LAURA BEATRIZ OLIVEIRA DE OLIVEIRA

ANGIOARQUITETURA DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS, QUIMICAMENTE INDUZIDO EM BOLSA JUGAL DE HAMSTER: ANLISE EM MICROSCOPIA DE LUZ E MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA DE RPLICAS VASCULARES

Tese apresentada como requisito parcial obteno do ttulo de Doutor em Biologia Celular e Molecular, da Pontifcia Universidade Catlica do Rio Grande do Sul.

Data de aprovao em 20 de janeiro de 2009

BANCA EXAMINADORA:

Prof. Dr. Jos Antnio Poli de Figueiredo ..................................................................

Prof. Dr. Leo Kraether Neto ..............................................................................

Prof. Dr. Manoel SantAna Filho ..............................................................................

Prof. Dr. Mnica Ryff M. Roca Vianna ..............................................................................

Porto Alegre 2009

SUMRIO

CAPTULO 1 .......................................................................................................... 18 1 INTRODUO ................................................................................................... 19 1.1 VASCULOGNESE VERSUS ANGIOGNESE ............................................. 20 1.2 REGULAO DA ANGIOGNESE ................................................................ 21 1.3 PROMOTORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE ..................................... 21 1.4 INIBIDORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE .......................................... 24 1.5 ANGIOGNESE NO TUMOR ......................................................................... 25 1.6 MODELO ANIMAL .......................................................................................... 27
1.7 AGENTES CARCINOGNICOS ................................................................................................ 29 1.7.1 DMBA, 9,10 dimetil benzatraceno (9, 10 dimethyl-1, 2-benzathracene) .......................... 29

1.7.2 Perxido de Carbamida ............................................................................. 30 1.8 TCNICA DE MODELO DE CORROSO VASCULAR .................................. 32 1.9 HIPTESE ...................................................................................................... 34 2 OBJETIVOS ....................................................................................................... 34 2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 34 2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................... 34

CAPTULO 2 - HAMSTER SRIO DOURADO (MESOCRICETUS AURATUS) UM MODELO PARA ESTUDO DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS........ 35 1 INTRODUO ................................................................................................... 38 1.1 CNCER BUCAL ............................................................................................ 38 1.2 MODELO ANIMAL .......................................................................................... 38
2 OBJETIVO .................................................................................................................................... 43

3 MATERIAIS E MTODO .................................................................................... 43 3.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 43 3.2 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL ................................................................... 44 3.3 PREPARO DOS AGENTES QUMICOS .......................................................... 44 3.4 APLICAO .................................................................................................... 45 3.5 EUTANSIA E ANLISE DOS ESPCIMES ................................................... 45 4 RESULTADOS ................................................................................................... 46 5 DISCUSSO ...................................................................................................... 47

REFERNCIAS ...................................................................................................... 53

CAPTULO

BOLSA

JUGAL

DE

HAMSTER

SRIO

DOURADO

(MESOCRICETUS AURATUS): ESTUDO COM MODELO DE CORROSO E MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA ASSOCIADA MICROSCOPIA DE LUZ .................................................................................................................. 58 1 INTRODUO ................................................................................................... 60 1.1 ANATOMIA E ARRANJO VASCULAR DA BOLSA JUGAL E DO MSCULO RETRATOR ........................................................................................................... 61 2 OBJETIVOS DO TRABALHO ........................................................................... 65 3 MATERIAIS E MTODO .................................................................................... 65 3.1 PERFUSO COM RESINA ACRLICA ............................................................ 65 3.2 CORROSO VASCULAR ............................................................................... 66 3.3 ANLISE DAS RPLICAS MICROVASCULARES ......................................... 67 3.4 MICROSCOPIA DE LUZ ................................................................................. 68 4 RESULTADOS ................................................................................................... 68 4.1 MICROSCOPIA DE LUZ ................................................................................. 68 4.2 TNICA MUCOSA .......................................................................................... 69 4.3 TNICA MUSCULAR ...................................................................................... 70 4.4 TNICA ADVENTCIA ..................................................................................... 71 4.5 TECIDO CONJUNTIVO / VASOS SANGNEOS .......................................... 71 4.6 MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA .......................................... 72 4.6.1 Vasos arteriais ............................................................................................ 72 4.6.2 Vasos venosos ........................................................................................... 72 4.6.3 Capilares ..................................................................................................... 73 5 DISCUSSO ...................................................................................................... 75 REFERNCIAS ...................................................................................................... 79 CAPTULO 4 - ARTIGO (submetido ao peridico Oral Oncology) ................... 83
REFERNCIAS ................................................................................................................................. 98

5 CONSIDERAES FINAIS ............................................................................... 101 5.1 HISTOLOGIA ................................................................................................... 101 5.2 INDUO QUMICA DE CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS MODELO ANIMAL .................................................................................................................. 103 5.3 ENRIQUECIMENTO AMBIENTAL ................................................................... 103 5.4 CARCINOMA DE CLULAS ESCAMOSAS BEM DIFERENCIADO ................ 103

5.5 TCNICA DE CORROSO VASCULAR ASSOCIADA MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA ........................................................................... 104 5.6 MICROSCOPIA DE LUZ E MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA ............................................................................................................................... 105 REFERNCIAS ..................................................................................................... 106 ANEXOS ............................................................................................................... 117 Anexo A - A oncologia de cabea e pescoo da Grcia Antiga ao Sculo XX quando a avaliao histolgica de tumores se tornou um padro prtico ........................... 118 REFERNCIAS ...................................................................................................... 121 Anexo B - O animal experimental - hamster srio dourado com bolsa jugal evidenciada ............................................................................................................ 123 Anexo C - 2nd International Workshop on advances in vascular casting ................ 127 Anexo D Ofcio 055/08-CEUA ............................................................................. 134

RESUMO O cncer da cavidade bucal e o cncer orofarngeo representam o 6 tipo mais comum de cncer no mundo, sendo que 90% desses tumores bucais so do tipo carcinoma de clulas escamosas. Para que ocorra o estabelecimento, a expanso e a metastatizao de neoplasias fundamental que tumores estimulem a produo de sua prpria rede vascular, processo conhecido como angiognese tumoral. Assim, o resultado uma nova rede de vasos adequada ao crescimento e a viabilizao de metstases. Os vasos do tumor so considerados como imaturos e diferem dos vasos normais, apresentando formas tortuosas, irregulares, revestidos por clulas endoteliais amplamente fenestradas e muitas vezes com ausncia de membrana basal. Os objetivos deste trabalho foram: definir um protocolo para estudo da angioarquitetura em rplicas vasculares de tumores quimicamente induzidos na bolsa jugal de hamster srio dourado Mesocricetus auratus, descrever a histologia do rgo normal por microscopia de luz (ML) e a angioarquitetura por microscopia eletrnica de varredura (MEV), analisar qualitativamente a rede vascular neoformada em bolsas jugais de hamster srios aps induo qumica de tumor em trs tempos diferentes. 24 hamsters srios machos e com cinco semanas de vida, divididos em trs grupos de oito animais cada, tiveram suas bolsas jugais direitas tratadas trs vezes por semana com dimetilbenzantraceno (DMBA) e duas vezes por semana com perxido de carbamida por 55, 70 e 90 dias, respectivamente cada grupo. A bolsa esquerda foi isenta de tratamento e considerada como controle. Posteriormente induo do tumor, cinco animais de cada grupo tiveram suas redes vasculares moldadas pela resina Mercox e analisadas em microscopia eletrnica de varredura (MEV). Os trs animais restantes de cada grupo tiveram suas bolsas preparadas para anlise em microscopia de luz (ML). Aps 55 dias de induo tumoral, todos os espcimes analisados por ML j apresentavam carcinoma de clulas escamosas na bolsa jugal tratada e este resultado se consolidou aos 70 e 90 dias de tratamento. O menor tempo necessrio para a induo tumoral comparado a estudos anteriores e o sucesso na produo do tumor em todos os animais submetidos ao tratamento foi correlacionado a ao do perxido de carbamida e ao enriquecimento ambiental empregado durante o experimento. Foi possvel concluir que o protocolo desenvolvido pode ser til anlise da angioarquitetura dos tumores em bolsas jugais de hamster srio. A tcnica de MEV possibilitou diferenciar vasos arteriais de venosos, como tambm replicar estruturas como esfncteres, bifurcaes, anastomoses e sugestionar a presena de sproutings. No estudo da bolsa jugal normal com ML foram evidenciadas trs tnicas: a tnica mucosa, a tnica muscular e a tnica adventcia. Quando analisadas por MEV, as replicas vasculares das bolsas controle apresentavam sua rede vascular composta por vasos paralelos ao seu maior eixo, conforme a fisiologia do rgo. Nas bolsas submetidas induo tumoral observou-se a formao de uma nova rede vascular, com a presena de vasos tortuosos e paralelos. Durante a progresso do tumor houve perda do paralelismo vascular e um aumento do calibre dos vasos. Estururas de angiognese tambm foram observadas. Palavras-chave: hamster srio, bolsa jugal, DMBA, perxido de carbamida, angioarquitetura, microscopia de luz, microscopia eletrnica de varredura, carcinoma de clulas escamosas.

1 INTRODUO

Todas as clulas dependem de oxignio e nutrientes para a sua sobrevivncia. Essa necessidade implica em que as clulas se encontrem prximas a capilares sangneos, a uma distncia que permita a difuso de oxignio (DANIEL; ABRAHAMON, 2000). A rede vascular basal insuficiente em situaes de aumento de consumo de oxignio e nutrientes, como por exemplo, no crescimento e na regenerao tecidual. Para ultrapassar o dficit nestas situaes, a vasodilatao, muitas vezes, no suficiente, sendo necessria a formao de novos vasos sangneos. O processo de formao de novos vasos a partir dos pr-existentes denomina-se, genericamente, angiognese (BECK JR.; DAMORE, 1997; DANIEL; ABRAHAMON, 2000). Sob circunstncias fisiolgicas controladas, a angiognese um processo normal e essencial. Entretanto, durante o processo de estabelecimento e propagao do cncer, a angiognese permite que o tumor produza sua prpria fonte de provimento sangneo para obter os nutrientes e o oxignio. Assim, o resultado uma rede de vasos adequada ao crescimento e a viabilizao de metstases (FOLKMAN, 1998). Fisiologicamente, este processo est presente no desenvolvimento embrionrio e no crescimento ao longo dos primeiros anos. Na idade adulta, observa-se no aparelho reprodutor feminino a cada ciclo menstrual, na gravidez, na cicatrizao de feridas e na seqncia de processos inflamatrios (POLVERINI, 2002; JAFFE, 2000). Clulas endoteliais, que normalmente permanecem quiescentes, com turnover entre os 1000 e 5000 dias, em determinadas circunstncias, emergem para estados de rpida proliferao, viabilizando a formao de novos vasos (DANIEL; ABRAHAMON, 2000; BECK JR.; DAMORE, 1997). Portanto, nas situaes em que h aumento das necessidades de oxignio e nutrientes, existe uma resposta fisiolgica do organismo que aumenta a densidade da rede capilar. Essa resposta minuciosamente regulada e tem uma durao limitada (POLVERINI, 2002; ZAKRZEWICZ; SECOMB; PRIES, 2002). H, porm, inmeras situaes patolgicas em que o processo persiste descontroladamente durante meses ou anos. O exemplo mais conhecido o do

tumor, em que a angiognese fundamental, para sustentar o crescimento tumoral e assim permitir a metastatizao (POLVERINI, 2002). Outros exemplos de desregulao da angiognese so citados, tais como as doenas inflamatrias intestinais, as doenas de neovascularizao ocular, a destruio de cartilagens na artrite reumatide, o desenvolvimento de placa aterosclertica, os hemangiomas infantis, a endometriose, a obesidade, entre outras (POLVERINI, 2002; GIBALDI, 1998; CARMELIET, 2005). Ocorrem tambm mltiplas situaes de processos isqumicos, onde til a formao de novos vasos que possam suprir o dficit de oxignio. Porm, muitas vezes, a proliferao vascular no suficiente perante as necessidades, como no caso da doena arterial perifrica, na coronariopatia, em patologias neurodegenerativas e em fraturas sseas (POLVERINI, 2002; GIBALDI, 1998; CARMELIET, 2003).

1.1 VASCULOGNESE VERSUS ANGIOGNESE

A vasculognese o processo iniciado precocemente na vida embrionria, que origina os vasos de grande calibre, a partir de precursores mesodrmicos, os angioblastos (RISAU; FLAMME, 1995). A vasculognese pode desempenhar um papel fundamental na organognese (MATSUMOTO et al., 2001). O termo angiognese muitas vezes empregado no seu sentido mais lato, como o mecanismo de proliferao de clulas endoteliais e musculares lisas para formar novos vasos sangneos. Em 1787, Hunter foi o pioneiro a usar o termo angiognese (crescimento de novos vasos sangneos) para descrever o crescimento de vasos sangneos semelhantes a galhos de rvore. Aps a formao dos grandes troncos vasculares, os vasos ramificam-se e distribuem-se numa rede vascular complexa (CARMELIET, 2000). Os vasos neoformados surgem a partir de vasos preexistentes e este processo mantm-se durante toda a vida do indivduo, respondendo sempre que necessrio a alteraes na demanda de oxigenao tecidual (SCOTT, 2000). Podem ser descritos dois mecanismos distintos de angiognese: a angiognsese por brotamento (RISAU, 1997) e a angiognse por intussuscepo (CADUFF et al., 1986).

A angiognese por brotamento consiste na proliferao das clulas endoteliais e o subseqente aumento do calibre do vaso, a que se segue a migrao de clulas para o lmen, subdividindo-se o vaso inicial em vrios vasos de menor calibre (RISAU, 1997). Outro mecanismo de angiognese a intussuscepo, e refere-se ao processo pelo qual um nico capilar se divide longitudinalmente em dois pela formao de um septo. Neste caso, as clulas endoteliais de lados opostos do vaso se estendem intraluminalmente at entrarem em contato formando um septo, levando ao surgimento de dois vasos (CADUFF et al., 1986). Ela ocorre quando o sistema capilar se expande dentro dele mesmo como, por exemplo, no crescimento do tipo intersticial no tecido cartilaginoso (CADUFF et. al., 1986).

1.2 REGULAO DA ANGIOGNESE

To importante quanto a proliferao vascular quando h aumento das necessidades de oxignio e nutrientes, a involuo deste processo, que ocorre aps a resoluo dessa demanda adicional, com a regresso dos vasos neoformados (SEMENZA, 2002). Desta forma, evitado que haja um aporte excessivo de oxignio que, alm de desnecessrio, poderia conduzir a estresse oxidativo e formao de radicais livres de oxignio, nefastos para os tecidos (SEMENZA, 2002). Nesse contexto inconstante, o mecanismo angiognico parece atuar como uma balana, em que, de um lado esto os ativadores, e do outro, os inibidores. do resultado deste balano que sobrevm um maior ou menor estmulo para a proliferao vascular. Em muitas patologias h desregulao desse balano, o que justifica a identificao de uma resposta em cascata visando ao restabelecimento da homeostasia (BERGERS; BENJAMIN, 2003).

1.3 PROMOTORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE

Citam-se como promotores endgenos da angiognese o fator de crescimento fibroblstico (Fibroblastic growth factors -FGF); o fator de crescimento vascular endotelial (Vascular endothelial growth factors -VEGF); o fator de

crescimento da clula endotelial derivado de plaqueta (Platelet-derived endothelial cell growth factor- PD-ECGF), os fatores de crescimento derivados de plaquetas, como as prostraglandinas, angiotensina e a heparina, e o fator de necrose tumoral alfa (Tumor necrosis factor - TNF ) (BRAT; VAN MEIR, 2001). Devido ao harmoniosa, complementar e coordenada destas molculas que se formam vasos funcionais (DANIEL; ABRAHAMON, 2000). Dentre as inmeras molculas indutoras da angiognese, se destaca o VEGF (CARMELIET, 2003). Embora tendo ao predominante na estimulao da angiognese, o VEGF forma apenas vasos imaturos, no funcionais e instveis (McMAHON, 2000). O VEGF foi primeiramente descrito como fator de permeabilidade vascular e se constitui em uma famlia de molculas mitognicas endoteliais, indutoras da angiognese in vivo (FRELIN et.al., 2000). O VEGF tem participao central na regulao da proliferao vascular, podendo ter sua expresso induzida ou reprimida conforme a oxigenao tecidual. Por exemplo, caso exista uma leso na pele, o organismo promove uma resposta imunitria local e inicia o processo de cicatrizao. Esses fenmenos aumentam as necessidades de oxignio e induzem a sntese do fator indutor de hipxia (Hypoxia Inducible Factor) em resposta hipxia, que aumenta a expresso do VEGF e estabiliza o seu RNA mensageiro (RNAm). Quando a ferida cicatrizada e existe um excesso de aporte de oxignio, estimula a sntese do fator indutor de hiperxia (Hyperoxia Inducible Factor), que inibe a expresso do VEGF e instabiliza seu respectivo RNAm (SEMENZA, 2002). Existem quatro isoformas principais do VEGF (VEGF-A), cada uma codificada por uma poro diferente do gene VEGF. So estas suas isoformas: VEGF121, VEGF165, VEGF189, e VEGF206. Embora estas isoformas se comportem identicamente em soluo, elas diferem na sua capacidade de ligao heparina e matriz extracelular (RINI; SMALL, 2005). As Angiopoietinas (Ang) so uma famlia de duas molculas (Ang1, Ang2) que se ligam ao mesmo receptor, o TK. A Ang1 induz as clulas endoteliais a liberarem fatores de crescimento que promovem a associao aos pericitos e s clulas musculares lisas, incorporando-se aos vasos (JONES et al., 2001). A Ang2, ao ligar-se ao TK, inibe a ao da Ang1, resultando uma instabilizao vascular que leva ao afastamento dos pericitos e clulas musculares

lisas. Por ao da Ang2, obtido um tubo endotelial (estrutura tubular revestida por clulas endoteliais que ainda no formam um vaso maduro) que, na presena de VEGF, aumenta a angiognese e, na sua ausncia, conduz apoptose das clulas endoteliais e regresso vascular (JONES et al., 2001). A Efirina-B2 e a Ang1 so essenciais na maturao vascular, sabendo-se hoje que a Efirina- B2 particularmente importante na diferenciao arterial ou venosa dos vasos imaturos (YANCOPOULOS; KLAGSBRUN; FOLKMAN, 1998). A Ang1 essencial para a estabilidade vascular. A interrupo desse sinal estabilizador coincide com o reincio da angiognese, mediada por um antagonista da Ang1, a Ang2, que uma secreo autcrina do endotlio. Esse processo ocorre primariamente no desenvolvimento estrutural, sendo reativado na angiognese do adulto (aparelho reprodutor feminino, na cicatrizao de feridas, em tumores, entre outros) (ELLIS et.al., 2002). J os fatores de crescimento fibroblstico (Fibroblast Growth Factors - aFGF e bFGF), potentes moduladores da proliferao celular, motilidade e diferenciao no so especficos quanto a sua atuao sobre as clulas endoteliais pois atuam tambm em fibroblastos, clulas musculares lisas e neurnios (GERWINS; SKOLDENBERG; CLAESSON-WELSH, 2000). Desempenham um papel central na iniciao do processo angiognico (CHEN, J.; FOROUGH, R., 2006). Os fatores aFGF1 e bFGF2, devido sua potente ao mitognica e atividade pr-migratria, tm a capacidade de induzir alteraes metablicas e fenotpicas na clula endotelial que so necessrias para estimular a angiognese (CHEN, J.; FOROUGH, R., 2006). So fatores que merecem destaque, j que so protenas angiognicas mais potentes in vivo. Em conjunto com a Ang2, tornam-se mais especficos: a Ang2, ao repelir as clulas musculares, potencializa a sua ao nas clulas endoteliais. Estes fatores tem duas origens principais: a matriz extracelular, onde est armazenado, sendo mobilizado por proteinases e heparinases e os macrfagos ativados (GERWINS; SKOLDENBERG; CLAESSON-WELSH, 2000). Existem nveis anormalmente elevados de bFGF no soro e urina de indivduos com diversos tipos de tumor, e no lquido cfalo-raquidiano de doentes com vrios tipos de tumores cerebrais (REYNOLDS; REDMER, 1998).

H ainda um fator que pela sua sntese muito especfica por parte da placenta ao longo da gravidez, adquiriu o nome de fator de crescimento da placenta (placental inducible growth factor- PIGF). Suas aes so semelhantes s do VEGF, porm mais potentes, sendo importante na gravidez (SMITH et al., 2000). Os principais receptores que parecem envolvidos nas cascatas de transduo de sinal em resposta ao VEGF so uma famlia de receptores tirosinaquinase com trs membros: VEGFR-1, VEGFR-2 e VEGFR-3. Paralelamente, esto identificados alguns receptores acessrios, as neurofilinas, que modulam a ligao aos receptores principais. O VEGFR-2 o principal mediador nos efeitos do VEGF no crescimento e permeabilidade dos vasos. J o VEGFR-1 pode ter um papel negativo, suprimindo a sinalizao pelo VEGFR-2 (BERNATCHEZ et al, 1999). O VEGFR-3, que est presente essencialmente nos vasos linfticos e parece levar proliferao destes, tem grande afinidade pelo VEGF-C (SHIBUYA et. al., 2001).

Membros da famlia do VEGF

Receptores VEGFR-1, VEGFR-2, neuropilina-1. VEGFR-1 VEGFR-2, VEGFR-3 VEGFR-2, VEGFR-3 VEGFR-2 VEGFR-1, neuropilina-1

Funo Angiognese, manuteno vascular A estabelecer Linfangiognse Linfangiognse Angiognese Angiognese e inflamao

VEGF (VEGF-A)
VEGF-B

VEGF-C VEGF-D VEGF-E (fator viral) *PIGF

Quadro 1 - Promotores angiognicos VEGF e seus receptores *PIGF: fator de crescimento da placenta Fonte: GENENTECH, BIONCOLOGY Disponvel em: <http://www.researchvegf.com/researchvegf/ligand/vegf/index.m>

1.4 INIBIDORES ENDGENOS DA ANGIOGNESE

Inibidores endgenos da angiognese so molculas cuja sntese laboratorial est em franca expanso, estando identificadas inmeras aplicaes teraputicas (FERRARA; KERBEL, 2005). A angiostatina, endostatina, fator plaquetrio 4, prolactina,

trombospondina, os inibidores teciduais de metaloproteinase 1, 2, 3 (tissue inhibitor of metalloprotenase 1-TIMP-1, tissue inhibitor of metalloprotenase 2-TIMP-2, tissue

inhibitor of metalloprotenase 3-TIMP-3) so protenas inibidoras da angiognese (BRAT; VAN MEIR, 2001). Entre as molculas mais importantes salientam-se a angiostatina, a endostatina e a antitrombina III (REYNOLDS; REDMER, 1998). Vrios ensaios clnicos demonstraram que certos tumores poderiam produzir inibidores angiognicos (CARMELIET, 2003). Esse fenmeno explicaria porque, em certas cirurgias, aps a remoo do tumor principal (carcinomas do clon e da mama e sarcomas osteognicos), havia rpido desenvolvimento de metstases distncia (FOLKMAN, 2006). Soff (2000) relatou que os fatores inibidores provinham da ao enzimtica de metaloproteinases em protenas comuns. Assim, a angiostatina resulta da degradao do plasminognio e a endostatina, do colgeno XVIII. De acordo com o autor, ambas as molculas, reconhecidamente importantes na inibio do processo angiognico, esto sendo usadas em mltiplos ensaios clnicos na rea da oncologia.

1.5 ANGIOGNESE NO TUMOR

Para se analisar o crescimento tumoral deve-se supor que no tumor coexistam dois compartimentos celulares que se estimulam mutuamente: o compartimento das clulas endoteliais e o compartimento das clulas tumorais (BERGERS; BENJAMIN, 2003). A existncia de hiperemia tumoral tornou-se conhecida h cerca de dois sculos, durante as intervenes cirrgicas (FOLKMAN, 2006). Contudo, at 1970 o fato era explicado pela dilatao dos vasos sanguneos preexistentes, como resultado do processo inflamatrio que acompanhava o tumor. No incio da dcada de 70, surgiu a hiptese de que os tumores poderiam recrutar o seu prprio aporte sanguneo atravs da produo e liberao de molculas estimuladoras da formao de novos vasos sanguneos. Essa hiptese foi aceita com ressalvas. Somente aps a introduo da cultura de clulas endoteliais, da purificao de protenas angiognicas, e do advento da biologia molecular, foi possvel a sua confirmao (McDONNELL et al., 2000).

Sabe-se atualmente que a maioria dos tumores humanos surge sem atividade angiognica, mantendo-se, microscopicamente, como neoplasias in situ durante meses e anos (CARMELIET, 2005). Ao longo deste tempo, somente uma pequena porcentagem adquire fentipo angiognico, que lhe permite crescimento e metastizao (McDONNELL et al., 2000; KIRSCH et al, 2000). Na maioria dos tumores humanos, o fentipo maligno histologicamente reconhecvel precede o fentipo angiognico (BERTRAM, 2001). Clinicamente, a migrao para a condio angiognica reconhecida pela rpida expanso da massa tumoral para dimenses detectveis, hemorragias locais e metastizao. No caso da metastizao, a angiognese necessria no incio e ao final (KIRSCH et al., 2000; ZETTER, 1998). Em animais experimentais, foi observado que antes da neovascularizao raramente eram encontradas clulas tumorais em circulao, sendo as metstases virtualmente inexistentes (ZETTER, 1998). Quando ocorre a neovascularizao, a metastizao surge de imediato e de maneira proporcional vascularizao (KIRSCH et al., 2000; ZETTER, 1998). Por outro lado, as metstases que subsistem distncia, tornam-se detectveis aps desenvolverem vascularizao prpria, pois de outra forma, mantm-se indefinidamente quiescentes (KIRSCH et al., 2000; ZETTER, 1998). Comprovada a importncia da angiognese no desenvolvimento tumoral, particularmente no processo de metastizao, os frmacos inibidores da angiognese apresentam-se como uma arma teraputica no tratamento de vrias neoplasias, quando combinados com a quimioterapia, resultando em um aumento de sobrevida nos pacientes com tumores malignos avanados (CARMELIET, 2003) Mesmo que no seja obtida a cura, estes frmacos podem viabilizar o controle da doena (ZETTER, 1998; FERRARA; KERBEL, 2005; BALUK et al., 2005). O uso de frmacos inibidores da angiognese tem inmeras vantagens em comparao quimioterapia convencional. Os agentes citostticos, sustncias citotxicas utilizadas especificamente para causar um dano celular, no so seletivos para as clulas tumorais, sendo inespecficos, acabam por destruir tambm clulas no neoplsicas, constituindo um entrave ao aumento das doses e so responsveis pelos seus inmeros efeitos adversos (GOODMAN; GILMAN, 2006). Acrescenta-se ainda, que as clulas tumorais so geneticamente instveis, com elevado ndice de mutaes, o que conduz muitas vezes resistncia a drogas

inicialmente eficazes (CARMELIET, 2005). provvel que mantenham sensibilidade terapia antiangiognica, sendo as clulas endoteliais geneticamente estveis e com baixo ndice de mutao, comparadas s clulas tumorais e outras clulas somticas (FERRARA; KERBEL, 2005). Os citostticos clssicos podem comear a ser usados de maneira diferente como na aplicao de doses menores, ao longo de um tempo maior, embora exera menos efeito no tecido tumoral, consegue inibir a diviso das clulas endoteliais, reprimindo a angiognese (KERBEL; KAMEN, 2004). Dessa forma, evita-se o crescimento e a metastizao do tumor. Esse tambm o princpio da radioterapia fracionada, que utiliza o aumento da freqncia das exposies com doses menores (PUDUVALLI; SAWAYA, 2000). Tem-se estudado esquemas combinados dos vrios frmacos disponveis, com o objetivo de inibir as vrias etapas do desenvolvimento tumoral e aproveitar o efeito sinrgico das drogas (PUDUVALLI; SAWAYA, 2000). A utilizao da densidade microvascular como indicador prognstico tem sido alvo de inmeros estudos (BERGERS; BENJAMIN, 2003). Porm, h ainda relativo desconhecimento quanto integrao das mltiplas cascatas angiognicas e anti-angiognicas, sendo difcil especular sobre o prognstico da evoluo tumoral em funo da maior ou menor vascularizao (MAcDONALD et al., 2002).

1.6 MODELO ANIMAL

O hamster dourado ou srio Mesocricetus arautus, um roedor da famlia Cricetidae. Os hamsters dourados silvestres ocorrem em uma faixa de rea limitada do Oriente Mdio, na Sria, onde so chamados pelo equivalente arbico de possuidores de bolsas para carregar, em virtude de suas bolsas faciais (HARKNESS; WAGNER, 1993). Estes animais vivem em profundas galerias, onde estocam grandes quantidades de gros, apresentam cauda curta quando comparada com a de ratos Wistar e so pequenos (cerca de 100g de peso). So conhecidos pelo curto perodo de gestao, fcil domesticao, presena de bolsas faciais, tolerncia imunolgica e pela grande habilidade em escapar do confinamento (HARKNESS; WAGNER, 1993). Em laboratrio alimentam-se com rao peletilizada ou dieta para roedores

com alto teor de protenas e geralmente permanecem saudveis e ativos durante sua vida. Os hamsters possuem tempo de vida que varia entre 18 e 24 meses, entretanto, animais mais idosos tambm podem ser observados (HARKNESS; WAGNER, 1993). Os hamsters apresentam alto grau de tolerncia imunolgica a transplantes homlogos e heterlogos de tecidos normais ou neoplsicos (BILLINGHAM, et al., 1960). So animais com sistema imune ntegro, possuindo um local de privilgio imunolgico natural nas suas bolsas jugais (LEMON et.al., 1952). As bolsas servem ao hamster como meio de estocagem de alimentos e ao homem como um stio de privilgio imunolgico para uso em pesquisa, j que so facilmente acessveis para induo de tumor. As bolsas jugais ou faciais so divertculos bilaterais das mucosas jugais, altamente distensveis que se estendem, sob a pele, da extremidade posterior da comissura labial at aproximadamente ao nvel das escpulas do animal. O epitlio da parede da bolsa similar pele humana, sendo denominado pele sem folculos e glndulas (DULING, 1973). A bolsa, ao ser evertida, assume um aspecto sacular. Apresenta camadas basal, espinhosa, granular e crnea com queratincitos, similar epiderme e epitlio da gengiva ou palato duro humano (WHITE et. al., 1982). As camadas de clulas epiteliais apiam-se em tecido conjuntivo frouxo, naturalmente imunodeficiente e aparentemente com ausncia de vasos linfticos, exceto na regio proximal, onde se inserem as fibras do msculo retrator da bolsa (GOLDENBERG; STEINBORN, 1970). A bolsa jugal do hamster um excelente stio para o estudo de carcinoma da mucosa oral porque susceptvel a modificaes por uma variedade de influncias locais e sistmicas (GIJARE et al., 1990), sendo um dos modelos

usados nas pesquisas de cncer oral (SALLEY, 1954; EVESON, 1980; MOGNETTI

et al., 2005).

1.7 AGENTES CARCINOGNICOS

1.7.1 9,10 dimetil benzatraceno (DMBA) O composto 9,10 dimetil

benzatraceno

(DMBA),

agente

carcinognico iniciador, induz uma transverso no par de bases adenina-timina (A-T) na segunda posio do cdon 61 do gen ras, sendo esta mutao freqentemente identificada em carcinomas de clulas escamosas (SAM; WATT, 2006). Em 1954, Salley relatou que aplicaes de um ou vrios hidrocarbonetos policclicos podem induzir a carcinoma de clulas escamosas na mucosa de hamster. O autor aplicou DMBA dissolvido em ter e este se apresentou como um carcinognico efetivo na induo de tumores aps 16 semanas. O autor descreveu 4 estgios histologicamente reconhecveis na mucosa, que vo desde hiperplasia, papiloma, carcinoma in situ, at carcinoma de clulas escamosas. Morris (1961) relatou que o epitlio da bolsa jugal de hamsters idosos apresentaram maior resistncia ao do DMBA do que animais jovens. O autor relatou que: cinco semanas, o tempo necessrio para iniciar as anlises de carcinogsese experimental. A carcinognese na bolsa jugal de hamster provavelmente o sistema animal mais comparvel com o desenvolvimento de pr-malignidade e malignidade do cncer bucal humano. Alm disso, o autor definiu que 0,5% de DMBA em soluo de acetona, produz o efeito mximo de neoplasia, com o mnimo de perodo de latncia e sem morbidade. Morris (1961) padronizou o procedimento, de tal modo que a leso experimental pde ser reproduzida posteriormente. O DMBA 0,5% induz uma resposta hiperplsica no epitlio da bolsa aps poucas aplicaes, constatando-se pela aparncia de variedades de leses displsicas parecidas com leses pr-malignas humanas, aps seis a oito semanas de tratamento (SANTIS et al., 1964). Tumores benignos e malignos, leses papilomatosas e carcinomas, especificamente de clulas escamosas comeam a ser evidenciados aps algumas semanas de tratamento (SANTIS et al., 1964). Contudo, estgios de carcinognese (iniciao, promoo, progresso) no tm sido bem definidos (GIMENEZCONTI; SLAGA, 1993).

Lin et al. (1996) obtiveram 100% de incidncia de tumor na bolsa jugal de hamster aps aplicao de DMBA trs vezes por semana por oito semanas consecutivas. A maior vantagem da aplicao do DMBA neste modelo animal a similaridade entre a mucosa da bolsa jugal do hamster e a mucosa oral mastigatria humana. Alm disso a ausncia de induo de carcinomas espontneos, desenvolvimento de leso displsica comparvel com a leucoplasia humana oral e a suceptibilidade do sistema de tumor a influncias sistmicas como vitaminas, hormnios e vrias drogas (SHKLAR et al., 1979). Outra caracterstica desse modelo est na possibilidade de acompanhamento macroscpico da evoluo do tumor, em tempos diferentes aps o tratamento, pela simples everso da bolsa, e o mesmo tambm permite delimitao dos stios onde est sendo induzida a leso (KREIMANN et al., 2001). A maior desvantagem do modelo experimental em bolsa jugal de hamster o procedimento intensivo laboratorial, em adio ao extensivo manuseio do animal com o carcingeno. No modelo clssico de Salley (1954) e no modelo modificado de Lin et al. (1996), o animal manuseado, no mnimo, 48 vezes durante a induo do tumor.

1.7.2 Perxido de Carbamida O perxido de carbamida, um agente promotor da carcinognese, pode ser encontrado comercialmente nas concentraes de 10%, 11%, 15%, 16% e 35% em anidro glicerol ou glicerina (CH4N2O-H2O2) (DISHMAN; BAUGHAN, 1992; FASANARO, 1992; KWONG et al., 1993; McGUCKIN; MEYER, 1992). tambm conhecido como perxido de uria, perxido de hidrognio-uria, perxido de hidrognio-carbamida ou peridrol-uria; sendo muito utilizado na tcnica caseira de clareamento de dentes vitais (DARNELLA; MOORE, 1990; FASANARO, 1992; HAYWOOD; HEYMANN, 1989). O perxido de carbamida nas concentraes mais usadas uma substncia instvel e quando em contato com a saliva se dissocia em 3,6% a 5% de perxido de hidrognio e 6,4% a 7% de uria (FASANARO, 1992; HAYWOOD, 1992; HUMMERT et al., 1993). O perxido de hidrognio presente no perxido de carbamida, por sua vez, se dissocia em oxignio e gua, quebrando-se

posteriormente e liberando radicais livres; a uria dissocia-se em amnia e dixido de carbono (HAYWOOD; HEYMANN, 1989; HAYWOOD et al., 1990; FASANARO, 1992; HAYS et al., 1995). O perxido de hidrognio o princpio ativo do perxido de carbamida (NAIK, et al., 2006). A presena de radicais livres originrios da quebra do perxido de hidrognio pode ser nociva pelo fato de que, os nions superxidos e os ons hidroxila liberados so radicais oxidantes altamente reativos e txicos, um vez que agem diretamente nos componentes vitais das clulas, onde podem danificar membranas celulares, alterar o DNA e as protenas, podendo causar mutaes (CHERRY et al., 1993; IMLAY; LINN, 1988; POWELL; BALES, 1991). Sabe-se, porm, que o organismo possui mecanismos de defesa bioqumicos e mecanismos de reparo intracelulares que reagem com os radicais livres inativando-os, como o caso de sistemas enzimticos que controlam o ciclo celular (FRIDOVICH, 1978). Ito et al. (1981) avaliaram a induo de tumores duodenais em ratos pela administrao de perxido de hidrognio. A soluo de perxido de hidrognio foi adicionada na gua destilada para beber, nas concentraes de 0,1% e 0,4%. Os autores verificaram que os grupos de 0,1% e 0,4% de diluio apresentaram alta incidncia de hiperplasia duodenal com ndices de 40% e 62% respectivamente. Adenoma duodenal foi encontrado em 5% dos ratos, no grupo em que foi administrada a concentrao de 0,4%, e em 1% dos animais, no grupo em que foi administrada a concentrao de 0,1%. Eroses gstricas surgiram aps 40 semanas; hiperplasia duodenal, aps 10 semanas e carcinomas duodenais em 65 semanas. Os autores concluram que o perxido de hidrognio pode ter dupla funo na formao de ndulos duodenais, ampliando a ocorrncia espontnea de hiperplasia duodenal e transformando ndulos hiperplsicos em neoplsicos. Weitzman et al. (1984), discutiram a possibilidade dos metablitos do perxido de hidrognio danificarem o DNA das clulas e causarem mutaes. Os autores alertaram para os perigos da administrao crnica do perxido de hidrognio no tratamento de doenas gengivais, pois a exposio constante pode levar a alteraes indesejveis nos tecidos. As clulas so danificadas quando expostas a altas concentraes de oxidantes. A

preocupao que os perxidos possam aumentar a expresso de tumores por outros carcingenos do meio ambiente (WEITZMAN et al.,1984). O tumor, para se manifestar, pode demorar anos ou dcadas em humanos (WEITZMAN et al.,1984). Weitzman et al. (1986), avaliaram o efeito carcinognico do perxido de hidrognio no modelo de carcinognese qumica bucal induzida em hamster. Os animais foram divididos em 4 grupos, sendo que o grupo I recebeu DMBA; o grupo II recebeu DMBA e perxido de hidrognio 3%; o grupo III recebeu DMBA e perxido de hidrognio 30%; e o grupo IV recebeu perxido de hidrognio 30%. A concentrao de DMBA foi de 0,25% em leo mineral. As bolsas jugais do hamster foram pinceladas duas vezes por semana com os carcingenos, e o sacrifcio foi realizado aps 19 e aps 22 semanas. Foi observada a presena de queratose e hiperplasia em mais de 85% dos animais em todos os grupos aps 19 semanas. Aps 22 semanas, os animais do grupo I apresentaram carcinomas epidermides em trs de sete animais; no grupo II, seis de 11 animais desenvolveram carcinomas em 22 semanas e todos os animais do grupo III desenvolveram carcinomas invasivos. No grupo IV, os animais no desenvolveram carcinomas, porm, apresentaram mudanas associadas a leses pr-neoplsicas, incluindo hipercromatismo de clulas e displasia mdia. Os resultados sugeriram uma ao co-carcinognica do perxido de hidrognio no modelo analisado e este, isolado ou associado, provocou mudanas pr-neoplsicas e aumentou a atividade mittica e hiperplsica.

1.8 TCNICA DE MODELO DE CORROSO VASCULAR

A tcnica de modelo de corroso vascular associada MEV tem sido aplicada no estudo do padro vascular de rgos e tecidos normais, de processos patolgicos e de estruturas em desenvolvimento WEIGER, 1990;

(LAMETSCHWANDTNER;

LAMETSCHWANDTNER;

DERUITER et al., 1991). Os modelos vasculares desses rgos e tecidos so obtidos pela modelagem do lmen dos vasos com resina de baixa viscosidade, seguida pela corroso com soluo alcalina, do tecido circunjacente resina

polimerizada (WEEKES; SIMS, 1986; HODDE; STEEBER; ALBRECHT, 1990; OHTA et al., 1992; SUGIOKA; IKE, 1993; PIETTE; LAMETSCHWANDTNER, 1994; SELLISETH; SELVIG, 1995b; KRONKA; WATANABE; SILVA, 2001; VERLI, F.D. et al, 2007). O modelo de corroso vascular fornece a angioarquitetura da estrutura anatmica (AHARINEJAD; BCK, 1994), sendo que alguns dos aspectos morfolgicos observados so: o arranjo tridimensional da

vascularizao, o dimetro vascular, a impresso dos ncleos das clulas endoteliais na superfcie do modelo vascular, bem como o trajeto das arterolas e vnulas que compem a estrutura avaliada (HOSSLER; DOUGLAS, 2001). A moldagem realizada com resina Mercox (Mercox CL 2RB, Ladd Research Industries, Burlington, VT), material de moldagem vascular base de metilmetacrilato, bastante utilizado nas pesquisas de modelo de corroso vascular (KOGUSHI et al., 1988; OHSHIMA; YOSHIMA; KOBAYASHI, 1990; AHARINEJAD; BCK, 1994; NINOMIYA, 2000; VERLI, F.D. et al, 2007) . Aps a moldagem, realizada a corroso, que a dissoluo dos tecidos circunjacentes moldagem, utilizando solues de hidrxido de sdio (NaOH) e hidrxido de potssio (KOH), associadas ou no a detergentes em diferentes concentraes (HODDE; STEEBER; ALBRECHT, 1990;

LAMETSCHWANDTNER; LAMETSCHWANDTNER ; WEIGER, 1990). Aps corroso dos espcimes, estes sofrem tratamento condutivo, que consiste no revestimento dos espcimes com uma camada metlica (metalizao). Com a adio desta camada, h conduo de eltrons sobre as superfcies dos espcimes e a produo de eltrons capazes de gerar sinal suficiente para a formao da imagem em MEV (LAMETSCHWANDTNER; LAMETSCHWANDTNER; WEIGER, 1990; BELZ; AUCHTERLONIE, 1995). As eletromicrografias de varredura de arterolas, vnulas, artrias, veias e alas capilares obtidas pela tcnica de corroso vascular fornecem imagens tridimensionais individualizadas dessas estruturas. Essas imagens proporcionam informaes especficas dos modelos vasculares como dimetro vascular e a impresso das clulas na superfcie dos modelos (HODDE; STEEBER; ALBRECHT, 1990; KONERDING, 1991). A anlise dos modelos de corroso vascular principalmente descritiva (KONERDING, 1991).

5.6 CONCLUSO

O entendimento da morfologia da microcirculao tem um papel importante na compreenso dos fenmenos fisiolgicos e fisiopatolgicos de todos os sistemas orgnicos.