak
beras ketan hitam yang diuji berbeda nyata.
Data hasil pengolahan dengan uji lanjutan Duncan (lampiran V)
menunjukkan bahwa keempat sampel terbagi dalam empat subset. Hal ini
berarti aktivitas antioksidan vitamin C berbeda nyata dengan ekstrak
aseton, ekstrak etanol serta ekstrak metanol.
Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak aseton memiliki aktivitas
antioksidan yang paling tinggi dalam penangkapan radikal bebas DPPH
47,15
23,32
14,49
7,11
0
10
20
30
40
50
60
ekstrak metanol ekstrak etanol ekstrak aseton Vitamin C
10

dan ekstrak metanol memiliki aktivitas yang paling rendah diantara semua
ekstrak. Meskipun demikian, aktivitas ekstrak aseton masih lebih rendah
dengan signifikansi p<0,01 dibandingkan dengan vitamin C.
Ekstrak aseton menunjukkan aktivitas antioksidan yang paling
tinggi padahal kandungan antosianinnya paling rendah. Berdasarkan hasil
analisis korelasi dengan metode pearson antara kadar antosianin dengan
nilai IC
50
penangkapan radikal bebas DPPH menunjukkan perbedaan
nyata dengan nilai r=0,901 (p<0,001) di mana, semakin tinggi kadar
antosianin suatu ekstrak maka makin tinggi pula nila IC
50
nya. Dengan kata
lain aktivitasnya semakin rendah.
Hal ini diduga oleh adanya senyawa lain selain antosianin pada
ekstrak aseton yang ikut terekstraksi dan diduga senyawa tersebut adalah
gamma oryzanol (-oryzanol). Gamma oryzanol (-oryzanol) adalah suatu
senyawa yang terkandung dalam minyak beras yang memiliki aktivitas
antioksidan yang kuat. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh
Panita B, dkk (2006) -oryzanol ini banyak terkandung pada minyak beras
ketan hitam dibandingkan pada beras putih (15).

BAB IV
KESIMPULAN DAN SARAN
IV. 1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian, analisis data dan pembahasan dapat
disimpulkan bahwa jenis ekstrak beras ketan hitam berpengaruh sangat
nyata terhadap aktivitas peningkatan radikal bebas DPPH dengan nilai
IC
50
ekstrak metanol, ekstrak etanol dan ekstrak aseton adalah 47,15
g/ml, 23,32 g/ml dan 14,49 g/ml.
IV. 2 Saran
Sebaiknya dilakukan penelitian lebih lanjut tentang senyawa aktif
antioksidan pada ekstrak aseton.
















11

DAFTAR PUSTAKA

1. Damardjati, D. S. Struktur dan Komposisi Kimia Beras. Fakultas Pasca
Sarjana. IPB, Bogor. 1980.

2. Tananuwong, K. dan Tewaruth W. Extraction and application of
antioxidants from black glutinous rice LWT. Food Sci. Technol. 2010.
476

3. Hanum, T. Ekstraksi dan Stabilitas Zat Pewarna Alami dari Katul Beras
Ketan Hitam (Oryza sativa glutinosa). Buletin Teknologi dan Industri
Pangan, Vol. XI, 1. Universitas Bandar Lampung. 2000.

4. Ronald, E.W and Terry, E.A. Handbook Food Analitycal Chemistry :
Extraction, Isolation and Purification of Anthocyanins. John Wiley and
Sons, Inc. 2001.

5. Chang, L., Huang, S.C. and Duh, P.D. Antioxidant activity of sesame
coat. Food Chemistry. 2002

6. Wu, D and Cederbaum, A.I. Alcohol, Oxidative Stress, and Free
Radical Damage. Alcohol Research and Health. 2003. Vol. 27 No. 4.
278.

7. Miller, A.L. Antioxidant flavonoids : structure, function and clinical
usage. Alt Med. 1996. 103-111.

8. Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hintze, R., Ruser, A., and
Hansen, U.P. Determination of DPPH radical oxidation caused by
methanolic extracts of some microalgal species by linear regression
analysis of spectrophotometric measurements. Sensors 7. 2007.
2080-2091.

9. Giusti, M and Wrolstad, R.E. Characterization and Measuement of
Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Oregon State Unuversity.
2001.

10. Shipp, J., dan Abdel-Aal, E.M., Food Applications and Physiological
Effects of Anthocyanins as Functional Food Ingredients. The Open
Food Science Journal. 2010.4. Hal. 7-22.

11. Harborne, J.B., Phytochemical Methods: A Guide to Modern
techniques of Plant. London : Chapman and Hall. 1998.
12

12. Giusti, M., dan Wrolstad, R.E., Characterization and Measuement of
Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy. Oregon State University.
2001.
13. Molyneux, P., The Use of The Stable Free Radical
Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activity.
Journal Science Technology. 2004. 26(2). Hal. 211-219.

14. Suhartono, E., Triawanti., Setiawan, B., Firdaus, T.R., dan Sari, M.P.,
Peran Rebusan Daun Tapak Dara (Catharanthus roseus L. G.Don)
Sebagai Antioksidan dalam Menghambat Fotooksidasi Cairan Nutrisi
parenteral Glukosa. Majalah Obat Tradisional, 2004, Vol : 9. hal. 21-25.

15. Boonsit, P., Karlade, D., dan Phongpiacan, C., Gamma Oryzanol
Content in Purple Rice Thailand Local Genotype. Prosperity and
Poverty in a Globalized WorkdChallenges for Angricultural Research.
2006. 1-4.















13

LAMPIRAN

Lampiran 1. Penyiapan Sampel













Skema Kerja Penetapan Kadar Total Antosianin









Dikeringkan dalam oven suhu 40C selama 2 jam dan
diblender. Ditimbang sebanyak 25 gram
Diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut
metanol+ HCl 0,01%, etanol + HCl 0,01% dan aseton + HCl
0,01% selama 1 x 24 jam. Di remaserasi 4-5 kali
Dirotavapor dengan suhu 50C
Beras Ketan Hitam
(Oryza sativa Linn. var glutinosa)
Serbuk beras ketan hitam

Ekstrak cair
Ekstrak
Metanol Kering
Ekstrak
Etanol Kering
Ekstrak
Aseton Kering
!"
!"
!"
Hasil
- Pengukuran Kadar Antosianin
- Pengujian Antioksidan
Pembahasan dan Kesimpulan
Ekstrak
- Dilarutkan ekstrak dalam dapar KCl pH1
- Ditentukan panjang gelombang maksimum dengan
spektrofotometer dan faktor pengenceran (Fp= 50)
pH 1 pH 4,5
Sampel dilarutkan dalam
dapar KCl pH 1
Sampel dilarutkan dalam dapar
Na-asetat pH 4,5
Didiamkan 15 menit Didiamkan 5 menit
Absorbansi
Absorbansi diukur dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang 509 nm dan 700 nm
Kadar Total Antosianin
14

Pengujian antioksidan










Lampiran II. Perhitungan Rendamen Ekstrak
Table 4. Data Penimbangan Bobot Sampel dan Ekstrak
No. Jenis Ekstraksi
Bobot
Sampel (g)
Hasil
Ekstraksi (g)
Rendamen (%b/b)
1 Metanol-Asam
25,0040
0,5725 2,29 25,0046
25,0032
2 Alkohol-Asam
25,0031
0,5625 2,25 25,0051
25,0022
3 Aseton-Asam
25,0051
0,6725 2,69 25,0036
25,0055
Perhitungan rendamen ekstrak
Renuamen =
bcrot ckstrok
bcrot sompcl
x1uu%
=
0,5725
25,0039
x1uu%
= 2,29

Ekstrak sebanyak 1 mg dilarutkan
dalam 10 ml metanol absolute
Ekstrak Metanol, Etanol dan Aseton BKH
Larutan stok ekstrak
Larutan ektsrak
10, 20, 30, 40 dan 50 bpj
Ditambahkan DPPH 75 l
Diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit
Di ukur absorbansi dengan Elisa Reader (515 nm)
Mikroplate
Hasil
Pembanding
Vitamin C
Larutan pembanding
2,5, 5, 7,5, 10 dan 12,5 bpj

Data absorbansi
Perhitungan IC50

15

Lampiran III. Perhitungan Kadar Antosianin Total
Tabel 5. Data Absorban pada pH 1
No Ekstrak
Volume
(L)
Bobot
sampel
(g)
pH 1
Absorban
700
nm 509 nm
A(509 - 700)
1 Aseton 1 0.058 25.0051 0.011 0.507 0.496
2 Aseton 2 0.067 25.0036 0.216 0.792 0.576
3 Aseton 3 0.051 25.0055 0.037 0.608 0.571
4 Alkohol 1 0.071 25.0031 0.425 1.332 0.908
5 Alkohol 2 0.072 25.0051 0.278 0.945 0.667
6 Alkohol 3 0.072 25.0022 0.337 1.231 0.894
7 Metanol 1 0.073 25.0040 0.403 1.435 1.032
8 Metanol 2 0.070 25.0046 0.418 1.405 0.986
9 Metanol 3 0.071 25.0032 0.437 1.325 0.887
Tabel 6. Data Absorban pada pH 4.5
No Ekstrak
Volume
(L)
Bobot
sampel
(g)
pH 4.5
Absorban
700 nm 509 nm A(509 - 700)
1 Aseton 1 0.058 25.0051 0.019 0.123 0.104
2 Aseton 2 0.067 25.0036 0.210 0.416 0.206
3 Aseton 3 0.051 25.0055 0.024 0.175 0.151
4 Alkohol 1 0.071 25.0031 0.353 0.732 0.379
5 Alkohol 2 0.072 25.0051 0.189 0.411 0.222
6 Alkohol 3 0.072 25.0022 0.300 0.585 0.285
7 Metanol 1 0.073 25.0040 0.245 0.534 0.289
8 Metanol 2 0.070 25.0046 0.309 0.564 0.255
9 Metanol 3 0.071 25.0032 0.253 0.523 0.270







16

Tabel 7. Perhitungan kadar Antosianin beras ketan Hitam
No Ekstrak
Volume
(L)
Bobot
sampel
(g)
A
(pH 1)
A
(PH 4.5)
Absorban
(A)
%
Kadar
Rata-
rata (ApH1-
ApH4.5)
1
Aseton
1
0,058 25,0051 0,496 0,104 0,392 0,076
0,076 2
Aseton
2
0,067 25,0036 0,576 0,206 0,370 0,083
3
Aseton
3
0,051 25,0055 0,571 0,151 0,420 0,071
4
Alkohol
1
0,071 25,0031 0,908 0,379 0,529 0,125
0,126 5
Alkohol
2
0,072 25,0051 0,667 0,222 0,445 0,107
6
Alkohol
3
0,072 25,0022 0,894 0,285 0,609 0,146
7
Metanol
1
0,073 25,0040 1,032 0,289 0,743 0,181
0,166 8
Metanol
2
0,070 25,0046 0,986 0,255 0,731 0,171
9
Metanol
3
0,071 25,0032 0,887 0,270 0,617 0,146
Contoh Perhitungannya :
Aseton 1
- Perhitungan Absorbansi dari sampel
A = [(A
509
A
700
)
pH 1
(A
509
A
700
)
pH 4,5
]
A = (0,507 0,011) (0,123 0,019)
= 0,496 - 0,104
= 0,392
Perhitungan kandungan antosianin
Total antosianin (%b/b) =
A x Mw x P x v x 100%
s x L x wt


=
0,392 x 449,2 x 50 x 0,058x 100%
26900 x 1 x 25,0051

= 0,076 % b/b

17

Lampiran IV. Perhitungan Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas
DPPH
Tabel 8. Data Absorbans DPPH pada perlakuan dengan ekstrak BKH
Kons.
Ekstrak BKH A Ekstrak BKH B Ekstrak BKH C
Blanko Abs. %inhib. Blanko Abs. %inhib. Blanko Abs. %inhib.
10
ppm
0,844 0,778 7,81 0,865 0,614 29,01 0,865 0,498 42,42
0,862 0,775 10,09 0,832 0,629 24,39 0,832 0,495 40,50
0,851 0,773 9,16 0,859 0,643 25,14 0,859 0,491 42,84
0,863 0,778 9,84 0,848 0,623 26,53 0,848 0,487 42,57
0,881 0,740 16,00 0,843 0,640 24,08 0,843 0,482 42,82
20
ppm
0,844 0,686 18,72 0,865 0,464 46,35 0,865 0,379 56,18
0,862 0,640 25,75 0,832 0,481 42,18 0,832 0,361 56,73
0,851 0,646 24,08 0,859 0,476 44,58 0,859 0,362 57,85
0,863 0,683 20,85 0,848 0,463 45,50 0,848 0,375 55,77
0,881 0,646 26,67 0,843 0,471 44,12 0,843 0,366 56,58
30
ppm
0,844 0,561 33,53 0,865 0,361 58,26 0,865 0,274 68,83
0,862 0,581 32,59 0,832 0,370 55,52 0,832 0,285 65,74
0,851 0,543 36,19 0,859 0,370 56,92 0,859 0,287 66,58
0,863 0,524 39,28 0,848 0,380 55,18 0,848 0,286 66,27
0,881 0,512 41,88 0,843 0,357 57,65 0,843 0,283 66,42
40
ppm
0,844 0,480 43,12 0,865 0,284 67,16 0,865 0,219 74,68
0,862 0,475 44,89 0,832 0,290 65,14 0,832 0,213 74,39
0,851 0,497 41,59 0,859 0,297 65,24 0,859 0,220 74,38
0,863 0,495 42,64 0,848 0,281 66,86 0,848 0,216 74,52
0,881 0,491 44,26 0,843 0,277 67,14 0,843 0,213 74,73
50
ppm
0,844 0,416 50,71 0,865 0,209 75,83 0,865 0,144 83,35
0,862 0,415 51,85 0,832 0,214 74,27 0,832 0,157 81,12
0,851 0,407 52,17 0,859 0,261 69,61 0,859 0,163 81,02
0,863 0,406 52,95 0,848 0,212 75,00 0,848 0,162 80,89
0,881 0,412 52,23 0,843 0,217 74,25 0,843 0,161 80,90









18

Tabel 9. Data Absorbans DPPH pada perlakuan dengan vitamin C
Kons.
Vitamin C
Blanko Absorbansi %inhibisi
2,5 ppm
0,818 0,756 7,5
0,826 0,743 4,19
0,810 0,776 10,04
0,831 0,726 12,6
0,816 0,713 12,6
5 ppm
0,818 0,582 28,85
0,826 0,568 31,48
0,810 0,555 31,23
0,831 0,560 31,37
0,816 0,560 32,61
7,5 ppm
0,818 0,411 49,75
0,826 0,414 50,61
0,810 0,400 49,87
0,831 0,416 47,91
0,816 0,425 49,93
10 ppm
0,818 0,296 63,81
0,826 0,286 66,66
0,810 0,270 65,37
0,831 0,267 63,97
0,816 0,294 67,87
12,5 ppm
0,818 0,187 77,13
0,826 0,172 80,00
0,810 0,162 79,17
0,831 0,198 81,37
0,816 0,152 76,17









19

Tabel 10. Hasil Perhitungan Nilai IC50 Eksrak BKH dengan Metode DPPH
No. Sampel IC
50
(g/ml)
1 Ekstrak Metanol
Replikasi 1 50,58
Replikasi 2 47,75
Replikasi 3 47,42
Replikasi 4 46,34
Replikasi 5 45,49
2 Ekstrak Etanol
Replikasi 1 18,83
Replikasi 2 24,21
Replikasi 3 24,09
Replikasi 4 22,90
Replikasi 5 26,60
3 Ekstrak Aseton
Replikasi 1 14,42
Replikasi 2 14,99
Replikasi 3 14,22
Replikasi 4 14,48
Replikasi 5 14,38
4 Vitamin C
Replikasi 1 7,379
Replikasi 2 7,046
Replikasi 3 7,261
Replikasi 4 6,934
Replikasi 5 6,934

Contoh perhitungan IC
50
pengikatan radikal bebas DPPH :

o = 1,81u b = 1,872 r = u,986
y = o +bx
x =
S 1,81u
1,872

x = 1,7u4
Log IC
50
= 50,58 g/ml




Blanko Konsentrasi Absorbansi % inhibisi Log (X) Probit (Y)
0,844
10 0,778 7,81 1 3,76
20 0,686 18,72 1,30 4,10
30 0,561 33,53 1,47 4,57
40 0,480 43,12 1,60 4,82
50 0,416 50,71 1,69 5,02
20

Tabel 11. Harga Probit Sesuai Persentasenya
PERSENTASE
Probit
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
-
3,72
4,17
4,48
4,75
5,00
5,25
5,52
5,84
6,25
2,67
3,77
4,19
4,50
4,77
5,03
5,28
5,55
5,88
6,34
2,95
3,82
4,23
4,53
4,80
5,05
5,31
5,58
5,92
6,41
3,12
3,87
4,26
4,56
4,82
5,08
5,33
5,61
5,95
6,48

3,25
3,92
4,29
4,59
4,85
5,10
5,36
5,64
5,99
6,55
3,36
3,95
4,33
4,61
4,87
5,13
5,39
5,67
6,04
6,64
3,45
4,01
4,36
4,64
4,90
5,15
5,41
5,71
6,08
6,75
3,52
4,05
4,39
4,67
4,92
5,18
5,44
5,74
6,13
6,88
3,59
4,08
4,42
4,69
4,95
5,20
5,47
5,77
6,18
7,05
3,66
4,12
4,45
4,72
4,97
5,23
5,50
5,81
6,23
7,33

99
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
7,33 7,37 7,41 7,46 7,51 7,58 7,66 7,75 7,88 8,09
Sumber : (Soekardjo, B. Siswandono. 1995. Prinsip-prinsip Rancangan Obat).



21

Lampiran V. Data Statistik
Oneway



Post Hoc Tests

Homogeneous Subsets








Descriptives
IC50 DPPH
5 23,3260 2,84955 1,27436 19,7878 26,8642 18,83 26,60
5 47,1500 1,26537 ,56589 45,5788 48,7212 45,49 48,75
5 14,4980 ,29141 ,13032 14,1362 14,8598 14,22 14,99
5 7,1108 ,20075 ,08978 6,8615 7,3601 6,93 7,38
20 23,0212 15,52549 3,47160 15,7550 30,2874 6,93 48,75
ekstrak etanol
ekstrak metanol
ekstrak aseton
Vitamin C
Total
N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound
95% Confidence Interval for
Mean
Minimum Maximum
ANOVA
IC50 DPPH
4540,388 3 1513,463 614,835 ,000
39,385 16 2,462
4579,774 19
Between Groups
Within Groups
Total
Sum of
Squares df Mean Square F Sig.
IC50 DPPH
5 7,1108
5 14,4980
5 23,3260
5 47,1500
1,000 1,000 1,000 1,000
Kelompok
Vitamin C
ekstrak aseton
ekstrak etanol
ekstrak metanol
Sig.
Duncan
a
N 1 2 3 4
Subset for alpha = .05
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
Uses Harmonic Mean Sample Size = 5,000.
a.
22

Correlations

Antosianin Total DPPHx
Antosianin Total Pearson Correlation 1 .901
**

Sig. (2-tailed)

.001
N 9 9
DPPHx Pearson Correlation .901
**
1
Sig. (2-tailed) .001

N 9 9
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

Lampiran VI. Gambar










Gambar 3.Foto Beras Ketan Hitam Gambar 4. Foto Ekstrak BKH yang dilarutkan

Gambar 5. Foto Mikrowell Plate Gambar 6. Foto Elisa Reader
23

Lampiran VII. Bukti Determinasi Sampel Beras Ketan Hitam