Resumen:

La cuantificacin de protenas ya sea de tejido (en este caso de camarn) o de levadura es un

proceso ya muy estudiado que conlleva diversas tcnicas ya sea mtodos fsicos mecnicos,
mtodos fsicos no mecnicos y mtodos qumicos. En esta prctica se realizaron distintas
tcnicas que nos permitieron analizar desde un punto de vista cualitativo y cuantitativo, el
contenido proteico de nuestras muestras biolgicas. La cuantificacin de protena se llev acabo
en tres pasos, primero se realiz una extraccin de protena por medio de una disrupcin
mecnica para que despus se llevara a cabo una cuantificacin de la concentracin proteica
utilizando tres mtodos para este caso como lo son: el mtodo Biuret, Bradford y Lowry. Para cada
uno de mtodos anteriormente mencionados se les realizo una curva estndar midiendo su
absorbancia en un espectrofotmetro. Se realiz la cuantificacin de dos muestras problema
(Tejido de camarn y levadura) a las cuales se les hicieron las tres pruebas. Por ltimo se realiz
una electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) que sirvi para la purificacin, anlisis y
caracterizacin de protenas ya que esta tcnica permite separar molculas cargadas y explota
diferencias en movilidad cuando se les somete a la accin de un campo elctrico.
Introduccin:
Las protenas son polmeros de alfa-aminocidos estas desempean una amplia variedad de
funciones esenciales en los mamferos. Entre las funciones dinmicas se encuentra la catlisis de
las transformaciones qumica, el transporte, el control metablico y la contraccin. En cuanto a sus
funciones estructurales, las protenas proporcionan la matriz para los tejidos seo y conjuntivo
que dan estructura y forma al organismo humano (1).
La extraccin de protenas es una etapa clave en el estudio de proteomica. Un mtodo de
extraccin ideal es aquel que permite obtener el mayor nmero y mayor cantidad de protenas
posibles de forma que se puedan detectar y a la vez no genere artefactos de modificacin post-
extraccin. No existe un protocolo universal que permita extraer todas y cada una de las
protenas, teniendo en cuenta el elevado nmero de especies proteicas (de decenas a cientos de
miles) (2).
Los organismos de las cueles se obtuvieron las protenas fueron camarn y levadura
saccharomyces cerevisiae. En el camarn podemos encontrar la morfologa de s cuerpo se divide
en tres partes: cefalotrax, abdomen y telson. La parte en la que se extrajo nuestra muestra fue el
musculo este est constituido por protenas las cuales estn distribuidas a lo largo del mismo, y
estas pueden ser de 3 tipos: sarcoplasmaticas, estromales, y miofibrilares siendo estas ltimas de
mayor inters debido a que son las que se relacionan principalmente con la calidad del pescado y
mariscos mediante la congelacin y la conservacin (3).Para la levadura Saccharomyces cerevisiae
es un hongo ascomiceto que ha sido ampliamente estudiado dada su importancia en la industria
panadera y vitivincola, as como porsu capacidad de producir etanol.
La extraccin de protenas celulares comienza siempre con una ruptura celular o lisis. Los mtodos
ms utilizados se basan esencialmente en la homogenizacin de los tejidos y la destruccin de los
lmites celulares por medio de diferentes procedimientos fsicos y/o qumicos, obtenindose lo
que se denomina extracto crudo. Los objetivos a lograr en esta etapa son maximizar la liberacin
de las protenas de inters, evitando la degradacin trmica o las alteraciones secundarias por
oxidacin, protelisis, etc. Se han desarrollado una amplia gama de tcnicas de disrupcin celular,
que se usan a escala de laboratorio que se pueden clasificar como: a) mtodos fsicos mecnicos:
agitacin con abrasivos, homogeneizacin a alta presin o extrusin por presin; b) mtodos
fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacin descongelacin, sonicaacin o secado;
c) mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes, cidos o sustancias
caotrpicas. Luego de la lisis, suelen aplicarse sucesivos pasos de separacin y purificacin de los
componentes celulares. Como primera medida, puede realizarse una centrifugacin diferencial
para obtener fracciones subcelulares. En este caso, las protenas asociadas a membrana quedarn
en el pellet (precipitado que queda en el fondo del tubo luego de una centrifugacin) y las solubles
en el sobrenadante (4).
Para determinar concentracin de protenas totales se realiza una curva de calibracin
utilizando una protena estndar, cuya concentracin es conocida. Los ensayos colorimtricos
que ms se utilizan son:
Ensayo de biuret (550nm): la reaccin de biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la
formacin de un complejo Cu++ en medio alcalino en compuestos que poseen ms de un grupo
CO-NH.
Ensayo lowry (750nm): se trata de una reaccin en dos fases: en una primera se practica una
reaccin parecida a la de biuret y en la segunda se trata el sistema mediante el reactivo de fenoles
de folin-Ciocalteu. Esta segunda fase desarrolla un color azul obscuro y se debe a la presencia en la
protena de aminocidos aromticos, particularmente tirosina y triptfano.
Ensayo de Bradford (595nm): el mtodo de Bradford se fundamenta en la fijacin del colorante
azul de coomassie (fast blue B) a las protenas, dando lugar a un cambio en el color que puede ser
medido en el espectrofotmetro. (5)
Para la separacin de las protenas se puede utilizar el mtodo de ELECTROFORESIS SDS-PAGE: SDS
es el detergente anionico dodecil sulfato sodicco; PAGE es el acrnimo de polyacrylamide gel
electrophoresis. Se trata de un procedimiento de electroforesis en el cual el desplazamiento de la
protena en el medio electrofortico inducido por un campo elctrico es una funcin inversa (no
necesariamente lineal) a su peso molecular. Para ello la preparacin de la protena cuyo peso
molecular queremos conocer se calienta en presencia de SDS antes de la electroforesis y es as
mismo tratada con mercaptoetanol o ditiotenol para romper los enlaces disulfuro. Con este
procedimiento la protena se desnaturalizan pero continua en solucin gracias al detergente cuyas
molculas se agregan a la protena desnaturalizada y debido a su carga elctrica negativa dotan a
esta de una densidad uniforme de carga, ya que la molcula de SDS se fija a la protena
desnaturalizada en una relacin de una molcula de SDS por cada dos aminocidos. Todas las
protenas presentes en la preparacin adquieren as la misma densidad de carga elctrica (5).
Metodologa:
Extraccin de protena soluble
Primero se realiz la extraccin de levadura: en un tubo eppendorf se coloc 1 mL de extracto
de levadura, 200 L de buffer Tris 50 mM pH 8.2 y una tercera parte de su contenido en perlas
de vidrio, enseguida el contenido fue homogenizado constantemente durante 8 lapsos de 1
minuto, teniendo cuidando de que la muestra en cada lapso reposara en un recipiente helado,
durante otro minuto terminando este tratamiento se le realizo a nuestra muestra una
centrifugacin a 13000 RPM durante 5 minutos por dos tiempo esto para que l muestra no se
calentara demasiado. Despus se prepar un micro extracto de protena con tejido de
camarn, cortando el tejido con un bistur en fragmentos muy pequeos, posteriormente el
tejido fue colocado en un tubo eppendorf con 200 L de buffer Tris 50 mM pH 8.2 y un tercera
parte de su contenido en perlas de vidrio, enseguida el contenido fue homogenizado
constantemente durante 8 lapsos de 1 minuto, teniendo cuidando de que la muestra en cada
lapso reposara en un recipiente helado, durante otro minuto terminando este tratamiento se
le realizo a nuestra muestra una centrifugacin a 13000 RPM durante 5 minutos por dos
tiempo esto para que l muestra no se calentara demasiado.
Cuantificacin de protenas:
Curva estndar. Mediante el mtodo de Bradford.
Primero se prepar una solucin stock de albumina srica bovina (ABS fraccin V) con una
concentracin de 1 mg/mL, enseguida se realizaron 10 diluciones con albumina y agua
destilada a concentraciones diferentes. La primer dilucin fue de 1000 L de agua destilada
con 0 L de solucin stock, la segunda dilucin fue de 980 L de agua destilada con 20 L de
solucin stock, la tercera dilucin fue de 960 L de agua destilada con 40 L de solucin stock,
la cuarta dilucin fue de 940 L de agua destilada con 60 L de solucin stock, la quinta
dilucin fue de 920 L de agua destilada con 80 L de solucin stock, la sexta dilucin fue de
900 L de agua destilada con 100 L de solucin stock, la sptima dilucin fue de 850 L de
agua destilada con 150 L de solucin stock, la octava dilucin fue de 800 L de agua destilada
con 200 L de solucin stock, la novena dilucin fue de 750 L de agua destilada con 250 L
de solucin stock y la dcima dilucin fue de 500 L de agua destilada con 500 L de solucin
stock. De estas 10 disoluciones, se tomaron 200 L de cada una y se colocaron por separado
en 10 tubos eppendorf, enseguida se les coloco a cada tubo 0.8 mL de reactivo de Bradford y
se mezclaron con cuidadosamente, enseguida estas muestras se incubaron a temperatura
ambiente durante 5 minutos para despus realizar la lectura de las mismas en un
espectrofotmetro (Bio-Rad, SmartSpec Plus) a una longitud de onda de 595 nm en celdas de
1 mL, para obtener sus absorbancias.
Cuantificacin de protena. Mediante el mtodo de Bradford
Con extracto inicial de protena obtenido del tejido camaron, se tomaron 10 L y se colocaron
en un tubo eppendorf, despues, se le adicionaron 990 L de agua destilada y se mezcl con
cuidado. De los 1000 L de la mezcla anterior se tomaron 200 L y se colocaron en un tubo
eppendorf al cual se le agreg 1 mL de reactivo de Bradford. El contenido anterior fue
colocado en una celda para posteriormente ser ledo en un espectrofotmetro (Bio-Rad,
SmartSpec Plus) a una longitud de onda de 595 nm y obtener su absorbancia. Lo mismo se
realiz con el extracto de levadura.



Curva estndar. Mediante el mtodo de Lowry.
Primero se prepar una solucin stock de albumina srica bovina (ABS fraccin V) a una
concentracin de 1 mg/mL, enseguida se realizaron 10 diluciones con albumina y agua
destilada a concentraciones diferentes. La primera dilucin fue de 1000 L de agua destilada
con 0 L de solucin stock, la segunda dilucin fue de 980 L de agua destilada con 20 L de
solucin stock, la tercera dilucin fue de 960 L de agua destilada con 40 L de solucin stock,
la cuarta dilucin fue de 940 L de agua destilada con 60 L de solucin stock, la quinta
dilucin fue de 920 L de agua destilada con 80 L de solucin stock, la sexta dilucin fue de
900 L de agua destilada con 100 L de solucin stock, la sptima dilucin fue de 850 L de
agua destilada con 150 L de solucin stock, la octava dilucin fue de 800 L de agua destilada
con 200 L de solucin stock, la novena dilucin fue de 750 L de agua destilada con 250 L
de solucin stock y la dcima dilucin fue de 500 L de agua destilada con 500 L de solucin
stock. De estas 10 disoluciones, se tomaron 200 L y se colocaron por separado en 10 tubos
eppendorf, enseguida se les coloco a cada uno de los tubos 1 mL de solucin D (de trabajo:
carbonato de sodio [Na2CO3] 3% en NaOH 0.2 N, sulfato de cobre [Cu2SO4] 2% y tartato de
sodio [Na] y potasio [K] 4%), se mezclaron con cuidado. Las muestras anteriores se incubaron
a temperatura ambiente durante 10 minutos, ensgida se les agreg 100 L de reactivo de
Folin a cada una y se les coloco en oscuridad total durante 30 minutos. Despus, se realiz la
lectura de las muestras en un espectrofotmetro (Bio-Rad, SmartSpec Plus) a una longitud de
onda de 750 nm en cubetas de 1 mL, y as obtener sus absorbancias.
Cuantificacin de protena. Mediante el mtodo de Lowry.
Con el extracto inicial de protena obtenido del tejido camaron, se tomaron 10 L y se
colocaron en un tubo eppendorf, despues, se le adicionaron 990 L de agua destilada y se
mezcl con cuidado. De los 1000 L de la mezcla anterior se tomaron 200 L y se colocaron en
un tubo eppendorf al cual se le agreg 1 mL de reactivo del reactivo D (carbonato de sodio
[Na2CO3] 3% en NaOH 0.2 N, sulfato de cobre [Cu2SO4] 2% y tartato de sodio [Na] y potasio [K]
4%). El contenido anterior fue colocado en una celda para posteriormente ser ledo en un
espectrofotmetro (Bio-Rad, SmartSpec Plus) a una longitud de onda de 750 nm y obtener su
absorbancia. Lo mismo se realiz con el extracto de levadura.

Electroforesis en geles de poliacrilamida. Protocolo para PAGE-SDS, con geles
discontinuos.
Pre-Desnaturalizacin de la muestra proteica a analizar
Del extracto inicial de protena obtenido del tejido de camarn, se tomaron 37.5 L y 12.5 L
de buffer de disociacin y se colocaron en un tubo eppendorf. Esta muestra fue calentada en
bao de agua en ebullicin durante 10 minutos). Lo mismo se realiz con extracto de
levadura.
Preparacin del gel para la fase de corrida, al 12%
El gel se prepar realizando una mezcla de diferentes soluciones. La soluciones que se
necesitaron para la preparacin de este gel fueron las siguientes en el ordenen indicado fueron
las siguientes: 3.5 mL de agua destilada, 2.5 mL de buffer de separacin (1.5 M Tris pH 8.8), 4
mL de acrilamida (CH2CHCONH2), 100 L de solucin SDS al 100%, 50 L de solucin PSA
10% y 5 L de solucin TEMED. Las ltimas dos soluciones se agregaron con mucho cuidado
y solo, hasta que el sistema de electroforesis fue montado correctamente.

Preparacin del gel para la fase de empaquetamiento, al 4%
El gel se prepar realizando una mezcla de diferentes soluciones. La soluciones que se
necesitaron para la preparacin de este gel fueron las siguientes en el ordenen indicado fueron
las siguientes: 3.05 mL de agua destilada, 1.25 mL de buffer de empaquetamiento (0.5 M Tris
pH 6.8), 0.65 mL de acrilamida (CH2CHCONH2), 50 L de solucin SDS al 100%, 25 L de
solucin PSA 10%
y 3 L de solucin TEMED. Las ltimas dos soluciones se agregaron con mucho cuidado y
solo, hasta que el sistema de electroforesis fue montado correctamente.

Montaje del sistema de electroforesis.

Para armar el sistema de electroforesis este consisti en montar dos placas de vidrio en un
soporte que los sujetaba hermticamente con una separacin de 1 mm entre las cara de los
vidrios y formaba una cmara pequea entre los vidrios donde posteriormente se colocaran
los geles. Una vez listo el sistema, se comprob que este no tuviera fugas agregando agua
destilada en esta separacin, despus de comprobar que no hubiese fugas se prosigui a
colocar el gel de fase de corrida; con mucho cuidado para evitar la formacin de burbujas de
oxgeno, hasta llegar a un lmite indicado. Enseguida se agreg a la cmara una pequea capa
de butanol para identificar la polimerizacin del gel de corrida mediante la observacin de una
interface con el mismo. Una vez que la interface se form y el gel polimerizo de forma
satisfactoria, se retir el butanol con mucho cuidado y se sec con ayuda de un pequeo
pedazo de papel filtro. Enseguida y rpidamente se coloc el gel de empaquetamiento
previamente preparado hasta que este desbordara superficialmente los cristales del sistema;
se limpi con papel filtro el excedente, y se coloc en el borde del sistema un peine que sell
al sistema y form espacios vacos o pocillos entre sus dientes donde colocamos nuestra
muestra proteica posteriormente. Se esper una hora a que el gel polimerizara, y se retir el
peine enseguida los cristales con el gel polimerizado fueron retirados de su soporte inicial y se
colocaron con cuidado en el aparato de electroforesis donde las cmaras de electroforesis
fueron llenadas hasta la lnea indicada, con un buffer de reservorios diluidos (1X). Enseguida;
dentro de los pocillos formados en los geles, se colocaron las muestras (extracto de camarn y
levadura) en el primer pocillo se coloc la muestra indicadora. Finalizado este proceso se
coloc rpidamente la tapa en la cmara de electroforesis y se conect a una fuente de poder
con un voltaje de 100. Terminado el proceso anterior, se retiraron de la cmara de
electroforesis los geles, con mucho cuidado se colocaron los geles en un recipiente plstico
con solucin de teido durante varias horas a temperatura ambiente. Para finalizar los geles
fueron desteidos, sumergindolos en solucin de desteido (contiene cido actico, metanol
y agua destilada) hasta lograr visualizar bandas de las protenas.
Resultados.
1.-Las curvas estndar de Bradford, Lowry y biuret y la electroforesis por geles de
poliacrilamida PAGE-SDS se realizaron siguiendo el protocolo que propone el
manual de prcticas de laboratorio de bioqumica del Instituto Tecnolgico de la
paz; obteniendo los siguientes resultados, en la tabla 1 se muestran los datos de
la curva estndar de Bradford y en la figura 1 se reporta la grfica con los datos de
la tabla 1. De la misma forma en la tabla 2 se muestran los datos de la curva
estndar de lowry y en la figura 2 se reporta la grfica con los datos de la tabla
2.En la imagen 1 se muestran los resultados obtenidos de la electroforesis PAGE-
SDS.
Tabla 1. Se muestra los datos obtenidos (concentracin y absorbancia) de la
curva estndar que se realiz de Bradford a diferentes concentraciones con una
longitud de onda de 595nm, con mtodos espectrofotomtricos
(espectrofotmetro, SmartSpec, Biorad).

Longitud de onda Absorbancia concentracin
595 0.309 20
595 0.585 40
595 0.976 60
595 0.791 80
595 1.082 100
595 1.371 150
595 1.614 200
595 1.728 250
595 2.164 500


Figura 1. Se muestra los valores graficados de la tabla 1, absorbancia vs la
concentracin, los puntos azules representa los valores dados por el
espectrofotmetro, la lnea delgada muestra los datos ajustado por el mtodo
estadstico de los mnimos cuadrados.

Tabla 2. Se muestra los datos obtenidos (concentracin y absorbancia) de la
curva estndar que se realiz de Lowry a diferentes concentraciones con una
longitud de onda de 750nm, con mtodos espectrofotomtricos
(espectrofotmetro, SmartSpec, Biorad).
Longitud de onda Concentracin microg/mL Absorbancia
750
20 0.057
750 40 0.104
750 60 0.207
750 80 0.219
750 100 0.283
750 150 0.42
750
200 0.472
750 250 0.562
750
500 0.947


y = 0.0036x + 0.6158
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
0 100 200 300 400 500 600
Bradford


Figura 2. Se muestra los valores graficados de la tabla 2, absorbancia vs la
concentracin, los puntos azules representa los valores dados por el
espectrofotmetro, la lnea delgada muestra los datos ajustado por el mtodo
estadstico de los mnimos cuadrados.

Clculos de la concentracin:
Para estos clculos se recurri a la ecuacin de la recta obtenida de la curva
estndar de lowry mediante la siguiente forma:
Y= 0.0018X + 0.0804.
Donde X es la concentracin que se busca y Y es la longitud de onda obtenida del
espectrofotmetro, (en camarn 0.367 y en levadura 0.102) teniendo esto
despejamos y obtenemos: X= (Y-0.0804)/0.0018.
Para camarn tenemos: x = (0.376-0.804)/0.0018 = 164.22 este valor se multiplica
por 100 debido a la concentracin 1:100 y despus se divide entre 1000 ya que el
valor se representara en mg/ml dndonos una concentracin de 16.422.
Para levadura se realiza la misma forma dando un resultado de 1.2 mg/ml


y = 0.0018x + 0.0804
R = 0.976
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 100 200 300 400 500 600
Lowry


Imagen 1. Se muestran los resultados obtenidos en la ELECTROFORESIS SDS-
PAGES. Donde a la izquierda podemos observar las bandas obtenidas con los
extractos y a la derecha se muestra los datos del marcador utilizado (6).


Discusin.
En la primera parte de la prctica no hubo mayor problema debido a que solo se
hiso disrupcin mecnica y centrifugacin de nuestras muestras de protenas.
Para la siguiente parte en las pruebas de Bradford,biuret y lowry los resultados
obtenidos quedaron dentro del rango aceptable de las curvas realizadas. Cabe
destacar que nicamente se utilizaron las curvas estndar de Bradford y lowry
debido a que en la curva de biuret no se obtuvieron los resultados esperados
debido a problemas con las disoluciones por lo cual de esta cuerva no se reportan
resultados. Para los clculos de la concentracin estos se realizaron con los datos
de la curva estndar de lowry utilizando la ecuacin de la recta proporcionada por
esta curva. En la tabla 1 se muestran los resultados de la curva de Bradford
pudindose observar que solo se tiene un valor raro y es cuando la absorbancia
pasa de 0.976 a 0.791 debido a que entre mayor sea la concentracin se debera
obtenerse una longitud de onda mayor ya que las molculas interrumpiran el paso
de la luz dando una longitud de onda ms alta, esto pudo deberse a una mala
disolucin en las muestras. En la tabla 2 se pueden observar los valores de la
curva estndar de lowry aqu los valores parecen ser acorde en relacin a
concentracin-longitud de onda por lo cual aqu no queda mucho que discutir.
Con respecto a los resultados obtenidos en la electroforesis PAGE-SDS estos se
muestran en la imagen 1, se puede observar que las bandas obtenidas no se
encuentran muy definidas. Estos resultados pudieran deberse errores
experimentales tales como la velocidad de la polimerizacin; que si es muy rpida
puede deformar las bandas de los geles, pureza de los reactivos, preparacin de
las muestras, las concentraciones de las muestras ya que esta es una tcnica muy
sensible y puede ser afectada por todos estos factores.
Tambin podemos destacar que en extracto de tejido de camarn las bandas
grandes que se alcanzan a apreciar nos pueden indicar una alta concentracin de
protenas o protena. En el caso del extracto de levadura se observa bandas ms
delgadas lo que nos puede indicar una poca concentracin de protenas.
.









Conclusin.
En esta prctica se pudo comprobar que para la extraccin, determinacin y cuantificacin de
protenas hay diversa tcnicas las cuales nos ayudan a cumplir con estos objetivos. Varios de estos
mtodos ya se conocan como lo son la disrupcin mecnica por medio de perlas y un pistilo en la
etapa de extraccin o los mtodos de determinacin de la concentracin de protenas como lo
son: Bradford, Lowry y Biuret (mtodos usados en esta prctica), pero haba otros que no se
conoca o no se avan realizado como lo es la electroforesis PAGE-SDS mtodo por el cual se
separaron nuestras protenas. En general en todos los procesos que se realizaron en esta
prctica desde la extraccin hasta la elaboracin de la electroforesis GE-SDS, es de vital
importante tener mucho cuidado en todo el procedimiento y en cada detalle pues son prcticas en
las que cualquier error o descuido puede arruinar toda la prctica.




Bibliografa:
1.-Thomas M. Devlin.2008/Bioqumica Libro de texto con aplicaciones clnicas/ Editorial
reverte/cuarta edicin/ paginas 94,95.
2.- Vicente pallas, carolina escobar.2007/Herramientas biotecnolgicas en fitopatologa/
Editorial Aedos, s.a/ primera edicin/ pgina 80.
3.- http://tesis.uson.mx/digital/tesis/docs/10626/Capitulo5.pdf/ consultada el da 13 de
octubre del 2013.
4.- http://ibcmunq.files.wordpress.com/2010/03/tp2.pdf/ Introduccin a la Biologa
Celular y Molecular/ consultada el da 13 de octubre del 2013.
5.- Enrique Battaner Arias.2000/Biomoleculas/Ediciones universal salamanca/primera
edicion/Paginas 262,264,265
6.- http://www.bio-rad.com/ consultada el da 13 de octubre del 2013.