Seminarios Informales 2012

Espectroscopia de Fluorescencia
Dra. Valeria Sueldo Occello

S2

S1 T1

Energa

Absorcin

S0

S2

Conversin interna

S1 T1

Energa

Absorcin

Conversin interna y externa

S0

S2

Conversin interna

Relajacin vibracional

S1 T1

Energa

Absorcin

Conversin interna y externa

S0

S2

Conversin interna

Relajacin vibracional Cruce entre sistemas T1

S1

Energa

Absorcin

Conversin interna y externa

S0

S2

Conversin interna

Relajacin vibracional Cruce entre sistemas T1

S1

Energa

Absorcin

Fluorescencia Conversin interna y externa

S0

Absorcin

Fluorescencia Fosforescencia

S2

Conversin interna

Relajacin vibracional Cruce entre sistemas T1

S1

Energa

Absorcin

Fluorescencia Conversin interna y externa

Fosforescencia

S0

Absorcin

Fluorescencia Fosforescencia

Variables que afectan la fluorescencia

Factores estructurales Efectos de la temperatura y del solvente Efecto del tomo pesado Efecto del pH Efecto de la concentracin

Variables que afectan la fluorescencia

Factores estructurales Efectos de la temperatura y del solvente Efecto del tomo pesado Efecto del pH Efecto de la concentracin

Factores estructurales
Molculas aromticas o que presentan mltiples doble enlaces conjugados estabilizadas por resonancia. Efecto del sustituyente: -NH2, -OH, -F, -OCH3, -NHCH3, -N(CH3)2 -Cl, -Br, -I (Efecto del tomo pesado); -NHCOCH3, -NO3, -COOH Rigidez estructural. Incremento de las intensidades

Disminucin o quenching de las seales

Variables que afectan la fluorescencia

Factores estructurales Efectos de la temperatura y del solvente Efecto del tomo pesado Efecto del pH Efecto de la concentracin

Efectos de la temperatura y del solvente

La disminucin de la temperatura y el aumento de la viscosidad aumentan las intensidades. La introduccin de tomos pesados disminuyen la fluorescencia, sin embargo, favorecen la fosforescencia. - disolventes (CBr4, CH3CH2I) - sales (TlNO3)

Variables que afectan la fluorescencia

Factores estructurales Efectos de la temperatura y del solvente Efecto del tomo pesado Efecto del pH Efecto de la concentracin

Efecto del pH
Variacin del pH Variacin del perfil espectral y de las intensidades
PYRNH2
[1-PYRNH2] = 0,10 M !ex = 338,0 nm

PYRNH3+

pKa ! pKa*
() solucin reguladora de pH = 9,000; () solucin reguladora de pH = 6,994; () HCOOH 55 % p/v; () HCl 18 % p/v y () HCl 36 % p/v

Variables que afectan la fluorescencia

Factores estructurales Efectos de la temperatura y del solvente Efecto del tomo pesado Efecto del pH Efecto de la concentracin

Efecto de la concentracin
- absorcin de energa radiante - self-absorption (auto-absorcin) - formacin de excmeros

PROBLEMA: Prdida de linealidad

Absorcin de energa radiante (efecto de filtro interno): absorcin de la radiacin de excitacin o de emisin. Self-absorption: atenuacin de la radiacin de excitacin.

Efecto de la concentracin
Formacin de excmeros
(A) [PYR] = 1 x 10-2 M (B) [PYR] = 7,75 x 10-3 M (C) [PYR] = 5,5 x 10-3 M (D) [PYR] = 3,25 x 10-3 M (E) [PYR] = 1 x 10-3 M (G) [PYR] = 1 x 10-4 M

Banda del monmero

Banda del excmero

IF

!, nm

Efecto de la concentracin
SOLUCIN: - Trabajar con soluciones diludas.
" = coeficiente de extincin molar a la longitud de onda de excitacin b = paso ptico [C] = concentracin del compuesto fluorescente
Absorbancia 0,001 Desviaciones de la linealidad de la relacin entre la intensidad de fluorescencia y la concentracin para varios valores de absorbancia 0,01 0,05 0,1 0,2 Desviacin (%) 0,1 1,1 5,5 10,6 19,9

2,303 x " x b [C] < 0,05

Otros efectos
Quenching: disminucin de las intensidades fluorescentes mediante diversos procesos: - reacciones en el estado excitado - rearreglo molecular - transferencia de energa - formacin de complejos en estado basal - quenching colisional - mecanismos no moleculares: atenuacin de la luz incidente por el fluorforo u otras especies (impurezas, tomos pesados o sustancias paramagnticas). - efecto de filtro interno (inner-filter effect): disminucin de las intensidades por presencia de cualquier compuesto que absorbe una fraccin de la energa de excitacin o de emisin.

- control de la temperatura - cubeta

Arreglos geomtricos

Consideraciones experimentales
SOLVENTES y REACTIVOS Examinar la calidad de los solventes peridicamente por espectroscopia UV-Visible: - Solventes grado HPLC (no almacenar en recipientes de plstico). - Agua destilada calidad Milli-Q. RAMAN del solvente. Otros contaminantes: -! Detergentes sintticos empleados para la limpieza del material (fuertemente fluorescentes) ! Solucin: Emplear agentes inorgnicos. -! Crecimiento de microorganismos. -! Empleo de papel de filtro (puede introducir fenoles derivados de la madera).

Consideraciones experimentales
Trabajar con soluciones diludas (No almacenarlas). Prdida de sustancias orgnicas por adsorcin sobre las paredes del recipiente. -! Evitar la medida de sustancias aromticas en solventes no polares. -! Lavar con cido los materiales nuevos. Fotodescomposicin: -! Empleo de ventanas (shutter). -! Seleccionar otra longitud de onda de excitacin. -! Reducir la intensidad de excitacin mediante el uso de ancho de rendijas ms estrechos o filtro de densidad neutra. Oxidacin - Disminuir la presencia de trazas de agentes oxidantes (oxgeno disuelto y/o perxidos).

Determinacin de espectro de emisin

1) Determinar el espectro de absorcin

2) Seleccionar la longitud de onda de excitacin

3) Determinar el espectro de emisin seleccionando las mejores condiciones experimentales y parmetros instrumentales: - Condiciones experimentales:
- temperatura - concentracin

- Parmetros instrumentales:
- ancho de las rendijas de emisin y de excitacin - voltaje del fotomultiplicador o ganancia - velocidad de barrido

IMPORTANTE: Determinar el espectro de emisin de una solucin de referencia siempre que se emplee el equipo.

Mayor resolucin

- ancho de las rendijas de emisin y de excitacin

Ancho de rendija de excitacin: 10 nm Ancho de rendija de emisin: 10 nm Ancho de rendija de excitacin: 1,5 nm Ancho de rendija de emisin: 3,0 nm

Mayor resolucin Menor sensibilidad

- Espectrofluormetros:
- Jasco F777 (Grupo Dra. Rossi / Lab 004 / Encargados: Sueldo Miambres Carranza). - Perkin Elmer LS 55 (2008 / Subsidio FONCYT, Dra. Rossi / Lab. 005 007 / Encargados: Sueldo Miambres Carranza).

- Espectrofluormetros:
Espectrofluormetro PTI con counting photon detector y gated detection; slits manuales Fondos de FOMEC Ubicacin: Lab 202 (Fisicoqumica) Encargado: Dr Gerardo Arguello

- Fluorescencia - Fosforescencia esttica y resuelta en el tiempo

-! B. Valeur; Molecular Fluorescence. Principles and Applications.; Primera Edicin, Wiley-VCH, Weinheim, 2001. -! J. R. Lakowicz; Principles of Fluorescence Spectroscopy.; Tercera Edicin, Springer, New York, 2006.

Muchas gracias por su atencin!!!