Guia de Bacteriologia

Autores:
Alfredo Guilln, Carlos Benites, Cesar Guerrero, Nora Bravo

Alumno: Grupo:

2008
GUI A DE PRCTI CAS
CURSO DE BACTERI OLOGI A

AUTORES

Alfredo Guilln Oneeglio
Mdico Cirujano
Profesor Asociado
Facultad de Tecnologa Mdica, Universidad
Nacional Federico Villarreal.
J efe de Microbiologa, Laboratorio, Clnica San
Borja.
alfredo_guillen@yahoo.com

Carlos Benites Azabache
Tecnlogo Mdico
Magster en Microbiologa
Profesor Auxiliar
Nacional Federico Villarreal.

Cesar Guerrero Barrantes
Bilogo
Magister en Microbiologa
Profesor Principal
Nacional Federico Villarreal

Nora Bravo Cruz
Biloga
Profesor Asociado
Facultad de Ciencias Naturales y Matemtica,
Universidad Nacional Federico Villarreal

Lima, Marzo del 2008

AUTORIDADES

Lic. Regina Medina Espinoza
Decana

Lic. Edix Noriega
Secretaria Acadmica

Lic. Jos Bernala Uchuya
J efe (e) Departamento Acadmico de
Tecnologa Mdica

Lic. Jos Bernala Uchuya
Director de la Escuela Profesional de
Laboratorio y Anatoma Patolgica

DIRECCION

Facultad de Tecnologa Mdica
J r. Ro Chepn s/n, El Agustino
Lima Per
Telfono 3627578
Pagina Web: www.unfv.edu.pe

CURSO DE BACTERIOLOGIA
UNFV- FTM EPLAP Pag. 2

REGULACIONES

INFORMACION GENERAL
Antes de cada sesin de trabajo se debe leer la gua de prctica y planificar el trabajo
cuidadosamente.
No empezar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones. La sesin de trabajo se iniciar con las
instrucciones del profesor de prcticas. Si la informacin del instructor o del manual no estn claras,
realice las preguntas adecuadas.
Anote las observaciones cuando las realice. El examen prctico incluir la informacin que el
profesor de prcticas le brindar, la del manual y la de sus propias observaciones y conclusiones.
Responda y discuta las preguntas de la gua con su profesor de prctica, estas sern consideradas
en el examen prctico.

REGLAS DEL LABORATORIO
Debe usar un mandil blanco o chaqueta, limpios cuando este en el laboratorio. Este debe ser lavado
por lo menos una vez a la semana utilizando agua caliente y leja. No se permitir el ingreso o la
permanencia de alumnos sin mandil o chaqueta.
Antes de empezar y despus de trabajar limpie la mesa del laboratorio y cada vez que sea necesario
(derrame de material contaminado).
Coloque slo el material indispensable sobre las mesas de laboratorio. No colocar bolsas, ni
mochilas u otro material que no sea del curso.
Nunca utilice la boca para pipetear, el material puede ser txico o infeccioso.
Esta PROHIBIDO comer, fumar o aplicarse cosmticos en el laboratorio.
Lvese las manos con agua y jabn antes de retirarse del laboratorio.
Colocar el material contaminado en envases apropiados y estos deben ser esterilizados al terminar
las prcticas, siendo de responsabilidad del grupo correspondiente de acuerdo al cronograma.
Algunos de los reactivos y los microorganismos con que se trabajan son peligrosos. Use guantes o
mascarillas descartables cuando sea necesario y siga las instrucciones del profesor de prcticas.
Reporte todos los accidentes o derrames, incluso los menores, al instructor. Estos reportes no sern
tomados en cuenta para la nota pero son importantes para tomar medidas de bioseguridad para
todos y evitar la repeticin de los accidentes.

MATERIAL NECESARIO (para todas las prcticas)
El alumno debe contar con el siguiente material para el desarrollo de las prcticas:
Gua de prcticas (obligatorio)
Desinfectantes: Alcohol 70%, fenol al 5%
J abn lquido y toallas de papel
Material de escritorio: Marcador de tinta indeleble, lpiz de cera, caja de colores, papel kraft.
Material de limpieza: detergente, escobillas.
Material de laboratorio: lminas portaobjetos y cubreobjetos, asa de siembra y aguja de cultivo.
Equipos: mechero Bunsen, microscopio compuesto, estufa, autoclave, balanza y refrigeradora.
Set de colorantes de Gram, agua destilada y suero fisiolgico estril.

PRACTICA 1
EQUIPOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

OBJETIVO
Conocer el funcionamiento de los equipos utilizados en el laboratorio de microbiologa.
INTRODUCCION
En un laboratorio de microbiologa, es necesaria la utilizacin de ciertos instrumentos para llevar a cabo
su normal funcionamiento. Los instrumentos ms comunes en un laboratorio de microbiologa son:
microscopio, incubadora, autoclave, horno, refrigeradora, bao Mara, centrfuga, balanza, potencimetro,
porta filtros.
EL MICROSCOPIO Y SUS PARTES
El microscopio, es el instrumento ms importante utilizado por los microbilogos, de los cuidados y
correcto uso dependern el xito de las observaciones. Es funcin del microscopio hacer visible
aquellas cosas tan pequeas que el ojo humano no puede hacerlo, esta compuesto de un sistema de
lentes de suficiente magnificacin y poder de resolucin que aquellos elementos que estn muy juntos
entre s, se puedan distinguir separados dando una imagen clara y detallada cuando se utiliza
suficiente iluminacin.
El aumento total de un microscopio se determina multiplicando el aumento que proporciona el ocular
por el aumento que proporciona el objetivo.
Parte mecnica esta constituida por: Soporte, Cuerpo con el revlver porta-objetivos, Platina,
Reguladores de enfoque: tornillos macromtrico y micromtrico.
Parte ptica, constituida por: oculares, con diferentes aumentos 5X, 10X o 15X, puede ser monocular
o binocular, Objetivos secos, bajo poder 10X, alto poder 45X, Objetivo de inmersin de gran definicin
96X 100X
Sistema de iluminacin, constituido por: condensador, diafragma, Fuente de iluminacin interna o
externa con un espejo plano/cncavo.
INDIQUE LAS PARTE DEL MICROSCOPIO


INCUBADORA
Equipo que se caracteriza por tener
temperaturas fijas o que fluctan en un rango
muy corto 0.2C, la cual esta regulada
mediante un termostato.
Se utiliza para mantener los cultivos a una
temperatura adecuada segn los
requerimientos del germen con el cual se est
trabajando.
Se caracteriza por tener una puerta de vidrio
interna que permite observar el desarrollo de
los cultivos sin alterar la temperatura interna.
En algunos la fuente de calor esta en la parte
inferior, en otras marcas tienen canaletas que
distribuyen el calor en toda la cmara
permitiendo una mejor distribucin del calor y
una temperatura estable.

Partes
Cmara interna
Puerta interna de vidrio
Puerta externa
Control de temperatura
Termmetro (digital o de mercurio)
Temporizador
Bandejas

HORNO
Se caracteriza por proporcionar temperaturas
altas, se utiliza para esterilizar material de vidrio
e instrumental metlico mediante calor seco. La
temperatura mxima generalmente es de
200C.
La temperatura de funcionamiento es de 160 a
180 C por 60 a 120 minutos.

BALANZA MECANICA
Instrumento de precisin que se utiliza para
determinar el peso de diferentes sustancias,
existen diversos tipos de acuerdo a las
necesidades, con diferente sensibilidad. Hay
balanzas mecnicas y electrnicas.

AUTOCLAVE
Sirve para esterilizar materiales y medios de
cultivo que son sensible a las altas
temperaturas utilizadas en los hornos. Utilizan
vapor de agua a presin durante tiempos
variables de acuerdo a la naturaleza del
material a esterilizar.
Parmetros
Presin: 1,2 kg/cm
2
=15 lb/pulgada
2

Temperatura: 121C
Tiempo: 15 a 30 minutos dependiendo de
la carga

Los modelos pueden ser
de mesa (automtica) o
De pie
Partes
Manmetro de presin
Termmetro
Llave de paso
Llave de seguridad
Panel de control para temperatura y tiempo
Llave de purga
Tornillos de ajuste para la tapa

POTENCIOMETRO
Instrumento de precisin que sirve para
determinar la concentracin de iones (pH) en
diferentes soluciones, sustancias o medios de
cultivo (lquidos o slidos), dependiendo de la
sustancia que se quiera medir el pH se elige el
tipo de electrodo a utilizar.

DESTILADOR DE AGUA / DESIONIZADOR
Sirve para obtener agua libre de impurezas
para la preparacin de los medios de cultivo y
reactivos, se puede utilizar cualquiera de los
dos aparatos, pero se debe controlar el agua
obtenida.

REFRIGERADORA
Equipo para proporcionar ambientes de temperaturas bajas, se utiliza con fines de conservacin para
el material biolgico, medios de cultivo ya preparados, reactivos, etc.
BAO MARIA
Equipo que se utiliza para mantener temperaturas homogneas que transmitirn calor en forma
indirecta. El rango de temperatura se puede graduar de acuerdo a la utilidad que se le va a dar, para
licuar medios de cultivo por ejemplo se utilizar entre 70C y 90C
CENTRIFUGA
Equipo que se caracteriza por proporcionar fuerzas centrfugas que permitirn al usuario separar
sustancias a diferentes velocidades y rangos de temperatura predeterminados, para procesar una
muestra de orina se requiere 3,000 r.p.m. x 5'
PORTAFILTROS
Equipo que se utiliza como soporte de las membranas de filtro, las que se usan con diferentes
objetivos, por ejemplo para esterilizar algunas sustancias (medios de cultivo) o para procesar
muestras como es el caso del estudio bacteriolgico de aguas.
CONGELADORA
Sirven para mantener reactivos que son sensibles al calor o para mantener muestras o cepas. Son de
-20C y -70C.
CAMARA DE BIOSEGURIDAD
Equipo que se utiliza para manipular microorganismos altamente infecciosos. El sistema puede ser
cerrado (cabinas de bioseguridad I y II) o semicerrado (cabinas de bioseguridad III) que permite
trabajar con agentes infecciosos evitando la contaminacin del material en trabajo, asi como da
proteccin al trabajador. En estos sistemas el aire que entra y sale pasa a travs de filtros de alta
eficiencia (HEPA). Las cmaras de flujo laminar se utilizan en laboratorios de produccin o
preparacin de medios de cultivo pues proporcionan una ambiente estril, pero no proporciona
proteccin al personal de laboratorio.
OTROS
Porta asa o mango de Kolle, para fijar la aguja o alambre de nicrn. Gradillas porta tubos. J arra de
anaerobiosis. Mecheros, de alcohol o de gas

ESQUEMATICE EL EQUIPO DE LABORATORIO, INDICANDO SUS COMPONENTES.
DISCUTA LOS SIGUIENTES TEMAS CON SU PROFESOR DE PRCTICA:
1. Definir que es un equipo y que es un aparato
2. Cual es el procedimiento de uso de la autoclave, el horno y el destilador.
3. Cada cuanto tiempo se debe realizar el mantenimiento de los equipos
4. Cual es la diferencia entre una cmara de humos, cmara de flujo laminar y cmara de bioseguridad.
5. Cual es la diferencia entre el agua obtenida en un destilador y la de un desmineralizador o
desionizador.
6. Como se hace el control de calidad del agua destilada.
Actividades
1. Prepare hojas de procedimientos para el uso de la autoclave, el horno, el destilador y el microscopio.
2. Prepare una hoja para el control de temperatura de los equipos de laboratorio: estufa y refrigeradora.
3. Realice un esquema de una jarra de anaerobiosis e indique para que se utiliza.
4. Haga un esquema de la llama de un mechero con la temperatura que se puede conseguir.


PRACTICA 2
PREPARACION DE MATERIAL DE VIDRIO

OBJETIVO
Conocer el material de laboratorio utilizados en el laboratorio de bacteriologa y su manera de
prepararlo para su uso.
FUNDAMENTO
En un laboratorio de microbiologa, cuando se procesan cultivos, es necesario utilizar material limpio, sin
residuos de detergente y estril para tener xito en el aislamiento y posterior identificacin de los
grmenes que se est investigando. La limpieza es un proceso fsico mediante el cual se elimina de los
objetos en uso las materias orgnicas y otros elementos sucios por el lavado con agua con o sin
detergente.
MATERIAL NECESARIO
Placas Petri 100 x 15 Tubos 13 x 100
Tubos 13 x 100 con tapa de bakelita Tubos 15 x 125
Pipetas serolgicas x 1 mL Pipetas serolgicas x 5 mL
Pipetas serolgicas x 10 mL Matraces de 1000 mL
Matraces de 500 mL Probetas
Algodn Papel Kraft
Detergente Guantes domsticos
Escobillas para tubos
PROCEDIMIENTOS
Identificar el material y el uso al que esta destinado
Lavar el material de vidrio
Secar el material
Poner tapones de algodn en la boca de las pipetas, tubos y matraces
Envolver el material con papel kraft
Esterilice los materiales de vidrio en el horno a 160 a 180C por una hora.
DISCUTA CON SU PROFESOR LO SIGUIENTE
Acondicionamientos del material dentro de los equipos.
Uso de desinfectantes en el laboratorio
Limpieza de la mesa de trabajo
Uso de indicadores de esterilizacin qumicos y biolgicos
Esterilizacin por calor seco y por calor hmedo
Procedimientos en caso de derrame de sustancias infecciosas.
CUESTIONARIO
1. Cual es el detergente adecuado para el lavado de material.
2. Que riesgos existen en el momento de lavar el material.
3. Como se limpian y preparan las lminas portaobjetos.
4. Como se prepara la mezcla sulfocrmica, puede estar ser reemplazada por otro reactivo.

PRACTICA 3
PREPARACION DE MATERIAL Y BIOSEGURIDAD

OBJETIVO
Preparar asas de cultivo.
Practicar el lavado de manos
Practicar el uso de guantes
MATERIALES
1 metro de alambre de nicrn nmero 24 o 26 Mangos de asa de Kolle
Varillas de 5 mm de dimetro Alicate
J abn lquido o en barra Papel toalla
Guantes
PROCEDIMIENTOS
Aguja de cultivo
o Cortar un pedazo de alambre de nicrn de aproximadamente 10 cm de largo
o Enderezar el alambre y fijarlo al extremo de un mango de asa de siembra
o Asa de cultivo
o Enrollar el alambre de nicrn en la varilla tratando de que se forme un aro.
o Cortar el alambre con un alicate
o Con el alicate darle la forma adecuada
o Fijarlo en un mango de asa de siembra.
Lavado de Manos: el propsito del lavado de manos es remover y quitar la suciedad, la materia
orgnica y los microorganismos transitorios.
o Diferenciar los diferentes tipos de lavado de manos
Social
Clnico o antisptico
Quirrgico
o Practicar el lavado de manos clnico o antisptico
Humedecer las manos
J abonar y frotar en espacios interdigitales
Realizar un frotamiento mecnico y vigoroso para generar espuma. J abonar bien toda la
superficie; sobre todo alrededor de las uas.
Enjuagar con abundante agua.
Secarse con una toalla de papel.
Cerrar la llave utilizando el papel toalla.
Uso de guantes
o Cuando se debe usar guantes
o Que tipos de guantes existen y cual es su utilidad
o Practicar el colocarse y quitarse los guantes de manera apropiada.


PRACTICA 4
PREPARACION DE COLORANTES Y REACTIVOS

COMPETENCIA
El alumno al termino de la prctica podr describir los diferentes procedimientos de preparacin de
colorantes y reactivos utilizados en la coloracin de bacterias, pudiendo mencionar la diferencias y los
usos que les dan a las mismas. Ser capaz de preparar cualquiera de los colorantes y otros cuando
cuente con el procedimiento necesario.
INTRODUCCION
Teir es un proceso de colorear artificialmente los microorganismos con colorantes o reactivos con el
objeto de facilitar su observacin y estudio al microscopio. Los colorantes son compuestos orgnicos
conformados por anillos bencnicos que tienen un grupo auxocromo y uno cromforo.
Los colorantes pueden ser:
Simples o directos como el azul de metileno o cualquier colorante utilizado para dar color al
organismo en estudio.
Selectivos para cpsulas, grnulos metacromticos, esporas, citoplasma y ncleos en
protozoarios patgenos.
Diferenciales como Gram o Zhiel Neelsen.
Indirectos o de contraste, donde se colorea el fondo y la bacteria se observa por contraste, ej. la
tinta china.
Los colorantes deben conservarse en frascos de color mbar. Se recomienda preparar en cantidades para
un consumo no mayor de un mes. Cada vez que las soluciones colorantes sean trasvasadas a los
pequeos cuentagotas que se emplean para la tincin, deben filtrarse; esto es especialmente necesario
para la fucsina fenicada y el cristal violeta, porque con el tiempo se forman pequeos cristales que son
causa de error al hacer la lectura de las lminas. Los frascos cuentagotas y sus tapas deben ser lavados
con todo cuidado cada vez que se renueve su contenido.
MATERIALES
Morteros Papel filtro
Envases de vidrio de 250 mL limpios y secos Envases de polietileno
Embudos Etiquetas
REACTIVOS
Violeta de genciana o cristal violeta Oxalato de amonio
Alcohol 96 Yoduro de potasio
Yodo resublimado Safranina
Fucsina bsica Fenol
Azul de metileno Verde de malaquita
Paradimetilamino benzaldehido cido clorhdrico
Agua destilada Hidrxido de potasio

PREPARACION DE COLORANTES
La formula de preparacin de colorantes y reactivos se encuentra en el manual de preparacin de medios
y colorantes.
Se debe preparar los siguientes:
Colorantes de Gram (1 juego por mesa)
Cristal violeta x 250 mL
Lugol x 300 mL
Alcohol 95 x 250 mL
Safranina x 250 mL
Colorantes de Zhiel Neelsen
Fascina fenicada x 100 mL
Alcohol cido clorhdrico x 100 mL
Azul de metileno x 100 mL
Reactivos
Reactivo de Kovacs x 50 mL
Hidroxido de potasio al 40%

CUESTIONARIO
1. Qu significa cromforo y auxocromo?
2. Qu es un mordiente?
3. Busque una coloracin para flagelos, describa el procedimiento, la preparacin de los reactivos y la
referencia.

PRCTICA N 5
COLORACIONES SIMPLES Y COMPUESTAS

OBJETIVO GENERAL
Aprender los procedimientos utilizados en el examen directo y la Coloracin de bacterias.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Al trmino de la prctica el alumno ser capaz de:
Explicar el principio de la coloracin de Gram y otras coloraciones
Sealar los paso del procedimiento de la coloracin de Gram
Identificar el rea apropiada de la lmina para ser observada en el microscopio
Identificar las estructuras vistas microscopicamente, incluyendo bacterias, clulas y artefactos
MATERIALES
Microscopio binocular, con objetivo de inmersin. Mechero
Soporte de varillas para las lminas portaobjetos. Lpiz para marcar vidrio de cera
Lminas portaobjetos limpias y desengrasadas. Papel lente
Colorantes de Gram Piceta con agua
Aceite de inmersin Tolueno
Lpiz para marcar vidrio de cera Lminas cubreobjetos
Suero fisiolgico
Papel filtro
Embudos de vidrio
Mondadientes
Aceite de inmersin
Frascos goteros
Cultivo de Staphylococcus sp Cultivos de Escherichia coli
EXAMEN DIRECTO
Permite observar directamente los elementos formes de la secreciones que se pueden obtener
Su utilidad es limitada a detectar la presencia de clulas epiteliales, leucocitos y presencia de bacterias,
pero sin poder diferenciar a estas ltimas.
Sirve de paso previo en algunos tipos de muestras, y en el estudio de lquidos biolgicos en los cuales
se centrifuga la muestra y se observa el sedimento.
Se puede aadir colorantes como el de lugol que permite la observacin de parsitos en muestras de
heces
Procedimiento
En una lmina portaobjetos colocar una gota de suero fisiolgico (Cloruro de sodio al 0,85% en AD).
Con un mondadientes o una asa de cultivo tome un poco de muestra y haga una suspensin en la gota
de suero fisiolgico, extendiendolo en un rea de 1 cm
Colocar un lmina cubreobjetos y examinar la suspensin al microscopio con 100x y 400x.
COLORACION DE GRAM
La coloracin de Gram, es una de las ms empleadas en el diagnstico de enfermedades infecciosas,
es una tincin completa en el cual intervienen dos colorantes, uno primario (cristal violeta) y otro
secundario o diferencial (Safranina). A esta tincin tambin se le llama diferencial debido a que permite
diferenciar a las bacterias en dos grandes grupos:
Bacterias Gram positivas: se tien de color morado oscuro.
Bacterias Gram negativas: se tien de color rosa.
Algunas bacterias pueden tomar o no el colorante primario (cristal violeta), es decir pueden presentarse
como Gram positivas o Gram negativas, a ellos se les denomina Gram variables.
PROCEDIMIENTO
Fijacin de la muestra
Comnmente se hace un frotis de la muestra sobre una lmina portaobjetos, pudiendo hacerse con el
asa de siembra o con el hisopo, de tal manera que el frotis sea tan fino como sea posible, no debe
frotarse vigorosamente la muestra para evitar alteraciones de la forma de las clulas. Dejar secar la
muestra a temperatura ambiente o al calor suave para luego colorear.
Coloracin
Cubre el frotis con cristal violeta para Gram durante un minuto.
Lavar con agua corriente, cuidando de no eliminar la muestra, y djelo escurrir.
Cubra la muestra con solucin de Lugol para Gram durante un minuto.
Lave con agua corriente y escrralo.
Decolore con alcohol-acetona.
Cubra el frotis con safranina durante 10-20 segundos.
Deje secar la lmina al aire libre.
Observe la lmina al microscopio con aumento de 100x y 400x.
Coloque una gota de aceite de inmersin sobre la lmina y observe utilizando lente de inmersin
(1000x).
Reporte
Reportar la presencia de clulas y el tipo
Reportar la presencia de bacterias: forma, tipo de reaccin, asociacin y su asociacin con las clulas
Reportar la presencia de otras estructuras y diferenciar los artefactos.
CUESTIONARIO
1. A que se debe que unas bacterias se tian de rojo y otras de violeta en la coloracin de Gram?
2. Existen bacterias que no se puedan colorear con Gram, cuales son y como hara para colorearlas?
3. Que otros tipos de coloraciones se pueden realizar.


REALICE DIBUJOS DE SUS OBSERVACIONES, INDICANDO EL AUMENTO Y QUE OBSERVO:

Muestra:
Coloracin:
Aumento:
Muestra:
Coloracin:
Aumento:
Muestra:
Coloracin:
Aumento:

Muestra:
Coloracin:
Aumento:
Muestra:
Coloracin:
Aumento:
Muestra:
Coloracin:
Aumento:


PRACTICA 6
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

OBJETIVO
Adiestrar en la preparacin de los diferentes medios de cultivo utilizados en bacteriologa.
MATERIALES
1 Baln de 500 mL 1 Baln de 250 mL
1 Probeta graduada de 500 mL 1 Esptula
1 Trpode Guantes para objetos calientes
1 Rejilla para mechero 10 tubos 15 x 125 estriles
Agar tripticasa soya 10 ml de sangre de carnero
Caldo tripticasa soya 10 Placas Petri 100 x 15
PROCEDIMIENTO GENERAL:
Pesado de los ingredientes
El material de vidrio debe estar completamente limpio y libre de sustancias detergentes.
Para preparar el medio de cultivo a partir de sus ingredientes, estos se debern pesar exactamente
uno a uno y colocarlos en un baln que tenga el doble de volumen de la cantidad a prepararse.
Para preparar utilizando un medio deshidratado, se debe leer cuidadosamente las instrucciones del
fabricante y tomar exactamente la cantidad indicada, teniendo cuidado de cerrar hermticamente el
frasco inmediatamente despus de haberlo utilizado.
Agregar el volumen de agua destilada o desmineralizada necesaria, preferentemente en dos partes,
primero la mitad del volumen y se agita suficientemente para conseguir una suspensin homognea.
Despus se incorpora la cantidad restante, aprovechando de esta para desprender las partculas de
medio de cultivo que pudieran quedarse adheridas a la pared interna del recipiente.
Disolucin
Si el medio contiene agar o gelatina, es necesario disolverlo con ayuda del calor. Este calentamiento
se puede realizar en un bao Mara, en un mechero con ayuda de una rejilla o utilizando un horno
microondas, hasta que se alcance su completa disolucin, esto se reconoce cuando al agitar no se
adhiere ninguna partcula de agar a la pared interna del recipiente. No debe olvidarse que todos los
medios de cultivo son sensibles al calentamiento, por este motivo no debe calentarse ms de lo
estrictamente necesario. Los medios de cultivo que no contienen agar o gelatina son solubles en agua
fra.
Es necesario que el medio de cultivo se encuentre al pH indicado, con los medios comerciales y
utilizando agua destilada neutra no es necesario, pero cuando se prepara por componentes es
necesario realizar la medicin, para lo cual se utiliza un potencimetro o papel indicador de pH que
tenga un rango til de 4.0 a 8.0. El valor de pH se ajusta a los intervalos previstos con la adicin de
gotas de cido clorhdrico 1N o hidrxido de sodio 1N.
Preparacin de medios en tubos
Si se utilizan medios semislidos, estos deben ser distribuidos en los tubos que se van a utilizar antes
de esterilizarlos, despus de ella dejarlo enfriar en posicin vertical.
Cuando se quieren colocar medios slidos en tubos igualmente se les debe distribuir en sus envases
finales y luego de autoclavar dejarlos enfriar en posicin inclinada o semi inclinada.
Esterilizacin
Antes de la esterilizacin es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones pequeas, de ser
posible en los recipientes definitivos en los que posteriormente se llevara a cabo el trabajo (a
excepcin de las placas Petri).
Si las instrucciones del fabricante no indican otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en la
autoclave a 121 C durante 15 minutos.
Vertido en placas
Antes de verter el medio de cultivo en las placas Petri es necesario que el medio se encuentre a una
temperatura de 45 a 55C para evitar que se formen gotas de agua de condensacin en la tapa de las
placas. En la prctica a esta temperatura es posible sostener el frasco con el medio con la mano
desnuda sin quemarse.
Se agita el recipiente que contiene el medio de cultivo en forma circular para asegurar que halla una
mezcla uniforme y flameando previamente la boca del recipiente se agregar el medio de cultivo a las
placas Petri que se encuentran cerca del mechero, aproximadamente 16 a 18 mL a cada una.
Si se forma burbujas de aire en la superficie del medio, estas se pueden eliminar flameando
rpidamente la superficie con la llama del mechero de Bunsen.
Se debe dejar que se enfre el medio de las placas a temperatura ambiente. Si la superficie del medio
quedara hmeda, puede colocarse las placas en estufa a 37C, dejando las tapas ligeramente
abiertas y con el lado que contiene el medio hacia arriba por 30 minutos.
Luego que el medio este listo, puede colocarse en la refrigeradora si no se va a usar de inmediato.
Una placa de cada lote preparado deber colocarse en la estufa a 37C para verificar su esterilidad.
Guardar las placas en posicin invertida en el refrigerador hasta el momento de usar.
MEDIOS DE CULTIVO
Medio simple
Pesar 8 g de TSA y colocarlo en un matraz.
Aadir 200 mL de agua destilada y mezclar.
Calentar hasta ebullicin, agitando constantemente.
Autoclavar a 121C (15 lb de presin) por 15 minutos.
Sacar de la autoclave y dejar enfriar a 50C.
Preparar 3 placas y tubos en plano inclinado y semi-inclinado.
Agar sangre
Preparar el medio segn se ha descrito y esterilizarlo.
Al frasco con TSA y enfriado a 45C, se le aade 5 a 10% de sangre de carnero desfibrinada y fresca,
mezclar bien evitando se formen burbujas.
Verter en placas Petri estriles y dejar enfriar.
Controlar en la incubadora a 37C por 24 horas.
Agar chocolate
Una vez preparado el agar sangre, y calentarlo en bao Mara a 80, agitando suave y
constantemente hasta que el medio tome un color chocolate. El tiempo necesario depende de la
sangre que se este utilizando y el uso que se le va a dar.
Dejar enfriar a 50C antes de plaquear.
ESQUEMA DE TRABAJO
1 hora Pesado y Preparacin de medios
2 y 3 hora Esterilizacin en autoclave
4 hora Preparacin y plaqueado de medios
CUESTIONARIO
1. Que importancia tiene el uso de los medios slidos.
2. Que sustancia es la encargada de solidificar los medios slidos y de donde se extrae.

Realice un esquema del procedimiento y dibuje los medios preparados.

PRACTICA 7
METODOS DE SIEMBRA

INTRODUCCION
Las muestras clnicas pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razn se utilizan
diversas tcnicas para separar un microorganismo de otro y obtenerlos en cultivo puro, para luego
identificarlos estudiando sus caractersticas de cultivo, bioqumicas, susceptibilidad a antibiticos, etc. La
siembra por estras si se ejecuta correctamente es el mtodo ms til para obtener colonias aisladas y
cultivos puros.
OBJETIVO
Adiestrar al estudiante de bacteriologa las tcnicas de siembra de muestras y aislamiento para la
obtencin de cultivos puros de bacterias.
MATERIALES
Placas con agar nutritivo Tubos con caldo nutritivo
Tubos con agar en plano inclinado Tubos con agar en plano semi-inclinado
DEFINICIONES
Siembra.- Es la accin de poner en contacto bacterias con un medio de cultivo; en el cual luego de un
periodo de incubacin se van a desarrollar colonias. Los fines de la siembra son los de aislamiento de
la bacteria, su enriquecimiento, recuento poblacional y estudios bioqumicos.
Inculo.- Es la porcin de muestra que se siembra.
Resiembra y repicaje.- Es cuando se extrae con el asa o la aguja de cultivo una fraccin de las
colonias a partir de un medio slido o de un medio lquido y se lleva este inculo a otro medio lquido o
slido en el cual se evidencia el desarrollo de colonias por grmenes de una sola especie,
obtenindose el aislamiento bacteriano.
Cultivo puro.- Es aquel que consta de una sola especie bacteriana.
Cepa.- Es una especie bacteriana plenamente identificada por sus caractersticas morfolgicas,
fisiolgicas, bioqumicas y serolgicas.
MODALIDADES DE SIEMBRA
Siembra por estras
Consiste en repartir el inculo por la superficie del medio slido con el asa de Kolle, en forma de
lneas zigzagueantes.
Flamee hasta la incandescencia el asa de cultivo sobre la llama del mechero. Deje que enfre el asa.
Usando el dedo meique de la mano derecha, retire el tapn de algodn del tubo que contiene la
muestra. Flamee ligeramente la boca del tubo con la muestra. Tome una asada de la muestra. La
medida del inculo utilizado depende del estimado del nmero de bacterias que podra contener la
muestra. Coloque nuevamente el tapn sobre la boca del tubo.
Coloque el inculo sobre un extremo de la superficie de la placa de agar y estre toda la placa,
procurando que el espacio entre estra y estra sea el mnimo posible.
Flamee el asa de cultivo.
Siembra por agotamiento
Consiste en repartir el inculo sobre la superficie del medio slido produciendo lneas zigzagueantes
en tres o cuatro campos de la placa Petri, rotando sucesivamente la placa. Sirve para aislar bacterias
a partir de muestras muy contaminadas.
Flamee hasta la incandescencia el asa de cultivo sobre la llama del mechero. Deje que enfre el asa.
Destape el tubo que contiene la muestra y flamee ligeramente la boca del tubo con la muestra. Tome
una asada de la muestra. Coloque nuevamente el tapn sobre la boca del tubo.
Coloque el inculo sobre un extremo de la superficie de la placa de agar y estre la cuarta parte de la
superficie de la placa.
Rote la placa en un ngulo de 90 y estre tomando como punto de inicio la parte final de lo estriado
con anterioridad.
Repita el paso anterior y luego en este momento estre toda la superficie de la placa que falte.

Placa vertida
En esta modalidad de siembra el inculo se mezcla con el medio slido licuado (45C
aproximadamente). Se utiliza en el recuento de poblacin bacteriana.
Siembra por diseminacin
Consiste en sembrar sobre la superficie del medio slido a manera de monocapa obtenindose un
desarrollo homogneo. Sirve para pruebas de sensibilidad, estudios bacteriolgicos y desarrollo
masivo de cepas (recoleccin para vacunas).
Sumerja un hisopo con punta de algodn en un tubo con caldo con un cultivo bacteriano.
Exprima el exceso de lquido en la pared del tubo.
Estre sobre la superficie del medio
Siembra por puntura o picadura
Los medios de cultivo que se utilizan en tubos pueden estar en forma slida, lquida (caldos), o
semislida. En algunos casos se utiliza el asa de cultivo para la inoculacin, en otros es necesario la
utilizacin de la aguja de cultivo. Sirve para estudiar las caractersticas bioqumicas o morfolgicas.
Flamee el asa o aguja de cultivo sobre la llama del mechero, deje que se enfre.
Destape el tubo que contiene la muestra y flamee ligeramente la boca del tubo. Tome una asada de la
muestra y tape nuevamente el tubo que contiene la muestra. Destape el tubo que va a ser inoculado.
En un tubo con medio slido siembre por estras sobre la superficie de este.
En un medio semislido inocule con la aguja de puntura hasta antes de tocar el fondo del tubo.
En medios que tienen una parte inclinada y fondo, toque con la punta de la aguja de cultivo una
colonia y luego inocule primero el fondo del tubo y luego estre la superficie del medio.
En medios lquidos emulsione el cultivo en el medio.
Esquematice las diferentes formas de siembra utilizados en la prctica:

PRACTICA 8
OBSERVACION DE COLONIAS

INTRODUCCION
Las placas de Petri y los tubos sembrados e incubados a 37C por 18 a 24 horas, son retiradas de la
incubadora para realizar la "lectura" de las colonias anotando sus caractersticas de crecimiento en los
diferentes medios de cultivo.
Colonia.- Es el desarrollo masivo de microorganismos de una especie. Es una agrupacin de clulas
bacterianas que comparten las mismas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas cuando
se hallan en un medio slido o semislido y se han originado probablemente de una sola clula
progenitora. Las colonias elegidas para ser estudiadas debern estar separadas una de otra y
adecuadamente conservadas.
OBJETIVOS
Diferenciar las caractersticas de las colonias bacterianas.
Conocer las caractersticas de crecimiento de la colonia su forma, su tamao, etc.
PROCEDIMIENTO
Estudio de las colonias en medio slido
Observar las caractersticas morfolgicas de los distintos tipos de colonias, se enumeran y describen cada
una por separado. Teniendo en cuenta lo siguiente:
Cantidad: Hacer un recuento si es posible o dar una apreciacin (poco, regular, abundante) de las
colonias que son iguales.
Tamao: Se mide el dimetro de cada tipo diferente de colonia y se expresa en milmetros. Sern:
grandes: >de 4 mm, medianos: 2 a 4 mm, pequeos: 1 a <2 mm o puntiformes: <1 mm.
Forma: Redondeada, ovalada e irregular.
Borde: Enteros, ondulados, dentados, festoneados y filamentosos.
Elevacin: Plana, elevada, convexa, umbilicada, papilar o crateriforme.
Superficie o aspecto: Puede ser: Mucoide, Lisa, Rugosa, Brillante u opaca
Color: Puede verse si la colonia es incolora o pigmentada; indicar el color y el medio de cultivo.
Incoloros: Streptococcus.
Pigmentos propios: Pseudomonas aeruginosa (bacilo piocinico, colonias verdes). Bacteroides
melaninogenicus (colonias de color negro).
Color por el medio: Escherichia coli color rosado en agar MacConkey; Salmonella color negro en
agar SS.
Olor: Proteico, cido lctico, a heces, a frutas (agradable o desagradable).
Caractersticas debidas al medio de cultivo:
La hemlisis en Agar Sangre que puede ser Beta - hemolticas (halo claro que indica hemlisis
completa), alfa - hemolticas (halo verdoso que indica hemlisis parcial) o gamma - hemolticas
(ausencia de halo que indica no hemlisis).
Demostracin de la accin enzimtica sobre el sustrato del medio: Accin de proteasas, lipasas,
DNAsas entre otras
Fermentacin de carbohidratos.
ESTUDIO DE LAS COLONIAS EN MEDIO LIQUIDO
El desarrollo bacteriano en medio lquido se evidencia por la presencia de: sedimento, turbidez o
pelcula
HAGA ESQUEMAS DE LAS COLONIAS OBSERVADAS Y DE LA COLORACIN DE GRAM

PRACTICA 9
GENERO STAPHYLOCOCCUS

INTRODUCCION
El gnero Staphylococcus es una de las ms importantes de la familia Micrococcaceae; son cocos Gram
positivos, en forma de racimo y catalasa positivos, que producen una serie de enfermedades pero que
tambien forman parte de la flora normal del ser humano.
OBJETIVO
Conocer las caractersticas morfolgicas, culturales y bioqumicas de las principales especies de
Staphylococcus que producen infeccin humana.
CEPAS
Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
MATERIALES
2 Placas de agar sangre 1 Placa de agar Manitol Salado
1 Placa de Agar DNAsa 2 Placas de agar Mueller Hinton
Frasco gotero con Agua oxigenada 3% Acido clorhdrico 1 N
3 Discos de novobiocina 4 tubos con 2 mL de plasma
3 Hisopos de madera con punta de algodn
PROCEDIMIENTO
Da 1
Recibidas las cepas proceda a realizar un extendido y colorelo por el mtodo de Gram. Observe y
grafique la morfologa, disposicin y coloracin.

Inocular un tercio de la placa de Agar Sangre para cada cepa, de manera que se obtengan colonias
aisladas.
Sembrar en un tercio de la placa de Agar Manitol salado para cada cepa, no olvidar que este medio
posee alta selectividad y el inculo debe ser mayor.
Sembrar una placa de DNAsa agar, realizando pequeos inculos de acuerdo al esquema

Rotule sus placas e incbelas a 37C por 24 horas.
Siembre un tercio de la placa de agar Mueller Hinton con cada cepa utilizando un hisopo y ponga un
disco de novobiocina en el centro de la siembra.
Da 2
Examine las placas de agar sangre: Observe el color, tamao y actividad hemoltica de las colonias.
Prepare y examine un extendido coloreado por el mtodo de Gram de una de estas colonias, anote
sus observaciones.
Examine la placa de agar manitol salado, recuerde que en este medio crece casi exclusivamente
estafilococo. Observe si se produce cambio en las colonias y en la coloracin del medio debido a la
fermentacin del manitol, anote e interprete los resultados.
Con una aguja de cultivo o con un mondadientes tome una porcin de una de las colonias bien
aisladas y transfiralo a la superficie de una lmina portaobjetos, aada una o dos gotas de perxido
de hidrgeno al 3%, la rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas indica una reaccin
de catalasa positiva. Observe y grafique su resultado.
Examine la placa de agar DNAsa, bae la placa con cido clorhdrico 1N, se revelaran zonas claras
alrededor de las colonias que son desoxiribonucleasas positivas, observe e interprete los resultados.
Coloque una gota de suero fisiolgico estril sobre una lmina porta-objeto, emulsione suavemente
una porcin de una de las colonias en estudio. Coloque una gota de plasma junto a la gota de
suspensin bacteriana, mezcle bien. Rote el portaobjetos suavemente observando si se produce la
formacin de grumos lo cual indicara una prueba positiva para la coagulasa en lmina.
Tome 2 a 3 colonias de la placa de agar sangre e inocule un tubo de caldo plasma, agite e incube a
37C, observando cada meda hora durante las primeras cuatro horas para ver si se produce la
formacin de un coagulo visible dentro del tubo. Las pruebas que sean negativas a las cuatro horas
deben observarse despus de 24 horas de incubacin.
Mida el halo de inhibicin con el disco de novobiocina para cada cultivo de Staphylococcus.
Recordando las caractersticas de los diferentes tipos de estafilococos, realice la identificacin de las
cepas reportando sus resultados.
HAGA ESQUEMAS Y DIBUJOS DE SUS OBSERVACIONES

Cultivo A Cultivo B Cultivo C Cultivo D
Gram
Catalasa
Hemlisis Agar
sangre

Aspecto de la colonia

Color de la colonia
Crecimiento Agar
manitol salado

Dnasa
Coagulasa en lmina
Coagulasa en tubo
Novobiocina
Diagnstico


PRACTICA 10
STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS

OBJETIVO
Conocer las caractersticas morfolgicas y culturales de las especies que pertenecen a los gneros
Streptococcus y Enterococcus..
INTRODUCCION
En los procesos infecciosos de la faringe es importante identificar al Streptococcus pyogenes del
grupo A de Lancefield, por las complicaciones cardacas y articulares que de el puede provenir; asi
como otras especies que pueden producir cuadros neumnicos o septicmicos como el caso del
neumococo y del Streptococcus del grupo B. Los Enterococcus son responsables de infecciones
urinarias, infecciones intrahospitalarias y en otros lugares anatmicos.
CEPAS
Streptococcus pyogenes grupo A Streptococcus agalactiae grupo B
Enterococcus faecalis (enterococos) Staphylococcus aureus ATCC 25923
MATERIALES
2 Placas de agar sangre 2 Tubos con Agar Bilis esculina
2 Tubos con agar TSA con telurito de K. 2 Tubos con TSA con Cl Na 6,5%
1 Disco de Optoquina 1 Disco de Bacitracina 0.04 U
Desoxicolato de sodio al 10% Agua oxigenada
2 Tubos con 2 mL de suero fisiolgico Hisopos estriles

PROCEDIMIENTO
Da 1:
Cepas: Siembre las cepas de Streptococcus en mitades de placas de agar sangre
En la cepa de Streptococcus del grupo A, coloque sobre el inculo un disco de Bacitracina de 0.04 U
con la ayuda de una pinza previamente flameada.
Sobre la mitad de una placa de agar sangre trace una estra de la cepa de Streptococcus del grupo B en
forma perpendicular a una estra de Staphylococcus aureus (beta hemoltico). Ambas lneas no deben
tocarse. Incubar la placa a 37C por 24 horas.
En otra mitad siembre la cepa de enterococo
Da 2
Sembrar el Enterococcus en un tubo con agar bilis esculina, un tubo de TSA con cloruro de sodio al
6,5% y un tubo con agar tripticasa soya con telurito de potasio. Hacer lo mismo con la cepa de S.
agalactiae (control negativo). Incube a 37C por 24 horas.
Da 3:
Observe el crecimiento de los cultivos en los diferentes medios, anote las caractersticas de la colonia, el
tamao y la presencia de hemlisis.
Realice una coloracin de Gram de cada una de las colonias.
Realice la prueba de la catalasa con cada una de las colonias.
Examine la placa de agar sangre en la cual se coloc el disco de Bacitracina y verifique la sensibilidad:
Amplia zona de inhibicin alrededor del disco =Positivo
Crecimiento alrededor del disco =Negativo
Examine la placa en la que sembr la cepa de Streptococcus del grupo B. Una prueba de CAMP
positiva estar dada por una intensificacin de la hemlisis, que en la zona de interseccin con la cepa
de Staphylococcus, asumir la forma de una cabeza de flecha.
Examine el tubo con agar Bilis esculina. Una prueba positiva (hidrlisis de la esculina) estar dada por la
aparicin de un halo marrn o negro alrededor de la colonia.
Examine el tubo con agar tripticasa soya y telurito de potasio, Enterococcus faecalis crece en este medio
dando colonias de color negro.
Cuestionario
1. Cual es el fundamento de la reaccin de CAMP
2. Que especies de estreptococos se pueden encontrar en la boca
REALICE ESQUEMAS Y DIBUJOS DE SUS RESULTADOS.

PRACTICA 11
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE

COMPETENCIA
El alumno podr describir las caractersticas morfolgicas y culturales de Streptococcus pneumoniae y
podr hacer la diferenciacin en muestras clnicas.
INTRODUCCION
En los procesos infecciosos severos del tracto respiratorio alto y bajo, se puede aislar Streptococcus
pneumoniae siendo tambin un bacteria que puede causar casos de septicemia y meningitis tanto en
poblacin adulta como peditrica.
CEPAS
Streptococcus peumoniae Streptococcus viridans (aislada de boca)
Muestra de esputo
MATERIALES
3 Placas de agar sangre 1 placa de agar sangre azida de sodio
1 Placa de agar sangre con gentamicina 1 ratn blando de 15 a 20 g de peso
Discos de Optochin J eringa de tuberculina
Desoxicolato de sodio al 10% Agua oxigenada
4 Tubos con 2 mL de suero fisiolgico Hisopos estriles

PROCEDIMIENTO
Da 1:
Cepas: Siembre la cepa de Streptococcus pneumoniae en una placa de agar sangre y colocar un disco
de Optochin sobre el inculo.
Siembre una muestra de la boca en una placa de agar sangre azida de sodio por agotamiento
Siembre la muestra de esputo en una placa de agar sangre con gentamicina
Inocule 0,5 mL de la muestra de esputo por via intraperitoneal en una ratn blanco de 15 a 20 g de peso.
Incube las placas a 37C, por 24 horas en atmsfera de CO2.
Da 2
Sacrifique el ratn si este no esta muerte y en forma aseptica habra el torax y extraiga el corazn. Corte
el corazn y siembre la sangre en una placa de agar sangre y coloque un disco de Optochin. Realice
dos extendidos y coloreelos con Gram. Incube la placa a 37C por 24 horas.
De la placa de agar sangre azida realice el aislamiento de colonias alfa hemoltica en una placa de agar
sangre y coloque un disco de optochin en cada una de ellas.
Da 3:
Observe el crecimiento de los cultivos en los diferentes medios, anote las caractersticas de la colonia, el
tamao y la presencia de hemlisis.
Realice una coloracin de Gram de cada una de las colonias.
Realice la prueba de la catalasa con cada una de las colonias.
Observe lo sucedido alrededor del disco de Optoquina:
Sensible =Zona de inhibicin alrededor del disco >14 mm
Resistente =Sin crecimiento alrededor del disco o halo menor de 14 mm.
Haga una suspensin con las colonias de S. pneumoniae y Streptococcus viridans aislada de la boca y
aada unas gotas de desoxicolato de sodio al 10% y observe:
Positivo =Lisis total de la colonia con aclaracin del tubo con suero fisiolgico.
Negativo =No ocurre nada o se aclara muy ligeramente
Cuestionario
1. Cual es el fundamento para identificar neumococo con el disco de optochin.
2. Cuales son los antibiticos efectivos para el tratamiento de una infeccin por neumococo.
REALICE ESQUEMAS Y DIBUJOS DE SUS RESULTADOS.

PRACTICA 12
GNERO BACILLUS

CEPAS
Bacillus anthracis Bacillus subtilis
MATERIALES POR MESA
2 Placas de agar sangre 2 Placas de agar almidn
2 Tubos con medio de SIM 2 Tubos con gelatina nutritiva
2 tubos TSA +cloruro de sodio al 6,5% Batera para coloracin de esporas
PROCEDIMIENTO
Da 1
Una vez recibida las muestras, divida en dos una placa de agar sangre y siembre ambas cepas, una a
cada lado de la placa. Incube a 37C por 24 horas.
Divida del mismo modo en dos una placa de agar almidn y siembre ambas cepas una en cada lado de
la placa. Incube a 37C por 24 horas
Siembre por puntura en el medio SIM y en los tubos con gelatina nutritiva y TSA con cloruro de sodio al
6,5%, incube a 37C por 24 horas.
Siembre las cepas en los tubos con caldo nutritivo, incube a 37C por 24 horas.
Da 2
Revise las placas de agar sangre y observe las colonias de Bacillus que son grandes, blanco
grisceas, de borde irregulares y que tienden a expandirse. Verifique la produccin de hemlisis. Es
una caracterstica til para diferenciar al B. anthracis, que no produce hemlisis, de los saprfitos que
provocan beta hemlisis.
Tome una porcin de las colonias en agar sangre y realice un extendido en dos lminas portaobjetos;
coloree una por el mtodo de Gram y la otras para coloracin de esporas con Verde de malaquita.
Observe: En la lmina coloreada con Gram se observan los bacilos Gram positivos, en cadenas, en los
cuales las esporas se observan como reas sin colorear dentro de la clula.
En la lmina coloreada con Verde de Malaquita, las esporas se observan de color verde sobre un fondo
rojo tomado por la bacteria.
Sobre el desarrollo en la placa de agar almidn vierta unas gotas de lugol hasta baar la placa,
observe. La aparicin de un halo claro alrededor de las colonias indicara que el almidn del medio ha
sido hidrolizado.
Revise sus tubos con gelatina nutritiva y verifique la licuefaccin de esta.
B. anthracis no lica la gelatina y desarrolla en este medio dando un aspecto de pino invertido.
Verifique la movilidad en el medio SIM, la cual se ve como un halo difuso alrededor de la zona de la
puntura.
Realice dibujos y esquemas de sus observaciones

PRACTICA 13
Gnero Listeria

CEPAS
Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus
Listeria ivanovii Rodococcus equi
MATERIALES
2 Placas de agar sangre 1 Placa de agar tryptosa
4 tubos con Medio SIM
PROCEDIMIENTO
Da 1
Una vez recibida las muestras siembre las cepas de Listeria en agar sangre y agar triptosa.
Siembre una placa de agar sangre con las cepas de Listeria y en forma perpendicular la cepa de S.
aureus y Rodococcus equi de acuerdo al esquema. Incube a 37C por 24 horas.
Listeria
monocytogenes
Staphylocococus
aureus
Rodococcus
equi
Listeria
ivanovii

Siembre dos tubos con medio SIM de cada cepa e incube un tubo a temperatura ambiente y otro en la
incubadora por 24 horas.
Da 2
Revise las placas y observe las colonias. Descrbalas
Tome una porcin de las colonias y realic un extendido en lminas portaobjetos; coloree por el
mtodo de Gram. Observe la presencia de bacilos Gram positivos cortos.
Vea la prueba de CAMP, haga un esquema.
Vea la movilidad y dibuje el tipo de movilidad y a que temperatura se desarroll. Discuta por que.


PRACTICA 14
MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

DESCRIPCION
En el diagnstico de tuberculosis se utilizan dos mtodos: la observacin del agente por medio una
coloracin de Zhiel Neelsen que se denomina baciloscopa y el aislamiento del agente mediante el cultivo
en medios especiales. La baciloscopa es un mtodo importante en el diagnstico de la tuberculosis y en el
control de la evolucin del tratamiento as como la evaluacin epidemiolgica y operacional. Es una tcnica
bsica, sencilla, eficaz y de bajo costo, debiendo ser usado preferentemente en los sintomticos
respiratorios y luego, segn los recursos en contactos y grupos de alto riesgo.
El cultivo se realiza en el medio de Ogawa y despus de 30 a 60 das se observan las colonias. El cultivo
esta indicado cuando se trata de muestras que por su escaso contenido bacilar deben ser procesadas por
una tcnica ms sensible, para el diagnstico de tuberculosis extrapulmonar o para realizar la sensibilidad
en casos de fracaso del tratamiento.
MATERIALES
Muestras de esputo positivo Bajalenguas de madera
Fenol al 5% Batera para coloracin de Zhiel Neelsen
Mascarillas descartables Mechero de alcohol
Muestras de esputo BK positivo Hidrxido de sodio al 4%
Tubos 16 x 100 Bajalenguas de madera
Fenol al 5% Medio de Ogawa
Pipetas Pasteur Pipeta de 1 mL
Chupn para pipeta Medio de Ogawa

COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN
Preparacin del extendido
Colocar sobre la mesa de trabajo una hoja doble de papel peridico, humedecido con fenol al 5%.
Tomar la lmina portaobjetos y con un lpiz de cera trazar una lnea que divida su superficie en una
tercera parte destinada a la numeracin y dos terceras partes para hacer el extendido.
Destapar cuidadosamente el envase colocndolo cerca al mechero.
Dividir a lo largo un bajalenguas de madera en dos o tres partes para obtener aplicadores. Seleccionar
la partcula til, que es la porcin mucopurulenta de color amarillo verdoso, enrrollndola en el
aplicador.
Colocar la partcula til sobre el portaobjeto y extender, haciendo movimientos de vaivn, hasta lograr
que el extendido sea homogneo (ni muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lmina.
Incinerar los aplicadores o colocarlos en un envase para luego esterilizarlos.
Dejar secar la lmina, y luego fijar al calor con la ayuda de la llama de un mechero.
Coloracin
Cubrir el extendido con el fucsina bsica fenicada, previamente filtrado.
Calentar suavemente con la llama de un mechero hasta la emisin de vapores, dejar enfriar. Repetir el
proceso 3 veces, no debe hervir la preparacin. El tiempo de coloracin debe ser de 5 minutos.
Eliminar la fucsina y lavar con agua corriente para eliminar el colorante.
Cubrir la superficie del extendido con la solucin de alcohol cido y decolorar hasta que el extendido
tenga una coloracin clara o rosa plido.
Lavar nuevamente la lmina con agua.
Cubrir la superficie con azul de metileno, previamente filtrado, durante 30 segundos a un minuto.
Eliminar el azul de metileno y lavar la lmina con agua. Dejar secar.


Observacin de las laminas
Objetivos: determinar si hay bacilos cido-alcohol resistentes (BAAR) y establecer su nmero
aproximado.
Observar al microscopio con lente de inmersin (1000 x).
Los bacilos aparecen como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, teidos de rojo, aislados, en
parejas o en grupos sobre un fondo azul claro.
Seguir una pauta uniforme de observacin, leyendo de izquierda a derecha del extendido un mnimo de
100 campos tiles, equivalentes a 5 minutos.
Se considera campo microscpico til aquel en el cual se observa elementos celulares de origen
bronquial (leucocitos, fibras mucosas o clulas ciliadas). Los campos en que no aparezcan dichos
elementos no deben contabilizarse en la lectura.
Informe de resultados
Se utiliza la siguiente escala semicuantitativa:
Negativo No se encuentran bacilos cidos alcohol resistentes (BAAR)
en 100 campos microscpicos observados
Positivo 1+ Menos de un BAAR por campo, en 100 campos observados
(de 10-99 BAAR).
Positivo 2+ 1 a 10 BAAR por campo, en 50 campos observados.
Positivo 3+ Ms de 10 BAAR por campo en 20 campos observados.
Si en un extendido se encuentra de 1 a 9 bacilos en 100 campos observados, observar 100 campos
ms. Si persistiese el resultado, realizar otro extendido de la misma muestra e informar lo encontrado
(Ej. 5 BAAR en 100 campos) y solicitar nueva muestra.
Al trmino de la lectura retirar la lmina de la platina del microscopio, limpiar el aceite de inmersin con
tolueno y guardar la lmina. Limpiar con papel lente humedecido con tolueno el exceso de aceite del
objetivo de inmersin del microscopio.
Las muestras de esputo deben autoclavarse o incinerarse antes de ser descartadas.
Cultivo
Mezclar un parte de esputo con 4 partes de Hidrxido de sodio al 4%, homogeneizar y poner 25
minutos en la estufa a 37C.
Con una pipeta tomar 0.1 mL del homogeneizado y sembrar un tubo de medio de Ogawa al 3%.
Incubar por 6 semanas a 37C.
Observar el aspecto de las colonias de M. tuberculosis en el medio de Ogawa y describir sus
caractersticas.

REALICE ESQUEMAS Y DIBUJOS DE LOS PROCEDIMIENTOS
PREGUNTAS
1. Cada alumno recibir una lmina para su coloracin (trabajo individual)
2. Anote los resultados de las 5 lminas recibidas para bacilosocopa (trabajo en grupo):

Identificacin Resultado Cuantificacin
1
2
3
4
5
3. Porque los extendidos no deben llegar hasta los bordes?
4. Que utilidad tiene usar el papel embebido en fenol?

PRACTICA 15
ENTEROBACTERIAS I

CEPAS
Escherichia coli Enterobacter aerogenes
Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca
MATERIALES POR MESA
2 Placas de agar Mac Conkey 2 Placas de agar Eosina Azul de metileno (EMB)
4 Tubos con caldo nutritivo 4 Tubos con agar Triple Sugar Iron (TSI)
4 Tubos con agar Lisina hierro (LIA) 4 Tubos con medio SIM
4 Tubos con caldo glucosado (MR-VP) 4 Tubos con agar Citrato de Simmons
Reactivo de Kovacs Solucin de Rojo de metilo
Alfa naftol al 5% Hidrxido de potasio al 40%
Agar urea o caldo urea
PROCEDIMIENTO
Da 1
Recibida las cepas proceda a hacer una emulsin de cada una en caldo nutritivo.
Siembre cada una de las cepas en una placa de agar Mac Conkey y agar Eosina Azul de metileno
(EMB) tratando de obtener colonias aisladas. Incubar a 37C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura en los tubos de TSI y LIA, el profesor de prcticas le indicar la forma
correcta de hacerlo.
Prueba de IMVIC: Siembre cada una de las cepas en caldo peptonado, un tubo con caldo glucosado y
un tubo con Citrato de Simmons, incubar por 24 horas a 37C.
Da 2
Observe el desarrollo obtenido en el agar Mac Conkey y EMB, identifique las colonias lactosa positivas
en el agar Mac Conkey y la presencia de brillo metlico en el EMB, anote sus observaciones.
TSI: Observe las reacciones ocurridas en el medio, interprete y grafique los resultados.
Las bacterias que fermentan la glucosa dan una reaccin alcalina en el plano inclinado y cida en el
fondo (K/A).
Si adems fermenta glucosa y/o sacarosa se produce acidez suficientes para acidificar tanto el
fondo como el plano inclinado (A/A).
La produccin de gas se verifica por la aparicin de cavidades en el medio y la produccin de
hidrogeno sulfurado (H2S) como un precipitado de color negro (que pueden ir de 1 a 4+).
LIA: Observe las reacciones ocurridas en el medio, interprete y grafique los resultados.
Las bacterias que descarboxilan la lisina originan una reaccin alcalina (color prpura) en todo el
medio (K/K).
Los microorganismos que no descarboxilan la lisina producen un plano inclinado alcalino y un fondo
cido (K/A).
Los cultivos de Proteus, Providencia y Morganella producen un plano inclinado de color rojo y un
fondo cido (R/A).
PRUEBA DE ROJ O DE METILO: A tubo con caldo glucosado separar la mitad en otro tubo, y agregar 5
gotas de una solucin de rojo de metilo al 0.04%.
Positivo: El medio cambia a un color rojo magenta.
Negativo: El medio queda de color amarillo o ligeramente rosado.
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER: Al tubo que se haba separado caldo glucosado, se debe aadir
0.2 mL de alfa naftol al 5% y 0.2 mL de Hidrxido de potasio al 40%. agitar bien el tubo y dejarlo en
reposo
Positivo: Presencia de color rosa.
Negativo: No hay cambio de color.
UTILIZACION DE CITRATO: Observar la presencia de crecimiento en el plano inclinado y cambio en el
color del medio frente a un tubo no inoculado.
Positivo: Presencia de color azul brillante y crecimiento en el medio de cultivo.
Negativo: No se observa crecimiento ni cambio de color.
CALDO UREA: Observe las reacciones ocurridas en el medio, las bacterias productoras de ureasa
hidrolizan la urea para formar amoniaco:
Positivo: Medio de color rojo
Negativo: El medio no cambia de color.
MEDIO SIM PRUEBA DE INDOL: Aadir 0.2 mL de reactivo de Kovacs al tubo con caldo peptonado
inoculado, agitar y dejar reposar, observar el resultado.
Positivo: Se forma un anillo color rojo cereza en la parte superior del medio.
Negativo: No se observan cambios en el color del medio.
MEDIO SIM PRUEBA DE MOVILIDAD: Observar el crecimiento de la bacteria en el medio semislido
Positivo: Turbidez en el medio
Negativo: Solo se observa crecimiento en la lnea de puntura.
Describa el tipo de colonias observadas:
COMPLETE LOS ESQUEMAS Y DIBUJOS DE ACUERDO A SUS OBSERVACIONES:

MC EMB TSI LIA MR VP CIT UREA SIM
BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________

PRACTICA 17
ENTEROBACTERIAS II

CEPAS
Salmonella paratyphi A Shigella flexneri
Salmonella typhi Salmonella paratyphi B
MATERIALES POR MESA
2 placas de agar XLD 2 placas de agar SS
4 Tubos con caldo glucosado (MR-VP) 4 Tubos con Citrato de Simmons
Reactivo de Kovacs Rojo de metilo
Kit de sueros para Salmonella Kit de sueros para Shigella
PROCEDIMIENTO
Da 1
Siembre cada una de las cepas en una placa de agar Mac Conkey y EMB tratando de obtener colonias
aisladas. Incubar a 37C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura en los tubos de TSI y LIA.
Prueba de IMVIC: Proceda como en la prctica anterior.
Da 2
Observe el desarrollo obtenido en el agar Mac Conkey y EMB, diferencie con respecto a las colonias
lactosa positivas de la prctica anterior.
Observe y anote los resultados de las reacciones en los diferentes medios de cultivo.
Serologa para Salmonella y Shigella: en una lmina portaobjetos poner una gota de suero fisiolgico,
hacer una suspensin densa con la colonia sospechosa y aadir una gota pequea del suero
polivalente, mezclar y agitar por 2 minutos, es positivo si se observa aglutinacin.
Cuestionario:
1. Que enzima desdobla la lactosa y como acta?
2. En que se diferencia una Escherichia coli enteropatgena de una E. coli enterohemorrgica?
3. En que se diferencia una E. coli enteroinvasiva de una Shigella

BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________


PRACTICA 18
ENTEROBACTERIAS III

CEPAS
Citrobacter freundii Proteus mirabilis
Morganella morganii Serratia marcesens
MATERIALES POR MESA
4 Tubos con caldo glucosado (MR-VP) 4 Tubos con Citrato de Simmons
Reactivo de Kovacs Rojo de metilo
4 tubos de agar urea
PROCEDIMIENTO
Da 1
Siembre cada una de las cepas en una placa de agar Mac Conkey y EMB tratando de obtener colonias
aisladas. Incubar a 37C por 24 horas.
Inocule con la aguja de puntura en los tubos de TSI y LIA.
Prueba de IMVIC: Proceda como en la prctica anterior.
Inocule los tubos de agar urea
Da 2
Observe el desarrollo obtenido en el agar Mac Conkey y EMB, diferencie con respecto a las colonias
lactosa positivas de la prctica anterior.
Observe y anote los resultados de las reacciones en los diferentes medios de cultivo..
Cuestionario:
1. Que diferencia existe entre el agar urea y el caldo urea?
2. cual es el mecanismo bioqumico de utilizacin de la urea?
3. A que se debe el pigmento producido por Serratia?

BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
BACTERIA_______________________________________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________
TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
Ur ea: _______
SI M: ________


PRACTICA 19
GNERO VIBRIO

COMPETENCIA
El alumno estar capacitado para realizar el aislamiento y la identificacin de los vibrios ms comunes
aislados en nuestro pas.
CEPAS
Vibrio cholerae O1 Inaba Vibrio cholerae O1 Ogawa
Vibrio cholerae No O1 Vibrio parahaemolyticus
MATERIALES POR MESA
2 Placa de agar TCBS 4 Tubos con caldo peptonado alcalino
4 Tubos con agar Triple Sugar Iron (TSI), 4 tubos con LIA +0,5 % ClNa
4 tubos con Medio MR-VP 4 tubos con Agar Citrato de Simmons
4 tubos Agar LIA 4 tubos con medio SIM
Caldo nutritivo con 0, 1, 3, 7 y 10% de sal 4 Tubos agar Lisina hierro (LIA),
Tubos con TSA en plano inclinado Reactivo de oxidasa
Desoxicolato de sodio al 0,5% Papel filtro
Kit de sueros para Vibrio cholerae Tiras con reactivo de Gilles para Indol
PROCEDIMIENTO
Da 1
Haga un extendido del cultivo recibido y colorearlo por el mtodo de Gram. Observe y grafique.
Haga una suspensin de las cepas en caldo peptonado alcalino e incube
Prepare una suspensin de la bacteria e inocule una placa de agar TCBS e incube a 37C por 24 horas.
Da 2
Examine las placas de agar TCBS, dibuje el color y tamao de las colonias, interprete sus resultados.
Con una aguja de puntura tome una de las colonias e inocule los tubos con medios diferenciales y la
batera de tubos para evaluar el crecimiento en presencia de sal. Siembre una juego de tubos con
medios normales (sin adicionar la sal)
Coloque una tira de papel de filtro impregnado en reactivo de Gilles en la boca del tubo de LIA.
Asimismo inocule el tubo de TSA.
Incube a 37C por 18 a 24 horas.
Da 3
Observe las reacciones obtenidas en los medios inoculados, anote e interprete los resultados.
Verifique la produccin de indol por el cambio de coloracin a rosado del papel impregnado con el
reactivo de Gilles.
Impregne una tira de papel de filtro con reactivo de oxidasa y con ayuda de un mondadientes tome una
porcin del desarrollo en TSA y tope con esta el papel impregnado, verifique el cambio de coloracin a
azul del papel lo que indica una reaccin positiva.
Coloque una gota de desoxicolato de sodio al 0.5% sobre una lmina portaobjetos, luego tome una
porcin del desarrollo en TSA y haga una emulsin en el desoxicolato, con cuidado levante suavemente
el asa y observe la formacin de un filamento que asemeja un collar de perlas.
CUESTIONARIO
1. Existe diferencia en el tubo de LIA cuando se le aade sal. Cual es la explicacin.
D
I
A

1
D
I
A

3
D
I
A

2

TCBS
BACTERIA____________________________________________
TSI LIA MR VP CIT LIA+S SIM
0% 1% 3% 7%
TOLERANCIA A LA SAL
10%
Gram

Oxidasa

P.cuerda

TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
SI M: ________
TCBS
BACTERIA____________________________________________
0% 1% 3% 7%
TOLERANCIA A LA SAL
10%
Gram

Oxidasa

P.cuerda

TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
SI M: ________


TCBS
BACTERIA____________________________________________
0% 1% 3% 7%
TOLERANCIA A LA SAL
10%
Gram

Oxidasa

P.cuerda

TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
SI M: ________
TCBS
BACTERIA____________________________________________
0% 1% 3% 7%
TOLERANCIA A LA SAL
10%
Gram

Oxidasa

P.cuerda

TSI : ________
LI A: ________
I MVi C: ______
SI M: ________

PRACTICA 20
CAMPYLOBACTER

MATERIALES POR MESA
Muestra tomadas por los alumnos Medio de transporte de Cary y Blair
Hisopos con punta de algodn 1 placa de Agar sangre Butzler
Reactivo de oxidasa Agua oxigenada al 3%
Mercurio cromo Cristal violeta para Gram
Campana de microaerofilia Filtro estril de 0,45 m
Cepa de Klebsiella 1 placa de agar sangre
Da 1
Los alumnos obtendrn muestras de heces de pollo, con un hisopo estril, el cual colocaran en el medio
de transporte de Cary y Blair. A la vez realizarn dos extendidos de la muestra en lminas portaobjetos
para luego colorearlo por el mtodo de Gram y el de Vago. El medio de transporte se debe conservar a
temperatura de refrigeracin (2-8C).
En el laboratorio sembrar las muestras en una placa de agar sangre con suplemento antibitico de
Butzler segn las indicaciones del profesor y colocar en una campana con atmsfera de microaerofilia
incubando a 42C por 48 horas.
Corte el filtro en 4 partes utilizando unas tijeras estriles, coloque una parte en la mitad de una placa de
agar sangre, deposite 200 uL de una suspensin de la muestra de heces sobre el filtro en forma de
pequeas gotas, espere 20 minutos hasta que se filtre y retire el filtro. Siembre en la otra mitad por
diseminacin una cepa de Klebsiella. Selle la placa con un guante e incube a 42C por 48 horas.
Da 3
Las placas son examinadas a las 48 horas para observar las colonias caractersticas que son planas, no
hemolticas, grises y que pueden seguir la lnea de siembra.
Realizar un extendido de una de las colonias y colorearlo por el mtodo de Gram. Observe la morfologa
de Campylobacter que puede ser en forma de S o curvados (ala de gaviota). Grafique los resultados.
Tome una porcin de una colonia con un mondadientes y colquelo sobre una tira de papel de filtro
impregnado con reactivo de oxidasa, observe si se produce el cambio de coloracin a azul lo que
indicara una prueba positiva.
Tome asimismo una porcin de la misma colonia y realice la prueba de la catalasa colocndola sobre
una lmina portaobjetos y agregando agua oxigenada al 3%, verifique si se produce el burbujeo.
Anote los resultados de las 5 muestras recibidas para bsqueda de Campylobacter

Identificacin Resultado
1
2
3
4
5
CUESTIONARIO
1. Que mtodos se pueden utilizar para crear una atmsfera ideal para el crecimiento de Campylobacter.
2. Cual es el tratamiento recomendado para una diarrea producida por esta bacteria?

PRACTICA 21
BACILOS GRAM NEGATIVOS NO FERMENTADORES

CEPAS
Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Alcaligenes faecalis Acinetobacter calcoaceticus
MATERIALES
Placas de agar sangre Placas de agar Mac Conkey
Tubos con agar TSI Tubos con medio O-F de Leifson con glucosa
Medio de LIA Medio SIM
Caldo nitrato Vaselina lquida estril
Reactivo para oxidasa Reactivos para nitrato
Papel filtro Mondadientes estriles
PROCEDIMIENTO
Da 1
Siembre una placa de agar sangre y otra de Mac Conkey con las cepas proporcionadas.
Incubar a 37C por 24 horas.
Da 2
Observe y anote las caractersticas de las colonias que desarrollaron tanto en las placas de agar
sangre como en las de agar Mac Conkey.
Por cada cepa inocule tubos de TSI, LIA, SIM y 2 tubos de medio O/F con glucosa. El OF debe
inocularse con una aguja de puncin que atraviese el medio hasta llegar casi al fondo del tubo y cubrir
uno de los tubos con una capa de 1 mL de vaselina lquida estril, dejando el otro tubo expuesto al aire.
Incubar a 37C por 48 horas.
Inocule por cada cepa un tubo de agar nitrato y otro con agar Citrato de Simmons.
Sobre una de las colonias que desarrolla en la placa de agar sangre agregue una gota de reactivo para
la prueba de oxidasa. Observe si se produce el cambio de color de la colonia a azul oscuro, lo que
indicara una prueba positiva.
Da 3
Observe las reacciones bioqumicas, compare los resultados obtenidos de las bacterias sembradas.
Observe las reacciones obtenidas en el medio O/F. La aparicin de un color amarillo en el medio
indicara la produccin de cido.
Los microorganismos fermentadores producen un cambio de color en ambos tubos.
Los microorganismos oxidadores solo producen una reaccin de acidez en el tubo que esta
expuesto al aire (oxidacin) que se nota primero cerca de la superficie del medio y luego se
extiende en todo el tubo.
Los microorganismos no fermentadores (no sacarolticos) no cambian el color de los tubos.
Aada los reactivos para la prueba de nitrato, observe la produccin de un color rojo en el medio.

PRACTICA 22
GNERO NEISSERIA

CEPAS
Neisseria gonorrhoeae Neisseria sicca
Neisseria lactamica Secrecin uretral obtenida por los alumnos
MATERIALES
2 Placas de agar chocolate 1 placa de agar sangre
1 placa de agar Mac Conkey Hisopos estriles
Tubos con medio de transporte de Stuart o
Amies
4 sets de Agar Cistena tripticasa (CTA) con
azucares: glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa
Tubos con agua destilada estril Reactivo para oxidasa
Palitos mondadientes
PROCEDIMIENTO
Da 1:
Los alumnos se dirigirn a un dispensario antivenreo portando medios de transporte de Stuart o Amies,
laminas portaobjetos e hisopos estriles.
Tomar una muestra de secrecin uretral purulenta con un hisopo estril, colocar el hisopo en el medio
de transporte. Con otro hisopo tomar una segunda muestra y realizar un extendido en varias lminas
portaobjetos rotando el hisopo sobre la superficie de la lmina. Este material as trabajado se llevar al
laboratorio para la prctica.
Sacar el hisopo del medio de transporte y sembrar con el una placa de agar chocolate trazando con el
hisopo impregnado de la secrecin una "Z" a lo largo de la placa, luego con el asa de siembra proceda a
realizar estras sobre el trazo realizado con el hisopo.

Coloque la placa en una campana de vidrio o en una J arra tipo Gas-Pak, prenda una vela pequea
dentro de la campana, cierre la campana y coloque en la estufa a 37C por 24 horas.
Con la lmina trada del dispensario, hacer una coloracin de Gram, observe la morfologa, coloracin y
disposicin de las Neisserias.
Sembrar las cepas suministradas en mitades de placas de agar sangre, agar chocolate y agar Mac
Conkey. Incubar a 37C con el agar Chocolate en atmsfera de CO
2
, las dems placas en atmsfera
normal.
Da 2
Examine la placa de agar chocolate a las 24 horas.
Si no hay desarrollo, retorne la placa inmediatamente a la campana de CO2 e incube 24 horas ms.
Si hay desarrollo observe el tipo, color y tamao de las colonias.
Recoger el desarrollo de cada cepa de la placa de agar chocolate en aproximadamente 0.5 mL de suero
fisiolgico.
Con el asa de cultivo tomar la suspensin bacteriana densa e inocular solo los 5 mm superiores del
medio CTA con carbohidratos, incinerar el asa antes de inocular un nuevo tubo de medio.
Tapar hermticamente los tubos y colocarlos en una incubadora a 37C, dejndolos por lo menos 72
horas antes de descartarlos como negativos.
Da 3
Tome unas colonias y realice un extendido, coloree con Gram y observe.
Agregue una gota de reactivo de oxidasa sobre algunas de las colonias y observe:
La colonia se colorea de azul oscuro =Oxidasa positivo
No hay cambio de color =oxidasa negativo
El color puede variar de acuerdo al tipo de reactivo pudiendo ser de color rojizo. Alternativamente se
puede sacar una colonia con un palito mondadientes y estriarlo en papel filtro, luego se aade una gota
del reactivo de oxidasa. No usar asas de nicrn porque pueden dar falsos positivos.
Observe los resultados en los tubos de CTA con carbohidratos. La aparicin de una banda amarilla en la
parte superior del medio indica la produccin de cido y se interpreta como prueba positiva de utilizacin
de hidratos de carbono.
Realice la identificacin.
REALICE UN ESQUEMA DE SUS OBSERVACIONES:
Cultivo 1 Cutivo 2 Cultivo 3 Muestra
Gram
Color de la colonia
Aspecto de la
colonia

Oxidasa
CTA glucosa
CTA maltosa
CTA lactosa
CTA sacarosa

D
I
A

1
D
I
A

3
D
I
A

2

PRACTICA 23
HAEMOPHILUS INFLUENZAE

CEPAS
Haemophilus influenzae Staphylococcus aureus
MATERIALES POR MESA
Agar tripticasa soya x 100 mL Sangre de carnero x 10 mL
Discos con factores X y V Placas de agar tripticasa soya
Hisopos con punta de algodn Placas de agar sangre
5 Placas Petri estriles 5 tubos de Caldo tripticasa soya x 2 mL
PROCEDIMIENTO
Da 1
Preparar agar chocolate: Pesar 4 g de TSA y colocar en un frasco de 150 m, Aadir 100 mL de agua
destilada. Esterilizar en autoclave a 121 C por 15. Dejar enfriar a 50C. Aadir de 5 a 10 mL de sangre
de carnero. Mezclar sin formar espuma. Calentar en bao mara a 80C por 10 minutos. Dejar enfriar a
50C. Repartir en 5 placas
Una vez recibida las muestras siembre la cepa de Haemophilus en agar chocolate y agar sangre,
siembre en forma perpendicular la cepa de S. aureus en la placa de agar sangre. Incube a 37C por 24
horas.
Estra de S. aureus

Requerimiento de factor V y X: prepare una suspensin en caldo tripticasa soya. Teniendo cuidado de
no transferir medio al caldo. Remoje un hisopo de algodn estril en la suspensin y siembre por
diseminacin en una placa de agar tripticasa soya, y colocar discos conteniendo factores V y X a una
distancia de 2 cm. Incube a 37C por 24 horas
Da 2
Revise las placas y observe las colonias. En agar chocolate, H. influenzae aparece como colonias
opacas grandes, planas, de incoloras a grises. No hay hemlisis o decoloracin aparente del medio. Las
cepas encapsuladas son ms mucoides (acuosas) que las no encapsuladas, que aparecen como
colonias compactas grisceas.
Revise la placa con los discos de papel conteniendo factores X y V; H. influenzae crecer entre los dos
discos.
Tome una porcin de las colonias y realice un extendido en lminas portaobjetos; coloree por el
mtodo de Gram. Observe la presencia de cocobacilos Gram negativos.
Haga esquemas y dibujos de sus observaciones.


PRACTICA 24
GENERO BRUCELLA

CEPAS
Placas sembradas con Brucella melitensis Placas sembradas con Brucella abortus
Suspensin de Brucella sp.
MATERIALES
Tubos con agar tripticasa soya Tubos con caldo urea
Placas de agar TSA con tionina 1/50,000 Placas de agar TSA con fucsina 1/50,000
Tiras de papel con acetato de plomo Reactivo de oxidasa
Tubos con caldo TSB Campana de CO
2

Hisopos estriles
PROCEDIMIENTO
Da 1
Observe la placa de agar tripticasa soya y describa el tipo de colonia
Observe la placa de agar sangre y determine la presencia de hemlisis.
Prepare un frots en una lmina portaobjetos con la suspensin provista y coloree con Gram. Observe
el microscopio, Brucella se presenta como cocobacilos Gram negativos.
Da 2
Tome una tira de papel de filtro, humedzcala con una gota de reactivo de oxidasa y con ayuda de un
palito de dientes tome una colonia y colquela sobre el papel, la aparicin de un color azul oscuro o
rojizo (dependiendo del tipo de reactivo) es indicativo de una reaccin positiva.
Tome una porcin de la colonia con una aguja de puntura, colquela sobre una lmina portaobjetos y
luego agregue una gota de agua oxigenada al 3%, observe. Si la prueba es positiva se observar la
aparicin de un burbujeo.
Siembre dos tubos con TSA, incbelos a 37C, dejando uno en campana de CO
2
y el otro en atmsfera
normal durante 48 horas.
En el tubo de agar TSA que se coloca en campana de CO
2
poner una tira de papel con acetato de
plomo, tenga cuidado de que el papel no toque el medio.
Inocule un tubo con caldo urea con una asada de cultivo del agar sangre, incube a 37C y observe a
los 15, 30, 60 minutos y a las 24 horas.
Prepare una suspensin densa del desarrollo en la placa de agar sangre y con un hisopo estril
mojado en la suspensin haga una estra en cada una de las placas con colorantes, incube a 37C por
48 horas.
Da 3
Examine sus tubos de TSA sembrados y observe en cual de ellos se produjo crecimiento. Si desarrollo
tan solo en el tubo que se incub en campana de CO
2
indica que la bacteria necesita de anhdrido
carbnico para su desarrollo.
Observe si el extremo del papel con acetato de plomo que se coloc en el tubo de TSA se ha
oscurecido, lo que indica la produccin de hidrgeno sulfurado.
Observe si el tubo con caldo urea que se sembr cambi de color a rosado, lo que indica una prueba
positiva.
Verifique si se produjo desarrollo visible en las placas con colorantes.
Con los resultados obtenidos, realice la identificacin de las cepas.
ANOTE Y GRAFIQUE SUS RESULTADOS.

PRACTICA 25
BACTERIAS ANAEROBICAS

CEPAS
Clostridium sp. Peptostreptococcus anaerobius
Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae
MATERIALES
3 Placas de agar chocolate 1 Placa de agar Mac Conkey
2 Placas de agar Brucella con sangre,
vitamina K y hemina
1 Placa de Agar Brucella con sangre, Vitamina
K, Hemina, vancomicina y kanamicina
6 Tubos con Caldo tioglicolato fluido J arra de anerobiosis
Indicador de anaerobiosis Catalizador de paladio
Sobre de anaerobiosis Gas Pak Sobre de anaerobiosis Anaerocult P
Agua destilada Alcohol al 50%
Muestra de heces Tubos 16 x 100 estriles
Pipeta de 10 mL Clips para cerrar bolsas de anaerobiosis
Conos de papel para odontologa Bajalenguas
PROCEDIMIENTO
Da 1
Muestra de heces
Haga una suspensin de heces en alcohol al 50% y djelo una hora a temperatura ambiente o
realice la suspensin en suero fisiolgico y pngalo en bao mara durante 10 minutos.
Siembre dos placas de agar sangre anaerobio, una de las placas colquela en la incubadora en
atmsfera normal.
La otra placa colquela en la jarra de anaerobiosis, ponga el indicador, el catalizador y el sobre de
anaerobiosis; aadir el agua destilada al sobre y cerrar la jarra. Observar la presencia de vapor de
agua y el cambio del indicador de anaerobiosis. Incube a 37C por 48 horas.
Obtenga la muestra de microbiota bucal:
Tome una muestra de sarro o espacio periodontal en los dientes molares.
Siembre en la placa de agar Brucella con vancomicina y kanamicina,
Coloque la placa en la bolsa del Anaerocult.
En el lado de la tapa de la placa, coloque un indicador de anaerobiosis y un sobre de Anaerocult y
aada 3 mL de agua.
Ponga un clip e incube a 35 por 48 horas.
Da 3
Revise las placas y observe las colonias. Descrbalas
Tome una porcin de las colonias y realice un extendido en lminas portaobjetos; coloree por el
mtodo de Gram.
Realice una coloracin para ver la presencia de esporas.
Una vez recibida las cepas, simbrelas en los diferentes medios de cultivo. Siembre en caldo
tioglicolato e Incube a 37C por 24 horas

REVISE LOS SIGUIENTES PROCESOS
1. Funcionamiento de la jarra de anaerobiosis
2. Funcionamiento de los sobres para anaerobiosis
3. Como preparar un indicador de anaerobiosis
4. Medios que se utilizan para el cultivo de anaerobios
5. Como regenerar los catalizadores de paladio
6. Como funciona una cabina para anaerobiosis

DIA 1
Tratamiento:
Alcohol 50 x 1 h.
T 80C x 10
Anaerobios
Muestra de heces
Agar sangre
Anaerobio con
Hemina y
vitamina K
Agar sangre
Anaerobio con
Hemina Vit. K
Kanamicina
Vancomicina
Cultivo de
Klebsiella
Agar Mac
Conkey
Agar Bilis
esculina
gentamicina
Anaerobios
Ambiente Microaerofilia Anaerobiosis
Caldo tioglicolato
Gram
Incubar por 48 horas a 37 C
Ambiente Microaerofilia Anaerobiosis Caldo tioglicolato
Ambiente Microaerofilia Anaerobiosis
Caldo tioglicolato
Gram
1
2
3
4
5
6
RESULTADOS
1
2
3
4
5
6

PRACTICA 26
ANTIBIOGRAMA

OBJETIVO
Demostrar la susceptibilidad de los microorganismos frente a los antibiticos utilizando la prueba de
difusin en disco segn Kirby y Bauer.
INTRODUCCION
El mtodo de disco difusin para medir la susceptibilidad de los microorganismos frente a los antibiticos
nos permite categorizar a los aislamientos bacterianos como susceptibles, resistentes o intermedios.
Para el desarrollo de esta prueba se utilizan discos de papel filtro impregnados con la cantidad
especfica de los agentes antimicrobianos los mismos que son colocados en la superficie de un agar
donde previamente se ha sembrado la bacteria que se quiere probar.
CEPAS
Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923
Pseudomonas aeruginosa ATCC
MATERIALES
Medio de Mueller Hinton en placas Caldo de Mueller Hinton en tubos x 3 mL
Estndar de Mc Farland 0.5 Cloruro de Bario al 1% x 100 mL
Acido sulfrico al 1% x 100 mL Pinzas de punta plana
Hisopos con punta de algodn Discos de antibiograma
Tabla para la lectura de los halos de inhibicin Regla
Placas de Petri 15 x 100 estriles Tubos de prueba 13 x 100 estriles
PROCEDIMIENTO
Preparacin de medios y reactivos
Preparar el agar Mueller Hinton Agar como lo indica el fabricante. Repartir en placas, llenar hasta
conseguir 4 mm de espesor.
Preparar caldo Mueller Hinton. Repartir 5 mL en cada tubo antes de autoclavar.
Preparar la escala de Mc Farland 0,5: 9,95 mL de cido sulfrico 1% +0,05 mL de Cloruro de Bario al
1,175%. Colocar en tubos con dimetro similar al que tiene el caldo Mueller Hinton y cerrarlo
hermticamente.
Preparacin del inculo
Con una asa de siembra y de la placa con el germen a probar se tocan 4 5 colonias morfolgicamente
iguales y se suspenden en el Caldo Mueller Hinton.
Incubar hasta que la turbidez sea igual al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland comparando con un papel
con lineas.
Ajustar la turbidez
Si falta, incubar un poco ms o aadir mas colonias.
Si esta muy turbio diluir con suero fisiolgico o caldo Mueller Hinton.
Siembra de las placas
Dentro de los 15 minutos prximos de haber estandarizado el inculo, sumergir en el tubo un hisopo
estril, remover el exceso de inculo rotando el hisopo contra las paredes del tubo.
Con el hisopo, inocular la superficie total del Agar Mueller Hinton en tres direcciones y a 60 una de otra
dejar secar entre 3 a 5 minutos.
Colocacin de los discos antibiticos
Con la ayuda de una pinza estril colocar los discos de antibiticos apropiados sobre la superficie del
agar ya inoculado y haciendo ligera presin sobre los mismos asegurndonos de lograr un buen
contacto con la superficie del agar.
Colocar las placas en la incubadora y en forma invertida e incubar por 16 a 18 horas a 37C

Esquema de siembra de las placas de antibiograma:

Lectura e interpretacin de la prueba
Medir los halos de inhibicin con la ayuda de una regla milimetrada colocndola sobre la placa (se debe
colocar sobre el centro del disco) y sobre un fondo oscuro.
Interpretar la zona de inhibicin como: Susceptible, Intermedio o Resistente de acuerdo con la tabla de
interpretacin.
Coloque los resultados obtenidos en la prueba
Bacteria:
Iniciales Antibitico Lectura en mm Interpretacin

Realice un esquema del procedimiento y de sus observaciones
Discuta los siguientes temas con su profesor
1. Que significa NCLSS y SCLI, cual es la funcin de esta institucin y que material ha producido en
relacin a esta prctica.
2. Que material ha producido el Instituto Nacional de Salud para la estandarizacin de antibiogramas.
3. Que normas de lectura de antibiograma existen en otros pases y cual es la diferencia con la norma
nacional y la de Estados Unidos.
4. Como se realiza el control de calidad del antibiograma, que aspectos mide y cual es la importancia.
5. Cual es el mecanismo de accin de la penicilina, la gentamicina y la ciprofloxacina?
6. Cuales son los mecanismos de resistencia que presentan las bacterias al cloramfenicol y la
tetraciclina?
7. Para el grupo: Realice un grfico con los resultados de un antibitico en una de las bacterias utilizadas.
Son las diferencias significativas? Haga un comentario, (utilice los resultados de los alumnos de todos
los grupos, cada grupo debe utilizar un germen y un antibitico diferente), presentar un informe.


PRACTICA 27
CONTROL DE CALIDAD EN ANTIBIOGRAMA

COMPETENCIA
El alumno podr discutir todos los problemas concernientes al control de calidad del antibiograma
utilizando la prueba de difusin en disco segn Kirby y Bauer y podr tomar medidas de control para
mejorar el desempeo de la prueba.
INTRODUCCION
Como todo mtodo analtico, la prueba de difusin de Kirby y Bauer es susceptible de errores, que
pueden ser debidos al operador, al procedimiento o a los materiales utilizados; si bien los proveedores
garantizan que sus productos estn en buenas condiciones, no se puede garantizar que paso en el
transporte hasta el laboratorio y lo que sucedi dentro de el. Por eso es necesario un estricto control de
calidad tanto de los insumos como del desempeo del operador. Para esta prctica se han diseado una
serie de experimentos con la finalidad de evaluar los diferentes errores que se puede producir durante el
procesamiento y de esa manera el alumno estar capacitado para evaluar, diagnosticar y corregir las
fallas en los procedimientos.
CEPAS
Escherichia coli ATCC 25922
MATERIALES
Medio de Mueller Hinton Caldo de Mueller Hinton en tubos x 3 mL
Estndar de Mc Farland 0.5 Pinzas de punta plana
Papel para determinar pH Tabla para la lectura de los halos de inhibicin
Hisopos con punta de algodn Placas de Petri 15 x 100 estriles
Tubos de prueba 13 x 100 estriles Regla
Discos de antibiograma: ampicilina, gentamicina Discos: Cotrimoxazole, Ciprofloxacina
Discos: ceftriaxona, nitrofurantoina Discos: Acido nalidxico

PROCEDIMIENTO
Usar la cepa de Escherichia coli ATCC 25922 para todos los experimentos.
Se utilizarn placas descartables 100 x 10 debido a que son mas uniformes para diferenciar los resultados
de las pruebas.
En las placas se colocarn 4 discos y se puede utilizar cualquier combinacin de ellos excepto en el
experimento 4 donde se indican cuales utilizar.
Experimento 1: Efecto del tamao del inoculo
Preparar el inoculo equivalente al tubo 0,5 de Mc Farland
Diluir una parte del inculo 10 veces
Preparar un Inculo concentrado equivalente al tubo 4 de Mc Farland
Sembrar las placas y colocar 4 discos
Medir los halos despus del periodo de incubacin
Experimento 2: Efecto de la profundidad del agar
Preparar 4 placas de agar Mueller Hinton utilizando 12, 18, 25 y 35 mL de medio
Hacer un antibiograma con 4 discos diferentes.
Medir los halos y la profundidad del medio
Analizar los resultados
Experimento 3: pH del medio
Preparar 3 frascos de Agar Mueller Hinton y uno de agar Mac Conkey
Acidificar una frasco de medio con HCl 0,1 M, hasta pH 6
Alcalinizar un frasco de medio con NaOH 0,1 M hasta pH 8,0
Plaquear los medios
Inocular la cepa de E. coli
Colocar discos de gentamicina, ceftriaxona, nitrofurantoina y cido nalidxico
Despus de incubar medir los halos y analizar los resultados
Experimento 4: Efecto del tiempo entre inoculacin y colocacin de discos
Preparar los inculos para la prueba de KB e inocular 3 placas
Placa 1: Colocar los discos de inmediato
Placa 2: Esperar 30 minutos para colocar los discos
Placa 3: Esperar 2 horas para colocar los discos
Experimento 5: Efecto del tiempo de colocacin de discos
Preparar 3 inculos para la prueba de KB con el estandar de Mc Farland
Placa 1: Inocular la placa y colocar los discos de inmediato
Placa 2: Esperar 30 minutos para inocular la placa y colocar los discos
Placa 3: Esperar 2 horas para inocular la placa y colocar los discos
Experimento 6: Efecto del tiempo de incubacin
Preparar los inculos para la prueba de KB e inocular 3 placas y colocar los discos
Placa 1: Incubar de inmediato
Placa 2: Esperar 30 minutos a temperatura ambiente antes de incubar a 37C
Placa 3: Esperar 2 horas a temperatura ambiente antes de incubar
Medir los halos y analizar los resultados
Lectura e interpretacin de la prueba
Medir los halos de inhibicin con la ayuda de una regla milimetrada colocndola sobre la placa (se
debe colocar sobre el centro del disco) y sobre un fondo oscuro.
Interpretar la zona de inhibicin como: Susceptible, Intermedio o Resistente de acuerdo con la tabla
de interpretacin.
Los resultados sern fotografiados para incluirlos en el Power Point con los resultados finales que
sern enviados a todos los participantes (este ser el informe de la prctica)
Analizar los resultados comparando con las placas que utiliza el procedimiento estndar.

Guia de Bacteriologia

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Autores:

Alfredo Guilln, Carlos Benites, Cesar Guerrero, Nora Bravo

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