UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

AVALIAO DO EFEITO DA EXTRAO E DA MICROFILTRAO DO AA SOBRE SUA COMPOSIO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Ana Paula Gil Cruz

2008

UFRJ

AVALIAO DO EFEITO DA EXTRAO E DA MICROFILTRAO DO AA SOBRE SUA COMPOSIO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Ana Paula Gil Cruz

Dissertao de Mestrado apresentado ao Programa de Ps-Graduao em

Bioqumica, Instituto de Qumica, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessrios obteno Cincias. do ttulo de Mestre em

Orientadoras: Carmen Marino Donangelo Virgnia Martins da Matta

Rio de Janeiro, Agosto, 2008 ii

AVALIAO DO EFEITO DA EXTRAO E DA MICROFILTRAO DO AA SOBRE SUA COMPOSIO E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Ana Paula Gil Cruz

Aprovada por:

________________________________________ Prof Dr Carmen Marino Donangelo Presidente Instituto de Qumica UFRJ

________________________________________ Dr Virgnia Martins da Matta Embrapa Agroindstria de Alimentos

________________________________________ Dr. Sonia Couri Embrapa Agroindstria de Alimentos

________________________________________ Prof. Dr. Joab Trajano Silva Instituto de Qumica UFRJ

________________________________________ Prof Dr Adriana Farah Instituto de Qumica UFRJ

Rio de Janeiro Agosto, 2008 iii

Cruz, Ana Paula Gil. Avaliao da influncia da extrao e microfiltrao do aa sobre sua composio e atividade antioxidante/ Ana Paula Gil Cruz. Rio de Janeiro: UFRJ/ IQ, 2008. xvii; 88 f.: il, 31cm. Orientadores: Carmen Marino Donangelo e Virgnia Martins da Matta Dissertao (Mestrado) UFRJ/ IQ/ Programa de Psgraduao em Bioqumica, 2008. Referncias bibliogrficas: 81- 92. 1. Aa. 2. Extrao. 3. Microfiltrao. 4.Compostos 5. Atividade Antioxidante. 6. Estgios de

Bioativos.

maturao. I. Donangelo, Carmen Marino; Matta, Virgnia Martins da. II. Unisversidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Qumica/ Programa de Ps-graduo em Bioqumica. III. Avaliao da influncia da extrao e microfiltrao do aa sobre sua composio e atividade antioxidante.

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DEDICATRIA

Dedico esta importante conquista aos meus pais, Jos Luiz e Ins, pelo amor, carinho, dedicao e sabedoria com que me educaram sem os quais nada seria possvel. Dedico igualmente ao meu esposo, Esteban, por seu imenso amor, apoio, companheirismo, conselhos e desprendimento, que me permitiram a realizao de mais um sonho e s minhas filhas, Pmela e Manuela, por todo amor e cumplicidade que por muitas vezes no me deixaram fraquejar e sem os quais as renncias de alguns momentos no seriam possveis.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por todas as bnos que tenho recebido e que permitiram todo meu crescimento at ento e continuaro a iluminar os caminhos a serem trilhados por mim na busca do aperfeioamento constante tanto profissional como espiritual. Embrapa Agroindstria de Alimentos, pela oportunidade e cesso de suas instalaes que permitiram a realizao deste trabalho. s minhas orientadoras, Carmen e Virgnia, pelo carinho, confiana no meu potencial, ensinamentos e conselhos que me permitiram um crescimento mpar e a conquista de mais uma etapa. Aos professores e funcionrios do Programa de Ps-Graduao em Bioqumica do Instituto de Qumica, pelo apoio. Aos meus amigos da Embrapa, Choro, Flvia, William, Fil, Selma, Claudo, David, Henriqueta, Andressa, Manuela, Ana Cristina, Luciana Sampaio, Sidina e Marco pela amizade, conversas e o carinho que sempre esteve presente em nossos relacionamentos, alm da imensa ajuda em diferentes etapas da parte experimental deste trabalho. pesquisadora Rafaella Mattietto, da Embrapa Amaznia Oriental e profa. Cristina Dib Txi e sua equipe, da Universidade Federal Rural da Amaznia, pela ajuda nos experimentos de extrao do aa. Lourdes e Angela Furtado, pelo carinho, amizade e valiosos ensinamentos e conselhos. Ao Edmar, Snia, Mnica Damaso, Flix e Viktor, por contriburem de alguma forma com meu crescimento e pelo convvio sempre to rico. Aos colegas de mestrado, em especial Mnica, Ellen, Morgana, Ilana, Vanessa, Juliane, Gisele, Srgio, Lindomar, Cristiano e Ieda por compartilhar tanto os momentos de desespero, como os de alegrias e sucessos ao longo do curso. Aos colegas do Laboratrio de Bioqumica Nutricional e de Alimentos pela troca de conhecimento e pelo convvio. Aos meus pais, que me ensinaram a prosseguir sempre e que os obstculos existem para serem superados sem, contudo, trair nossos valores e ideais. vi

 minha famlia, Esteban, Pmela e Manuela que sempre me incentivaram e com todo amor, pacincia, sensibilidade e sabedoria me acompanharam, principalmente durante este perodo. Aos meus amados irmos, Tico e Tuti, que mesmo longe fisicamente sempre se fazem presentes em minha vida e dos quais sempre tenho o apoio e conselhos que necessito. Aos meus tios e tias, Bibiana, Newton, Madalena (in memorian), Clayton, Jos Augusto, Tereza, Bralio, Ireny, Maria Francisca, Jaime, Marilda e Mrcio pelos inmeros ensinamentos de vida. Aos meus avs, Bralio (in memorian), Aparecida, Joanna e Mrcio (in memorian) que me mostraram que a humildade e a dedicao so ferramentas fundamentais para o conhecimento e crescimento. Aos meus sogros, Humberto e Marina, meus primos, primas, cunhadas, sobrinho e sobrinha pelo incentivo. Mnica Pagani pela amizade, conselhos, fora e companheirismo durante este perodo to intenso da minha vida. Aos amigos Daniel, Aline Bravo, Poliana, Sandra Mrcia e Simone pelo apoio, incentivo e pelo convvio to rico, feliz e intenso. Aos amigos conquistados ao longo deste tempo Flvia Pingo, Cristina, Isabelle, ngela, Alcilcia, Bia, Andr, Andr (Pimenta), Adriana, Lauro, Ana Carolina, Rafael, Pietro, Fernandinha, Aline e Denise, pela ajuda, por todos os momentos compartilhados e pelos laos que no se desfazem com o tempo e distncia. A todos com quem tive o prazer de conviver e que certamente contriburam para este momento. CAPES pela concesso de bolsa e ao Projeto PAVUC Inco-Dev 15279, pela bolsa inicial e pelo financiamento do projeto.

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RESUMO

O aa (Euterpe oleracea Mart.) uma palmeira da regio amaznica, de cujo fruto globuloso violceo se extrai uma polpa cremosa que vem conquistando tanto novos mercados consumidores em funo do seu valor nutricional e sabor extico, quanto o interesse da comunidade cientfica, por sua composio em compostos bioativos. O aa um fruto de grande importncia para o desenvolvimento da regio amaznica, no s por fazer parte do hbito alimentar da populao local como tambm por responder pela sustentao econmica das populaes envolvidas no seu cultivo. Dados de composio qumica do aa so ainda escassos e o potencial de desenvolvimento de novos produtos no foi completamente explorado. Deste modo, os objetivos deste trabalho foram avaliar as alteraes na composio do aa durante a maturao assim como avaliar a influncia da extrao e da microfiltrao sobre os compostos bioativos e sua atividade antioxidante in vitro. Os resultados obtidos mostraram que as antocianinas do aa somente so produzidas ao final da maturao. Os teores de compostos fenlicos totais apresentaram ligeira queda no incio da maturao e um aumento considervel ao final da mesma, tendo a atividade antioxidante in vitro apresentado o mesmo comportamento. O tratamento enzimtico a 40C, durante a etapa de macerao dos frutos, incrementou em 50% a extrao de compostos fenlicos e em mais de 75% a extrao dos pigmentos antocinicos em relao a extrao a 40C sem a adio da preparao enzimtica. A polpa obtida nesta condio de macerao apresentou teor de fenlicos totais de 346 mg/100g, antocianinas totais de 58 mg/100g e uma atividade antioxidante de 26 mol equivalentes de Trolox/g. A temperatura de processo e o tipo de membrana utilizada na microfiltrao da polpa de aa centrifugada, de uma forma geral, no influenciaram significativamente os compostos bioativos e a atividade antioxidante das duas fraes obtidas, entretanto, o fluxo de permeado foi fortemente afetado pelos dois fatores, atingindo o maior valor mdio (117 L/hm2) com a membrana cermica a 35C. A microfiltrao do aa permitiu a obteno de duas fraes com caractersticas distintas, porm igualmente ricas, tanto em relao composio qumica das mesmas como em relao viii

ao potencial de aplicao industrial. O suco clarificado, que pode ser utilizado como base para gelias finas, repositores de sais e, refrigerantes, apresentou teores de antocianinas de 16 mg/100g, fenlicos totais de 138 mg/100g e atividade antioxidante de 9 mol equivalentes de Trolox/g. A frao retida, por sua vez, com caractersticas similares s do aa original, apresentou teores de 75 mg/100g de antocianinas, 433 mg/100g de fenlicos totais e 31 mol equivalentes de Trolox/g de atividade antioxidante, podendo servir de matriaprima para diferentes produtos tais como nctares prontos para o consumo, iogurtes, recheios e sorvetes.

Palavras-chave:

aa,

estgios

de

maturao,

processamento

de

polpa,

microfiltrao, compostos bioativos, atividade antioxidante.

ix

ABSTRACT

Aa (Euterpe oleracea Mart.) is a palm plant of the Amazon region with round-shaped dark-purple fruits from which a creamy pulp can be extracted. It has increasing consumer markets due to its nutritional value, exotic flavor and composition in bioactive substances. Aa fruit is important for the development of the Amazon region, not only as a major staple local food but also as a major economic resource for the local population. Data on chemical composition are still scarce and the potential for development of new products has not been completely explored. Therefore, the objectives of this work were to evaluate changes in composition of aa during maturation and the influence of extraction and microfiltration processes on bioactive components and in vitro antioxidant activity. The results obtained showed that anthocyanins are produced in aa at the final stage of maturation. Total phenolic compounds, as well as antioxidant activity, were slightly reduced at the early stage of maturation, but increased substantially at the final stage. Enzymatic treatment at 40C during fruit maceration increased extraction of total phenolics (50%) and of total anthocyanins (75%). Using this treatment, the pulp contained 356 mg/100g total phenolics, 58 mg/100g total anthocyanins, and 26 mol Trolox equivalents/g of antioxidant activity. In general, the temperature and type of membrane used during microfiltration of the centrifuged aa pulp did not influence significantly bioactive components and antioxidant activity of the two fractions obtained. However, the permeate flux was strongly dependent on both factors, reaching the highest mean value (117 L/hm2) with the ceramic membrane at 35oC. Microfiltration of aa resulted in two fractions with distinct characteristics although both rich in bioactive components and with potential industrial application. The clarified juice that could be used in the formulation of jellies, sport and soft drinks, had 16 mg/100g of anthocyanins, 138 mg/100g of total phenolics and 9 mol Trolox equivalents/g antioxidant activity. The retained fraction, with similar characteristics to the original aa fruit, had 75 mg/100g anthocyanins, 433 mg/100g total phenolics and 31 mol Trolox equivalents/g x

of antioxidant activity, and could be used as an ingredient for different products like ready to drink nectars, yoghurts, fillings and ice-creams.

Key-words: aa, ripeness degrees, pulp processing, microfiltration, bioactive compounds, antioxidant activity

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 2.1: Metabolismo de compostos fenlicos em plantas ........................... 5 Figura 2.2: Principais classes de compsotos no-flavonides .......................... 6 Figura 2.3: Ncleo falvano................................................................................. 6 Figura 2.4: Principais classes de flavonides .................................................... 7 Figura 2.5: Reao de quantificao de fenlicos totais por reagente de FolinCiocalteu ............................................................................................................ 8 Figura 2.6: Principais antocianidinas em alimentos ......................................... 10 Figura 2.7: Grupos estruturais que contribuem para a atividade antioxidante das antocianinas .............................................................................................. 12 Figura 2.8: Comporatamento das antocianinas em funo do pH................... 14 Figura 2.9: Comportamento espectral do ABTS .............................................. 18 Figura 2.10: Processos de separao por membranas em funo do tamanho dos poros.......................................................................................................... 19 Figura 2.11(a): Esquema de filtrao em profundidadel .................................. 20 Figura 2.11(b): Esquema de filtrao tangencial ............................................. 20 Figura 2.12(a): Aaizeiro ................................................................................. 24 Figura 2.12(b): Fruto do aa........................................................................... 24 Figura 3.1: Diagrama dos procedimentos experimentais realizados ............... 32 Figura 3.2: Fluxograma de obteno da polpa dos frutos do aa em trs estgios de maturao .................................................................................... 33 Figura 3.3: Batedeira ou despolpadeira de aa .............................................. 33 Figura 3.4: Despolpadeira de escovas ............................................................ 36 Figura 3.5: Centrfuga de cestos ..................................................................... 36 Figura 3.6: Sistema de microfiltrao com membranas cermicas ................. 37 Figura 3.7: Sistema de microfiltrao com membranas polimricas ............... 38 Figura 3.8: Fluxograma de processo de limpeza dos sistemas de microfiltrao ......................................................................................................................... 40 Figura 3.9: Procedimento de obteno do extrato para quantificao da atividade antioxidante ...................................................................................... 42 Figura 3.10: Procedimento de quantificao das antocianinas totais por Fuleki & Francis (1968 a) ........................................................................................... 43 xii

Figura 3.11: Procedimento de quantificao das antocianinas totais e monomricas por pH diferencial ...................................................................... 45 Figura 3.12: Procedimento de obteno do extrato e quantificao do teor de fenlicos totais por Folin-Ciocalteu .................................................................. 48 Figura 4.1: Exemplo de cromatograma obtido coma polpa de aa ............... 54 Figura 4.2: Relao entre a atividade antioxidante e o teor de compostos fenlicos totais do aa em trs estgios de maturao .................................. 56 Figura 4.3: Influncia da temperatura e do tratamento enzimtico durante a macerao do fruto sobre os compostos fenlicos da polpa de aa .............. 60 Figura 4.4: Influncia da temperatura e do tratamento enzimtico durante a macerao do fruto sobre as antocianinas da polpa de aa .......................... 61 Figura 4.5: Influncia do tipo de membrana sobre o fluxo de permeado nos processos a 25C ............................................................................................ 67 Figura 4.5: Influncia do tipo de membrana sobre o fluxo de permeado nos processos a 35C ............................................................................................ 68

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1: Matrias primas utilizadas ............................................................. 31 Tabela 3.2: Gradiente de concentrao da fase mvel .................................... 47 Tabela 4.1: Composio centesimal e parmetros fsico-qumicos da polpa do aa em trs estgios de maturao ................................................................ 51 Tabela 4.2: Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro da polpa do aa em trs estgios de maturao ................................................................ 53 Tabela 4.3: Rendimento da polpa de aa em diferentes estgios de maturao do fruto ............................................................................................................. 57 Tabela 4.4: Parmetros fsico-qumicos das polpas de aa obtidas em diferentes condies de macerao do fruto .................................................... 58 Tabela 4.5: Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro das polpas de aa obtidas em diferentes condies de macerao do fruto ......................... 59 Tabela 4.6: Anlise de varincia de dois fatores dos parmetros das polpas de aa obtidas em diferentes condies de macerao do fruto ......................... 63 Tabela 4.7: Parmetros da polpa do aa antes e aps os pr-tratamentos, refino e centrifugao ....................................................................................... 64 Tabela 4.8: Compostos fenlicos e ativiadade antioxidante in vitro da polpa do aa antes e aps os pr-tratamentos, refino e centrifugao .......................... 65 Tabela 4.9: Parmetros fsico-qumicos do suco de aa clarificado por microfiltrao .................................................................................................... 69 Tabela 4.10: Parmetros fsico-qumicos da frao retida do aa durante a sua microfiltrao .................................................................................................... 70 Tabela 4.11: Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro do suco de aa clarificado por microfiltrao ..................................................................... 71 Tabela 4.12: Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro da frao retida do aa durante a sua microfiltrao ...................................................... 72 Tabela 4.13: Perdas de compsotos fenlicos e atividade antioxida in vitro em funo dos processos de microfiltrao ........................................................... 74

xiv

SUMRIO

1. 2. 2.1.

INTRODUO ................................................................................................... 1 REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................... 4 Compostos fenlicos .......................................................................................... 4

2.1.1. Caracterizao qumica ...................................................................................... 4 2.1.2. Mtodos de anlise ............................................................................................ 7 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. Antocianinas ..................................................................................................... 10 Atividade antioxidante ...................................................................................... 15 Processos de separao por membranas ........................................................ 18 Aa 23

2.5.1. Caracterizao qumica e atividade antioxidante ............................................. 25 2.5.2. Processamento do aa .................................................................................... 28 3. 3.1. 3.2. MATERIAL E MTODOS ................................................................................. 31 Matria-prima ................................................................................................... 31 Procedimento experimental .............................................................................. 32

3.2.1. Caracterizao da polpa de aa em trs estgios de maturao .................... 33 3.2.2. Extrao da polpa de aa em diferentes condies de macerao ................ 34 3.2.3. Pr-tratamentos para a microfiltrao .............................................................. 35 3.2.4. Microfiltrao .................................................................................................... 36 3.2.5. Limpeza dos sistemas de microfiltrao ........................................................... 39 3.3. Mtodos analticos ........................................................................................... 41

3.3.1. Atividade antioxidante ...................................................................................... 41 3.3.2. Antocianinas totais e monomricas .................................................................. 43 3.3.3. Identificao das antocianinas monomricas por CLAE .................................. 46 3.3.4. Fenlicos totais ................................................................................................ 47 3.3.5. pH........ ............................................................................................................ 48 3.3.6. Slidos solveis (oBrix) .................................................................................... 48 3.3.7. Acidez titulvel total .......................................................................................... 49 3.3.8. Teor de polpa.................................................................................................... 49 3.3.9. Slidos totais .................................................................................................... 49 3.3.10. Composio centesimal .................................................................................. 49 xv

3.3.11. Anlise estatstica dos dados .......................................................................... 50 4. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................ 51 Caracterizao da polpa de aa em trs estgios de maturao .................... 51 Extrao da polpa de aa em diferentes condies de macerao ................ 57 Pr-tratamentos................................................................................................ 64 Microfiltrao .................................................................................................... 66

4.4.1. Desempenho do processo ............................................................................... 66 4.4.2. Avaliao das fraes obtidas .......................................................................... 69 5. 6. CONCLUSES E SUGESTES...................................................................... 75 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 78

xvi

1. INTRODUO
O aumento no consumo de frutas pode ser verificado pelo crescimento de 85,6% na produo mundial de frutas ao longo dos 25 anos analisados pela FAO (2006 apud OLIVEIRA JUNIOR; MANICA, 2006). Em 2004 foram produzidas 675,1 milhes de toneladas de frutas, atingindo 690,8 milhes de toneladas em 2005, um aumento de 4,86% em um ano. Em 2005 a China aparece como o maior produtor mundial com 167,0 milhes de toneladas, seguido pela ndia, com 57,9, e o Brasil ocupa o terceiro lugar com 41,2 milhes de toneladas de frutas (OLIVEIRA JUNIOR; MANICA, 2006). O crescente interesse dos consumidores por produtos mais saudveis como frutas e vegetais reflete as evidncias de vrios estudos cientficos que apontam o elevado consumo destes alimentos com efeitos benficos sade como a preveno de doenas crnicas cuja causa primria est relacionada ao estresse oxidativo, dentre as quais se destacam as doenas

neurodegenerativas, cncer e doenas cardiovasculares (VALKO et al, 2006; SCANDALIOS, 2005). Apesar de o consumo per capita de sucos de frutas industrializados no Brasil ainda ser pequeno, tem-se observado seu crescimento. A produo de sucos naturais e integrais vem crescendo continuamente, passando de 2,8 milhes de litros em 2002 para 8,6 milhes em 2006 e 13,7 milhes em 2007, com um aumento de 58% no ltimo ano (ARRUDA, 2008). Os sucos adoados, por sua vez, atingiram um pico de 6,7 milhes de litros em 2005 e este valor foi reduzido para 4,5 milhes em 2007. Esperancini (2005) aponta que os investimentos do setor em embalagens, nichos especficos (sem adio de acar) e na diversificao de sabores (frutas regionais ganhando novos mercados internos), permitiram consolidar o segmento de sucos industrializados para consumidores de renda mais elevada e mais preocupados com a sade. O aa um fruto amaznico que vem ganhando novos mercados desde a dcada de 90, devido principalmente ao seu elevado valor nutricional. No entanto, seu consumo no ocorre na forma in natura, mas principalmente como polpa, devendo o fruto ser submetido a um processo de extrao. As 1

principais barreiras para a consolidao e ampliao do mercado do aa decorrem da produo do fruto ser ainda 80% extrativista e pela alta perecibilidade do fruto e da polpa, necessitando ser sumbetida a um processo de conservao imediatamente aps a extrao (NOGUEIRA, et al., 2005). Alguns pesquisadores tm estudado as propriedades fsico-qumicas da polpa e apontam para um potencial antioxidante aprecivel em funo de sua rica composio em compostos fenlicos, em especial as antocianinas (POZOINSFRAN, BRENES & TALCOTT, 2004; PACHECO-PALENCIA, HAWKEN & TALCOTT, 2007). Sanabria & Sangronis (2007) avaliaram a influncia da sazonalidade sobre a composio centesimal, perfil de cidos graxos e compostos com capacidade antioxidante da polpa de aa, utilizando, para tanto, frutos coletados nos meses de fevereiro e julho, entretanto no existe estudo sobre as alteraes decorrentes da etapa de maturao sobre a composio centesimal e nem sobre os compostos no nutrientes com capacidade antioxidante.O aa foi sugerido por Bobbio et al (2000) como uma boa fonte para a extrao de pigmentos antocinicos e, seguindo esta linha de pesquisa, Constant (2003) desenvolveu processos de extrao e obteno das antocianinas do aa em p, aplicando, com sucesso, o corante obtido em iogurte, petit suisse e isotnico em p. Pacheco-palencia, Hawken & Talcott (2007) verificaram perdas das antocianinas e, consequentemente, da atividade antioxidante do aa em funo da sua clarificao com terra diatomcea. Ao avaliar a estabilidade do suco clarificado de aa foi verificado que a temperatura de armazenamento tambm afetou estes compostos. Os estudos sobre a composio nutricional e de compostos bioativos do aa so recentes, escassos e os resultados so divergentes. Contudo, todos apontam o aa como um fruto rico em polifenis, especialmente em antocianinas, com um teor relativamente alto, variando de 50 a 180 mg/100g de polpa. Em comparao com o suco de uva, reconhecido como boa fonte destes compostos e que apresenta um teor de 14 a 27 mg/100g (BOBBIO et al., 2000; POZO-INSFRAN, BRENES & TALCOTT, 2004; WU et al., 2006), verifica-se que os teores no aa so relevantes. 2

Diante do exposto, o presente trabalho teve por objetivo geral quantificar os compostos fenlicos totais e antocianinas do aa assim como sua atividade antioxidante, por mtodo in vitro, avaliando a influncia do processo de obteno da polpa e do processamento com membrana sobre os parmetros qumicos e fsico-qumicos. Os objetivos especficos foram:

Caracterizar quimicamente a polpa de aa obtida com o fruto em trs diferentes estgios de maturao, incluindo a quantificao dos compostos fenlicos totais e antocianinas, bem como sua atividade antioxidante.

Avaliar a influncia da temperatura e do tratamento enzimtico na obteno da polpa de aa sobre o rendimento do processo, o teor de compostos fenlicos totais e antocianinas bem como sobre a atividade antioxidante.

Avaliar a influncia dos pr-tratamentos, refino e centrifugao, da polpa de aa sobre o teor de polpa, os slidos totais, os compostos fenlicos totais e antocianinas alm da atividade antioxidante.

Avaliar a influncia da temperatura e do tipo de membrana utilizados durante a microfiltrao do suco de aa, sobre o seu teor de compostos fenlicos totais e antocianinas, sua atividade antioxidante, bem como sobre o fluxo de permeado.

2. REVISO BIBLIOGRFICA 2.1. Compostos fenlicos

Os compostos fenlicos correspondem a um grupo formado por molculas muito distintas entre si que esto divididas, em funo da estrutura qumica, em duas classes, flavonides e no-flavonides, e estas duas classes dividem-se em vrias subclasses em funo do padro de substituio e das estruturas qumicas. Os compostos fenlicos so metablitos secundrios das plantas

sintetizados em resposta a condies de estresse. Podem agir como fitoalexinas, como atrativo para polinizao, por contriburem para a pigmentao do vegetal, como antioxidantes e, similarmente ao sistema imunolgico humano, protegendo a planta de raios ultravioleta e de patgenos, dentre outros. Nos alimentos so os principais compostos responsveis pelas caractersticas sensoriais tais como adstringncia, amargor e aroma, alm da estabilidade oxidativa dos produtos derivados de vegetais. Por muito tempo, esses compostos foram associados negativamente qualidade de alimentos vegetais pela ao antinutricional como, por exemplo, dos taninos, que complexam protenas, diminuindo o valor nutricional e em alguns casos inibem a atividade de enzimas como tripsina e lipases (SHAHIDI & NACZK, 1995). No entanto, vrios estudos recentes tm demonstrado antialrgico, seus efeitos

plurifarmacolgicos

(bactericida,

antiviral,

antitrombtico,

antiinflamatrio, anticarcinognico, hepatoprotetor, vasodilatador), despertando grande interesse principalmente por sua alta prevalncia nas dietas j que so compostos onipresentes nos vegetais (CHEYNIER, 2005; NAZCK & SHAHIDI, 2004; SOBRATTEE et al., 2005).

2.1.1. Caracterizao qumica

Os compostos fenlicos so derivados metablicos da fenilalanina e tirosina, produzidos em clulas vegetais. No entanto, no se apresentam uniformemente 4

distribudos no vegetal, ocorrendo variaes das classes e subclasses destes compostos, bem como das suas concentraes, em funo da localizao no vegetal. A fenilalanina amnia-liase (PAL) a enzima chave na regulao da via metablica de fenilpropanides, conforme ilustra a Figura 2.1, convertendo a L-fenilalanina em cido trans-cinmico e iniciando a biossntese de fenlicos. Fatores genticos iro determinar quais classes e subclasses desses compostos sero sintetizadas (NACZK & SHAHIDI, 2004).
C6 C3

Fenilalanina PAL

C6

C3

C6

C3

Lignanas
C6

cido Cinmico

C3

n Ligninas

C6

C3

3-Malonil-CoA Estilbeno sintase

C6

C2

C6

Fenilpropanide
3-Malonil-CoA Chalcona sintase

Estilbenos

C6

C3

n Suberinas, Cutinas

C6

C3

C6

Chalconas

C6

C3

C6

C6

C3

C6

n Proantocianidinas Flavonides -Flavonas -Flavanis -Flavanonas -Flavonis -Flavononas

Figura 2.1 Metabolismo dos compostos fenlicos em plantas

Os teores e o perfil dos compostos fenlicos em plantas podem ainda variar em funo da espcie, variedade, estresse ambiental a que foi submetida a planta, estgios de crescimento e maturao, alm da metodologia analtica empregada na determinao dos mesmos. 5

A classe dos no-flavonides no apresenta uma estrutura bsica em comum e, portanto, uma classe muito heterognea, conforme ilustra a Figura 2.2, sendo composta por cidos fenlicos (cido benzico, cido

hidrxicinmico e seus derivados), ligninas, lignanas, suberinas, estilbenos e taninos hidrolisveis (CHEYNIER, 2005).
R1
R1 OH

OH R2

HOOC

R2

HOOC

OH
RO H

OH OH
OH

OH O CO CO O CO O O CO OH OH OH O O CO OH

HO

OH OH OH OH

Figura 2.2 Principais classes de compostos no-flavonides

Os flavonides caracterizam-se por apresentar uma estrutura comum composta por dois anis aromticos ligados por trs carbonos e um tomo de oxignio formando um heterociclo oxigenado denominado ncleo flavano (Figura 2.3). O grau de oxidao e o padro de substituio do anel C, heterociclo, definem as classes de flavonides e dentro destas o padro de substituio nos anis A e B determinam os compostos especficos (RHODES, 1996).
Bravo, 1998

Figura 2.3 - Ncleo flavano As principais classes de flavonides encontradas em vegetais utilizados como alimentos (Figura 2.4) so as flavonas, flavanis e antocianinas (RHODES, 1996; SHAHIDI & NACZK, 2004). No aa, a classe das antocianinas a de maior interesse devido a sua maior prevalncia (POZOINSFRAN, BRENES & TALCOTT, 2004).
R1 R2 HO O R3 OH OH O OH O HO O R3
R O OH

R1 R2

HO

OH
R1 R2 HO O R3

HO

O OH OH OH HO O OH OH OH HO O OH OH OH OH

OH

R1 OH HO O OH OH
HO O R3 OH OH

OH

R2
R1 R2

Figura 2.4 Principais classes de compostos flavonides

2.1.2. Mtodos de anlise

Apesar do grande interesse por este grupo de compostos, este recente e, portanto, poucos estudos de identificao e quantificao dos polmeros de 7

polifenis tm sido conduzidos (por exemplo, flavanois e proantocianidinas, dentre outros), embora esses compostos sejam majoritrios na maioria das plantas. Isto devido heterogeneidade dos compostos bem como falta de tcnicas de separao eficientes, que foram desenvolvidas apenas

recentemente (NACZK & SHAHIDI, 2004; CHEYNIER, 2005). As metodologias utilizadas na quantificao destes compostos podem ser divididas em anlises espectrofotomtricas e anlises cromatogrficas. As anlises espectrofotomtricas baseiam-se em diversos princpios e podem ser empregadas para quantificao de vrios grupos estruturais. De acordo com Naczk & Shahidi (2004), a anlise que emprega o reagente de Folin-Denis foi uma das primeiras a ser utilizada (SINGLETON & ROSSI, 1965) e foi sofrendo modificaes ao longo do tempo, utilizando-se, atualmente, o reagente de Folin-Ciocalteu. A quantificao dos compostos fenlicos totais pela metodologia que emprega o reagente de Folin-Ciocalteu baseia-se na reduo dos cidos fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolbdico (H3PMo12O40), presentes no reagente de Folin-Ciocalteu, pelos fenlicos presentes na amostra a xido de tungstnio (W 8O23) e xido de molibdnio (Mo8O23) em meio alcalino (Figura 2.5). Estes xidos formados apresentam colorao azulada, sendo possvel a quantificao da absorvncia da soluo na regio do visvel (760nm). Atravs de uma cruva de calibrao de cido glico possvel correlacionar a intensidade da cor concentrao de fenis presentes na amostra, sendo o resultado expresso em equivalente de cido glico (GAE).

H3PW12O40 + H3Mo12O40 + FENOL

Folin-Ciocalteu

W3O23 + Mo3O23

Figura 2.5 - Reao de quantificao de fenlicos totais por reagente de

No entanto, o reagente de Folin-Ciocalteu no especfico para grupos fenlicos sofrendo interferncias de outras substncias redutoras presentes na amostra, tais como cido ascrbico e acares redutores, superestimando os valores. Em funo destes interferentes, Georg et al. (2005) propuseram uma 8

modificao na metodologia de Singleton & Rossi (1965) inserindo uma etapa de extrao em fase slida (SPE) em coluna, capaz de reter os compostos fenlicos. Por esta metodologia possvel quantificar os fenlicos totais assim como o cido ascrbico e eliminar outros interferentes. De acordo com Goldstein (1963, apud NACZK & SHAHIDI, 2004), o mtodo da vanilina especfico para flavan-3-is, dihidrochalconas e proantocianidinas. Este mtodo baseia-se na formao do radical vanilina em meio cido, que se liga aos compostos acima citados pelos carbonos 6 ou 8 do anel A, formando um cromforo vermelho capaz de absorver luz a 500nm. Apesar de no ser especfico, o mtodo da vanilina em metanol mais sensvel s

proantocianidinas do que aos flavan-3-is e, portanto, muito utilizado para deteco e quantificao dos taninos condensados. Segundo Naczk & Shahidi (2004) existem outros mtodos espectrofotomtricos para a quantificao das proantocianidinas, como o mtodo DCMA (4-dimetilamino cinamaldedo) e o da hidrlise cida em butanol, o qual converte os taninos em antocianidinas que absorvem luz no visvel. Existem ainda mtodos especficos para taninos hidrolisveis, antocianinas (FULEKI & FRANCIS 1968a e, 1968b; GIUSTI & WROSLTAD, 2000), de complexao dos fenlicos com Al (III), dentre outros (NACZK & SHAHIDI, 2004). As separaes cromatogrficas em gel, papel e camada delgada, tm sido bastante utilizadas (SHAHIDI & NAZCK, 1995), porm, atualmente, a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) a tcnica mais utilizada para a identificao e quantificao de compostos fenlicos bem como para avaliao das interaes entre os fenlicos com outros componentes da matriz (NAZCK & SHAHIDI, 2004). Estas tcnicas tm sido modificadas quer seja na etapa de preparo da amostra ou extrao dos compostos, quer seja na fase mvel e ou estacionria, para uma melhor separao dos compostos. A identificao propriamente dita dificultada devido grande variabilidade de compostos fenlicos possveis na natureza, sendo realizada com segurana por espectrometria de massas acoplada cromatografia lquida (CLAE-MS) (NACZK & SHAHIDI, 2004).

2.2. Antocianinas
As antocianinas so flavonides, ou seja, possuem o ncleo flavano como estrutura bsica e caracterizam-se por serem compostos hidrossolveis responsveis pela colorao vermelha, azul, violeta e rosa de frutas, hortalias e flores. Sua biossntese e acmulo dependem de alguns fatores como luz, temperatura, condio nutricional, hormnios, danos mecnicos e ataque de patgenos. A luz o fator externo mais importante na biossntese por fotoativar indiretamendete as enzimas envolvidas atravs do sistema fitocromo. Fatores genticos definem as substituies nos carbonos 3 e 5 do anel B as quais definem as agliconas, ou antocianidinas, sendo seis as de principal interesse em alimentos (Figura 2.6). As substituies no anel B contribuem para a variao de cor, porm o pH, concentrao na soluo e a presena de copigmentos so tambm fatores importantes (MAZZA & BROUILLARD, 1990; GRISEBACH, 1995; WROLSTAD et al., 2005)

R1 OH HO A OH B O C OH R2

Antocianidinas Perlagonidina Cianidina Delfinidina Peonidina Petunidina

R1 H OH OH OMe OMe

R2 H H OH H OH

Figura 2.6 - Principais antocianidinas em alimentos

As antocianinas se apresentam no vegetal predominantemente na forma de mono ou di-glicosdeos, e muito pouco na forma de agliconas, com as glicosilaes ocorrendo mais freqentemente nos carbonos 3 e 5, podendo porm tambm ocorrer, ainda que raramente, como triglicosdeos nas posies 7, 3, 4 e/ou 5. Os acares mais encontrados so mono e dissacardeos como glicose, ramnose, galactose, xilose e arabinose. As antocianinas podem ainda sofrer acilaes nas molculas do acar, em muitos casos por cidos tais como p-cumrico, cafeico, ferrlico ou sinpico, e com menor freqncia pelos cidos p-hidroxibenzico, malnico ou actico. Geralmente, os cidos se ligam 10

ao carbono 3 da molcula do acar, sendo que, em alguns pigmentos, essa ligao ocorre no grupamento 6-hidroxil e muito raramente no 4-hidroxil (SHAHIDI & NACZK, 1995, FRANCIS, 1982, FRANCIS, 1993). De acordo com Francis (1989) e Wrolstad et al. (2005), a estabilidade das antocianinas afetada pela sua estrutura qumica e concentrao, luz, enzimas endgenas ou adicionadas, temperatura, pH, co-pigmentos e relao molar destes com as antocianinas, oxignio, cido ascrbico, ons metlicos, acares e seus produtos de degradao, protenas e dixido de enxofre. A ao das enzimas endgenas (polifenoloxidase e peroxidase) um dos principais fatores de degradao dos compostos fenlicos, especialmente as antocianinas. Por serem termorresistentes, a inativao trmica destas enzimas em produtos derivados de vegetais fica dificultada, sendo

alternativamente inibidas por adio de compostos que se ligam parte protica da enzima, que complexam o grupo heme ou que neutralizam o cofator. O dixido de enxofre (SO2) e os sulfitos, assim como o cido ascrbico, so largamente utilizados na indstria com esta finalidade. No entanto, esses compostos favorecem a degradao das antocianinas por mecanismos no enzimticos (RODRIGUEZ-SAONA et al., 1999; ROGEZ, 2000; MALIENAUBERT et al.,2001) Fatores estruturais da molcula so tambm responsveis pela estabilidade das antocianinas, da cor e, por conseqncia, da atividade biolgica, tais como o grau de substituio do anel B, ou seja, R1 e R3, a natureza e nmero de acares ligados molcula e, ainda, a estrutura e nmero de grupamentos acil bem como a posio da ligao destes na molcula de acar. Molculas diaciladas apresentam maior estabilidade, uma vez que os radicais acil podem proteger o ncleo flavano atravs do rearranjo espacial das molculas. A presena de resduo aromtico no grupamento acil promove uma interao hidrofbica com o ncleo flavlio protegendo-o do ataque nucleoflico da gua, diminuindo a hidratao e prevenindo a formao de chalcona (MALIENAUBERT et al.,2001; WROLSTAD et al.,2005) As acilaes favorecem as co-pigmentaes tornando-as mais eficientes j que propiciam a ligao covalente entre pigmento e co-pigmento. As copigmentaes so interaes entre as antocianinas e outros compostos que 11

podem

ser

flavonides,

alcalides,

aminocidos,

cidos

orgnicos,

nucleotdeos, polissacardeos ou metais, sendo nestes casos denominada de co-pigmentao intermolecular. Quando o co-pigmento outra molcula de antocianina, denomina-se de co-pigmentao intramolecular ou auto-

associao. A copigmentao um fenmeno de ocorrncia natural ao qual se atribui o principal mecanismo de estabilidade das antocianinas nos vegetais, ocorrendo preferencialmente sob condies cidas. Essas associaes qumicas fracas podem aumentar a estabilidade das antocianinas e ampliar as suas propriedades antioxidantes (MAZZA & BROUILLARD, 1990;

RODRIGUEZ-SAONA et al., 1999; REYES & CSNEROS-ZEVALOOS, 2007). Os estudos mais recentes apontam para a identificao de possveis interaes que seriam responsveis pela estabilidade das antocianinas (POZOINSFRAN, BRENES & TALCOTT, 2004; PACHECO-PALENCIA, HAWKEN & TALCOTT, 2007) e, por conseqncia, favoreceriam o poder antioxidante responsvel pela grande maioria das atividades biolgicas (antimutagnica, anticarcinognica, efeito protetor gstrico) desta classe de compostos. (GALVANO et al., 2004).
R1 OH HO O OH OH O
OH O HO R1 OH O OH R2

R2

R1 OH HO O O O H O H R2

Figura 2.7 - Grupos estruturais que contribuem para a atividade antioxidante das antocianinas.

12

O poder antioxidante das antocianinas se deve deficincia de eltrons do ncleo flavlio e presena de hidroxilas livres assim como de outras estruturas qumicas na molcula (Figura 2.7), podendo ocorrer variaes quanto intensidade da atividade antioxidante em funo da antocianina, acilaes e copigmentaes. (SOOBRAATTE et al., 2005; WADA et al., 2007) As anlises quantitativas das antocianinas podem ser divididas em anlises espectrofotomtricas e cromatogrficas. As anlises espectrofotomtricas baseiam-se no comportamento espectral desta classe de flavonides em funo do pH, sendo a primeira metodologia proposta por Sondheimer et al. (1948 apud FULEKI & FRANCIS, 1968b), com leituras de absorvncia do extrato em dois valores de pH (2.0 e 3.4) e uso de soluo vermelho de Congo como padro. A metodologia proposta por Fuleki & Francis (1968a) para a quantificao das antocianinas totais emprega uma extrao prvia de 12 horas sob refrigerao em etanol acidificado e filtrao em funil de buchner para obteno de um extrato isento de slidos em suspenso. O extrato obtido tem sua absorvncia lida em espectrofotmetro em comprimento de onda de mxima absorvncia (mx) em pH nico, sendo utilizado o coeficiente de extino molar () da antocianina majoritria para o clculo das antocianinas totais. No entanto, esta metodologia promove uma superestimao dos teores de antocianinas totais, por empregar leitura da absorvncia em um nico comprimento de onda, o de mxima absorvncia para as antocianinas, quantificando desta forma compostos de degradao que tambm absorvem luz nesta regio. Outra metodologia utilizada na quantificao a de pH diferencial, proposta inicialmente por Fuleki & Francis (1968b) e modificada por Giusti & Wrolstad (2001). Esta metodologia permite a quantificao das antocianinas totais e monomricas em funo do comportamento espectral diferenciado das monomricas em relao s polimricas em condies de pH distintas. Em funo dos comprimentos de onda empregados possvel eliminar a interferncia de compostos de degradao. A amostra submetida a dois tampes aquosos distintos, pH 1,0 e 4,5, e as solues obtidas tm a absorvncia medida em dois comprimentos de onda, 700nm e comprimento de 13

mxima absoro (mx), que pode variar de 510 a 550nm em funo das antocianinas presentes na amostra (HARBONE, 1958 apud FULEKI & FRANCIS, 1968a). As antocianinas tm sua cor intensificada em pH 1,0 e no so capazes de absorver a 700nm, onde somente os compostos de degradao, interferentes, absorvem. Portanto, a diferena entre a leitura obtida no mx e a 700nm da soluo de pH 1,0 indicam a concentrao das antocianinas totais. No entanto, em pH 4,5, somente as antocianinas monomricas assumem a forma hemiquetal (Figura 2.8), a qual incolor, e a diferena entre as leituras nos dois comprimentos de onda a pH 1,0 subtrada da diferena entre as leituras nos dois comprimentos de onda a pH 4,5, correspondendo s antocianinas monomricas.

R1 OH HO O O Gl O R
+

R1 OH HO OH O O Gl O R R2

R1 OH HO CH O R2 O Gl O R

R2

R1 OH O O O Gl O R

R1 O HO
R2

R1 OH HO CH O R2 O Gl O R

O O Gl O R

R2

Figura 2.8 Comportamento das antocianinas em funo do pH.

As anlises de identificao de antocianinas especficas foram introduzidas na dcada de 50 e desde ento vm sendo modificadas. As primeiras anlises qualitativas foram realizadas em cromatografia em papel e constavam dos seguintes procedimentos: (vcuo, extrao (metanol (em ou etanol acidificado); n 3);

concentrao

30 C);

purificao

papel

W hatman

determinao da algicona (hidrlise cida e padro); determinao dos acares (cromatografia em papel e padres); determinao da posio do acar (comportamento espectral A440/Amx); determinao de grupamentos acil 14

(comportamento espectral de compostos aromticos, pico extra na regio 310 320nm; e identificao por cromatografia em papel e padres). Vrios estudos foram realizados com diferentes solventes e antocianinas, os quais geraram valores de Rf (coeficiente de reteno), principal dado para identificao das mesmas. Atualmente, a cromatografia lquida de alta eficincia juntamente com a espectrometria de massa tm sido utilizadas para a identificao, quantificao e a avaliao das interaes das antocianinas com outros compostos da matriz (FRANCIS, 1982)

2.3. Atividade antioxidante

Seguindo a tendncia de maior preocupao com a sade e foco na preveno de doenas, tem-se observado um aumento no consumo de frutas em todo o mundo, pois vrias evidncias cientficas apontam efeitos benficos sade de dietas ricas em frutas, hortalias e vegetais, que apresentam em sua composio vrios compostos com capacidade antioxidante, como vitaminas A e C, carotenides e compostos fenlicos. Muitos autores tm demonstrado correlao entre a concentrao destes compostos e a capacidade antioxidante (MANACH et al., 2004; ALVES, et al., 2007; ZULETA et al., 2007). A atividade antioxidante de alguns compostos presentes nos alimentos tem despertado interesse pelo seu potencial efeito na preveno do estresse oxidativo, causa primria de muitas doenas crnicas por provocar danos celulares que, por sua vez, podem promover disfunes fisiolgicas e morte celular. O estresse oxidativo resultado do desequilbrio entre as espcies reativas de oxignio (ROS) e nitrognio (RNS) e o sistema de defesa antioxidante presente no organismo. As espcies reativas de oxignio e nitrognio podem ser geradas durante a irradiao por raios ultravioleta, raios X e raios gama, como produtos de reaes catalisadas por metais que podem estar na atmosfera como poluentes. Podem ser tambm geradas no organismo, por neutrfilos e macrfagos durante processo inflamatrio; por exposio a herbicidas, xenobiticos e toxinas e principalmente durante o metabolismo aerbico, na mitocndria (cadeia transportadora de eltrons). 15

Antioxidantes enzimticos como superoxido desmutase, catalase e glutation peroxidase, juntamente com antioxidantes no enzimticos, como as vitaminas C e E, carotenides, flavonides e antioxidantes tiis, formam o sistema de defesa antioxidante (VALKO et al., 2006; SCANDALIOS, 2005). As definies de antioxidantes diferem em funo da natureza dos compostos a serem protegidos. Para Chipault (1962 apud BECKER, NISSEN & SHIBSTED, 2004), antioxidantes em alimentos so substncias que em pequenas quantidades so capazes de prevenir ou retardar a oxidao de materiais facilmente oxidveis como as gorduras. Porm no mbito bioqumico-mdico citado por Huang, Ou & Prior (2005), antioxidantes so enzimas ou compostos orgnicos, como a vitamina E ou -caroteno, que so capazes de contrariar os efeitos danosos da oxidao em tecidos animais. Os compostos fenlicos tm despertado grande interesse devido ao seu alto teor nos vegetais e elevado poder antioxidante, capaz de remover radicais livres, quelar ons metlicos com atividade redox, modular a expresso gnica e interagir com mecanismos de sinalizao celular; sendo atribuda grande parte de sua bioatividade a estas caractersticas. Porm os mecanismos de absoro e metabolismo e teores presentes na dieta podem afetar a eficincia da ao antioxidante e estes aspectos no esto totalmente esclarecidos (RHODES, 1996; SOOBRATTEE et al, 2005). Devido ao grande interesse na quantificao da capacidade antioxidante de diversos compostos, vrias metodologias in vitro foram propostas, com diferenas no grau de complexidade, sensibilidade, mecanismos e espcies reativas envolvidas. Alm disso, ainda no h consenso quanto validade e relevncia destes mtodos em sistemas biolgicos (ARNAO, 2000;

LICHTENTHLER, MARX & KIND, 2003; HUANG, OU & PRIOR, 2005). Os mtodos qumicos para determinao da atividade antioxidante esto divididos quanto natureza da reao envolvida em dois grupos principais, os que envolvem transferncia de eltrons e os que envolvem transferncia de tomos de hidrognio. Dentre os mtodos baseados na transferncia de tomos de hidrognio, tem-se o ORAC (oxygen radical absorbance capacity), o TRAP (total radical trapping antioxidant parameter); o IOU (inibited oxygen uptake); e a inibio da 16

oxidao do cido linolico e da lipoprotena de baixa densidade, LDL. A maioria destas metodologias baseia-se na reao competitiva entre o antioxidante e o substrato para formao do radical por decomposio de compostos azo, permitindo o acompanhamento da reao por ultravioleta ou por fluorescncia (ORAC) (ARNAO, 2000; BECKER, NISSEN & SHIBSTED, 2004; HUANG, OU & PRIOR, 2005). A metodologia de quantificao de fenlicos totais pelo reagente de FolinCiocalteu, descrita no item 2.1.2, tambm utilizada para quantificar a atividade antioxidante e seu mecanismo de ao envolve a transferncia de eltrons, assim como no caso do ABTS expresso em TEAC (Trolox equivalence antioxidant capacity), FRAP (ferric ion reducing antioxidant parameter); DPPH (diphenil-1-picryhydrazyl) e capacidade de reduo do cobre II. As metodologias que envolvem a transferncia de eltrons baseiam-se na reduo do substrato por ao dos componentes antioxidantes presentes na amostra, que apresentam comportamento espectral distinto no estado oxidado e reduzido (ARNAO, 2000; BECKER, NISSEN & SHIBSTED, 2004; HUANG, OU & PRIOR, 2005). A metodologia de ABTS, cujo resultado expresso em TEAC, proposta por RE et al. (1999), utiliza o ABTS [cido 2,2 azinobis-3-(etilbenzotiazolina6sulfnico)] como substrato e emprega o persulfato de potssio para formar quimicamente o radical ABTS+. Em funo do material a ser analisado, este radical pode ter como meio de extino uma soluo tampo fosfato pH 7,4 ou lcool etlico 95%. Esta metodologia baseia-se no comportamento espectral do ABTS, que absorve luz na regio do visvel (734nm) somente na forma radicalar (ABTS+). Portanto, a presena de substncias com atividade antioxidante na amostra ir regenerar o ABTS+ (Figura 2.8), promovendo uma descolorao da soluo cuja intensidade ser correlacionada mesma intensidade ocasionada pelo padro analtico Trolox (cido 6-hidrxi-2-5-7-8tetrametilcromo2-carboxlico), um anlogo hidrossolvel da vitamina E

(BECKER, NISSEN & SKIBETED, 2004). A atividade antioxidante da amostra dada em M equivalente de Trolox em 1g ou 100g de amostra, originando o nome TEAC, capacidade antioxidante equivalente ao Trolox.

17

O3S

S S N N C2H5 C2H5 N N

SO3

x tio an e nt ida
K
2S

O3S

S S N N C2H5 C2H5 N N

SO3

Figura 2.9 Comportamento espectral do ABTS

A avaliao de atividade antioxidante baseada em metodologias in vitro deve ser feita com cautela uma vez que as mesmas no consideram fatores como biodisponibilidade, estabilidade do composto in vivo, reteno dos

antioxidantes pelos tecidos e reatividade in situ (HUNAG, OU & PRIOR, 2005). A atividade antioxidante medida in vitro sugere bioatividade, porm no a determina. No entanto, a identificao de fatores que influenciam a atividade antioxidante de grande interesse e vem recebendo muita ateno. Para os compostos fenlicos, alguns estudos apontam para uma relao entre a atividade antioxidante, e sua intensidade, com a estrutura qumica desses compostos. O nmero e a configurao de grupamentos hidroxil doadores de hidrognio, assim como as duplas conjugadas, parecem ser os principais fatores estruturais a influenciar a atividade antioxidante (WADA et al., 2007; SOOBRATTEE et al, 2005; TYRAKOWSKA, et al. 1999).

2.4. Processos de separao por membranas

Os processos de separao por membranas aplicados industrialmente so recentes, apesar de o primeiro estudo relatando fenmenos envolvendo membranas ser de 1748 com NOELLET, que emergiu em gua pura um copo contendo destilado de vinho e vedado com uma bexiga de origem animal, que 18

aps certo tempo estufou e, em alguns casos, rompeu-se, evidenciando, com esta experincia, a permeabilidade e a seletividade da membrana. Porm os fundamentos tericos destes processos s foram elucidados recentemente (CHERYAN, 1998; HABERT, BORGES & NBREGA, 2006). Os processos de separao por membrana baseiam-se na permeabilidade seletiva de alguns compostos do material atravs do meio filtrante, por meio de uma fora motriz. A composio da membrana e o tipo de fora motriz utilizado definem os diferentes processos: microfiltrao, ultrafiltrao, nanofiltrao, dilise, osmose inversa, evaporao osmtica, pervaporao, permeao de gases (PORTER, 1990). Os processos de micro, ultra e nanofiltrao utilizam membranas porosas cuja seletividade caracterizada pela diferena de tamanho entre as molculas da soluo e os poros da membrana; promovendo, ento, um fluxo convectivo com escoamento do permeado por entre os poros. A osmose inversa utiliza membrana densa, porm assim como nos processos citados acima utiliza a diferena de presso como fora motriz. Estes processos diferem entre si pelo tamanho dos poros, que diminuem da microfiltrao para a nanofiltrao (0,6 m a 100 Da) e quase inexistem nas membranas densas, aumentando a resistncia permeao e, conseqentemente, a diferena de presso aplicada (Figura 2.10).

Figura 2.10 Processos de separao por membranas em funo do tamanho dos poros Na dilise, as membranas podem ser porosas ou densas, porm a fora motriz aplicada a diferena de concentrao, resultando em um fluxo difusivo. Tanto a osmose inversa quanto a pervaporao utilizam membranas densas, 19

Cabral, L. M. C

diferindo entre si pela fora motriz, que so, respectivamente, a diferena de presso e a diferena de concentrao (CHERYAN, 1998; HABERT, BORGES & NBREGA; 2006). Os processos de separao por membranas geralmente ocorrem temperatura ambiente, trazendo como vantagens o baixo custo energtico, a preservao de compostos termo sensveis, a seletividade do meio filtrante e o fcil escalonamento, por se tratar de sistemas modulares. Contudo, o custo de reposio da membrana, a diminuio do fluxo ao longo do processo e a limpeza dos sistemas so algumas das desvantagens. Mesmo utilizando o fluxo tangencial (Figura 2.11), verifica-se a diminuio do fluxo de permeado ao longo do processo, conseqncia do fenmeno conhecido como fouling, que se caracteriza pelo aumento da resistncia passagem do solvente pela membrana, que pode ser resultante tanto da diminuio da porosidade (entupimento, adsoro) quanto da polarizao de concentrao e formao de camada gel na superfcie da membrana. A
Menezes, L. F. S.

Figura 2.11 - Esquemas de filtrao em profundidade (a) e filtrao tangencial (b) A principal desvantagem da aplicao dos processos de separao por membranas em polpas de frutas a diminuio do fluxo de permeado em funo da polarizao de concentrao e formao da camada gel, que ocorrem, principalmente, em processos com membranas porosas

(microfiltrao, ultrafiltrao e nanofiltrao). No entanto, estes fatores podem ser minimizados atravs de pr-tratamentos que promovam uma diminuio 20

dos slidos em suspenso presentes na polpa como a centrifugao, tratamento enzimtico ou refino, ou ainda atravs de alteraes das condies de processamento (MATTA, CABRAL & MORETTI, 2000; VAILLANT et al., 2001). Ushikubo, Watanabe & Viotto (2006) microfiltraram a polpa de umbu diluda (1:2 em gua) a 35C, em sistema polimrico (tamanho de poro de 0,2 m) e avaliaram a influncia da presso transmembrana, do pr-tratamento com enzima e da velocidade tangencial sobre o fluxo de permeado. A velocidade tangencial foi a principal varivel responsvel pelo aumento do fluxo de permeado, no entanto o tratamento enzimtico tambm indicou um efeito positivo, sendo tambm observado o sinergismo entre as variveis. Matta, Moretti & Cabral (2004), atravs da combinao dos processos de microfiltrao e osmose inversa, obtiveram um suco de acerola clarificado e concentrado com 29,2Brix, obtendo o mesmo fator de concentrao de4.2, em slidos solveis e em vitamina C. O suco clarificado obtido foi preparado para consumo por diluio e adio de acar e avaliado sensorialmente atravs do teste de aceitabilidade, sendo aceito por 84% dos consumidores. A obteno de suco de abacaxi clarificado e esterilizado a frio foi estudada por Carneiro et al. (2002), utilizando sistema de microfiltrao com membrana polimrica de polietersulfona com poros de 0,3 m, e tratamento enzimtico. As condies avaliadas permitiram atingir a esterilizao comercial aliada a um elevado fluxo de permeado, estabilizado na faixa de 100 L/hm. A frao retida nos processos de microfiltrao e ultrafiltrao to rica em macro e microelementos quanto os sucos originais, fazendo com que muitos trabalhos sugiram a reintroduo da frao retida na linha de produo ou o seu uso para a obteno de novos produtos, que poderiam contribuir para a viabilidade econmica da microfiltrao na produo de sucos clarificados, por maximizar o aproveitamento do fruto (SILVA, JARDINE & MATTA, 1998; VAILLANT et al., 2001; CASSANO et al., 2003). Seguindo esta tendncia, Penha et al. (2001) utilizaram o retido da ultrafiltrao de suco de acerola para obteno de licor. Fontes & Caminoto (2007) realizaram a microfiltrao de aa em dois sistemas de membrana cermica de -alumina, com poros de 0,6 e 0,2 m e 21

utilizaram a diluio da polpa e o refino como pr-tratamentos, obtendo fluxos de permeado de aproximadamente 9 L/hm. Palacio et al. (2007), por sua vez, utilizando a centrifugao como pr-tratamento, atingiu fluxos mdios de permeado de 100 L/hm com fator de concentrao volumtrico igual a 2, na microfiltrao de aa em membrana cermica com 0,1 m de tamanho de poros. O crescente interesse por compostos bioativos e produtos funcionais tambm tem sido observado nas pesquisas com membranas. Patil et al. (2007) avaliaram os processos de ultrafiltrao, osmose inversa e destilao osmtica e suas combinaes, para a obteno de um concentrado de antocianinas da casca de rabanete, sendo a combinao dos trs processos o mais atrativo quando comparado com os processos isolados. O extrato inicial foi concentrado 25 vezes (1 a 26Brix) sendo o mesmo fator de concentrao atingido com as antocianinas cuja concentrao passou de 40 mg/100 mL para 980 mg/100 mL. A concentrao de sucos por membranas ocorre, geralmente, temperatura ambiente, mantendo as caractersticas sensoriais do suco fresco, sem o sabor de produto cozido. Koroknai et al. (2008) empregaram a ultrafiltrao e a osmose inversa para obter sucos de frutas vermelhas clarificados e concentrados. Os sucos ultrafiltrados mantiveram 97% da atividade

antioxidante dos sucos frescos, no entanto a concentrao em slidos solveis no foi mantida na mesma razo para a atividade antioxidante. O uso de tecnologias de processamento mais amenas, como os processos de separao por membranas, pode ser uma alternativa com grande potencial para se atingir uma maior estabilidade dos compostos fenlicos que so facilmente degradados, por oxignio, pH, temperatura, cido ascrbico e principalmente por enzimas endgenas, polifenoloxidase e peroxidase (PACHECO-PALENCIA, HAWKEN & TALCOTT, 2007; NAZCK & SHAHIDI, 2004, SKREEDE, WROSLTAD & DURST, 2000). As enzimas polifenoloxidase e peroxidase so termorresistentes o que dificulta a inativao trmica das mesmas sem perdas sensoriais significativas para o produto processado, no entanto, Magalhes et al. (2004), verificaram a eficcia da microfiltrao e da ultrafiltrao para estabilizao da gua de coco. As tcnicas de separao por 22

membranas empregadas pelos referidos autores reduziram de 61 a 77% a atividade da polifenoloxidase e em 100% a atividade de peroxidase na frao permeada da gua de coco.

2.5. Aa
Aa o nome dado tanto ao fruto do aaizeiro (Euterpe oleracea Mart) como bebida oriunda da extrao deste fruto. O aaizeiro (Figura 2.12) uma palmeira nativa da regio Amaznica, sendo o estado do Par seu principal centro de disperso natural. As maiores e mais densas populaes espontneas ocorrem no esturio do rio Amazonas, devido s condies elevadas de temperatura, chuva e umidade relativa do ar. Os frutos so globulosos e apresentam-se em cachos (ROGEZ, 2000), porm seu consumo no ocorre na forma in natura, necessitando ser processado. A partir da dcada de 1990 o aumento da mdia internacional para a necessidade de preservao da Floresta Amaznica fez despertar o interesse pelos produtos regionais no-madeireiros. Como conseqncia, observou-se, talvez, a maior transformao da fruticultura da Amaznia que, impulsionada pela criao da fbrica de beneficiamento de polpa de fruta em Tom-Au, em 1991, teve frutas como cupuau, bacuri, pupunha e aa, conhecidas at ento apenas pela populao local, conquistando novos mercados, nacionais e internacionais (ROGEZ, 2000; HOMMA & FRAZO, 2002; NOGUEIRA et al., 2005).

23

Figura 2.12 - Aaizeiro (a) e fruto do aa (b)

O aa parece ter sido bem aceito pelos novos mercados, e apesar da escassez e divergncias de dados, algumas publicaes apontam um aumento de 130% na coleta dos frutos entre 1994 a 2001. Nogueira et al. (2005) apontam a preservao dos aaizais como um ganho ambiental importante como conseqncia destes novos mercados, pois 20% da produo, em 2004, foi proveniente de reas cultivadas e de aaizais nativos manejados, o que, em anos anteriores, era quase que exclusivamente extrativista. A diminuio do extrativismo e o aumento de reas cultivadas uma tendncia a ser mantida e ampliada em funo da necessidade de regularidade da produo para atender demanda. O incio da exportao se deu em 2000, para os Estados Unidos, ampliando depois para Frana, Japo, Itlia e Alemanha, na forma de polpa congelada, p, creme, sorvete e aa pronto para consumo com granola e guaran. No mercado externo, o aa apreciado como uma bebida extica, enquanto que no Brasil, em geral, como bebida energtica, e no Par, como parte da refeio, sendo a base da alimentao, principalmente da populao mais pobre e rural (MONTEIRO, 2006). Visando manuteno e ampliao do mercado de aa, algumas indstrias esto investindo no s no cultivo, mas tambm na qualificao da mo-deobra o que pode significar mais emprego e maior renda para a populao local. 24

Fotos : Matta, V. M.

Porm, a baixa vida de prateleira associada ao elevado custo de transporte so fatores a serem superados (MONTEIRO, 2006). Ainda h muito a se conhecer e desenvolver visando inovao e promoo do desenvolvimento sustentvel da cadeia do aa, devido importncia econmica deste agronegcio para os estados da regio Norte, especialmente Par e Amap, por responder pela sustentao das populaes ribeirinhas. Estima-se o envolvimento direto de quase 25 mil pessoas e de R$40 milhes no agronegcio da polpa e suco de aa (NOGUEIRA, et al., 2005;). O aa tem importncia socioeconmica devido no s sua relevncia na alimentao da populao ribeirinha e de mais baixa renda, mas tambm por seu potencial de aproveitamento (ROGEZ, 2000). Dos frutos se extrai a polpa e subprodutos, o caroo pode ser aproveitado no artesanato, como adubo orgnico e fonte de antioxidantes, o caule para obteno do palmito, as folhas para cobrir as casas dos habitantes do interior da regio e ainda os estipes adultos podem ser aproveitados para pasta e polpa de celulose pela indstria de papel (HOMMA & FRAZO, 2002; NOGUEIRA, et al., 2005).

2.5.1. Caracterizao qumica e atividade antioxidante

O aa tido como uma das frutas mais nutritivas da Bacia Amaznica e sua bebida um alimento altamente energtico e de elevado valor nutricional apesar de existirem divergncias com relao sua composio centesimal em macro e micro elementos. Alguns fatores como a sazonalidade, estgios de maturao e procedncia dos frutos, fatores ambientais, cultivares, alm das metodologias analticas empregadas na determinao dos parmetros (SANABRIA & SANGRONIS, 2007), ou, ainda, devido a divergncias na nomenclatura dos produtos obtidos de aa, polpa e bebida, influenciam os dados disponveis de composio qumica (ROGEZ, 2000) O perfil em cidos graxos da polpa de aa muito prximo ao perfil ideal de um leo vegetal (CNNB, 1996). A frao lipdica da polpa composta por aproximadamente 24% de saturados, 59% de monoinsaturados e 17% de poliinsaturados (ROGEZ, 2000; SANABRIA & SANGRONIS, 2007). Seu leo pode tambm ser utilizado como ingrediente para a indstria alimentcia, 25

cosmtica, dentre outras, agregando valor (PACHECO-PALENCIA, MERTENSTALCOTT & TALCOTT, 2008). Palacio (2008) utilizou a torta obtida com a centrifugao da polpa de aa para a extrao de leo por prensagem, obtendo um rendimento elevado de 78-80% e um leo de boa qualidade (ndice de perxido baixo), com os ndices de iodo e de saponificao tpicos de leos vegetais ricos em cidos graxos insaturados e de cadeia longa. A polpa de aa foi utilizada como matria-prima para a extrao de leo por solvente e por via enzimtica, no tendo sido verificadas diferenas significativas na composio em cidos graxos, apresentando predominncia de monoinsaturados (at 61%), porm com teor aprecivel em poliinstaurados de at 10,6% (NASCIMENTO et al., 2008) Os valores observados para micronutrientes em aa divergem bastante de acordo com a fonte bibliogrfica, em mais de dez vezes para o ferro, por exemplo, podendo ser atribudo s metodologias empregadas ou at mesmo em decorrncia da divergncia quanto nomenclatura dos produtos (ROGEZ, 2000). As variaes quanto aos macro e micronutrientes tambm ocorrem em funo do local de obteno e da safra, apesar de serem de menor magnitude (SANABRIA & SANGRONIS, 2007). O nico autor a quantificar a vitamina E no aa foi Rogez et al (1996), tendo encontrado um teor aprecivel (45 mg/100g), que poderia justificar a contribuio de 8% da frao lipoflica do aa para a atividade antioxidante global, determinada por Pozo-Insfran, Brenes & Talcott (2004). Os estudos sobre identificao e quantificao das antocianinas em aa so poucos e apresentam divergncias quanto s antocianinas identificadas. Em amostras distintas de polpa de aa foram identificadas em diferentes trabalhos as antocianinas cianidina-3 (glucosdeo, rutinosdeo e sambiosdeo),

perlagonidina-3-glucosdeo e peonidina-3 (glucosdeo e rutinosdeo) na polpa de aa. Apesar de no ter sido observado um perfil padro de composio de antocianinas no aa, somente a cianidina-3-glucosdeo foi identificada por todos. Pozo-Insfran, Brenes & Talcott (2004) foram os nicos a identificar a perlagonidina-3-glucosdeo, enquanto a cianidina-3-rutinosdeo foi identificada por Lichtenhler et al. (2004); De Rosso et al. (2005), Galori et al. (2005), Brito 26

et al. (2007) e Pacheco-palencia, Hawken & Talcott (2007). Outros compostos fenlicos como cidos fenlicos, flavanis e flavonis foram identificados e quantificados na polpa de aa por Pozo-Insfran, Brenes & Talcott (2004), Galori et al. (2005), Brito et al.(2007) e Pacheco-palencia, Hawken & Talcott (2007). A grande variabilidade de compostos fenlicos apontada como um possvel fator positivo para a estabilizao do pigmento, uma vez que a classe do copigmento e a razo molar copigmento/pigmento influenciam fortemente na estabilidade da cor. O uso do aa como corante tem sido avaliado no s para aplicao em alimentos, mas tambm para outros usos relacionados sade. Pesquisadores da Embrapa Amaznia Oriental em parceria com a Universidade Federal do Par desenvolveram um identificador de placa bacteriana com corante de aa, sendo depositada a patente nos Estados Unidos em 2007 (NAZAR et al., 2007), e Crdova-Fraga et al. (2004) o testaram como fluido para contraste intestinal. Na rea alimentcia, Constant (2003) extraiu as antocianinas do aa e aplicou o corante em p obtido por spray drying em iogurte, queijo tipo petit suisse, e isotnico em p e lquido, avaliando a estabilidade do corante nesses produtos, sendo o isotnico lquido o nico que no apresentou boa estabilidade, devido sua atividade de gua e pH relativamente altos. Wada et al. (2007) apontam um interesse crescente no uso de corantes naturais alimentcios como aditivos alimentcios multifuncionais, por seus efeitos teraputicos alm dos nutricionais. Bobbio et al. (2000) sugerem o uso do aa como fonte para extrao de antocianinas, devido ao elevado teor deste pigmento e ausncia de toxicidade da matria-prima. Seguindo esta linha, Cosson et al. (2007) avaliaram o uso de suco de aa como corante funcional em iogurte, comparando a atividade antioxidante do mesmo em relao ao produto comercial adicionado de suco de arando (bilberry), usado como padro. Apesar de o produto enriquecido com aa apresentar uma menor atividade antioxidante, o valor ainda foi relevante, sugerindo o uso de suco de aa, rico em antocianinas, como corante e flavorizante para obteno de um alimento lcteo que aumentaria a ingesto de cianidina -3-glicosdeo. Poucos estudos disponveis na literatura avaliaram a atividade antioxidante 27

da polpa de aa. Pozo-Insfran, Brenes & Talcott (2004) utilizaram polpa de aa da Colmbia e encontraram uma atividade antioxidante de 48,6 mol Trolox equivalente/mL, que foi atribuda, principalmente, s antocianinas. Pachecopalencia, Hawken & Talcott (2007), utilizando outra metodologia (ORAC), porm expressando tambm em Trolox, encontraram valores similares para a polpa integral, da ordem de 54,4 mol Trolox equivalente/mL e uma perda de quase 20% promovida pela clarificao clssica com terra diatomcea, como conseqncia da perda de compostos fenlicos antocinicos e noantocinicos.

2.5.2. Processamento do aa
O principal produto obtido do fruto do aa a polpa, tambm chamado simplesmente de aa, que pode ser utilizada como matria-prima para diversos produtos como gelia, sorvete, cremes, recheios de bombom, dentre outros. Com um mercado local muito forte, estima-se um consumo de aa de 120 mil litros/dia na cidade de Belm. Com o aumento do consumo em outras localidades, boa parte da produo deixou de ser artesanal, apesar de ainda ser realizada de forma bem emprica (NOGUEIRA et al., 2005; ROGEZ, 2000). A produo industrial da polpa consiste nas seguintes etapas: recebimento dos frutos; seleo manual; pr-lavagem; lavagem (com cloro); remoo do cloro (asperso com gua potvel); amolecimento ou macerao;

despolpamento e refino. A etapa de amolecimento ou macerao consiste em imergir os frutos em gua, por um perodo de tempo determinado. Tanto a temperatura quanto o tempo de macerao variam de um produtor para outro, pois ainda no existe um processo otimizado que facilite o aumento do rendimento na obteno da polpa sem prejudicar a sua qualidade (NOGUEIRA et al., 2005; ROGEZ, 2000). Os parmetros tempo de batida e quantidade de gua adicionada na etapa de despolpamento tambm so estipulados empiricamente, pela experincia prtica do manipulador, variando de acordo com o tipo de aa que se deseja obter, com a provenincia dos frutos, dentre outros (NOGUEIRA et al., 2005; ROGEZ, 2000). O Ministrio da Agricultura, Abastecimento e Agropecuria 28

(MAPA), atravs de Instruo Normativa, estabelece padres de identidade e qualidade para o aa e polpa de aa, classificando como polpa de aa o produto obtido atravs da extrao da polpa do fruto por meios mecnicos, sem adio de gua e sem filtrao, o que na prtica no possvel. Portanto, aa ou bebida de aa o produto obtido pela extrao do fruto com adio de gua e filtrado, sendo classificado em trs diferentes tipos como aa fino, mdio ou grosso, de acordo com o teor de slidos totais. O aa fino apresenta de 8 a 11%, o mdio, de 11 a 14% e o grosso, acima de 14% de slidos totais (BRASIL, 2000). Em funo dos novos mercados e da necessidade de transporte, grande parte da polpa de aa obtida atualmente sofre algum processo de conservao mantendo a oferta do produto o ano todo, apesar de ter uma produo de frutos ocorrendo em duas safras, a de vero, no perodo de agosto a dezembro, e a de inverno, entre maro e junho. Como observado por Cohen et al. (2007), a poca da colheita influencia na composio do aa, assim como a procedncia e as boas prticas de produo. Deste modo, de extrema importncia para o agronegcio do aa, o conhecimento sobre produo, colheita, ps-colheita e processamento, para que se mantenha a qualidade do produto ofertado durante todo o ano. Processos de conservao como branqueamento, pasteurizao,

congelamento e desidratao esto sendo utilizados, uma vez que a polpa de aa muito perecvel, apenas 12 horas sob refrigerao. A baixa estabilidade do produto pode ser decorrncia da elevada carga microbiana presente no fruto, que poderia ser minimizada por adoo de boas prticas agrcolas e de fabricao. As enzimas endgenas, peroxidase e polifenoloxidase, so responsveis por alteraes sensoriais importantes por induzirem indiretamente a oxidao lipdica e promoverem o escurecimento do produto, modificando a cor de roxo para marrom (ROGEZ, 2000; NOGUEIRA et al., 2005). Em funo da vida de prateleira muito curta, a tecnologia de obstculos foi avaliada para a conservao da polpa de aa por Alexandre, Cunha & Hubinger (2004), que empregaram a diminuio do pH, tratamento trmico, reduo da atividade de gua por adio de sacarose e adio de conservador sorbato de potssio. Todas as formulaes testadas permaneceram estveis 29

microbiologicamente ao longo dos cinco meses de armazenamento, entretanto nem todas foram aceitas sensorialmente. A tecnologia de alta presso foi testada por Menezes (2005) para a conservao da polpa de aa, mostrando-se uma alternativa eficiente pasteurizao. No entanto, os tratamentos a 500 Mpa e a 25C, por estimularem as enzimas polifenoloxidase e peroxidase, promoveram perda de colorao da polpa. Os dados escassos da literatura evidenciam a necessidade de

conhecimentos mais especficos e aplicados a fim de aliar segurana alimentar a qualidade sensorial, nutricional e funcional do aa e, assim, contribuir para promover a sustentabilidade econmica da cadeia.

30

3.

MATERIAL E MTODOS

3.1. Matria-prima
Na legislao brasileira (Brasil, 2000) polpa de aa o produto obtido sem adio de gua. Na prtica, entretanto, a extrao no possvel sem adio de gua, motivo pelo qual, neste trabalho, polpa de aa refere-se ao produto obtido com adio de gua. Para a avaliao dos estgios de maturao foi obtido um lote de polpa para cada estgio de maturao, utilizando para tanto os frutos verde, parol (de vez) e maduro, colhidos na Estao Experimental da Universidade Federal Rural da Amaznia (UFRA), localizada em Castanhal/PA, no ms de fevereiro. O estudo da influncia de diferentes condies para a obteno da polpa foi conduzido com frutos adquiridos comercialmente no mercado Ver-o-peso, em Belm-PA. Os experimentos de pr-tratamento e microfiltrao foram conduzidos com aa tipo grosso congelado, adquirido de uma indstria processadora de aa localizada em Belm/PA. As diferentes matrias-primas utilizadas esto resumidas na Tabela 3.1.

Tabela 3.1 Matrias primas utilizadas e os diferentes experimentos Matria prima Frutos verdes, de vez e maduros Frutos maduros Polpa de aa, tipo grosso Origem e obteno da polpa Colhidos na estao experimental de Castanhal e processados na UFRA para obteno das polpas. Adquiridos no mercado Ver-o-peso e processados na UFRA. Experimentos em que foram utilizadas Avaliao dos estgios de maturao Avaliao das condies da extrao Pr-tratamentos e microfiltrao 31

Adquiridos diretamente de uma agroindstria localizada em Belm.

Todas as polpas foram congeladas e transportadas via area para o Rio de Janeiro, onde foram processadas e ou analisadas em triplicata.

3.2. Procedimento experimental

Os testes para caracterizao do fruto e obteno da polpa de aa foram realizados na Planta Piloto do Centro de Tecnologia Agropecuria (CTA) da Universidade Federal Rural da Amaznia, em Belm/PA. Os experimentos de pr-tratamento e de microfiltrao assim como as determinaes analticas foram realizados nas Plantas Piloto II e IV e nos laboratrios da Embrapa Agroindstria de Alimentos, no Rio de Janeiro/RJ (Figura 3.1).

Figura 3.1 Diagrama dos procedimentos experimentais realizados.

32

3.2.1. Caracterizao da polpa de aa em trs estgios de maturao

Os frutos, em trs diferentes estgios de maturao, foram processados para a obteno da polpa de acordo com o fluxograma abaixo. As polpas obtidas foram caracterizadas fsico-quimicamente, a fim de se determinar o efeito do grau de maturao sobre os compostos fenlicos totais, antocianinas totais e monomricas bem como sobre a atividade antioxidante em cada estgio de maturao do fruto.

Figura 3.2 Fluxograma de obteno das polpas dos frutos em trs estgios de maturao

Para cada experimento, foram utilizados 9 kg de frutos. A macerao dos frutos foi realizada a 50C por 30 minutos. Para a obteno das polpas, foi adicionada gua na proporo de 0,61:1 (gua: fruto) e a extrao foi realizada em uma batedeira de aa (Figura 3.3).

Figura 3.3 Batedeira ou despolpadeira de aa

Foto : Matta, V. M.

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As polpas de aa obtidas foram devidamente identificadas, armazenadas em bolsa plsticas e congeladas, sendo parte armazenada na unidade de processamento e parte transportada por via area at o Rio de Janeiro, para as anlises laboratoriais descritas no item 3.3, sendo mantidas congeladas at o momento de realizao das anlises. O rendimento em polpa, para cada estdio de maturao foi calculado de acordo com a Equao 3.1.

3.2.2. Extrao da polpa de aa em diferentes condies de macerao

Para avaliao do efeito da temperatura e do uso de enzimas durante a macerao dos frutos sobre a extrao da polpa e sobre as caractersticas da mesma, foram realizados seis experimentos de obteno da polpa com 2kg de frutos maduros cada, seguindo o fluxograma (Figura 3.1) descrito no item anterior, variando-se as condies da etapa de macerao. A macerao foi realizada em trs temperaturas (30oC, 35oC e 40oC), com e sem a adio de enzima Rapidase TF da DSM Food Specialties, na concentrao de 0,1g/kg de fruto. A Rapidase TF, uma preparao enzimtica lquida oriunda de Aspergillus niger e Trichoderma reseei, apresentando atividade de pectinase e hemicelulase, com temperatura tima na faixa de 10 a 50C e pH entre 3,0 e 5,5. A enzima foi diluda na gua de macerao antes da adio dos frutos, que permaneceram sob estas condies por 15 minutos. Aps esta etapa os frutos foram pesados e seguiram para a batedeira sendo adicionada gua, para a obteno da polpa, na proporo de 0,5:1 (gua:fruto) durante o

processamento. As polpas obtidas foram pesadas e congeladas, para posterior realizao das anlises laboratoriais e avaliao do efeito das condies de macerao sobre os compostos bioativos e a atividade antioxidante do aa. O clculo do rendimento de cada processo foi calculado utilizando-se a Equao 3.1. 34

3.2.3. Pr-tratamentos para a microfiltrao

A polpa de aa tipo grosso, obtida comercialmente, foi a matria-prima utilizada para os testes de pr-tratamento, refino e centrifugao, assim como para os experimentos de microfiltrao. A polpa foi uniformizada, acondicionada em bombonas plsticas, congelada e mantida sob congelamento at o momento dos testes. Esta polpa foi denominada polpa integral, para fins analticos. O pr-tratamento teve por objetivo reduzir os teores de polpa e de slidos totais, e com isso, facilitar a microfiltrao do aa. Em cada teste foram utilizados 19 kg de aa grosso, efetuando-se a pesagem dos produtos obtidos, para a determinao do rendimento dos mesmos (Equao 3.2).

Os produtos obtidos atravs dos pr-tratamentos de refino e centrifugao, para efeito do presente trabalho, foram denominados de polpa refinada e polpa centrifugada de aa, respectivamente. Foram coletadas amostras das polpas integral, refinada e centrifugada, para realizao das anlises de

caracterizao e para avaliao do efeito dos pr-tratamentos sobre os compostos fenlicos totais e antocianinas totais, bem como sobre a atividade antioxidante das mesmas. Para o refino, foi utilizada uma despolpadeira de escovas (Figura 3.3) com peneira de ao inox com poros de 0,6mm de dimetro, marca Itametal, modelo Bonina 0,25df.

35

Figura 3.4 - Despolpadeira de escovas

Para a centrifugao, foi utilizada uma centrfuga de cestos (Figura 3.4) marca Internacional Equipment Company, modelo SIZE 2, a 406g, tendo como meio filtrante uma tela de nylon de 150 m.

Figura 3.5 Centrfuga de cestos

3.2.4. Microfiltrao
Testes preliminares de microflitrao foram conduzidos utilizando-se as polpas refinada e centrifugada, os quais resultaram na definio da centrifugao como a melhor condio de pr-tratamento para a microfiltrao. 36

Foto : Matta, V. M.

Foto: Matta, V. M.

Para os experimentos de microfiltrao, foram centrifugados 68 kg de polpa integral, nas mesmas condies descritas no item 3.2.3, sendo a polpa centrifugada uniformizada e fracionada em bombonas plsticas, previamente sanitizadas, em volumes de dois e quatro litros, para facilitar o

descongelamento antes dos experimentos. Foi realizado um planejamento experimental com dois fatores, temperatura e tipo de membrana, em dois nveis cada, para avaliar a influncia dos mesmos sobre os compostos bioativos presentes na polpa de aa durante a microfiltrao. Os processos foram realizados em duplicata, sendo testados dois tipos de membrana em sistemas pilotos, um composto por membranas cermicas e outro por membranas polimricas, e duas temperaturas de processamento, 25 e 35C.

Figura 3.6 - Sistema de microfiltrao com membranas cermicas

O sistema cermico (Figura 3.6) utilizado composto por quatro membranas tubulares de -alumina com poros de 0,1m e rea filtrante total de 0,022m. As membranas esto dispostas em srie, sendo o permeado coletado de cada membrana por tubos flexveis independentes. O tanque de alimentao, em ao inox, tem capacidade nominal de 4 litros, fechado e encamisado, permitindo o controle da temperatura de processo atravs do acoplamento do 37

Foto : Matta, V. M.

sistema de refrigerao. O sistema permite, tambm, acoplar uma entrada de nitrognio gasoso, a fim de diminuir o contato do produto com o oxignio e reduzir as reaes oxidativas.

Figura 3.7 - Sistema de microfiltrao com membrana polimrica

O sistema polimrico (Figura 3.7) utilizado composto por uma membrana tubular de polietersulfona com poros de 0,3 m de dimetro e rea filtrante total de 0,05 m. A polpa centrifugada, utilizada nos testes de microfiltrao, era

descongelada, em processo lento, no dia anterior ao processamento. Os processos foram realizados em batelada simples, com recirculao do retido, a uma vazo de recirculao de 900 L/h e diferena de presso aplicada membrana de 3,0 bar. O tempo de processo variou, uma vez que o parmetro utilizado para finalizao do processamento foi o fator de concentrao volumtrica, fixado em 2,0. O fator de concentrao volumtrica (Fc) dado pela equao 3.3.

Onde; Fc o fator de concentrao volumtrico, Va volume alimentado membrana, em litros e, 38

Foto : Silva, L. F. M.

Vp o volume de permeado, em litros. O acompanhamento dos processos foi realizado pela determinao do fluxo de permeado a cada cinco minutos. Nestes mesmos tempos, os valores de volume de permeado acumulado, as presses de entrada e sada e a temperatura eram anotados. O fluxo de permeado foi determinado pela medida do tempo necessrio para recolher um determinado volume de permeado e calculado utilizando-se a Equao 3.4.

Onde; J - fluxo de permeado, expresso em L/hm, V -volume de permeado recolhido, em litros, t - tempo medido no cronmetro, em segundos, a - rea filtrante da membrana, em m.

Em todos os processos foram retiradas amostras das fraes alimentao, permeado e retido, para serem analisadas posteriormente, a fim de avaliar o efeito dos processos sobre os compostos de interesse.

3.2.5. Limpeza dos sistemas de microfiltrao

Os sistemas de microfiltrao eram lavados e sanitizados de acordo com o procedimento descrito no fluxograma abaixo, sempre aps o uso e repetido, quando necessrio.

39

gua filtrada em sistema aberto.

Recirculao da soluo alcalina (NaOH 1%) a 50C e P=0 bar por 20 minutos.

Recircular por mais 10 minutos com P=2 bar.

gua filtrada em sistema aberto, at o pH do permeado atingir a neutralidade.

Recirculao de soluo cloroalacalina (NaOH 1% e 200ppm de hipoclorito de sdio), a 50c e P=0 bar, por 20 minutos.
NO

Adicionar 2 gotas de detergente para membranas na soluo cloroalcalina e recircular por 20 minutos.

gua filtrada em sistema aberto, at o pH do permeado atingir a neutralidade.

Permeabilidade restaurada em 90%?

Determinar a permabilidade hidrulica para verificao da limpeza.

SIM

Sistema limpo.

Figura 3.8 - Fluxograma de processo de limpeza dos sistemas de microfiltrao.

Aps a limpeza era realizada a determinao da permeabilidade hidrulica, a fim de verificar a eficcia do procedimento. O sistema era considerado limpo quando se restaurava, no mnimo, 90% da permeabilidade hidrulica inicial das membranas. Caso este valor no fosse atingido, todo o procedimento era repetido. A permeabilidade hidrulica um fator caracterstico de cada membrana e pode ser definido como o inverso da resistncia intrnseca da mesma. Ela pode 40

ser determinada pela medida da quantidade de gua que permeia a membrana em um determinado tempo, por unidade de rea e por unidade de presso. Para a determinao da permeabilidade hidrulica, o sistema era alimentado com gua, e o fluxo de permeado era medido temperatura e presso determinadas, sendo calculado, pela Equao 3.5.

Onde; J - fluxo de permeado, expresso em L/hm, V - volume de permeado recolhido, em litros, t - tempo medido no cronmetro, em segundos, a - rea filtrante da membrana, em m e, P a presso transmembrana aplicada ao sistema, em bar.

3.3. Mtodos analticos

3.3.1. Atividade antioxidante

Para a determinao da atividade antioxidante das diferentes amostras foram obtidos extratos de acordo com a metodologia descrita por Rufino et al.(2007) e a quantificao de acordo com Re et al (1999). Os extratos foram obtidos de acordo com o procedimento descrito abaixo (Figura 3.8) e congelados por no mximo 15 dias antes da anlise.

41

Pesar amostra em bquer (0,5 a 2g)

Adicionar 10mL de metanol50% e agitar manualmente. Repouso por 60 minutos/escuro.

Centrifugar por 20 minutos para separao das fases.

Recolher sobrenadante em balo volumtrico mbar de 25mL.

Adicionar 10mL de acetona 70% ao precipitado e agitar em vrtex.

Transferir soluo para o bquer e deixar em repouso no escuro por 60 minutos.

Centrifugar por 20 minutos para separao das fases.

Transferir o sobrenadante para o mesmo balo vollumtrico e completar com gua destilada

Figura 3.9 Procedimento de obteno do extrato para a quantificao da atividade antioxidante. O radical ABTS+ foi formado quimicamente com K2SO5, persulfato de potssio, adicionando em um frasco mbar5 mL da soluo 7mM de ABTS em gua destilada e 88 Ldasoluo deK2SO5 140mM, que permaneceu fechado temperatura por no mnimo 14 horas, para formao e estabilizao da soluo de ABTS+. Esta soluo concentrada de ABTS+ foi diluda, aproximadamente de 70 a 80 vezes, em etanol 95% at atingir uma absorvncia de 0,700 + 0,020 734nm. Para a construo da curva de calibrao de Trolox, eram elaboradas solues com concentraes de 100; 500; 1000; 1500 e 2000 M em etanol 95%, as quais ao reagirem com a soluo de ABTS+ (na proporo de 1:10) durante 6 minutos, ao abrigo da luz e temperatura ambiente, promoviam um decrscimo na absorvncia da soluo, lida 734nm, por restaurar parte do 42

ABTS+ em ABTS no radicalar. O branco era lido com etanol 95% na mesma proporo. A quantificao da atividade antioxidante dos extratos era realizada da mesma forma: alquotas do extrato e da soluo etanlica de ABTS+, na proporo 1:10, eram homogeneizadas, mantidas ao abrigo da luz temperatura ambiente e as absorvncias lidas aps 6 minutos da adio da ltima soluo. Deste modo, a diferena entre a absorvncia do branco e da amostra, pde ser expressa como equivalente de Trolox necessrio para uma mesma resposta, utilizando a equao da reta da curva de calibrao deste padro.

3.3.2. Antocianinas totais e monomricas

Para a avaliao da influncia dos pr-tratamentos sobre as antocianinas totais, estas foram quantificadas pelo mtodo descrito por Fuleki & Francis (1968a), de acordo com o procedimento descrito abaixo.

Figura 3.10 Procedimento de quantificao das antocianinas totais por Fuleki & Francis, 1968(a). 43

Para a filtrao do extrato em funil de buchner, foi utilizado papel de filtro faixa preta (rpida filtrao). A quantificao foi feita pela leitura da absorvncia a 528 nm, do extrato filtrado, e o clculo realizado atravs da equao 3.6, sendo o teor de antocianinas totais expresso em equivalente da antocianina principal, cianidina3-glucosdeo.

onde; AT so as antocianinas totais expressas em mg da antocianina predominante em 100g de amostra; Abs528 a absorvncia do extrato filtrado lida 528nm; PM o peso molecular da cianidina-3-glucosdeo (445,2); fd o fator de diluio dado pela razo volume:massa, sendo utilizados os valores em litros e gramas; o coeficiente de extino molar da cianidina 3-glucosdeo em soluo etanlica acidificada 528nm, cujo valor de 29.600 M-1cm-1; 100 utilizado para expressar o valor por 100 gramas de amostra. A determinao dos teores de antocianinas totais e monomricas dos demais experimentos foi realizada atravs da metodologia de pH diferencial descrita por Giusti & Wrolstad (2001) adaptada (Figura 3.11). Foi introduzida uma etapa de filtrao da amostra em papel de filtro de rpida filtrao, para eliminar os slidos em suspenso e deste modo, ser possvel a determinao da absortividade da soluo.

44

Figura 3.11 Procedimento de quantificao das antocianinas totais e monomricas por pH diferencial.

O comprimento de onda de 510nm foi escolhido devido ao valor do cianidina-3glucosdeo

em tampo pH 1.0 existente na literatura e por ser esta a nica

antocianina identificada em polpa de aa nos trabalhos consultados. Para a quantificao das antocianinas totais foram consideradas as absorvncias a 510 e 700nm apenas da soluo de pH 1 e os clculos realizados de acordo com a equao 3.7.

Onde; AT so as antocianinas totais expressas em mg de cianidina-3-glucosdeo, antocianina majoritria, em 100g de amostra; (Abs510 e Abs700)pH1,0 so os valores de absorvncia da amostra diluda na soluo tampo pH 1,0 lidos a 510 e 700nm, respectivamente; PM o peso molecular da cianidina-3-glucosdeo; fd o fator de diluio dado pela razo volume da diluio, em litros, por massa de amostra, em gramas; o coeficiente de extino molar da cianidina 3-glucosdeo em soluo 45

tampo pH 1,0 510nm, cujo valor de 26.900 Lcm -1mol -1; 100 utilizado para expressar o valor por 100 gramas de amostra. Para a quantificao das antocianinas monomricas foram consideradas as absorbncias a 510 e 700nm das amostras diludos nas solues tampo pH 1.0 e 4.5 e os clculos de acordo com a equao 3.8.

Onde, AM so as antocianinas monomricas expressas em mg de cianidina-3glucosdeo, antocianina majoritria, presentes em 100g de amostra. AT so as antocianinas totais expressas em mg da antocianina predominante em 100g de amostra (Abs510 e Abs700)pH 4.5 so as absorvncias lidas da soluo em pH 4.5 nos comprimentos de onda 510 e 700 nm, respectivamente.

3.3.3. Identificao das antocianinas monomricas por CLAE

As antocianinas monomricas foram identificadas por cromatografia lquida de alta eficincia atravs da metodologia proposta por Brito et al. (2007), a qual emprega uma extrao prvia das antocianinas com soluo de cido frmico a 10% em metanol e centrifugao a 25000 g a 20C. O extrato obtido foi seco com nitrognio gasoso e ento ressuspenso em metanol em cido frmico aquoso (1:9) antes de ser injetado no cromotgrafo. A anlise foi realizada em CLAEEM modelo HP series 1100 MSD com detector de arranjo de diodos (DAD) GB15A, utilizando uma coluna SB-C18 (3.5 m, 4.6 150 mm). A fase mvel foi constituda de solvente A (soluo aquosa de cido frmico 10%) e solvente B (soluo de cido frmico 10% em metanol) nas condies descritas na Tabela 3.2 com um fluxo mdio de 1mL/min e deteco do sinal a 530nm. 46

Tabela 3.2 Gradiente de concentrao da fase mvel Solvente B 12 25 % 25 60% 60 100% 100 12% Tempo da corrida (minutos) 32 48 50 55

A identificao das antocianinas majoritrias foi realizada atravs de um cromotograma padro de polpa de aa obtido atravs das mesmas condies cormatogrficas descritas acima, com o cromatgrafo acolpado a um espectrmetro de massa. Para a espectrometria de massa (Brito et al., 2007).

3.3.4. Fenlicos totais

A determinao dos teoes de fenlicos totais foi conduzida seguindo o fluxograma abaixo, de acordo com o mtodo espectrofotomtrico proposto por Singleton & Rossi (1965) modificado por Georg et al. (2005). A quantificao dos compostos fenlicos totais foi realizada atravs de uma curva de calibrao de cido glico, sendo os valores expressos em mg equivalentes de cido glico/100g de amostra.

47

Figura 3.12 Procedimentos de obteno dos extratos e quantificao do teor de fenlicos totais por Folin-Ciocalteu.

3.3.5. pH
As medidas de pH foram realizadas atravs de leitura direta em potencimetro Metronal E-120 de acordo com a metodologia descrita pela A.O.A.C. (1984 13.010), utilizando as solues tampo pH 4,0 e pH 7,0, para calibrao do equipamento.

3.3.6. Slidos solveis (Brix)

O teor de slidos solveis foi determinado pela leitura direta em refratmetro de acordo com a metodologia descrita pelo A.O.A.C., 1997 932,12, utilizando um refratmetro digital de bancada, marca Atago modelo PR 1001 com escala de 0 a 45 Brix .

48

3.3.7. Acidez titulvel total

A acidez titulvel total foi realizada atravs do mtodo titulomtrico proposto pela A.O.A.C. (1997), em titulador automtico, marca Metrohm, modelo 785 DMP Titrino, utilizando como titulante uma soluo de hidrxido de sdio fatorada com biftalato de sdio. Os valores obtidos foram expressos em mg de cido mlico por 100 g de amostra.

3.3.8. Teor de polpa

O teor de polpa das amostras foi medido atravs da metodologia proposta por Reed et al. (1968), que se baseia na determinao da polpa por centrifugao. Os valores foram expressos em porcentagem mssica.

3.3.9. Slidos totais

O teor de slidos totais foi realizado atravs da metodologia descrita no livro de normas analticas Instituto Adolfo Lutz (1985), a qual se baseia na determinao do peso seco obtido pela secagem em estufa a vcuo a 60 C do material de interesse at obteno de peso constante. Os valores foram expressos em porcentagem mssica.

3.3.10.

Composio centesimal

A composio centesimal das amostras foi realizada atravs das metodologias oficiais descritas abaixo: Teor de cinzas pelo mtodo 923.03, AOAC 2000; Umidade pelo mtodo 925.45D, AOAC 2005; Extrato etreo pelo mtodo 922.06, AOAC 2005; Nitrognio total pelo mtodo de Kjedahl tradicional - AACC 1995 mtodo 46-13 modificado e fator 6.25 para converso do nitrognio em protenas totais. Carboidrato total calculado pela diferena

49

3.3.11.

Anlise estatstica dos dados

A anlise estatstica dos resultados foi realizada com o programa XLSTAT 7.5, verso 7.5 para anlise de varincia (ANOVA) de um fator e teste de Tukey com intervalo de confiana de 95%. A anlise de varincia de dois fatores foi feita utilizando o programa GRAPHPAD PRISM 4 verso 4.0 e o teste de Bonferroni. A anlise de correlao de Pearson foi realizada no Excel.

50

4.

RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. Caracterizao da polpa de aa em trs estgios de maturao

As polpas obtidas dos frutos do aa em trs diferentes estgios de maturao foram avaliadas quanto composio centesimal e parmetros fsico-qumicos, e os resultados obtidos so apresentados na Tabela 4.1.

Tabela 4.1 - Composio centesimal e parmetros fsico-qumicos da polpa do aa em trs estgios de maturao. Amostras Parmetros Verde Cinzas (g/100g) Lipdeos (g/100g) Protena total (g/100) Carboidratos (g/100g) Slidos totais (g/100g) Teor de polpa (g/100g) pH Slidos solveis (oBrix) Acidez total titulvel 2 0,2 + 0,0c 0,1 + 0,0c 0,3 + 0,0c 0,8 + 0,2c 1,8 + 0,1c 6,4 + 0,1c 5,2 + 0,0a 1,0 + 0,0c 0,04 + 0,0c Parol (De vez) 0,3 + 0,0b 1,2 + 0,0b 0,5 + 0,0b 1,9 + 0,1b 5,3 + 0,0b 20,9 + 0,8b 5,1 + 0,0ab 1,4 + 0,2b 0,06 + 0,0b Maduro 0,4 + 0,0a 4,8 + 0,4a 1,2 + 0,0a 3,5 + 0,4a 10,7 + 0,4a 38,8 + 1,1a 5,1 + 0,0b 3,0 + 0,0a 0,12 + 0,0a

Valores calculados pela diferena, de acordo com a norma AOAC, expresso em g de cido mlico/100g. Letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa com 95% de significncia.

As variaes nos resultados dos estgios de maturao eram esperadas, uma vez que a maturao pode ser definida como uma seqncia de mudanas na cor, sabor e textura dos frutos, que os tornam aptos ao consumo 51

ou industrializao. As principais mudanas ocorridas durante a maturao incluem o desenvolvimento das sementes, mudana da cor, variaes na taxa respiratria e na produo de etileno, mudana na permeabilidade dos tecidos e na textura, alteraes qumicas nos carboidratos, cidos orgnicos, pectinas, pigmentos, compostos fenlicos, etc., alm da produo de substncias volteis e formao de ceras nas cascas (CHITARRA & CHITARRA, 2005). Os teores de slidos solveis, acidez, carboidratos, protenas e lipdeos totais aumentaram com a maturao, gerando as alteraes no sabor e na textura. Os slidos totais tambm apresentaram um aumento com a maturao, o que pode ser atribudo, em parte, dificuldade de extrao da polpa, pois apesar de ter sido adicionada a mesma proporo de gua para a extrao, os frutos parol e verde apresentavam a poro comestvel do aa (cerca de 15% do peso do fruto) muito aderida semente, dificultando sua extrao mecnica, mesmo aps a etapa de macerao. A polpa de aa obtida com o fruto maduro apresentou um teor mdio de lipdeos totais de 4,8g/100g de polpa, o que equivale a 45,2g/100g em base seca, valor muito prximo aqueles encontrados por Sanabria & Sangronis (2007) e por Menezes (2005), entre 42,0 e 49,4g/100g (base seca). Estes valores atendem legislao vigente (BRASIL, 2000), que estabelece uma faixa de 20 a 60g/100g de lipdeos totais dependendo do tipo de aa (fino, mdio ou grosso). Em termos de carboidratos totais, a polpa do aa maduro apresentou uma mdia de 3,5 g/100g equivalendo a 33,0 g/100g em base seca, na mesma faixa (31,6 g/100g) que o determinado por Sanabria & Sangronis (2007) na polpa com frutos colhidos tambm no ms de fevereiro, sendo ambos os valores inferiores aos da polpa obtida com os frutos colhidos pelos referidos autores no ms de julho (48g/100g) e ao determinado por Menezes (2005) em polpa congelada comercial (41,2g/100g). A sazonalidade uma grande fonte de variao na composio centesimal do aa, comprovada por Sanabria & Sangronis (2007), que encontraram variaes significativas em lipdeos, carboidratos, fibras totais e cinzas nas amostras obtidas com frutos colhidos nos meses de fevereiro e de julho. Os teores de fenlicos totais, antocianinas e a atividade antioxidante das 52

polpas de aa nos trs estgios de maturao, verde, de vez e maduro so apresentados na Tabela 4.2.

Tabela 4.2 - Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro da polpa do aa em trs estgios de maturao. Amostras Parmetros Verde Fenlicos totais Antocianinas totais Antocianinas monomricas Atividade antioxidante3(ABTS) 172,5 + 3,7b 2,5 + 0,2c 0,0c 23,8 + 1,0b De vez Maduro

118,7 + 5,8c 343,7 + 15,4a 9,5 + 0,4b 3,1 + 0,4b 15,8 + 0,2c 80,4 + 1,6a 52,7 + 1,2a 27,8+ 1,0a

expresso em mg equivalente de cido glico/100g; expresso em mg equivalente de cianidina-3-glucosdeo/100g; expresso em mol Trolox equivalente/g; letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa com 95% de significncia.

As antocianinas no aa apresentaram um perfil de aumento da concentrao com a maturao, em concordncia com os estudos realizados por Castrejn et al. (2008) com quatro cultivares de mirtilo e por Cheng & Breen (1991) em morangos durante o perodo aps a anttese e amadurecimento. Os autores verificaram que apesar de os flavonides terem sido sintetizados ao longo do desenvolvimento do fruto, o acmulo do teor de antocianinas somente ocorreu durante a maturao e segundo Cheng & Breen (1991), em morangos, este fenmeno acontece concomitantemente ao declnio do teor de taninos e ao segundo pico de atividade da enzima fenilalanina amnia liase (PAL), a enzima chave envolvida na biossntese de fenilpropanides. O teor de antocianinas totais da polpa de aa maduro, ainda que do tipo fino, foi de 80,4 mg cianidina 3-glucosdeo/100g, sendo este teor prximo ao obtido por Menezes (2005) de 78,8 mg/100g em aa grosso, e ainda mais que o dobro do teor encontrado por Kuskosky et al. (2007) para a polpa de uva (30,9 mg/100g) e quase o dobro para polpa de amora (41,8 mg/100g), indicando o aa como uma boa fonte destes pigmentos. Por outro lado, 53

Kuskosky et al. (2007), ao avaliarem uma polpa comercial congelada de aa, encontraram 22,8 mg de cianidina-3-glucosdeo/100g, um valor bem abaixo do encontrado na polpa obtida com frutos maduros. O baixo teor de antocianinas pode ser atribudo aos processos industriais utilizados na conservao da polpa, uma vez que Klopotek, Otto & Bhm (2005) encontraram uma perda de 27% nas antocianinas de suco de morango como conseqncia da pasteurizao. As antocianinas cianidina-3-rutinosdeo e cianidina-3-glucosdeo foram identificadas na polpa obtida com frutos maduros de aa (Figura 4.1), resultado semelhante ao encontrado por Galori et al. (2004), Brito et al. (2007) e Pacheco-palencia, Hawken & Talcott (2007). No entanto, Pozo-Insfran, Brenes & Talcott (2004) identificaram a perlagonidina-3-glucosdeo em polpa de aa e no identificaram a cianidina-3-rutinosdica. Existem divergncias com relao s antocianinas especficas presentes no aa, uma vez que tambm j foram identificadas cianidina-3-sambiosdeo, peonidina-3-glucosdeo e

peonidina-3-rutinosdeo (LICHTENHLER et al., 2004; SCHAUSS et al., 2006; DE ROSSO et al., 2005). Apenas a cianidina-3-glucosdeo foi identificada em todas as polpas oriundas de distintas regies, confirmando a prevalncia das cianidinas entre as antocianinas, tal como observado por GALVANO et al (2004).

Minutes

Figura 4.1 Exemplo de um cromatograma obtido com a polpa de aa (1: cianidina-3-glucosdeo; 2: cianidina-3-rutinosdeo).

54

Das antocianinas identificadas na polpa obtida com frutos maduros cultivados em Castanhal, PA, Brasil, a cianidina-3-rutinosdeo foi predominante, com 67% do total seguida da cianidina-3-glucosdeo com 26%, sendo este perfil similar ao encontrado por Schauss et al. (2006), com aproximadamente 60% de cianidina-3-rutinosdeo e 30% de cianidina-3-glucosdeo, e por Pacheco-palencia, Hawken & Talcott (2007), que encontraram 202,3 mg/L de cianidina-3-rutinosdeo e 75,1 mg/L de cianidina-3-glucosdeo em polpa comercial pasteurizada e congelada obtida no mercado de Los Angeles, Califrnia. Entretanto, este perfil bastante diferente do encontrado por PozoInsfran, Brenes & Talcott. (2004) em polpa de aa pasteurizada e congelada originria da Colmbia, com predominncia da cianidina-3-glucosdeo (1040 mg/L) seguida da perlagonidina-3-glucosdeo (74,4 mg/L) e no identificando a cianidina-3-rutinosdeo. Os fenlicos totais no aa em diversos estgios de maturao (Tabela 4.2) apresentaram um perfil diferente do esperado, com menor concentrao na polpa dos frutos de vez (parol) quando comparado com a polpa dos frutos verdes. Tal fato pode ser decorrente da existncia de diversas classes de feonlicos com biossntese diferenciada quanto ao estgio de desenvolvimento e maturao dos frutos. Estas classes de compostos fenlicos por sua vez apresentam poder redutor tambm diferenciado, o que poderia influenciar na anlise. Outro fato que deve ser considerado o fato de se ter obtido apenas um lote de polpa a partir de 9kg de frutos em cada estgio de maturao e estes provenientes de um nico local de coleta. Entretanto,comportamento semelhante foi observado em quatro cultivares de mirtilo por Castrejn et al. (2008). O aumento nos compostos fenlicos quando os frutos apresentaram-se maduros foi observado em trs dos quatro cultivares avaliados e este aumento no foi suficiente para atingir o valor inicial, sendo deste modo inferior ao do fruto verde. O comportamento da atividade antioxidante com a maturao (Figura 4.2) foi similar ao perfil verificado para os compostos fenlicos totais (Tabela 4.2).

55

Figura 4.2 - Relao entre a atividade antioxidante e o teor de compostos fenlicos totais do aa em trs estgios de maturao.

Apesar de a polpa verde apresentar cerca de 50% do total de fenlicos presentes na polpa madura, sua atividade antioxidante representou 85% da atividade antioxidante da polpa madura. A polpa de vez apresentou 34,5% do teor de fenlicos totais e uma atividade antioxidante de 56% da polpa madura. A razo atividade antioxidante:fenlicos totais foi similar nas polpas verde e de vez, com uma contribuio de aproximadamente 13 mol de Trolox equivalente por mg de fenlico, enquanto que houve uma contribuio de 8 mol de Trolox equivalente por mg de fenlico na polpa madura, sugerindo uma composio de fenlicos distinta e com maior poder redutor nas polpas verde e de vez. A atividade antioxidante da polpa verde , possivelmente, oriunda apenas de compostos fenlicos no antocinicos. Kuskosky et al. (2005) avaliaram onze polpas comerciais congeladas de frutas quanto aos teores de fenlicos totais, antocianinas totais e atividade antioxidante pelos mtodos ABTS, DPPH e DMPD, obtendo resultados similares entre as polpas de uva e aa quanto a estes compostos bioativos e atividade antioxidante. Entretanto, os valores encontrados destes compostos bioativos e atividade antioxidante na polpa obtida com frutos maduros do presente trabalho foram quase o triplo do obtido por Kuskosky et al. (2005) para a polpa comercial de aa. 56

4.2. Extrao da polpa de aa em diferentes condies de macerao

O rendimento em polpa resultante das diferentes condies de macerao do aa est apresentado na Tabela 4.3. Em funo de ter sido conduzido apenas um experimento em cada condio, no foi possvel avaliar estatisticamente a variao de rendimento. Houve pouca variao e os maiores rendimentos foram obtidos com a adio da preparao enzimtica.

Tabela 4.3 - Rendimento em polpa de aa em diferentes condies de macerao do fruto Condies da Macerao Com Enzima 30 C 35 C 40 C 30 C 35 C 40 C Rendimento em polpa (%) 30,8 35,4 31,5 28,8 29,8 30,8

Apesar da pequena variao no rendimento em polpa, foram obtidos dois tipos de produtos de acordo com a classificao do MAPA (Brasil, 2000), o aa mdio e o fino, em funo do teor de slidos totais. O aa mdio (teor de slidos totais superior a 11%) foi obtido somente nos processos onde a macerao foi realizada com enzima a 40C, e sem enzima a 30C (Tabela 4.4). As polpas obtidas foram avaliadas quanto composio centesimal e os resultados em polpa fresca esto apresentados na Tabela 4.4. As polpas obtidas sem adio de enzima no variaram quanto ao teor de slidos solveis, porm o valor encontrado (cerca de 2,0 Brix) foi 50% mais baixo que o da polpa madura obtida para a avaliao dos estgios de maturao, que foi de 3,0 Brix, evidenciando a variabilidade em funo da procedncia, condies 57

Sem Enzima

de obteno e armazenamento dos frutos, bem como o tempo decorrido da colheita at o processamento.

Tabela 4.4 - Parmetros fsico-qumicos das polpas de aa obtidas em diferentes condies de macerao do fruto.
Parmetros Condies Teor de polpa Com Enzima Slidos totais Slidos solveis pH Acidez total Lipdeos totais 3,8 + 0,4bc 3,3 + 0,5c 5,2 + 0,6a 4,6 + 0,1ab 4,6 + 0,0ab 5,2 + 0,3a

30 C 32,3 + 1,6 c 9,9 + 0,2 c

1,9 + 0,0b 4,9 + 0,0b 0,1 + 0,0c

35 C 37,5 + 1,6 b 10,2 + 0,3 bc 2,0 + 0,0b 4,8 + 0,1b 0,1 + 0,0b 40 C 41,1 + 1,0 a 12,00 + 0,3 a 2,9 + 0,0a 4,9 + 0,0b 0,2 + 0,0a 30 C 39,5 + 1,2 a 11,7 + 0,1a 2,0 + 0,0b 5,1 + 0,0a 0,1 + 0,0b 35 C 37,9 + 0,6 b 10,8 + 0,2 b 2,0 + 0,0b 5,1 + 0,0a 0,1 + 0,0b 40 C 37,7 + 0,7 b 10,4 + 0,2 bc 2,0 + 0,0b 5,2 + 0,1a 0,1 + 0,0bc

expresso em g/100g; expresso em Brix; expres so em g de cido mlico/100g; letras diferentes na mesma coluna indicam diferena significativa entre as amostras com 95% de significncia.

45% nos slidos solveis, que pode ser decorrncia no s da atividade de hemicelulase sobre polissacardeos, mas tambm de atividades residuais de amilase e -glucosidase, comumente presentes nas preparaes enzimticas, que poderiam hidrolisar ligaes 1-4 presentes em diversos compostos como as prprias antocianinas, liberando estes sacardeos. Todas as polpas obtidas apresentaram pH e acidez titulvel total dentro dos limites estabelecidos na legislao brasileira. As polpas sem adio de enzima apresentaram-se muito similares polpa obtida com frutos maduros para a avaliao dos estgios de maturao. Todas as polpas apresentaram um teor de lipdeos totais, em base seca, de acordo com a legislao, com valores variando de 32,7 a 50,4 g/100g. As polpas obtidas a 40C no apresentaram diferena significativa quanto ao teor de lipdeos, porm foram diferentes quanto acidez, o que pode ser decorrente 58

Sem Enzima

A polpa obtida com a adio de enzima a 40C apresentou um aumento de

de atividade residual de esterase presente em pectinase industrial de Aspergillus niger (BARBE & DUBORDIEU, 1998). Os compostos fenlicos bem como a atividade antioxidante das polpas de aa obtidas nas diferentes condies de macerao do fruto esto apresentados na Tabela 4.5.

Tabela 4.5 - Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro das polpas de aa obtidas em diferentes condies de macerao do fruto. Parmetros Condies Fenlicos totais Com Enzima 30 C 35 C 40 C 30 C 35 C 40 C 229,1 + 7,8 b 238,6 + 17,2 b 346,2 + 8,4 a 240,0 + 17,0 b 213,4 + 9,4 b 228,6 + 1,7 b Antocianinas totais 29,6 + 3,0 b 35,0 + 0,9 b 58,3 + 4,6 a 32,8 + 0,4 b 30,9 + 2,3 b 36,0 + 0,2 b Antocianinas monomricas 13,6 + 2,1 b 17,8 + 1,0 b 34,3 + 6,3 a 14,5 + 0,5 b 13,1 + 2,0 b 18,3 + 0,5 b Atividade antioxidante (ABTS) 18,2 + 0,6 b 19,5 + 0,5 b 25,5 + 1,0 a 19,9 + 1,4 b 18,4 + 0,5 b 19,9 + 1,1 b

expresso em mg equivalente de cido glico/100g; expresso em mg equivalente de cianidina-3-glucosdeo/100g; expresso em mol Trolox equivalente/g.; letras diferentes na mesma coluna indicam diferena significativa entre as amostras com 95% de significncia.

compostos fenlicos nos experimentos sem adio de enzima, como pode ser observado na Figura 4.3. Porm, a adio da preparao enzimtica apresentou sinergismo com a temperatura, promovendo um aumento de 50% na extrao dos fenlicos.

Sem Enzima

A temperatura de macerao no teve efeito sobre a extrao dos

59

Figura 4.3 - Influncia da temperatura e do tratamento enzimtico durante a macerao do fruto sobre os compostos fenlicos da polpa de aa.

Alguns compostos fenlicos como cidos ferlico e p-cumrico podem esterificar pectinas e arabinoxilanas ou ainda se ligar a polissacardeos da parede celular. As ligninas e cidos hidrxicinmicos podem tambm se ligar a componentes da parede celular (NAZCK & SHAHIDI, 2004). A maior extrao de compostos fenlicos na condio com enzima a 40C pode ser decorrente tanto da hidrlise de compostos da parede celular com liberao de fenlicos, quanto tambm em funo do extravasamento para o meio extracelular de outros compostos fenlicos como as antocianinas. Os frutos globulosos do aa possuem polpa clara recoberta por uma fina casca escura, o que explica a presena de pigmentos antocinicos (entre 30 e 60 mg/100g) em teores menores que o encontrado por Bobbio et al. (2000) na casca de aa, de 263mg/100g. Como pode ser verificado na Tabela 4.5, o aumento da temperatura no foi suficiente para aumentar a extrao das antocianinas. Somente a ao conjunta da preparao enzimtica com a temperatura ,ais elevada (40C) foi capaz de incrementar em mais de 60% a extrao deste flavonide, apresentando o mesmo comportamento que os fenlicos totais (Figura 4.4).

60

Figura 4.4 Influncia da temperatura e do tratamento enzimtico durante a macerao do fruto sobre as antocianinas da polpa de aa.

A adio da preparao enzimtica influenciou na qualidade das antocianinas das polpas, aumentando a proporo de antocianinas

monomricas (Tabela 4.6). A 35C, sem adio de enzima, esta proporo foi de 42% enquanto que com o uso da enzima foi de 51%. A 40C, sem enzima, foi de 51% aumentando para 59% com o tratamento enzimtico. Os pigmentos oligomricos e polimricos formados a partir das antocianinas monomricas so mais estveis, contudo, alteram a colorao do sistema ou produto para marrom avermelhado, diretamente atravs dos compostos formados, e indiretamente por contriburem para as reaes de escurecimento (PACHECOPALENCIA, HAWKEN & TALCOTT, 2007). No presente trabalho, foram identificadas apenas duas antocianinas nas polpas de aa em todos os tratamentos, a cianidina-3-glicosdeo e a cianidina3-rutinosdeo, esta com maior rea cromatogrfica. O perfil foi semelhante ao observado para a polpa de frutos maduros. O tratamento enzimtico aumentou a extrao de ambas as antocianinas, sem promover alterao no perfil, ou seja, a enzima utilizada no indicou ter afinidade distinta entre as antocianinas. As polpas obtidas nos experimentos de extrao apresentaram-se muito mais baixas em atividade antioxidante (Tabela 4.5) do que a polpa obtida com frutos maduros no experimento anterior (27,8 + 1,0 M Trolox equivalente/g), com exceo da condio de tratamento com enzima a 40C, confirmando a influncia dos cuidados durante o cultivo, colheita e ps-colheita sobre os 61

compostos fenlicos do aa. Os frutos utilizados nos experimentos de extrao foram adquiridos no comrcio local, sendo colhidos no dia anterior e transportados em canoas durante a noite, impactando na qualidade dos mesmos, pois estes compostos bioativos se perdem facilmente no transporte e processamento, se no forem tomadas as medidas adequadas de Boas Prticas em todas as etapas. A preparao enzimtica utilizada agiu conjuntamente com a temperatura aumentando a extrao das antocianinas quando foi utilizada a temperatura de 40C, como pode ser verificado na Tabela 4.5. Dados obtidos por Versari et al. (1997) apontam a manuteno do pigmento por algumas preparaes enzimticas, no incio do processo (duas horas). No entanto, a tendncia de degradao destes compostos foi observada em todas as condies aps 6 horas de processo, variando a intensidade em funo da preparao enzimtica utilizada. Sugerindo, deste modo, um efeito protetor ou incremento na extrao destes compostos por algumas preparaes que durante pouco tempo so capazes de neutralizar o efeito destrutivo da atividade residual de glicosidase destas preparaes sobre as antocianinas, formando as agliconas que so mais instveis. Porm, neste mesmo trabalho, os autores observaram perdas significativas maiores para o suco de framboesa (19 a 21%) do que para o suco de morango (10%). Outro fato elucidado foi o carter hidroflico da aglicona aumentando a afinidade substrato-enzima que explicaria a menor afinidade pelas antocianinas do morango, perlagonidinas e cianidina. A influncia da temperatura e tratamento enzimtico sobre os compostos bioativos assim como sobre o teor de polpa e de slidos totais foi avaliada estatisticamente por anlise de varincia de dois fatores seguido do teste de Bonferroni, com um intervalo de confiana de 95% (Tabela 4.6). Os resultados obtidos com o teste estatstico indicaram que existe influncia dos fatores temperatura e tratamento enzimtico para todos os parmetros avaliados e a interao entre eles parece ter um efeito ainda maior. Para o teor de polpa e de slidos totais, a temperatura influenciou de forma mais significativa que o uso de enzimas, enquanto que para os compostos bioativos e a atividade antioxidante ambos fatores parecem influenciar com a mesma significncia. 62

Tabela 4.6 Anlise de varincia de dois fatores dos parmetros das polpas de aa obtidas em diferentes condies de macerao do fruto.
Respostas Atividade Fontes de Variao Teor de Slidos Fenlicos Antocianinas Antocianinas antioxidante polpa totais totais totais monomricas (ABTS) Variao

24,875

13,28

36,10

51,49

50,98

46,45

13,62

15,52

49,35

76,00

32,77

32,98

Variao

0,0008 0,0005

<0,0001

<0,0001

<0,0001

<0,0001

PT

6,05

2,71

23,67

15,08

18,54

10,35

8,926

6,331

64,72

44,51

23,83

14,69

Variao

0,0241 0,0271

<0,0001

<0,0001

0,0004

0,0024

58,29

78,87

35,84

29,37

21,15

34,75

32,07

92,18

49,00

43,35

13,59

24,67

T temperatura; PT pr-tratamento e I interao. Os valores de P <0,05, em negrito, indicam significncia para uma avaliao com 95% de significncia.

A etapa de macerao conduzida por 15 minutos a 40C com adio da Rapidase TF mostrou ser a melhor condio para a obteno de uma polpa mais rica em compostos fenlicos, apesar de ter influenciado pouco no rendimento em polpa. 63

<0,0001 <0,0001 <0,0001

<0,0001

0,0008

<0,0001

4.3. Pr-tratamentos
O refino da polpa de aa grosso apresentou um rendimento de 84%, sendo este muito maior que o obtido com a centrifugao, 68%. No entanto, o material retido na centrifugao, denominado neste trabalho de torta, facilmente removido e pode ser utilizado para diversas finalidades enquanto que no refino o material fica muito aderido ao equipamento. Na Tabela 4.7 esto apresentados os resultados obtidos com os prtratamentos e pode-se verificar que enquanto o refino reduziu em pouco mais de 8% os teores de polpa e de slidos totais, a centrifugao removeu quase 90% dos slidos em suspenso e 68% dos slidos totais, sendo a centrifugao o pr-tratamento mais eficiente na remoo dos slidos da polpa de aa.

Tabela 4.7- Parmetros fsico-qumicos da polpa do aa antes e aps os pr-tratamentos, refino e centrifugao. Parmetros Teor de polpa (g/100g) Slidos totais (g/100g) pH Slidos solveis (oBrix) Acidez (g/100g)2 Aa integral 52,3 + 1,0a 14,6 + 0,5a 4,2 + 0,0a 3,0 + 0,0a 0,3 + 0,0a Aa refinado Aa centrifugado 48,0 + 0,7b 13,4 + 0,4b 4,2 + 0,0a 2,9 + 0,0b 0,3 + 0,0a 5,3 + 1,0c 9,9 + 0,1c 4,2 + 0,0b 2,5 + 0,1c 0,2 + 0,0b

Valores calculados pela diferena, de acordo com a norma AOAC, valores expressos em cido mlico equivalente/100g, letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa entre as amostras com 95% de significncia.

A acidez e o pH permaneceram inalterados com o refino e pouco se alteraram com a centrifugao. Porm, ambos permaneceram dentro dos parmetros estabelecidos pela legislao. Quanto ao teor de slidos solveis, ambos pr-tratamentos praticamente no influenciaram no mesmo, reduzindo aproximadamente 8% na centrifugao e menos de 5% no refino. 64

O efeito dos pr-tratamentos sobre o teor de fenlicos totais, antocianinas totais e atividade antioxidante do aa esto mostrados na Tabela 4.8. Os compostos fenlicos totais quantificados no apresentaram diferena

significativa entre as polpas integral e refinada, no ocorrendo o mesmo com a centrifugao.

Tabela 4.8 - Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro da polpa do aa antes e aps os pr-tratamentos, refino e centrifugao. Parmetros Fenlicos Totais Antocianinas Totais Atividade Antioxidante(ABTS) Aa Integral 523,8 + 9,5a 96,2 + 1,5a 36,6 + 2,8a Aa Refinado Aa Centrifugado 488,2 + 23,9a 82,4 + 2,9b 33,5 + 3,1ab 347,6 + 11,9 b 45,7 + 0,8c 22,1 + 2,7b

expresso em mg equivalente de cido glico/100g; expresso em mg equivalente de cianidina-3-glucosdeo/100g; expresso em mol Trolox equivalente/g, letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa entre as amostras com 95% de significncia.

Apesar de a centrifugao reduzir em 34% os compostos fenlicos, a polpa centrifugada apresentou-se muito similar s polpas obtidas com frutos maduros (Tabela 4.2) e com a melhor condio da etapa de macerao (Tabela 4.5). O teor de compostos fenlicos aps a centrifugao , ainda, superior ao teor de 136,8 mg/100g encontrado por Kuskosky et al. (2006) para uma polpa de aa congelada comercial. Ambos os processos de pr-tratamento testados promoveram perdas de pigmentos antocinicos, sendo, como esperado, mais acentuadas pela centrifugao, pela maior remoo de slidos. Mesmo contendo apenas 48% das antocianinas presentes na polpa integral a polpa centrifugada apresentou teor destes pigmentos semelhante ao encontrado por Rogez (2000), em aa mdio (44 mg/100g) e por Kuskosky et al. (2006) em polpa comercial de amora (41,8 mg/100g). Esse teor elevado quando comparado ao de outras polpas comerciais avaliadas por Kuskosky et al. (2006), como uva (30,9 mg/100g); morango (23,7 mg/100g) e ao prprio aa (22,8 mg/100g). Estes dados 65

evidenciam a grande variabilidade destes compostos no aa e a influncia de diversos fatores durante os processos de obteno da polpa sobre os mesmos. Tanto o refino quanto a centrifugao promoveram perdas mais acentuadas no teor de antocianinas do que no de fenlicos totais, possivelmente pelas antocianinas estarem concentradas na casca, como verificado por Bobbio et al. (2000), ou seja, na frao insolvel, enquanto que os fenlicos totais, que incluem outros compostos alm das antocianinas, se encontram mais uniformemente distribudos no fruto. A centrifugao reduziu em quase 40% a atividade antioxidante, como conseqncia da reduo tanto de antocianinas como dos demais fenlicos. A clarificao da polpa de aa por terra diatomcea realizada por Pachecopalencia, Hawken & Talcott (2007) promoveu perdas de 27,1% nos fenlicos, 20,4% nas antocianinas e 18,0% sobre a atividade antioxidante, sendo estas perdas bem menores que as obtidas com a centrifugao no presente estudo. No entanto, o subproduto da centrifugao pode ser aproveitado com diferentes finalidades, enquanto que o material retido na clarificao com terra diatomcea um resduo propriamente dito e no pode ser aproveitado. Apesar das pequenas perdas do refino sobre os compostos bioativos, observou-se uma intensa diminuio no fluxo de permeado logo no incio do processo, seguido do aumento da presso do sistema, inviabilizando a microfiltrao do aa at o fator volumtrico previsto para essa etapa. Portanto, a centrifugao foi o pr-tratamento escolhido para a conduo dos experimentos de microfiltrao.

4.4. Microfiltrao 4.4.1. Desempenho do processo

Os experimentos de microfiltrao foram conduzidos utilizando a polpa centrifugada, nos sistemas cermico e polimrico, a duas temperaturas, 25 e 35C, e o fluxo de permeado foi acompanhado ao longo do processo. Como pode ser observado na Figura 4.5, o tipo de membrana teve grande influncia sobre o rendimento dos processos a 25C. O fluxo de permeado mdio ao 66

longo do processo no sistema cermico foi de 81,6 L/hm, quatro vezes o obtido no sistema polimrico 18,1 L/hm, podendo o tempo de processo influenciar negativamente sobre os compostos bioativos da polpa, uma vez que os expe por mais tempo ao oxignio, temperatura e ao contato com as enzimas endgenas, polifenoloxidase e peroxidase. Como esperado, o fluxo de permeado decaiu com o tempo de processo, em decorrncia do entupimento, polarizao de concentrao e possvel formao de uma camada gel. No sistema cermico a 25C, o fluxo de permeado no final do processo atingiu 77% do fluxo mdio enquanto que para o sistema polimrico, este valor foi de 66%.

Figura 4.5 - Influncia do tipo de membrana sobre o fluxo de permeado nos processos a 25C.

Para os processos conduzidos a 35C, o fluxo de permeado tambm apresentou o mesmo comportamento, em que o sistema cermico apresentou um fluxo mdio de permeado de 117,4 L/hm superior em mais de quatro vezes o valor de 25,3 L/hm, verificado no sistema polimrico (Figura 4.6). No entanto, o efeito da temperatura sobre o fluxo de permeado foi de menor intensidade que o efeito do tipo de membrana. Foi observado um aumento de 40% no fluxo de permeado no sistema polimrico quando a temperatura de processamento passou de 25 para 35C. 67

Figura 4.6 - Influncia do tipo de membrana sobre o fluxo de permeado nos processos a 35C.

Em funo dos poros da membrana polimrica serem maiores que os da cermica e a microfiltrao ser um processo de separao cuja seletividade se d pela diferena entre o tamanho das partculas e os poros do meio permeante, era esperado um maior fluxo no sistema polimrico. No entanto, foi observado o inverso, os maiores fluxos foram atingidos no sistema cermico, com os menores poros. Fontes & Caminoto (2007) utilizaram apenas membranas de -alumina e tambm obtiveram os maiores fluxos de permeado com as membranas com poros 0,2 m e no com as de 0,6 m. O mais provvel que a polpa centrifugada tenha partculas com tamanhos superiores a 0,1 m e inferiores a 0,3 m, promovendo um entupimento mais acentuado no sistema polimrico. Fontes & Caminoto (2007) trabalharam com a polpa de aa refinada e diluda em torno de 17 vezes. No entanto, os maiores fluxos de permeado conseguidos com a polpa de aa diluda ainda foram inferiores ao menor fluxo obtido neste trabalho, na membrana polimrica a 25C (18,1 L/hm), o que evidencia que a centrifugao utilizada como pr-tratamento mais eficiente que a reduo na concentrao de slidos pela diluio.

68

4.4.2. Avaliao das fraes obtidas

Os parmetros fsico-qumicos das fraes de aa alimentado ao sistema, permeado (suco clarificado) e retido esto apresentados nas Tabelas 4.9 e 4.10 Mesmo sendo utilizada uma nica polpa centrifugada e homogeneizada, as caractersticas da alimentao variaram, em funo no s do tempo de congelamento a que foi submetida polpa, mas tambm em decorrncia da estabilizao do sistema antes da retirada da amostra. Com o intuito de minimizar estas interferncias, a frao alimentao foi normalizada e as demais foram recalculadas a partir da porcentagem inicial de cada parmetro. Os parmetros fsico-qumicos dos sucos clarificados obtidos (Tabela 4.9) no variaram significativamente com os fatores avaliados, temperatura e tipo de membrana. Considerando-se o suco clarificado, a microfiltrao reduziu os slidos totais da polpa de aa em 76% e os slidos solveis em 32%. Apesar de a acidez ter sido reduzida em 30%, o pH no se alterou com a microfiltrao.

Tabela 4.9 - Parmetros fsico-qumicos do suco de aa clarificado por microfiltrao. Suco clarificado Parmetros Polpa de aa Slidos totais (g/100g) pH Slidos solveis ( Brix)
o

Membrana cermica Membrana polimrica 25C 2,1 + 0,1a 4,6 + 0,1a 2,5 + 0,2a 0,2 + 0,0a 35C 2,1 + 0,0a 4,3 + 0,0a 2,5 + 0,0a 0,2 + 0,0a 25C 2,1 + 0,1a 4,4 + 0,3a 2,4 + 0,4a 0,2 + 0,0a 35C 2,0 + 0,1a 4,6 + 0,3a 2,5 + 0,1a 0,19 + 0,0a

8,5 + 0,5 4,5 + 0,0 3,6 + 0,2

Acidez (g/100g) 0,2 + 001

valores expressos em cido mlico equivalente/100g; letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa entre as amostras com 95% de significncia.

69

teor

de

slidos

totais

da

frao

retida

tambm

no

diferiu

significativamente nem em funo da temperatura nem do tipo de membrana. Foram observadas diferenas significativas quanto ao teor de polpa, porm sem uma correlao com os fatores avaliados, o que poderia ser atribudo ao elevado teor de lipdeos presente nestas fraes os quais formam uma camada na superfcie do tubo, muitas vezes no removida por completo, podendo ter influenciado nos resultados.

Tabela 4.10 - Parmetros fsico-qumicos da frao retida do aa durante a sua microfiltrao. Frao retida Parmetros Polpa de aa Teor de Polpa (g/100g) Slidos Totais (g/100g) pH Slidos solveis ( Brix)
o

Membrana cermica 25C 35C

Membrana polimrica 25C 45,8 + 2,3a 15,1 + 1,0a 4,4 + 0,3a 4,7 + 0,3ab 0,3 + 0,0a 35C 31,1 + 0,7d 14,4 + 0,1a 4,6 + 0,3a 4,7 + 0,2ab 0,3 + 0,0a

17,2 + 2,2 35,4 + 1,8c 40,7 + 1,9b 15,1 + 0,8a 14,3 + 0,8a 4,6 + 0,1a 4,4 + 0,2b 0,3 + 0,0a 4,3 + 0,0a 4,8 + 0,2a 0,3 + 0,0a

8,5 + 0,5 4,2 + 0,0 3,6 + 0,2

Acidez (g/100g) 0,3 + 0,0

valores expressos em cido mlico equivalente/100g letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa entre as amostras com 95% de significncia.

A frao retida apresentou um aumento de 70% no teor de slidos totais, no sendo verificado o mesmo incremento para os slidos solveis, os quais aumentaram aproximadamente 28%. No entanto, a frao retida atende legislao brasileira quanto ao pH, acidez e teor de slidos totais que a classifica como aa grosso, podendo ser introduzida para a obteno de outros produtos alimentcios derivados de aa (BRASIL, 2000). O tipo de membrana teve influncia sobre as antocianinas totais e avaliao estatstica indicou uma tendncia da interao com a temperatura (P=0,0741). 70

(Tabela 4.11). Os processos conduzidos no sistema cermico promoveram uma reteno mdia de 32% das antocianinas totais enquanto que no polimrico a reteno foi de 24%.

Tabela 4.11 - Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro do suco de aa clarificado por microfiltrao. Suco clarificado Parmetros Polpa de aa Fenlicos Totais Antocianinas Totais Antocianinas Monomricas Atividade Antioxidante 23,7 + 2,5 (ABTS)
expresso em mg equivalente de cido glico/100g; expresso em mg equivalente de cianidina-3-glucosdeo/100g; expresso em mol Trolox equivalente/g; letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa entre as amostras com 95% de significncia.

Membrana cermica 25C 35C

Membrana polimrica 25C 35C

331,3 + 19,5

141,5 + 10,3a 146,1 + 1,9a 129,4 + 15,4a 137,0 + 9,1a 17,6 + 0,5a 11,2 + 0,2a 14,0 + 0,3b 8,0 + 0,3b 14,5 + 1,2b 8,7 + 0,6b

58,0 + 3,2 18,9 + 1,9a 33,2 + 3,3 12,4 + 1,6a

9,9 + 0,8a

9,7 + 0,8a

9,5 + 0,6ab

8,4 + 0,9b

Apesar de as antocianinas monomricas serem mais sensveis degradao, por no estarem estabilizadas por interaes com outros compostos, estas apresentaram um comportamento muito similar ao das totais, com uma reteno de quase 36% no sistema cermico e 25% no polimrico. Contudo, a avaliao estatstica indicou influncia no s do tipo de membrana (P<0,0001), mas tambm da interao com a temperatura (P=0,0126) sobre as antocianinas monomricas. Como esperado, a atividade antioxidante tambm sofreu influncia do tipo de membrana (P=0,0138) e foi verificada a tendncia de influncia da temperatura (P =0,0530), pois os compostos responsveis por esta capacidade 71

sofreram influncia desses fatores. A mdia da atividade antioxidante dos sucos clarificados foi de 9,4 mol Trolox equivalente/g (6 minutos), valor superior aos 6,9 mol Trolox equivalente/g (30 minutos) encontrado por Kuskosky (2006) na polpa congelada de aa, e bem inferior aos 44,5 mol Trolox equivalente/mL quantificado no suco clarificado com terra diatomcea, sugerindo que, alm das perdas por processamento observadas por Pachecopalencia, Hawken & Talcott (2007), existem diferenas de qualidade nas prprias polpas integrais no processadas. Os dados apresentados na Tabela 4.11 indicam que a temperatura de 35C no processo conduzido no sistema polimrico foi pior para a manuteno dos compostos bioativos no suco clarificado, sendo as demais condies similares entre si. As fraes retidas foram avaliadas quanto aos teores dos compostos bioativos e atividade antioxidante (Tabela 4.12), pois, como j mencionado, as mesmas podem ser utilizadas como matria prima para diferentes produtos.

Tabela 4.12 - Compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro da frao retida do aa durante a sua microfiltrao. Frao retida Parmetros Polpa de aa Fenlicos Totais Antocianinas Totais Antocianinas Monomricas Atividade Antioxidante (ABTS)
expresso em mg equivalente de cido glico/100g; expresso em mg equivalente de cianidina-3-glucosdeo/100g; expresso em mol Trolox equivalente/g; letras diferentes na mesma linha indicam diferena significativa entre as

Membrana cermica 25C 425,8 + 22,5a 35C 426,6 + 9,7a

Membrana polimrica 25C 449,8 + 16,8a 35C 428,5 + 19,9a

331,3 + 19,5

58,0 + 3,2 76,2 + 3,5ab 70,3 + 2,0b 80,4 + 10,5a 73,3 + 3,8ab 33,2 + 3,3 39,7 + 2,3a 35,6 + 2,0ab 42,8 + 8,7a 35,0 + 2,8b

23,7 + 2,5 31,2 + 1,2a 31,3 + 0,5a 31,3 + 1,4a 31,2 + 2,4a

72

amostras com 95% de significncia.

Assim como observado para os sucos clarificados, os fenlicos totais no sofreram influncia de nenhum dos fatores avaliados, apenas uma tendncia (P=0,0908) quanto ao tipo de membrana. O fator de concentrao dos fenlicos totais foi de 1,3 abaixo do fator 2 de concentrao volumtrica. Mesmo com a injeo de nitrognio gasoso para diminuir a oxidao destes compostos, foram observadas perdas que podem ser atribudas s enzimas endgenas, polifenoloxidase e peroxidase. Diferentemente do verificado para o suco clarificado, na frao retida as antocianinas totais apresentaram uma reteno mdia de 32%, no sistema polimrico, enquanto que para o sistema cermico a reteno foi de 26%, sendo o sistema cermico a 35C a pior condio para a reteno das antocianinas. O fator de concentrao para as antocianinas foi o mesmo obtido para os fenlicos, aproximadamente 1,3. A anlise de varincia indicou a influncia da temperatura sobre a estabilidade das antocianinas monomricas, que apresentaram o fator de concentrao mais baixo, provavelmente por ser o composto menos estvel e facilmente degradado por enzimas, temperatura, luz e oxignio dentre outros. Apesar de diferenas significativas nos teores de antocianinas totais e monomricas, estas no foram suficientes para alterar a capacidade antioxidante das fraes retidas, que no apresentaram diferena significativa entre as diferentes condies de processo. O balano de massa de cada processo um dado importante que indica perdas (Tabela 4.13) e, portanto, pode auxiliar na identificao da melhor ou pior condio estudada. A anlise de varincia de dois fatores e o teste de Bonferroni aplicados s perdas de processos dos compostos bioativos indicaram interao entre os fatores e influncia da temperatura somente para as antocianinas totais, indicando o processo no sistema polimrico a 35C o que provocou a maior perda. Contudo esta perda de antocianinas no foi suficiente para afetar a atividade antioxidante. Uma vez que as fraes permeada (suco clarificado) e retida podem ser utilizadas como produtos ou ingredientes, a condio de processo ideal seria a 73

de menor perda dos compostos bioativos aliada manuteno destes nas duas fraes e ao rendimento do processo, determinado pelo fluxo de permeado.

Tabela 4.13 - Perdas dos compostos fenlicos e atividade antioxidante in vitro em funo dos processos de microfiltrao. Perdas nos processos Parmetros Membrana cermica 25C Fenlicos totais Antocianinas totais Antocianinas monomricas Atividade antioxidante (ABTS) 15% 19% 24% 35C 14% 24% 30% Membrana polimrica 25C 13% 19% 24% 35C 15% 24% 34%

14%

14%

14%

16%

Avaliando-se os resultados para os teores dos compostos bioativos e para a atividade antioxidante, verifica-se que o processo com a membrana polimrica a 35C foi o que mais afetou as caractersticas das duas fraes e que nas demais condies, as perdas foram similares. Desta forma, a avaliao do rendimento do processo foi o parmetro determinante, pelo qual se observou que a melhor condio, dentre os fatores estudados, foi a microfiltrao do aa em membranas cermicas a 35C.

74

5.

CONCLUSES E SUGESTES

A polpa do aa verde apresentou teores de compostos fenlicos e atividade antioxidante superiores aos obtidos na polpa de frutos de vez e inferiores aos obtidos com os frutos maduros.

As antocianinas do aa somente comearam a ser produzidas e armazenadas aps o fruto estar totalmente desenvolvido, entre a metade o e final da maturao.

O uso da preparao enzimtica RapidaseTF a 40C, durante a etapa de macerao, aumentou a extrao dos compostos fenlicos analisados, em 50% para os compostos fenlicos totais e em 60% para a classe das antocianinas, em relao polpa obtida tambm a 40 C porm sem a adio da preparao enzimtica.

A centrifugao da polpa de aa como etapa de pr-tratamento mostrou-se eficiente para a conduo da microfiltrao, por reduzir em 90% os slidos totais e em 68% o teor de polpa. Por outro lado, houve reduo dos fenlicos totais em 34%, das antocianinas em 53% e da atividade antioxidante em 40%, o que, no entanto, no comprometeu a qualidade do produto em funo dos teores considerveis destes compostos no aa centrifugado.

A temperatura de processo e o tipo de membrana utilizada na microfiltrao da polpa de aa centrifugada no influenciaram significativamente nos teores de compostos fenlicos e na atividade antioxidante das duas fraes obtidas, com exceo do processo realizado em membrana polimrica a 35C. O fluxo de permeado, por sua vez, foi fortemente afetado pela temperatura e pelo tipo de membrana utilizada, atingindo o maior valor mdio com a membrana cermica a 35C.

75

A microfiltrao mostrou-se eficiente para a clarificao da polpa de aa e ainda permitiu a obteno de uma segunda frao, a retida. As fraes obtidas apresentaram caractersticas distintas, porm igualmente ricas, tanto em relao composio das mesmas como em relao ao potencial de aplicao industrial.

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam a potencialidade do aa em termos de composio, bem como a viabilidade tcnica da aplicao de novos processos na cadeia de processamento do aa.

Diante dos resultados obtidos, sugere-se: Otimizao do tratamento enzimtico durante a etapa de macerao, aliando maior rendimento e maior qualidade da polpa, possibilitando a realizao de um estudo de pr-viabilidade econmica da introduo deste tratamento na obteno da polpa de aa. Aproveitamento da torta obtida na etapa de centrifugao da polpa para o desenvolvimento de novos produtos e como matria prima para a extrao de compostos de interesse.

Conduo de processos de microfiltrao da polpa do aa em sistema de batelada alimentada e com diferentes fatores de concentrao volumtrica.

Avaliao microbiolgica das fraes obtidas durante a microfiltrao.

Uso das duas fraes obtidas na microfiltrao do aa, retida e suco clarificado, no desenvolvimento de novos produtos. O suco clarificado poderia ser utilizado como base para gelias finas, repositores de sais, refrigerantes e a frao retida, em produtos tais como nctares prontos para o consumo, iogurtes, recheios e sorvetes. 76

 Avaliao da viabilidade econmica do uso da tecnologia de membranas no processamento integrado do aa.

77

6.
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