Genes and Genomes

Week 1 characterisation of the human genome

Chapter 2 chromosome stucture and function
2.4 Studying human chromosomes
Cytogenetics = het analyseren van chromosomen, dit is makkelijker bij de mitose dan tijdens de meiose. Bloedcellen en fibroblasten zijn dan de makkelijkste cellen voor cytogenetica. Tijdens de metafase zijn de chromosomen goed zichtbaar en door toevoeging van een spindle-disrupting agent, gaat de cel niet over in de volgende fase. Voor analyse van de chromosomen in de meiose zijn alleen geslachtscellen geschikt. Deze zijn bij vooral bij de vrouw lastig te verkrijgen (tijdens de ovulatie). Voor 1970 werd er een verdeling in chromosomen gemaakt naar de lengte en de plek van de centromeer binnen de chromosomen. Hierna ontstonden de technieken om de verschillende bandjes binnen een chromosoom zichtbaar te maken en zo een verdeling te maken. Hiervoor zijn verschillende technieken: G-banding: Giemsa kleuring, positieve donkere banden zijn Gbanden, lichte banden zijn Gnegatief. Q-banding: bindt aan AT rijk DNA, fluorescente banden zijn Qpositief, lichte banden zijn Qnegatief. R-banding: ???? door de hitte denatureert het AT rijke DNA. T-banding: identificeert een stuk van de Rbanden, maar dan dichtbij de telomeren. C-banding: laat een stukken heterochromatine zien. Chromosome banding pagina 44-45 Kleine arm van het chromosoom is de p arm (petit) en de lange arm is de q arm (queue), verder is de telling van de verschillende regios als volgt: p1, p2, p3 etc. en q1, q2, q3 etc., waarbij vanuit de centromeer naar buiten wordt geteld. Binnen deze regios is er een verdeling in banden: p11 = regio 1, band 1/p12 = regio 1, band 2 etc.. Binnen deze banden zijn ook weer sub-banden: p11.1 = regio 1, band 1, subband 1 etc.. Verder is er nog een onderscheidt in de worden proximal en distal. Hierbij betekent proximaal het dichtste bij de centromeer en distaal het verste van de centromeer af en dus tegelijkertijd het dichtste bij de telomeer. Voorbeeld: proximal Xq = de lange arm van chromosoom X het dichtste bij de centromeer. Bij het vergelijken van twee verschillende soorten is er de volgende notatie: de eerste letter van the genus naam en de eerste twee letters van de soort naam. Een karyotype is een cytogenic analysis report van zowel alle chromosomen incl. de geslachtschromosomen. Dus voor mannen: 46,XY en voor vrouwen 46,XX. Een karyogram, ookwel karyotype, is de totale hoeveelheid aan mitotische chromosomen van 1 persoon, waarbij de homologe paren naast elkaar staan. Chromosoom banding technieken geven een goed beeld weer van de globale organisatie van de chromosomen. Voor een verdere/betere analyse moeten er specifieke DNA sequenties binnen de chromosomen worden gedetecteerd. De DNA sequentie die we willen detecteren noemen we ook wel target DNA sequence, Daarnaast moet er gebruik worden gemaakt van een probe. Een probe bestaat uit gelabelde oligonucleotide (kort stukje enkelstrengs DNA/RNA) of nucleic acid. Natuurlijk: hoe langer de probe, hoe specifieker de binding met het target.

Oligonucleotide zijn vaak 15-20 nucleotiden lang en zijn chemisch te synthetiseren. Nucleic acid probes bestaan vaak uit honderden nucleotiden ( een paar kilobasen lang) en is verkrijgbaar uit DNA/DNA kopien/RNA transcripten. Aangezien de probe enkelstrengs is, moet er worden gezorgd voor denaturatie van het target DNA, zodat dit ook enkelstrengs wordt. Het doel daarna is dat de fluorescente probe door middel van waterstofbruggen bindt aan het stukje target DNA = moleculaire hybridisatie. FISH (Fluorescence in situ hybridization) Fish is een methode om een deel van het chromosoom fluorescent te labelen en vervolgens onder een fluorescentie microscoop te bekijken. Deze techniek kan ook worden gebruikt om naar bepaalde ziektes als gevolg van een afwijking in de chromosomen (translocatie/trisomerie) te kijken. Cellen worden in metafase van de celdeling gebracht, zodat de chromosomen condenseren en goed zichtbaar zijn. Vervolgens wordt er een fluorescent gemaakte probe, net als hierboven beschreven, toegevoegd aan het DNA waardoor hybridisatie optreedt en het target DNA oplicht. De niet bindende probes worden weggewassen en je houdt waarschijnlijk twee fluorescerende spots over. Wat logisch is, want de probe bindt aan alle twee de zuster chromatine. Een andere methode is het gebruik maken van twee verschillende probes, waarbij de eerste (reporter molecule) aan het stuk target DNA bindt en de tweede (affinity molecule) fluorescent is en aan de eerste probe bindt. Interfase FISH: is vergelijkbaar alleen dan niet in de metafase. Bijvoorbeeld als cellen al dood zijn en het niet mogelijk is ze naar de metafase te brengen. Er is dan wel een hogere resolutie nodig aangezien de chromosomen minder gecondenseerd zijn en dus moeilijker zichtbaar worden. CGH (Comparative genome hybridization) Doel van deze techniek is het vergelijken van twee verschillende stukjes DNA van een verschillende bron waarbij je verwacht dat deze stukjes veel met elkaar overeenkomen. Bijvoorbeeld de verschillende tussen gezond en tumorweefsel. Hetzelfde stukje DNA wordt met twee verschillende fluorescente kleuringen gemaakt en vervolgens wordt de FISH techniek toegepast. In de metafase zijn de chromosomen gecondenseerd, waarna de stukjes gefluoresceerde DNA kan worden gehybridiseerd. Dus, het ene DNA (tumor) wordt bijvoorbeeld groen gelabeld en het ander rood (gezond), nadat hybridisatie plaatsvindt kan worden gekeken waar de rode en groene stukjes zich bevinden. De resultaten kunnen met microarray worden bekeken, namelijk: evenveel rood en groen aanwezig zal een gele stip opleveren, terwijl meer rood een rode stip oplevert en andersom.

2.5 Chromosome abnormalities

Chromosoom afwijkingen zijn ook wel afwijkingen met een zichtbare veranderingen in de chromosomen. Hoe nauwkeurig je dit kunt zien hangt af van de techniek die wordt gebruikt. Door FISH bijvoorbeeld is er totaal geen onderscheidt te maken in de zogenaamde afwijkingen van het chromosoom zelf of van het DNA. Een andere definitie kan ook zijn: een afwijking door misrepair of chromosombreuken. In ieder geval is er onderscheidt te maken in twee verschillende afwijkingen. Namelijk: constitutional abnormality, deze afwijking komt in elke lichaamscel voor en zal dus ook al heel vroeg in de ontwikkeling hebben plaats gevonden. Misschien zelfs wel al in de sperma of eicel van de ouders. Daarnaast bestaat er ook somatic/acquired abnormality, hierbij komt de afwijking alleen voor in een aantal cellen of een bepaald weefsel. Binnen deze twee categorien is er een verder onderscheidt tussen: numerical abnormalities en structural abnormalities. Waarbij een numericale afwijkingen, afwijkingen zijn in het aantal kopien en structurele afwijkingen afwijkingen zijn in de chromosoom structuur. Numerical chromosomal abnormalities Numericale chromosomale afwijkingen zijn onder te verdelen in drie klasses.

1. Polyploidy: als de nakomelingen een ander aantal chromosomen hebben dan de ouders. Binnen een cel zijn dan meer chromosomen aanwezig dan een homoloog aantal aan het aantal chromosomen van de ouders. Dit is het geval als twee sperma cellen n eicel bevruchten. Vaak is dit niet levensvatbaar. 2. Aneuploide: hiervan is sprake als de celkern n of meerdere chromosomen mist of teveel heeft. Bijvoorbeeld trisomie, waarbij er drie ipv twee chromosomen van zijn (Downsyndroom) of monosomie waarbij er maar 1 chromosoom is (syndroom van Turner). Aneuploide kan door twee verschillende oorzaken ontstaan. Nondisjunction betekent het niet juist uitelkaar gaan van de chromosomen tijdens de celdeling, waardoor er ofwel 22 chromosomen of 24 in geslachtscellen komen en er dus of trisomie of monosomie ontstaat. Daarnaast kan ook anaphase lag een oorzaak zijn. Hierbij zijn de chromosomen te langzaam waardoor ze de kern niet halen. Chromosomen die in dochtercellen de kern niet halen worden vaak afgebroken. 3. Mixoploidy: dit houdt in dat n individu twee of meerdere verschillende genetische cel lijnen bevat. Het kan zijn dat de cellijnen van dezelfde zygote afkomen (mosaicism) of van twee verschillende zygoten (chimerism). Chimerism kan bijvoorbeeld optreden als twee zygoten aggregeren met elkaar. Het hebben van een niet normaal aantal chromosomen heeft vaak een dodelijke afloop. Behalve trisomie 21, 13 en 18 (leidt alle drie tot een bepaald syndroom) is geen n trisomie levensvatbaar. Autosomale monosomie is totaal niet levensvatbaar en leidt in de vroege embryonale fase al tot overleiden van de embryo. DNA schade kan optreden door bijvoorbeeld chemicalin of radioactieve straling. Op het moment dat er tijdens de G2 fase een enkelstrengs breuk optreedt spreek je van een: chromatide breuk, de breuk vindt namelijk plaats in 1 van de twee chromosomen. Als er tijdens de G1 fase schade optreedt spreken we van een chromosoom breuk, aangezien er dan wel degelijk schade is aan beide chromatide. Nadat er schade aan de chromosomen/chromatide heeft opgetreden zijn er drie verschillende opties hoe je lichaam daarop kan reageren. Ten eerste, de schade is niet te repareren en de cel wordt tot apoptose genduceerd. Ten tweede, de schade wordt correct gerepareerd. En tot slot, de schade wordt niet-correct gerepareerd waardoor er een chromosoom met een structurele afwijking ontstaat. Natuurlijk maakt de positie waar de schade optreedt ook uit voor het verdere vervolg. Zo zal een teenhaar cel damage minder schade opleveren dan schade in een T-cell receptor. Structurele afwijkingen kunnen dus ontstaan na verkeerde reparatie als bijvoorbeeld: een deletie, een inversie of het ontstaan van een ring chromosoom. Een deletie is een stukje chromosoom dat verloren is gegaan, een inversie een stukje chromosoom dat in de verkeerde richting zit en het ontstaan van een ring chromosoom kan optreden als de verkeerde eindjes aan elkaar gaan. Een deletie en inversie kunnen zowel optreden bij twee breuken in dezelfde arm als in verschillende armen van het chromosoom, terwijl het ontstaan van een ringstructuur alleen bij twee breuken in verschillende armen optreedt. Als twee verschillende chromosomen allebei een single breuk ondergaan met als gevolg het verkeerd repareren van de twee chromosomen spreken we van translocation. Een reciprocal translocation is de term die wordt gebruikt om een verschuiven van delen van de chromosomen tussen verschillende chromosomen te beschrijven. Als de delen van de chromatide die omwisselen gelijk zijn aan elkaar en allebei acentric zijn, is het chromosoom wel stabiel tijdens de mitose. Maar, als de fragmenten zowel centric als acentric zijn (wel en geen middenstuk bevatten) is dit niet stabiel tijdens de mitose. Een speciale translocatie, ook wel Robertsonian translocation, treedt op als er een verschuiving van fragmenten binnen n van de volgende chromosomen optreedt: 13, 14, 15,21 of 22. Deze chromosomen lijken heel erg op elkaar doordat hun korte arm heel kort en bijna gelijk zijn. Deze korte arm bestaat uit 1-2 megabasen of tandem repeated rRna tussen twee blokken van

heterochromatide DNA. Feit is dat er altijd een stukje chromatine verloren gaat, maar in dit geval hoeft dat niet altijd een probleem te zijn. Een isochromosoom is een chromosoom die n arm is verloren en die heeft vervangen door een exacte kopie van zijn andere arm. Dus: een chromosoom met twee korte of twee lange armen die identiek zijn aan elkaar. De invloed van een desbetreffende verandering binnen een chromosoom hangt van de situatie af. Werkelijke gebalanceerde afwijkingen hebben bijna nooit een heftige invloed, behalve: Als de chromosoom breuk een belangrijk gen onderbreekt; Als een breuk ervoor zorgt dat controle elementen of actieve genen in de heterochromatine domeinen belandt; Zie afbeelding 2.25 en 2.25 op pagina 56 en 57.