LABORATORIO DE HEMOSTASIA Y GENETICA VASCULAR

PROTOCOLO ELECTROFORESIS EN CONDICIONES DISOCIANTES

UTILIZANDO SDS Y BETA-MERCAPTOETANOL
Elaborado por Gustavo Bruges (Ph.D)


CRITERIOS PARA ELEGIR LA PROTEINA A SEPARAR SEGN LA
CONCENTRACIN DE ACRILAMIDA

SOLUCIONES
1. 1.5 M Tris pH 8.8: (27 g Tris + 2 ml HCl (conc.) + 150 ml dH2O). (Guardar
en nevera)
2. 0.5 M Tris pH 6.8: (3 g Tris + 50 ml dH2O, adust to pH 6.8 with HCl).
(Guardar en nevera)
3. 10% SDS (dodecilsulfato de sodio) 5 g SDS + 100 ml dH2O. (Guardar a TA)
4. 10% APS (persulfato de amonio) preparar APS fresco o usar alicuotas
congeladas a -20 C (i.e. 0.05g + 0.45 ml dH2O).
5. 30% acrylamide, 2.7% bis (58 g acrilamida + 1.6 g bis a 200 mL H2O)
almacenar en oscuridad a 4 C


6. 4X Sample Loading Buffer:
10 ml 1X
2.0 ml 1M Tris-HCl, pH 6.8 50 mM
0.8 g SDS 2%
4.0 ml 100% glycerol 10%
0.4 ml 14.7 M beta-mercaptoethanol 1%
1.0 ml 0.5 M EDTA 12.5 mM
8.0 mg bromophenol

7. Buffer de corrida 10X (1X: 0.025 M Tris pH 8.3, 0.192 M glicina, 0.1%
SDS)
SOLUCION 10 X. La solucin 1X puede reusarse hasta 5 veces.



Solucion de tincion
1). 2.5 g Azul Brillante Coomassie R-250
2). 450 mL metanol
3). 100 mL acido actico glacial
4). Aforar a 1 L con agua BD
Nota: Esta solucin se puede recuperar y reusar nuevamnte si se filtra y se
mezcla con la solucin de Coomassie

Solucion destiidora
1). 200 mL de metanol
2). 150 mL de acido actico
3). 650 mL de agua BD
Nota: Esta solucin se puede recuperar y reusar si se filtra con un poco de carbon
activado.

PREPARACIN DEL GEL
1. Preparar la mezcla del gel de separacin en tubo falcn. (USAR
TABLA ANEXA PARA PROPORCIONES)
2. Mientras, preparar el molde para cada gel y la solucin de
Persulfato de amonio (PSA).
3. Marcar en el molde la altura del gel de separacin: 2 cm desde el
borde superior del cristal pequeo.
4. Agregar PSA, mezclar, y a continuacin aadir TEMED. Mezclar
de nuevo y verter en el molde hasta un poco por encima de la
marca. El resto de la mezcla ponerla en un tubo eppendorf como
testigo de la polimerizacin.
5. Dejar polimerizar al menos 1 hora. Si el gel se va a correr el da
siguiente, colocar una capa de overlay buffer y dejar en cmara
fra tapado con papel de aluminio.
6. Una vez polimerizado el gel de separacin, lavar la superficie del
gel con agua destilada y secar las paredes.
7. Preparar la mezcla de stacking correspondiente, PSA y TEMED
(en este orden y mezclando cada vez). Verter en el molde hasta
el tope y colocar el peine.

Preparacin de las muestras: Mezclar con el buffer de carga SB 4X (1:3) y
hervir a 95 durante al menos 5 min, junto con el estndar.

Mientras, quitar el peine del gel con mucho cuidado y lavar los pocillos
con buffer de electroforesis con el fin de eliminar las partculas no
polimerizadas .
Sacar el molde del porta moldes verde y adosarlo al porta electrodos
(ste se ha untado con gel de sellado a lo largo de la gomilla verde),
con el cristal pequeo hacia dentro. Colocarlo a su vez en el monta
moldes de electroforesis y todo junto dentro de la cubeta. Marcar los
geles como A y B.
Llenar los compartimentos interior (125 ml) e inferior (200 ml) con buffer
de electroforesis (garrafa) y cargar las muestras con la punta blanca
larga.
Colocar la tapa porta electrodos y correr la electroforesis a 200 v
(constante) 35 min.
SACAR EL GEL CON MUCHO CUIDADO, DESARROLLAR LA TINCION DE
COOMASIE O LA ELECTROTRASFERENCIA




STACKING GEL 5% acrilamida

TINCION, DECOLORACION Y SECADO DE GELES DE POLIACRILAMIDA (PAGE)
Para teir el gel
1). Una vez que ha finalizado la corrida electroforetica, retirar el gel del casette y
colocarlo en un recipiente hermetico de plastico (tuper)
2). Aadir 50 mL de la solucion de tincion
3). Incubar a 22 oC, 12 h, en agitacion continua
Para desteir el gel
1). Incubar en 50 mL de solucion destiidora durante una hora
2). Repetir el procedimiento dos o tres veces mas hasta que aparezcan las
bandas teidas de azul y el fondo casi transparente
Para secar el Gel
1). Incubar durante 12 h en glicerol al 20% en agua BD.
2). Fotografiar o escanear
3). Secar en el bastidor de acrilico a 22 oC durante dos o tres dias. (se puede
celerar el proceso si se le coloca un foco incandescente de 60 W lo mas
cercano posible al gel, pero sin que llege a tocarlo).