Hemoaglutinacin e inhibicin de la hemoaglutinacin del paramixovirus aviar (APMV-1)

INTRODUCCIN La enfermedad de Newcastle (EN) est causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un serotipo del gnero Avulavirus (1). Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endmica en muchos pases. La vacunacin profilctica se practica en casi todos los pases productores de aves de corral a escala comercial.(2) El virus de la enfermedad de Newcastle es un agente patgeno de los humanos. Las infecciones registradas no suponen un riesgo para la vida y la debilidad que causan no dura ms de dos o tres das (3). Los sntomas que con mayor frecuencia se han sealado en las infecciones humanas son la infeccin ocular, que normalmente consiste en enrojecimiento de uno o de los dos ojos, lagrimeo excesivo, edema en los prpados, conjuntivitis, y hemorragia de la membrana subconjuntival. Aunque el dao ocular puede ser bastante grave, las infecciones son normalmente pasajeras y la cornea no se ve afectada. Los informes sobre otros sntomas en humanos infectados no estn tan bien documentados, pero apuntan a que a veces, puede presentarse un tipo de infeccin ms generalizada que provoca escalofros, dolor de cabeza, y fiebre, con o sin acompaamiento de conjuntivitis. (4) La actividad enzimtica de las protenas virales (hemaglutininas) produce hemaglutinacin en la cual los eritrocitos se unen por medio de puentes. Se ha demostrado que el glbulo rojo contiene cerca de 300 sitios en los cuales se puede adsorber un virus. Muchos virus contienen protenas en su capa externa que los capacitan para aglutinar glbulos rojos de varias especies. En influenza y algunos paramixovirus, la hemaglutinacin de la superficie, que es una glucoprotena, se fija al glbulo rojo que posee receptores complementarios.

Objetivo:

Metodologa

Pruebas de hemaglutinacin

Adicionar 0,050 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico

A cada pocillo se adicionan 0,025 ml de la suspensin vrica (liquido alantoideo de los huevos embromados cultivados sesiones anteriores)

A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de la suspensin vrica en volmenes de 0,025 ml.

En cada pocillo se dispensan 0,025 ml de RBC de pollo al 5% (v/v).

La solucin se mezcla golpeando suavemente la placa. Se dejan estticos los RBC durante unos 30 minutos a temperatura ambiente

La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de una corriente en forma de lgrima de los RBC. Debera leerse la titulacin a la dilucin ms alta a la que se de una HA completa (sin malla); esto representa 1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a partir del rango inicial de diluciones

Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin

Se dispensan 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico

Se adicionan 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.

A lo largo de la placa se realizan diluciones dobles del suero en volmenes de 0,025 ml

A cada pocillo se aaden 4 HAU de virus/antgeno en 0,025 ml y la placa se deja durante un mnimo de 15 minutos a 37C

A cada pocillo se aaden 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v) y, despus de mezclar suavemente, los RBC se dejan estticos unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20C, o durante unos 60 minutos a 4C si las temperaturas del ambiente son altas, considerando que los RBC control deberan sedimentar de una forma distinta.

El ttulo de HI es la dilucin mayor de suero que causa la inhibicin completa de 4 HAU de antgeno. La aglutinacin se valora inclinando las placas. Debera considerarse que muestran inhibicin solo aquellos pocillos en los que la corriente de RBC se produce a la misma velocidad que los pocillos control (que contienen 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS).

Resultados Y observaciones:
La prueba de hemaglutinacin realizada para el virus cultivado en huevos embrionados y el virus vacunal, donde el carril a y b presentan la dilucin para el virus cultivado con un ttulo presente en la dilucin numero 22 (ver figura no. 1),El ttulo del virus cultivado presenta 2,097,152 UHA, lo doble que presenta el virus vacunal

Figura No. 1 Pruebas de hemaglutinacin

En el caso de la inhibicin de la hemaglutinacin no se pudo presenciar el ttulo de la misma, a falta de diluciones de la muestra ya que solo se logr alcanzar la zona de equilibrio (ver figura No.2)

Figura No. 2: inhibicin de la hemaglutinacin, observece que en los posillos E1 y E2 se observa la presencia de malla seguido por botones de eritrocitos desde el posillo 3 al 9, sin embargo no se observa el culmino de la fase de equilibrio por lo cual no puede evidenciarse el titulo de la muestra

Discusin
La inhibicin de la hemoaglutinacin (IHA) es la unin de anticuerpos a la hemoaglutinina del virus y lasas pruebas de IHA constituyen mtodos de diagnstico e investigacin sencillos y tiles en la identificacin de virus, permitiendo la determinacin de la relacin antignica de virus aislados, identificacin y cuantificacin de anticuerpos contra virus, siendo estas pruebas altamente especficas y sensibles que se pueden adaptar fcilmente a laboratorios de escasa infraestructura por el bajo costo de los reactivos. Por lo cual la importancia de conocer su fundamento y aplicacin en estudios de virologa

Referencia
1.- ADAIR B.M., MCNULTY M.S., TODD D., CONNOR T.J. & BURNS K. (1989). Quantitative estimation of Newcastle irus antibody levels in chickens and turkeys by ELISA. Avian Pathol., 18, 175192. 2. ALDOUS E.W. & ALEXANDER D.J. (2001). Technical Review: Detection and differentiation of Newcastle disease virus (avian paramyxovirus type 1) Avian Pathol., 30, 117128. 3. ALDOUS E.W., COLLINS M.S., MCGOLDRICK A. & ALEXANDER D.J. (2001). Rapid pathotyping of Newcastle disease virus (NDV) using fluorogenic probes in a PCR assay. Vet. Microbiol., 80, 201 212. 4. ALDOUS E.W., MYNN J.K. BANKS J. & ALEXANDER D.J. (2003). A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene. Avian Pathol., 32, 239357. 5. ALEXANDER D.J (2001). Newcastle disease The Gordon Memorial Lecture. Br. Poult. Sci., 42, 5 22. 6. ALEXANDER D.J. (2003) Newcastle disease, other avian Paramyxoviruses and pneumovirus infections: