Determinarea simultan a coloranilor sintetici n produse alimentare i buturi prin cromatografie lichid de nalt performan cuplata/unita cu detector cu sistem

de diode
Stefania Bonan, Giorgio Fedrizzi, Simonetta Menotta, Caprai Elisabetta Istituto Zooprofilattico Sperimentale Lombardia Emilia Romagna, epartamentul de C!imie, "ia #ietro Fiorini, $, %&'() Bologna, Italia

1. Introducere
Culoarea este unul dintre principalele propriet*i prin care produsul alimentar este e+aluat, in acest moti+, colorani alimentari -naturali sau sintetici. se adaug* la produsele alimentare /n scopul de a le face mai atracti+e +izual pentru consumatori i pentru a restabili aspectul lor original, atunci c0nd a fost pierdut /n timpul proceselor de producie, irecti+a European* '11%2342EC 5'6 prezint* culorile care pot fi ad*ugate /n m0ncare7 definete, de asemenea, produse alimentare la care se pot ad*uga numai anumiti colorani, ni+elul lor ma8im permis2admis, precum i restriciile de utilizare, 9utoritatea European* pentru Sigurana 9limentar* -EFS9. este responsabil de ree+aluarea tuturor aditi+ilor permisi /n conformitate cu Regulamentul Comisiei (&'& 2 ($)2CE 5(6, e fapt, cantitatea permis* de colorani sintetici este strict reglementat* din cauza riscului lor potenial pentru s*n*tatea uman*, E8istena unei relaii funcionale /ntre ingestia de colorani alimentari artificiali i o cretere at0t /n durata, cat i in frec+ena de comportamente !iperacti+e la copii a fost demonstrata 53:$6, Mai mult dec0t at0t, consumul cronic de metanil galben pare s* predispuna la neuroto8icitate la animalele tinere i adulte 546, ;nii colorani alimentari sintetici, /n special coloranii azoici, ar putea fi redusi prin enzimele de azoreductaza in bacteriile intestinale si in celulele !epatice prin eliberarea de amine aromatice in organism 5)6, Lu0nd /n considerare at0t efectele poteniale asupra s*n*t*ii umane, cat i necesitatea de a cunoate componentele produselor alimentare, detectarea coloranilor sintetici /n produsele alimentare i b*uturi este un aspect important de care trebuie sa ne ocupam, 9ceste circumstane sunt do+edite de numeroase notificari de alerta, respingeri la frontiera, notificari de informare sau de urmarire create de R9SFF, Sistemul de alert* rapid*2sistemul rapid de alerta pentru alimente i fura<e -R9SFF. al ;niunii Europene -;E. denun* utilizarea ilegal* a mai multor culori alimentare care includ un coninut ridicat de anumiti colorani, prezena lor nedeclarata sau utilizarea ilegal* /n anumite tipuri de produse alimentare 5=6, >n scopul de a pre+eni frauda alimentara i pentru moti+e de siguran* alimentar* este necesar s* se dez+olte o metod* precis* i fiabil* pentru detectarea coloranilor sintetici /n produsele alimentare i b*uturi, 9u fost dez+oltate i /mbun*t*ite multe te!nici analitice de detectare a coloranilor /n alimente, eterminarea bazata e8clusi+ pe m*sur*tori ale absorbanei la lungimea de und* corespunz*toare absorbiei sale ma8ime poate fi problematic* /n amestecurile de colorant din cauza suprapunerii spectrelor de absorbie 516, ea poate necesita utilizarea de spectrofotometrie deri+ati+a 5'&6, Cele mai dez+oltate metode depind de separare si de detectia de absorbtie, Metodele includ te!nici cum ar fi cromatografia /n strat subire -?LC. 5'','(6, ?LC de /nalt* performan* combinata cu prelucrare de imagine 5'36, spectrofotometrie de faz* solid* 5'%,'$6, +oltametrie de adsorbie 5'46, oricum aceste metode presupun consum de timp pentru pretratarea eantionului2probei, 9lte metode folosesc cromatografie electrocinetica in microemulsie 5')6 sau electroforez* capilar* 51,'=,'167 ele sunt adec+ate pentru analiza speciilor ionice i a compuilor !idrofilici, dar au probleme de sensibilitate, ca urmare a unui +olum de in<ecie mic 5($6, 9u e8istat unele metode bazate pe polarografie in puls2puls:polarografie 5(&,('6 i izotacoforeza 5((6, Rezultatele te!nicilor de +oltametrie 5(36 au fost comparate cu cele obinute prin cromatografia lic!ida2de lic!ide i a reiesit ca sunt in concordanta 5('6, Cu toate acestea, te!nicile cele mai utilizate pe scar* larg* sunt cromatografia de lic!ide de /nalt* performan* -@#LC. 5(%:(16, cromatografia lic!ida Aperec!i ioniceB53&,3'6 ion:cromatografia de /nalt* performan* 53(67 aceste te!nici permit s* se atinga o sensibilitate i o rezoluie ridicate a coloranilor alimentari, Metodele analitice bazate pe cromatografia de lic!ide : spectrometrie de masa 53&6 sunt deosebit de potri+ite pentru analiza coloranilorr ilegali i to8ici, deoarece acestea au fost dez+oltate pentru a identifica /n mod clar coloranii la un ni+el infim, Scopul studiului actual a fost dez+oltarea unei metode R#:@#LC cuplata2unita cu detector cu sistem de diode - 9 . pentru determinarea a ') colorani sintetici /n diferite tipuri de produse alimentare i b*uturi, Coloranii luati /n considerare au fost at0t permisi, cat i nepermisi pentru a fi utilizati ca aditi+i alimentari /n ;E, Coloranii analizati au fost azo:compusii7 tartrazina -E'&(., galben auriu -E''&., azorubina -E'((., amarant

-E'(3., rou ponceau2rosu coenila 9 -E'(%., rou (G -E'(=., rou 9llura -E'(1., galben metanil -MC., Drange II2acid orange ) -DR II., ponceau (R -#(R., ponceau 4R -#4R., azocarmin B deri+ati+es benzop!enazine B -9ZD B. i azocarmin G -9ZD G.E galben de c!inolin* -E'&%.E albastru patent " -E'3'. i albastru briliant FCF -E'33. i indigotina2carmin indigo -E'3(., Metoda a fost +alidat* /n conformitate cu Regulamentul (&&%2==(2CE -ane8a III. 5336 pentru detectarea coloranilor alimentari galben, rou i albastru /n b*uturi i a coloranilor galben si rou /n matrici alimentare solide,

2. Materiale i metode

2.1. Substante chimice i reactivi Etanolul -EtD@. a fost ac!iziionat de la FluFa 9nalGtical -Stein!eim, Germania., metanolul -MeD@. i acidul fosforic -=$H I 2 +. au fost din Sigma:9ldric! -Stein!eim, Germania., Soluia de amoniac -3&H I 2 +. i acetonitril -MeCJ. au fost procurate de la Carlo Erba Reagents -Rodano, Milano, Italia., 9cetatul de sodiu tri!idrat -JaD9c. a fost ac!iziionat de la MerF Kga - armstadt, Germania., 9pa ultrapura i dispoziti+ele de filtrare centrifugale ;ltrafree au fost de la Millipore -Bedford, M9, Statele ;nite ale 9mericii., #oliamida isco+erG #9:4S 4 ml tub, cartue $&& mg S#E au fost ac!iziionate de la Supelco 9nalGtical -Bellefonte, #9, Statele ;nite ale 9mericii., ?artrazina, amarant, azocarmin B i Drange II au fost ac!iziionate de la FluFa, /n timp ce albastru brilian FCF, carmin indigo, albastru patent ", rou 9llura, galben auriu, #onceau 4R i azocarmin G au fost de la Sigmae9ldric! -Stein!eim, Germania., Galben de c!inolin*, rou coenil* 9, rou (G, azorubina, metanil galben i #onceau (R au fost furnizate de r, E!renstorfer:Sc!Lfers -9ugsburg, Germania., Cantit*i adec+ate de praf din fiecare culoare -cu e8cepia E'&( i metanil galben. au fost dizol+ate /n metanol 2 ap* -'7' + 2 +. pentru a da o concentraie de '&&& mg l:', ?artrazina i metanilul galben au fost dizol+ati in apa /n aceeai concentraie, aptesprezece colorani alimentari au fost impartiti in % grupe de soluii de lucru7 colorani roii permisi -Grupa 9., colorani roii nepermisi -grupa B., galbeni -Grupa C. i colorani albastri -grupa ., Grupa 9 include E'((, E'(3, E'(%, E'(= i E'(1, Grupa B conine coloranii ilegali azocarmin B, azocarmin G, ponceau (R i ponceau 4R, Grupa C cuprinde E'&(, E'&%, E''&, metanil galben i Drange II, Grupa include E'3', E'3( i E'33, #entru fiecare grup*, '&& mg l:' soluii au fost dispuse ca soluii /mbog*ire MspiFing solutionsN prin amestecarea fiecarui amestec2adaos de soluie, Curbele de calibrare ale celor patru grupe au +ariat de la ' la '&& mg L:', Sol+entul pentru toate diluiile a fost metanol:apa -'7' + 2 +., 2.2. Echipamente 9nalizele au fost efectuate cu @#LC @# seria ''&& ec!ipate cu depurator2degazorG'3((9 , pompa cuaternara G'3''9, autosampler G'3'39, C!emStation G'3'$9 9 i @# pentru colectarea i prelucrarea datelor, ?oate instrumentele au fost furnizate de 9gilent ?ec!nologies -Oaldbronn, Germania., Baia cu ultrasunete a fost de la Branson ultrasonic - anburG, C?, Statele ;nite ale 9mericii., ispersorul de proba ;ltra:?urra8 i masina de scuturat orizontal* au fost furnizate prin IK9 -Staufen Germania., ;ltracentrifuga a fost de la BecFman Coulter -Brea C9, S;9. i microcentrifuga a fost de la Eppendorf -@amburg, Germania., 2. . !regatire de probe 2.3.2. Procedura pentru buturi Gazul din b*uturi se /ndep*rteaz* prin plasarea lor /ntr:o baie ultrasunete timp de (& min, 9poi bautura a fost diluata -'7' + 2 +. cu ap* deionizat*, #roba se centrifug!eaz* la '$&&& rpm timp de '& min la temperatura camerei /ntr:un tub de &,$ ml, pre+*zut cu dispoziti+ cu filtru, 2.". #ondiii cromatografice Separarea a fost realizat* printr:o coloan* C= Luna -'$& mm 8 %,4 mm id, dimensiunea particulelor 3 Pm, #!enomene8, C9, ;S9. i printr:un gradient binar care a inclus acetonitril -faza mobil* 9. i '&& mM tampon de acetat de sodiu la p@ Q ) -faza mobil* B., ?oate e8perimentele au fost realizate la temperatura camerei i debitul a fost stabilit la' ml min:' /n mod constant, ?imp de separare a fost de 3$ min, Gradientul optimizat de separare a colorantului este dat /n tabelul ', "olumul de in<ecie a fost de (& Pl, etectorul cu sistem de diode a fost programat pentru a monitorizarea coloranilor de la (%& la )&& nm -$'$ nm cei rosii, %(& i %=& nm cei galbeni i 4(& nm cei albastri., 2.$. %alidarea metodei analitice Metoda a fost +alidat* /n conformitate cu (&&%2==(2 Regulamentul CE -9ne8a III. 5336, "alidarea a fost realizat* prin analiza probele inte cu grupele de colorani 9, B, C i , Matricile solide testate au fost carne i

produse din peste, produse de patiserie, pr*<ituri, gem, produse de panificaie, sosuri de fructe i legume, Matricile lic!ide au fost bauturi racoritoare, aperiti+e alcoolice, sucuri de fructe clare, #arametrii e+aluai au fost urm*trii7 liniaritatea r*spunsului, gama de aplicabilitate, acuratetea ca e8actitate i precizia, limita de detecie -L ., limita de cuantificare -LC., ?oi parametri au fost e+aluati pentru ambele matrici, solide i b*uturi, #entru a testa liniaritatea soluiilor standard, au fost in<ectate % replici ale curbelor de calibrare la concentraii cuprinse /ntre ' i '&& mg l:', S:au in<ectat cinci replici ale probelor tinte din fiecare grup de colorant /n scopul de a defini r*spunsuri liniare ale analiilor /n matrice, 9u fost calculate ecuaiile i coeficienii corelaie -R(. ai curbelor de calibrare, #entru a e+alua repetabilitatea metodei, ase replici la trei ni+eluri tinta diferite au fost analizate /n aceeai zi pentru fiecare colorant, 9celeai proceduri, efectuate timp de trei zile, s:au aplicat pentru a da repetabilitate intermediara, Identificarea fiecarei molecule a fost efectuat compar0nd timpul de retenie /n timpul e8perimentului cromatografic i spectrul zonei de +0rf, #entru ambele probe solide si lic!ide, dou*zeci de probe blanF au fost analizate pentru a e8clude interferenele matricei i pentru a +erifica specificitatea metodei, le #entru matrici solide ni+elurile spiFed pentru fiecare colorant din grupele 9 i C au +ariat de la '& la 3&& :' mg Fg , /n timp ce ni+elurile de fortificare pentru grupa de colorani B au +ariat de la $ la '&& mg Fg:', RS r i RS R au fost e+aluate prin procesarea rezultatelor pro+enite din 3 ni+eluri spiFing -$&, '&& i (&& mg Fg:'., Concentraiile, de+iaia standard, repetabilitatea i repetabilitate intermediara ca coeficient de +ariaie procentual* -C"H. au fost calculate pentru fiecare ni+el cu /mbog*ire menionat anterior, #robele s:au /mbog*it b*uturi la ni+eluri care +ariaz* /ntre $ '&& mg lR ' cu grupa 9, B, C i separat, RS r i RS R au fost e+aluat a+0nd /n +edere ni+elurile de fortificare de $, '& i ($ mg LR ', Concentraiile, de+iaia standard, repetabilitatea i intermediare repetabilitate ca coeficientul de +ariaie procentual* -C"H. au fost calculate pentru fiecare ni+el spiFing menionat mai /nainte, #robele de b*uturi au fost fortificate la ni+eluri care +ariaz* /ntre $ si '&& mg l:' cu grupa 9, B, C i separat, RS r i RS R au fost e+aluate a+0nd /n +edere ni+elurile de fortificare de $, '& i ($ mg L:', Concentraiile, de+iaia standard, repetabilitatea i intermediare repetabilitate ca coeficientul de +ariaie procentual* -C"H. au fost calculate pentru fiecare ni+el spiFing menionat mai /nainte,

. &e'ultate
atele pri+ind 1 coloranti rosii din produsele alimentare solide sunt prezentate /n ?abelul (, /n timp ce cele de la +alidarea celor ') colorani din b*uturi sunt prezentate /n tabelul 3, >n matricile solide toi coeficienii de corelaie pentru cur+ele de calibrare ale matricei au fost mai mari de &,1=, Recuperarea medie pentru fiecare colorant a fost calculata pe cele 3 ni+eluri spiFing pentru care reproductibilitatea a fost e+aluat*, "alorile medii de recuperare sunt afiate in ?abelul (, 9cestea au +ariat de la 4&,%H pentru E'(3 la 1&,)H pentru E'(1, RS rH a +ariat de la 3,='H p0n* la 31,&$H, /n timp ce R SRH a +ariat de la (,1)H la 3%,=%H, ?oti coeficienii de corelaie ai curbelor de calibrare pentru b*uturi au fost peste &,11, cu e8cepia metanilului galben, E'3' i E'3(, care au prezentat r( destul de redus -&,1(, &,13 i respecti+ &,1)., Recuper*rile medii pentru b*uturi au +ariat de la 4(,1H pentru metanilul galben la '&','H pentru E'(%, ?oate RS r calculate au fost mai mici cu '$H decat toate +alorile RS R,